Name: Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 26 s
Description: Poznaj cztery techniki pomiaru wewnątrzkomórkowych zmian Ca²⁺ w ludzkich plemnikach: fluorometrię konwencjonalną, fluorometrię zatrzymanego przepływu, cytometrię przepływową i obrazowanie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Jose Luisowi De la Vedze, Eriki Melchy i Dr. Takuya Nishigaki za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Mexico) (99333 i 128566 do CT); Dirección General de Asuntos del Personal Académico/ Universidad Nacional Autónoma de México (IN202212-3 do CT).

<ol><li>Bouschet, T., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+as+an+extracellular+signalling+molecule%3A+perspectives+on+the+Calcium+Sensing+Receptor+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Calcium as an extracellular signalling molecule: perspectives on the Calcium Sensing Receptor in the brain.</a> Comptes Rendus Biologies. 328, 691-700 (2005).</li>
<li>Darszon, A., Nishigaki, T., Beltran, C., Trevino, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channels+in+the+development%2C+maturation%2C+and+function+of+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium channels in the development, maturation, and function of spermatozoa.</a> Physiol. Rev. 91, 1305-1355 (2011).</li>
<li>Esposito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+for+soluble+adenylyl+cyclase+are+infertile+because+of+a+severe+sperm-motility+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mice deficient for soluble adenylyl cyclase are infertile because of a severe sperm-motility defect.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2993-2998 (2004).</li>
<li>Avenarius, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+male+infertility+caused+by+mutations+in+the+CATSPER1+channel+protein%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein.</a> American Journal of Human Genetics. 84, 505-510 (2009).</li>
<li>Carlson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+native+CatSper+channels+reveals+a+required+role+in+maintenance+of+sperm+hyperactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of native CatSper channels reveals a required role in maintenance of sperm hyperactivation.</a> PLoS ONE. 4, e6844(2009).</li>
<li>Brokaw, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+flagellar+response+during+the+chemotaxis+of+bracken+spermatozoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium and flagellar response during the chemotaxis of bracken spermatozoids.</a> J. Cell. Physiol. 83, 151-158 (1974).</li>
<li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121, 1139-1150 (1995).</li>
<li>Svahn, H. A., van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cells+or+large+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Single cells or large populations.</a> Lab on a chip. 7, 544-546 (2007).</li>
<li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 690-696 (2006).</li>
<li>Strunker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CatSper+channel+mediates+progesterone-induced+Ca2%2B+influx+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm.</a> Nature. 471, 382-386 (2011).</li>
<li>Lishko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Control+of+Male+Fertility+by+Spermatozoan+Ion+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Control of Male Fertility by Spermatozoan Ion Channels.</a> Annu. Rev. Physiol. , (2011).</li>
<li>Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+generated+cytosolic+calcium+pulses+and+their+detection+by+fluo-3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3.</a> J. Biol. Chem. 264, 8179-8184 (1989).</li>
<li>Kilic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+progesterone%3A+a+new+tool+for+studying+rapid+nongenomic+actions+of+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Caged progesterone: a new tool for studying rapid nongenomic actions of progesterone.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4027-4030 (2009).</li>
<li>Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+activates+the+principal+Ca2%2B+channel+of+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm.</a> Nature. 471, 387-391 (2011).</li>
<li>Xia, J., Ren, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BSA-induced+Ca2%2B+influx+during+sperm+capacitation+is+CATSPER+channel-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The BSA-induced Ca2+ influx during sperm capacitation is CATSPER channel-dependent.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 119(2009).</li>
<li>Galantino-Homer, H. L., Florman, H. M., Storey, B. T., Dobrinski, I., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+sperm+capacitation%3A+assessment+of+phosphodiesterase+activity+and+intracellular+alkalinization+on+capacitation-associated+protein+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Bovine sperm capacitation: assessment of phosphodiesterase activity and intracellular alkalinization on capacitation-associated protein tyrosine phosphorylation.</a> Mol. Reprod. Dev. 67, 487-500 (2004).</li>
<li>Baldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+accumulation+and+responsiveness+to+progesterone+in+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium accumulation and responsiveness to progesterone in capacitating human spermatozoa.</a> J. Androl. 12, 323-330 (1991).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Sygnalizacja wewnątrzkomórkowa jest niezbędna dla większości czynności komórkowych; Ca2+ jest wszechobecnym posłańcem, który towarzyszy komórkom ssaków przez całe ich życie, od ich powstania w momencie zapłodnienia, aż do końca cyklu życiowego. W odpowiedzi na różne bodźce [Ca2+]i wzrasta, oscyluje i maleje wraz z kodyfikacją czasoprzestrzenną; w związku z tym różne procesy są aktywowane, modulowane lub kończone przez komunikaty zakodowane w Ca2+. Wewnątrzkomórkowa dynamika Ca2 +</su...

