Name: Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 26 s
Description: Poznaj cztery techniki pomiaru wewnątrzkomórkowych zmian Ca²⁺ w ludzkich plemnikach: fluorometrię konwencjonalną, fluorometrię zatrzymanego przepływu, cytometrię przepływową i obrazowanie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Jose Luisowi De la Vedze, Eriki Melchy i Dr. Takuya Nishigaki za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Mexico) (99333 i 128566 do CT); Dirección General de Asuntos del Personal Académico/ Universidad Nacional Autónoma de México (IN202212-3 do CT).

<ol><li>Bouschet, T., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+as+an+extracellular+signalling+molecule%3A+perspectives+on+the+Calcium+Sensing+Receptor+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Calcium as an extracellular signalling molecule: perspectives on the Calcium Sensing Receptor in the brain.</a> Comptes Rendus Biologies. 328, 691-700 (2005).</li>
<li>Darszon, A., Nishigaki, T., Beltran, C., Trevino, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channels+in+the+development%2C+maturation%2C+and+function+of+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium channels in the development, maturation, and function of spermatozoa.</a> Physiol. Rev. 91, 1305-1355 (2011).</li>
<li>Esposito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+for+soluble+adenylyl+cyclase+are+infertile+because+of+a+severe+sperm-motility+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mice deficient for soluble adenylyl cyclase are infertile because of a severe sperm-motility defect.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2993-2998 (2004).</li>
<li>Avenarius, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+male+infertility+caused+by+mutations+in+the+CATSPER1+channel+protein%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein.</a> American Journal of Human Genetics. 84, 505-510 (2009).</li>
<li>Carlson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+native+CatSper+channels+reveals+a+required+role+in+maintenance+of+sperm+hyperactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of native CatSper channels reveals a required role in maintenance of sperm hyperactivation.</a> PLoS ONE. 4, e6844(2009).</li>
<li>Brokaw, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+flagellar+response+during+the+chemotaxis+of+bracken+spermatozoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium and flagellar response during the chemotaxis of bracken spermatozoids.</a> J. Cell. Physiol. 83, 151-158 (1974).</li>
<li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121, 1139-1150 (1995).</li>
<li>Svahn, H. A., van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cells+or+large+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Single cells or large populations.</a> Lab on a chip. 7, 544-546 (2007).</li>
<li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 690-696 (2006).</li>
<li>Strunker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CatSper+channel+mediates+progesterone-induced+Ca2%2B+influx+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm.</a> Nature. 471, 382-386 (2011).</li>
<li>Lishko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Control+of+Male+Fertility+by+Spermatozoan+Ion+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Control of Male Fertility by Spermatozoan Ion Channels.</a> Annu. Rev. Physiol. , (2011).</li>
<li>Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+generated+cytosolic+calcium+pulses+and+their+detection+by+fluo-3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3.</a> J. Biol. Chem. 264, 8179-8184 (1989).</li>
<li>Kilic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+progesterone%3A+a+new+tool+for+studying+rapid+nongenomic+actions+of+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Caged progesterone: a new tool for studying rapid nongenomic actions of progesterone.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4027-4030 (2009).</li>
<li>Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+activates+the+principal+Ca2%2B+channel+of+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm.</a> Nature. 471, 387-391 (2011).</li>
<li>Xia, J., Ren, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BSA-induced+Ca2%2B+influx+during+sperm+capacitation+is+CATSPER+channel-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The BSA-induced Ca2+ influx during sperm capacitation is CATSPER channel-dependent.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 119(2009).</li>
<li>Galantino-Homer, H. L., Florman, H. M., Storey, B. T., Dobrinski, I., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+sperm+capacitation%3A+assessment+of+phosphodiesterase+activity+and+intracellular+alkalinization+on+capacitation-associated+protein+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Bovine sperm capacitation: assessment of phosphodiesterase activity and intracellular alkalinization on capacitation-associated protein tyrosine phosphorylation.</a> Mol. Reprod. Dev. 67, 487-500 (2004).</li>
<li>Baldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+accumulation+and+responsiveness+to+progesterone+in+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium accumulation and responsiveness to progesterone in capacitating human spermatozoa.</a> J. Androl. 12, 323-330 (1991).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Sygnalizacja wewnątrzkomórkowa jest niezbędna dla większości czynności komórkowych; Ca2+ jest wszechobecnym posłańcem, który towarzyszy komórkom ssaków przez całe ich życie, od ich powstania w momencie zapłodnienia, aż do końca cyklu życiowego. W odpowiedzi na różne bodźce [Ca2+]i wzrasta, oscyluje i maleje wraz z kodyfikacją czasoprzestrzenną; w związku z tym różne procesy są aktywowane, modulowane lub kończone przez komunikaty zakodowane w Ca2+. Wewnątrzkomórkowa dynamika Ca2 +</su...

