Oczyszczanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych za pomocą chromatografii powinowactwa

Weźmy zawiesinę zmodyfikowanych bakterii wyrażających rekombinowane, samoorganizujące się nanocząstki białkowe ze znacznikami polihistydyny.

Sonikacja w celu uwolnienia składników wewnątrzkomórkowych.

Wirówka w celu zebrania supernatantu zawierającego nanocząstki białkowe. Rozcieńczyć go buforem niezawierającym imidazolu.

Pobrać kolumnę chromatograficzną o powinowactwie zawierającą kulki agarozy z unieruchomionymi kationami niklu.

Dodać bufor o niskim stężeniu imidazolu w celu zrównoważenia kolumny.

Dodaj lizat bakteryjny do kolumny.

Podczas biegu polihistydyna na nanocząstkach białkowych silnie wiąże się z kationami niklu.

Tymczasem zanieczyszczenia, takie jak lipopolisacharydy bakteryjne i inne białka, słabo wiążą się z kolumną.

Przemyć buforem zawierającym niskie stężenie imidazolu w celu usunięcia słabo związanych białek.

Wprowadź izopropanol, aby usunąć lipopolisacharydy, a następnie umyj.

Następnie należy wprowadzić bufor o pośrednim stężeniu imidazolu. Imidazol konkuruje z histydyną o wiązanie się z kationem niklu, uwalniając związane nanocząstki białkowe.

Następnie dodaj bufor zawierający wysokie stężenie imidazolu, aby całkowicie wymyć nanocząstki białka.

Zbierz oczyszczone nanocząstki białka do dalszej aplikacji.

Do lizy zebranych E. coli wykazujących ekspresję wiązki sześciu helis SAPN, należy użyć sondy o mocy wyjściowej 150 watów, z czterema sekundami sonikacji i sześcioma sekundami odpoczynku, aby sonikować zawieszone osady bakteryjne w 40 mililitrach buforu wolnego od imidazolu na lodzie przez pięć minut.

Odwirować lizat komórkowy w celu wytworzenia oczyszczonego supernatantu i przenieść supernatant do sterylnej kolby o pojemności 150 mililitrów. Następnie doprowadzić próbkę do końcowej objętości 100 mililitrów za pomocą świeżego buforu wolnego od imidazolu.

Aby wyizolować interesujące Cię białko, otwórz oprogramowanie FPLC i kliknij opcję Nowa metoda. W menu Ustawienia metody otwórz menu rozwijane Pozycja kolumny i wybierz Port C1 3. Z menu rozwijanego Pokazane przez technikę wybierz opcję Powinowactwo. Z menu rozwijanego Typ kolumny wybierz Inne, HisTrap HP i pięć mililitrów. Objętość kolumny i skrzynie ciśnieniowe zostaną automatycznie ustawione na odpowiednie wartości.

Kliknij opcję Kontur metody i przeciągnij przyciski Równoważenie i Przykładowe zastosowanie, trzy przyciski Mycie kolumn oraz przycisk Elution z wyskakującego menu Biblioteka faz obok strzałki, a następnie zamknij menu Biblioteka faz. Kliknij opcję Równowaga i ustaw wartości wymienione w tabeli na Bufor początkowy B (4%), Bufor końcowy B (4%) i Column Volume (Objętość kolumny) 5.

Kliknij pozycję Przykładowa aplikacja. W polu Sample Loading (Ładowanie próbki) kliknij przycisk Radi Inject Sample on Column with Sample Pump (Wstrzykiwanie próbki do kolumny za pomocą pompy do próbki) i upewnij się, że pole obok opcji Use Flow Rate From Method Settings (Użyj natężenia przepływu z metody) jest zaznaczone w polu Sample Injection (Wstrzykiwanie próbki) ze skrzynką pompy systemowej . Zmień wartość pola Wolumin na 100 mililitrów i Schemat zbierania frakcji na Włącz.

Usuń zaznaczenie pola Użyj wielkości frakcji w ustawieniach metody i zmień rozmiar frakcji na cztery mililitry. Kliknij pierwszy przycisk Column Wash (Mycie kolumny). Ustaw wartości wymienione w tabeli na Bufor początkowy B, 4%, Bufor końcowy B, 4% i Objętość kolumny, 10. Kliknij pole Włącz schemat zbierania ułamków i usuń zaznaczenie opcji Użyj rozmiaru frakcji dla ustawień metody. Zmień wielkość frakcji na cztery mililitry i kliknij drugi przycisk Mycie kolumny.

Ustaw wartości w tabeli na Bufor początkowy B, 0%, Bufor końcowy B, 0% i Wolumin kolumny, 5. Kliknij pole Włącz schemat zbierania ułamków i usuń zaznaczenie opcji Użyj rozmiaru frakcji w ustawieniach metody. Zmień wielkość frakcji na 4 mililitry i kliknij przycisk Mycie trzeciej kolumny. Ustaw wartości w tabeli na Bufor początkowy B, 0%, Bufor końcowy B, 0% i Wolumin kolumny, 10. Kliknij przycisk Włącz schemat zbierania ułamków i odznacz pole Użyj rozmiaru frakcji dla ustawień metody. Następnie zmień wielkość frakcji na 4 mililitry.

Kliknij przycisk Eliminacja i kliknij prawym przyciskiem myszy informacje w tabeli. W menu podręcznym kliknij opcję Usuń krok i przeciągnij dwukrotnie przycisk Gradient izokratyczny na tabelę, tak aby pozostały dwa wpisy. Ustaw wartość pierwszego wpisu na Bufor początkowy B, 30%, Bufor końcowy B, 30% i Wolumin kolumny, 10.

Ustaw wartość drugiego wpisu na Bufor początkowy B, 100%, Bufor końcowy B, 100% i wolumin kolumny, 10. Kliknij przycisk Włącz schemat zbierania frakcji, a następnie kliknij pole Użyj rozmiaru frakcji dla ustawień metody. Następnie kliknij Zapisz jako i nazwij plik Oczyszczanie.

Umieścić rurkę pompy A FPLC w buforze płuczącym niezawierającym imidazolu, a rurkę pompy B w 500-milimolowym buforze imidazolowym. Umieść rurkę pompy próbki w próbce o pojemności 100 mililitrów i uruchom program oczyszczania. Gdy potrzebne jest mycie 60% izopropanolem, wstrzymaj program, przesuń rurkę pompy z mycia bez imidazolu do mycia 60% izopropanolu i uruchom ponownie program. Pod koniec prania ponownie wstrzymaj program, włóż rurkę pompy A z powrotem do bufora płuczącego bez imidazolu i uruchom ponownie program oczyszczania.