Ca2+ jest uniwersalnym drugim przekaźnikiem szlaków transdukcji sygnału w komórkach eukariotycznych. Wewnątrzkomórkowy Ca2+ (Ca2 + i) uczestniczy w regulacji wielu podstawowych procesów fizjologicznych zarówno w komórkach pobudliwych, jak i niepobudliwych. Znaczenie i uniwersalność Ca2+ jako drugiego przekaźnika podczas zdarzeń transdukcji sygnału wynika z jego czasoprzestrzennej wszechstronności w przekazywaniu informacji w komórce. Chociaż Ca2+ nie może być syntetyzowany de novo ani degradowany w komórce, jego stężenie wewnątrzkomórkowe ([Ca2+] i) jest utrzymywane w bardzo ścisłych granicach dzięki różnym mechanizmom komórkowym, które w sposób ciągły buforują, sekwestrują, dzielą się na przedziały i / lub gromadzą Ca2+. Zmiany w stężeniu tego jonu mogą zachodzić w wysoce zlokalizowanych obszarach w komórce 1, a rozszyfrowanie takich fluktuacji jest niezbędne do głębszego zrozumienia (1) ich roli w mechanizmie sygnalizacji, (2) ich fizjologicznego znaczenia i (3) ogólnych mechanizmów sygnalizacji komórkowej. Sygnalizacja za pośrednictwem Ca2+ ma szczególne znaczenie w fizjologii plemników 2. Ruchliwość plemników jest jedną z najważniejszych funkcji decydujących o powodzeniu zapłodnienia, a w rzeczywistości kilka wad ruchliwości plemników może powodować bezpłodność 3-5. Znaczenie Ca2+ w ruchu wiciowym jest od dawna znane 6; jednak mechanizm, w jaki sposób Ca2+ kontroluje specyficzną formę zginania wici, nie jest w pełni zrozumiały.
Przed połączeniem z komórką jajową, plemniki muszą przejść kapacytację, złożony proces zależny od obecności plemników w żeńskim przewodzie. Podczas kapacytacji dochodzi do modyfikacji i organizacji lipidów błony plemników, głównie w wyniku usuwania cholesterolu z błony komórkowej. Dodatkowo kilka białek jest fosforylowanych tyrozyną 7. Co ważne, podczas kapacytacji dochodzi do wzrostu pH wewnątrzkomórkowego (pHi) oraz [Ca2+]i, a u niektórych gatunków dochodzi do hiperpolaryzacji potencjału błonowego 2. Kapacytacja zachodzi tylko w subpopulacji plemników (20-40%), a mechanizmy zaangażowane we wszystkie te zmiany komórkowe są dalekie od jasności. Ogólnie przyjmuje się, że tylko subpopulacja zpojemnościowych plemników ulega reakcji akrosomowej (AR) pod wpływem fizjologicznych induktorów. AR jest również zdarzeniem regulowanym przez Ca2+ wymaganym do zapłodnienia u wszystkich gatunków posiadających akrosom (wyspecjalizowane organelle z błonami zewnętrznymi i wewnętrznymi). Podczas tego procesu zewnętrzna błona akrosomalna łączy się z błoną plazmatyczną plemnika, uwalniając enzymy hydrolityczne, które umożliwiają plemnikowi przenikanie do macierzy glikoproteinowej otaczającej komórkę jajową (osłona przejrzysta lub ZP). AR odsłania również nową fuzogenną powierzchnię plemników, która oddziałuje z błoną plazmatyczną komórki jajowej w celu ostatecznego połączenia obu gamet. Istnieje kilka ligandów komórkowych, które indukują AR, a progesteron jest jednym z najlepiej przebadanych spośród nich.
W tej pracy prezentujemy cztery różne techniki polegające na użyciu barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na Ca2+ do pomiaru zmian [Ca2+]i w ludzkim plemniku wywołanych przez progesteron (z wyjątkiem cytometrii przepływowej, w której zmierzyliśmy wzrost [Ca2+]i indukowany podczas procesu kapacytacji in vitro). W tym konkretnym przypadku użyliśmy Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), barwnika przepuszczalnego dla membrany o Kd = 325 nM. In vitro monitorowaliśmy zmiany fluorescencji w funkcji czasu za pomocą trzech metodologii, a za pomocą czwartej techniki mierzyliśmy wartości fluorescencji w jednym określonym momencie. Te różne podejścia wzajemnie się uzupełniają, ponieważ razem zapewniają rozdzielczość przestrzenną i czasową zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji komórek.
Eksperymenty z populacją komórek lub masowe eksperymenty
Techniki masowe są szeroko stosowane nie tylko dlatego, że wymagane przez nie instrumenty są łatwo dostępne, ale także dlatego, że są proste, dobrze znane i pozwalają na uśrednianie informacji z pomiarów wykonanych na milionach komórek w jednym eksperymencie.
Technika #1. Fluorometria konwencjonalna 
Technika ta monitoruje zmiany fluorescencji w funkcji czasu; Eksperymenty przeprowadzane są w szklanych kuwetach o objętości próbek od 200 do 1000 μl. Prawidłowe wymieszanie dodanych odczynników wymaga mieszania magnetycznego, a zatem uzyskana rozdzielczość czasowa jest rzędu sekund. Typowy zakres stężeń komórek analizowanych próbek wynosi 105-10 8 komórek/ml.
Technika #2. Fluorometria zatrzymanego przepływu 
Technika ta monitoruje również zmiany fluorescencji w funkcji czasu, ale odczynniki są szybko mieszane ze sobą (pod ciśnieniem) w kuwecie rejestrującej zawierającej bardzo małą objętość próbki (w zakresie 25-100 μl). W związku z tym homogenizacja odczynników jest natychmiastowa, co umożliwia uzyskanie wysokiej rozdzielczości czasowej rzędu milisekund. Analiza uzyskanych śladów fluorescencyjnych w funkcji czasu jest odpowiednia do określania szybkości reakcji, wyjaśniania złożoności mechanizmu reakcji, uzyskiwania informacji o krótkotrwałych produktach pośrednich reakcji itp. Typowy zakres stężeń komórek w analizowanych próbkach wynosi 10 5-107 komórek/ml.
Eksperymenty z pojedynczą komórką
Eksperymenty zbiorcze informują o średnim zachowaniu dużej liczby komórek; jednak populacja może często wykazywać niejednorodne właściwości, które są pomijane podczas tego typu pomiarów. Techniki jednokomórkowe są zatem wykorzystywane do uzupełniania uzyskanych informacji za pomocą eksperymentów na populacji komórek.
Technika #3. Cytometria przepływowa 
Pomimo znaczenia informacji wynikających z pomiarów pojedynczych komórek, ważne jest, aby analizować dużą liczbę komórek, aby zapobiec błędnej ekstrapolacji właściwości specyficznych dla komórek na całą populację. Z tego powodu preferowane są techniki wysokoprzepustowe, a najpopularniejszą metodą jest cytometria przepływowa, w której konwencjonalnie analizuje się 10 000 komórek na stan. Metoda ta umożliwia wieloparametryczną analizę populacji heterogenicznych, ponieważ kategoryzuje komórki według ich wielkości (FSC)), ziarnistości (rozproszenie boczne (SSC)) i intensywności fluorescencji (specyficzne znakowanie przeciwciałem, markerem żywotności itp.), dostarczając w ten sposób informacji na temat rozkładu parametrów dla grupy komórek. Cytometria przepływowa dostarcza natychmiastowych, a nie zależnych od czasu informacji 8. Wartości rozproszenia do przodu i bocznego są również przydatne do wybierania bramki, która zawiera komórki, ale rozróżnia zanieczyszczenia komórkowe, kurz itp. Do pomiarów fluorescencji należy również uwzględnić kontrole fluorescencji ujemnej i dodatniej. Jeśli używany jest więcej niż jeden kanał fluorescencyjny, należy przeprowadzić proces znany jako kompensacja (szczegóły patrz <a href="http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp</a>). Kompensacja pozwala na dyskryminację nakładania się widmowego między fluoroforami. Cytometria przepływowa umożliwia również rozróżnianie martwych komórek, na ogół za pomocą barwienia jodkiem propidyny.
Technika #4. Obrazowanie pojedynczych komórek 
Mikroskopia to kolejna powszechna metoda badania zachowania pojedynczych komórek; Doskonale nadaje się do badań zależnych od czasu, a także zapewnia rozdzielczość przestrzenną. Główną wadą jest to, że analiza wysokoprzepustowa jest obecnie dopiero w powijakach 9.