Ca2+ jest uniwersalnym drugim przekaźnikiem szlaków transdukcji sygnału w komórkach eukariotycznych. Wewnątrzkomórkowy Ca2+ (Ca2 + i) uczestniczy w regulacji wielu podstawowych procesów fizjologicznych zarówno w komórkach pobudliwych, jak i niepobudliwych. Znaczenie i uniwersalność Ca2+ jako drugiego przekaźnika podczas zdarzeń transdukcji sygnału wynika z jego czasoprzestrzennej wszechstronności w przekazywaniu informacji w komórce. Chociaż Ca2+ nie może być syntetyzowany de novo ani degradowany w komórce, jego stężenie wewnątrzkomórkowe ([Ca2+] i) jest utrzymywane w bardzo ścisłych granicach dzięki różnym mechanizmom komórkowym, które w sposób ciągły buforują, sekwestrują, dzielą się na przedziały i / lub gromadzą Ca2+. Zmiany w stężeniu tego jonu mogą zachodzić w wysoce zlokalizowanych obszarach w komórce 1, a rozszyfrowanie takich fluktuacji jest niezbędne do głębszego zrozumienia (1) ich roli w mechanizmie sygnalizacji, (2) ich fizjologicznego znaczenia i (3) ogólnych mechanizmów sygnalizacji komórkowej. Sygnalizacja za pośrednictwem Ca2+ ma szczególne znaczenie w fizjologii plemników 2. Ruchliwość plemników jest jedną z najważniejszych funkcji decydujących o powodzeniu zapłodnienia, a w rzeczywistości kilka wad ruchliwości plemników może powodować bezpłodność 3-5. Znaczenie Ca2+ w ruchu wiciowym jest od dawna znane 6; jednak mechanizm, w jaki sposób Ca2+ kontroluje specyficzną formę zginania wici, nie jest w pełni zrozumiały.
Przed połączeniem z komórką jajową, plemniki muszą przejść kapacytację, złożony proces zależny od obecności plemników w żeńskim przewodzie. Podczas kapacytacji dochodzi do modyfikacji i organizacji lipidów błony plemników, głównie w wyniku usuwania cholesterolu z błony komórkowej. Dodatkowo kilka białek jest fosforylowanych tyrozyną 7. Co ważne, podczas kapacytacji dochodzi do wzrostu pH wewnątrzkomórkowego (pHi) oraz [Ca2+]i, a u niektórych gatunków dochodzi do hiperpolaryzacji potencjału błonowego 2. Kapacytacja zachodzi tylko w subpopulacji plemników (20-40%), a mechanizmy zaangażowane we wszystkie te zmiany komórkowe są dalekie od jasności. Ogólnie przyjmuje się, że tylko subpopulacja zpojemnościowych plemników ulega reakcji akrosomowej (AR) pod wpływem fizjologicznych induktorów. AR jest również zdarzeniem regulowanym przez Ca2+ wymaganym do zapłodnienia u wszystkich gatunków posiadających akrosom (wyspecjalizowane organelle z błonami zewnętrznymi i wewnętrznymi). Podczas tego procesu zewnętrzna błona akrosomalna łączy się z błoną plazmatyczną plemnika, uwalniając enzymy hydrolityczne, które umożliwiają plemnikowi przenikanie do macierzy glikoproteinowej otaczającej komórkę jajową (osłona przejrzysta lub ZP). AR odsłania również nową fuzogenną powierzchnię plemników, która oddziałuje z błoną plazmatyczną komórki jajowej w celu ostatecznego połączenia obu gamet. Istnieje kilka ligandów komórkowych, które indukują AR, a progesteron jest jednym z najlepiej przebadanych spośród nich.
W tej pracy prezentujemy cztery różne techniki polegające na użyciu barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na Ca2+ do pomiaru zmian [Ca2+]i w ludzkim plemniku wywołanych przez progesteron (z wyjątkiem cytometrii przepływowej, w której zmierzyliśmy wzrost [Ca2+]i indukowany podczas procesu kapacytacji in vitro). W tym konkretnym przypadku użyliśmy Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), barwnika przepuszczalnego dla membrany o Kd = 325 nM. In vitro monitorowaliśmy zmiany fluorescencji w funkcji czasu za pomocą trzech metodologii, a za pomocą czwartej techniki mierzyliśmy wartości fluorescencji w jednym określonym momencie. Te różne podejścia wzajemnie się uzupełniają, ponieważ razem zapewniają rozdzielczość przestrzenną i czasową zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji komórek.
Eksperymenty z populacją komórek lub masowe eksperymenty
Techniki masowe są szeroko stosowane nie tylko dlatego, że wymagane przez nie instrumenty są łatwo dostępne, ale także dlatego, że są proste, dobrze znane i pozwalają na uśrednianie informacji z pomiarów wykonanych na milionach komórek w jednym eksperymencie.
Technika #1. Fluorometria konwencjonalna 
Technika ta monitoruje zmiany fluorescencji w funkcji czasu; Eksperymenty przeprowadzane są w szklanych kuwetach o objętości próbek od 200 do 1000 μl. Prawidłowe wymieszanie dodanych odczynników wymaga mieszania magnetycznego, a zatem uzyskana rozdzielczość czasowa jest rzędu sekund. Typowy zakres stężeń komórek analizowanych próbek wynosi 105-10 8 komórek/ml.
