Oczyszczanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych za pomocą chromatografii powinowactwa

Weźmy zawiesinę zmodyfikowanych bakterii wyrażających rekombinowane, samoorganizujące się nanocząstki białkowe ze znacznikami polihistydyny.

Sonikacja w celu uwolnienia składników wewnątrzkomórkowych.

Wirówka w celu zebrania supernatantu zawierającego nanocząstki białkowe. Rozcieńczyć go buforem niezawierającym imidazolu.

Pobrać kolumnę chromatograficzną o powinowactwie zawierającą kulki agarozy z unieruchomionymi kationami niklu.

Dodać bufor o niskim stężeniu imidazolu w celu zrównoważenia kolumny.

Dodaj lizat bakteryjny do kolumny.

Podczas biegu polihistydyna na nanocząstkach białkowych silnie wiąże się z kationami niklu.

Tymczasem zanieczyszczenia, takie jak lipopolisacharydy bakteryjne i inne białka, słabo wiążą się z kolumną.

Przemyć buforem zawierającym niskie stężenie imidazolu w celu usunięcia słabo związanych białek.

Wprowadź izopropanol, aby usunąć lipopolisacharydy, a następnie umyj.

Następnie należy wprowadzić bufor o pośrednim stężeniu imidazolu. Imidazol konkuruje z histydyną o wiązanie się z kationem niklu, uwalniając związane nanocząstki białkowe.

Następnie dodaj bufor zawierający wysokie stężenie imidazolu, aby całkowicie wymyć nanocząstki białka.

Zbierz oczyszczon