<table><tbody><tr><td>Ham's F-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-6013</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny ok. 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-3881</td><td></td></tr><tr><td>Komora licząca Maklera</td><td>SEFI Medical Insruments LTD</td><td>SEF-MAKL</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td>20 fiolek/50 &mu; g każdy</td></tr><tr><td>Jonomycyna</td><td>Alomone</td><td>I-700</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0130</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td>Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3911</td><td>Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>JT Baker</td><td>3506</td><td>Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2670</td><td>Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)</td></tr><tr><td>Bezwodny chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td>Odczynniki do podłoża dla nasienia ludzkiego (HSM)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3125</td><td>Odczynniki do podłoża dla nasienia ludzkiego (HSM)</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>JT Baker</td><td>1906-01</td><td>Odczynniki do nasienia ludzkiego podłoże (HSM)</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2256</td><td>Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)</td></tr><tr><td>L-mleczan sodu (ok. 99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-7022</td><td>Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)</td></tr><tr><td>Jodek propidium </td><td>Invitrogen</td><td>L-7011</td><td>Składnik B</td></tr><tr><td>Triton X-100 (t-oktylofenoksyetoksyetanol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td>roztwór 2,4 mM w wodzie </td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełko nakrywkowe </td><td>VWR</td><td>48380 080</td><td>o średnicy 25 mm</td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek manganu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3634</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor; Komora komórkowa, do mikroskopii</td><td>Life technologies</td><td>A-7816</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulphoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>5x5 ml</td></tr></tbody></table>

pomiar wewnątrzkomórkowych zmian ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Plemniki to męskie komórki rozrodcze specjalnie zaprojektowane do docierania, rozpoznawania i łączenia się z komórką jajową. Aby wykonać te zadania, plemniki muszą być przygotowane do stawienia czoła stale zmieniającemu się środowisku i pokonania kilku barier fizycznych. Będąc w istocie cichymi transkrypcyjnie i translacyjnie, te ruchliwe komórki w dużym stopniu polegają na różnych mechanizmach sygnalizacyjnych, aby zorientować się i pływać w ukierunkowany sposób oraz zmagać się z trudnymi warunkami środowiskowymi podczas podróży w celu znalezienia jaja. W szczególności sygnalizacja za pośrednictwem Ca2 + ma kluczowe znaczenie dla kilku funkcji plemników: aktywacji ruchliwości, kapacytacji (złożonego procesu, który przygotowuje plemniki do reakcji akrosomowej) i reakcji akrosomowej (zdarzenie egzocytotyczne, które umożliwia fuzję plemnika z komórką jajową). Zastosowanie barwników fluorescencyjnych do śledzenia wewnątrzkomórkowych fluktuacji tego jonu ma niezwykłe znaczenie ze względu na ich łatwość aplikacji, czułość i wszechstronność wykrywania. Korzystając z jednego protokołu ładowania barwnika, wykorzystujemy cztery różne techniki fluorometryczne do monitorowania dynamiki Ca2+ plemników. Każda technika dostarcza odrębnych informacji, które umożliwiają rozdzielczość przestrzenną i/lub czasową, generując dane zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji komórek.

<img alt="Schemat procesu kapacytacji nasienia; obejmuje przygotowanie próbki, inkubację i liczenie komórek przy użyciu siatki." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Schemat protokołu eksperymentalnego dla przygotowania próbki plemników metodą swim-up. Przedstawiono główne etapy oddzielania ruchomych plemników ora...

Wewnątrzkomórkowa dynamika Ca2+ jest bardzo ważna w fizjologii plemników, a barwniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca2+ stanowią wszechstronne narzędzie do ich badania. Eksperymenty populacyjne (fluorometria i fluorometria zatrzymanego przepływu) oraz eksperymenty z pojedynczymi komórkami (cytometria przepływowa i obrazowanie pojedynczych komórek) są wykorzystywane do śledzenia zmian czasoprzestrzennych [Ca2+] w plemnikach ludzkich.

Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar wewnątrzkomórkowych fluktuacji wapnia w ludzkich plemnikach przy użyciu barwników fluorescencyjnych. Jest to realizowane poprzez wstępne przygotowanie próbki nasienia metodą swim-up i, w razie potrzeby, indukcję kapacytacji. Drugim krokiem jest załadowanie plemników fluorescencyjnego barwnika wapnia.Następnie, wykorzystując konwencjonalną fluorometrię, fluorometrię z zatrzymanym przepływem (stopped flow), cytometrię przepływową lub obrazowanie pojedynczych komórek, przeprowadza się eksperyment i rejestruje pomiary wapnia. Ostatecznie wyniki są analizowane w celu określenia zmian w wewnątrzkomórkowych stężeniach wapnia wywołanych przez progesteron lub występujących podczas procesu kapacytacji. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak te wykorzystujące radioaktywność, jest fakt, że jest to procedura o bardzo wysokiej czułości.Metoda ta jest bezpieczna i łatwa w wykonaniu. Może ona pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji wapniowej w SPR, takie jak identyfikacja związków indukujących wzrost poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową oraz ide

measuring-intracellular-ca2-changes-human-sperm-using-four-techniques

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomiar zmian poziomu Ca2+ wewnątrz komórki plemnika człowieka za pomocą czterech technik: konwencjonalnej fluorometrii, zatrzymanego przepływu fluorometrii, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Oceniono sygnały [Ca2+]i wywołane bodźcem w pojedynczych ludzkich plemnikach. Ruchome komórki obciążono fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na Ca2+ (metodą estru AM) i unieruchomiono w komorze przepływowej. Obrazowanie komórek przeprowadzono za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej, a stymulację wykonano poprzez medium perfuzyjne. Odpowiedzi pojedynczych komórek (lub obszarów) przeanalizowano offline przy użyciu programu Excel.

Techniki obrazowania sygnalizacji Ca2+ w ludzkich plemnikach

Wapń bierze udział w licznych fizjologicznych i patofizjologicznych szlakach sygnałowych. Obrazowanie żywych komórek wymaga specjalistycznego sprzętu i może być czasochłonne. Zoptymalizowano szybką, prostą metodę wykorzystującą cytometr przepływowy do określenia względnych zmian wapnia cytozolowego w przylegających komórkach nabłonka wprowadzonych do zawiesiny.

Cytozolowe pomiary wapnia w komórkach nabłonka nerek za pomocą cytometrii przepływowej

Obecnie, większość dostępnych wskaźników wapnia jest używana do ilościowego określania cytoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia jako pośrednich miar wapnia uwalnianego z retikulum sarkoplazmatycznego w hodowanych komórkach mięśni gładkich. Protokół ten opisuje użycie specyficznego wskaźnika opartego na FRET, który umożliwia bezpośredni pomiar sygnałów wapniowych w świetle retikulum sarkoplazmatycznego.

Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Tutaj prezentujemy metodologie oceny integralności błony plemników, cechy komórkowej związanej z kompetencją zapłodnienia plemników. Opisujemy trzy techniki fluorymetrycznej oceny błon plemników: jednoczesne barwienie za pomocą specyficznych sond fluorescencyjnych, mikroskopię fluorescencyjną oraz zaawansowaną cytometrię przepływową dedykowaną plemnikom. Przedstawiono również przykłady łączenia metodyk.

Techniki fluorymetryczne do oceny błon plemników

Tutaj opisane są dwa średnioprzepustowe testy do oceny wpływu na sygnalizację Ca2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich. Testy te można wykorzystać do szybkiego i łatwego badania przesiewowego dużych ilości związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2 + i reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach.

Średnioprzepustowe testy przesiewowe do oceny wpływu na sygnalizacjęCa2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich

Protokół ten opisuje, jak przeprowadzać rejestracje elektryczne z komórek plemników ssaków w konfiguracji całej komórki, z celem bezpośredniego rejestrowania aktywności kanałów jonowych. Metoda ta odegrała kluczową rolę w opisie elektrofizjologicznych profili kilku kanałów jonowych plemników i pomogła ujawnić ich tożsamość molekularną oraz regulację.

Rejestrowanie prądów elektrycznych przez błonę plazmatyczną plemników ssaków

Obecny protokół dostarcza praktycznego rozwiązania, które pozwala na pomiar apoptozy, potencjału błony mitochondrialnej i uszkodzeń DNA w plemnikach ludzkich za pomocą pojedynczego cytometru.

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów do wykrywania wad funkcjonalnych plemników ludzkich

Opisany tutaj model myszy AcroSensE i metody obrazowania żywych komórek dostarczają nowego podejścia do badania dynamiki wapnia w subkomórkowym przedziale akrosomu plemnika i jak regulują one etapy pośrednie prowadzące do fuzji błony i egzocytozy akrosomów.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym akrosomalnej dynamiki wapnia i egzocytozy w żywych plemnikach myszy

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Opisano wydajną metodę otrzymywania wysokiej czystości żywych frakcji meiotycznych z jądra myszy, która łączy udoskonalony protokół dysocjacji komórek z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS). Metoda ta wykorzystuje różnice w zawartości DNA oraz gęstości jąder poszczególnych frakcji meiotycznych.

Oczyszczanie komórek meiotycznych myszy metodą cytometrii przepływowej

Poznaj cztery techniki pomiaru wewnątrzkomórkowych zmian Ca²⁺ w ludzkich plemnikach: fluorometrię konwencjonalną, fluorometrię zatrzymanego przepływu, cytometrię przepływową i obrazowanie pojedynczych komórek.

Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca²⁺ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Przeglądaj więcej filmów