Technika #2. Fluorometria zatrzymanego przepływu 
Technika ta monitoruje również zmiany fluorescencji w funkcji czasu, ale odczynniki są szybko mieszane ze sobą (pod ciśnieniem) w kuwecie rejestrującej zawierającej bardzo małą objętość próbki (w zakresie 25-100 μl). W związku z tym homogenizacja odczynników jest natychmiastowa, co umożliwia uzyskanie wysokiej rozdzielczości czasowej rzędu milisekund. Analiza uzyskanych śladów fluorescencyjnych w funkcji czasu jest odpowiednia do określania szybkości reakcji, wyjaśniania złożoności mechanizmu reakcji, uzyskiwania informacji o krótkotrwałych produktach pośrednich reakcji itp. Typowy zakres stężeń komórek w analizowanych próbkach wynosi 10 5-107 komórek/ml.
Eksperymenty z pojedynczą komórką
Eksperymenty zbiorcze informują o średnim zachowaniu dużej liczby komórek; jednak populacja może często wykazywać niejednorodne właściwości, które są pomijane podczas tego typu pomiarów. Techniki jednokomórkowe są zatem wykorzystywane do uzupełniania uzyskanych informacji za pomocą eksperymentów na populacji komórek.
Technika #3. Cytometria przepływowa 
Pomimo znaczenia informacji wynikających z pomiarów pojedynczych komórek, ważne jest, aby analizować dużą liczbę komórek, aby zapobiec błędnej ekstrapolacji właściwości specyficznych dla komórek na całą populację. Z tego powodu preferowane są techniki wysokoprzepustowe, a najpopularniejszą metodą jest cytometria przepływowa, w której konwencjonalnie analizuje się 10 000 komórek na stan. Metoda ta umożliwia wieloparametryczną analizę populacji heterogenicznych, ponieważ kategoryzuje komórki według ich wielkości (FSC)), ziarnistości (rozproszenie boczne (SSC)) i intensywności fluorescencji (specyficzne znakowanie przeciwciałem, markerem żywotności itp.), dostarczając w ten sposób informacji na temat rozkładu parametrów dla grupy komórek. Cytometria przepływowa dostarcza natychmiastowych, a nie zależnych od czasu informacji 8. Wartości rozproszenia do przodu i bocznego są również przydatne do wybierania bramki, która zawiera komórki, ale rozróżnia zanieczyszczenia komórkowe, kurz itp. Do pomiarów fluorescencji należy również uwzględnić kontrole fluorescencji ujemnej i dodatniej. Jeśli używany jest więcej niż jeden kanał fluorescencyjny, należy przeprowadzić proces znany jako kompensacja (szczegóły patrz <a href="http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp</a>). Kompensacja pozwala na dyskryminację nakładania się widmowego między fluoroforami. Cytometria przepływowa umożliwia również rozróżnianie martwych komórek, na ogół za pomocą barwienia jodkiem propidyny.
Technika #4. Obrazowanie pojedynczych komórek 
Mikroskopia to kolejna powszechna metoda badania zachowania pojedynczych komórek; Doskonale nadaje się do badań zależnych od czasu, a także zapewnia rozdzielczość przestrzenną. Główną wadą jest to, że analiza wysokoprzepustowa jest obecnie dopiero w powijakach 9.

<table><tbody><tr><td>Ham's F-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-6013</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny ok. 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-3881</td><td></td></tr><tr><td>Komora licząca Maklera</td><td>SEFI Medical Insruments LTD</td><td>SEF-MAKL</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td>20 fiolek/50 &mu; g każdy</td></tr><tr><td>Jonomycyna</td><td>Alomone</td><td>I-700</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0130</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td>Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3911</td><td>Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>JT Baker</td><td>3506</td><td>Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2670</td><td>Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)</td></tr><tr><td>Bezwodny chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td>Odczynniki do podłoża dla nasienia ludzkiego (HSM)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3125</td><td>Odczynniki do podłoża dla nasienia ludzkiego (HSM)</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>JT Baker</td><td>1906-01</td><td>Odczynniki do nasienia ludzkiego podłoże (HSM)</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2256</td><td>Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)</td></tr><tr><td>L-mleczan sodu (ok. 99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-7022</td><td>Odczynniki do pożywki dla nasienia ludzkiego (HSM)</td></tr><tr><td>Jodek propidium </td><td>Invitrogen</td><td>L-7011</td><td>Składnik B</td></tr><tr><td>Triton X-100 (t-oktylofenoksyetoksyetanol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td>roztwór 2,4 mM w wodzie </td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełko nakrywkowe </td><td>VWR</td><td>48380 080</td><td>o średnicy 25 mm</td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek manganu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3634</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor; Komora komórkowa, do mikroskopii</td><td>Life technologies</td><td>A-7816</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulphoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>5x5 ml</td></tr></tbody></table>

pomiar wewnątrzkomórkowych zmian ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Plemniki to męskie komórki rozrodcze specjalnie zaprojektowane do docierania, rozpoznawania i łączenia się z komórką jajową. Aby wykonać te zadania, plemniki muszą być przygotowane do stawienia czoła stale zmieniającemu się środowisku i pokonania kilku barier fizycznych. Będąc w istocie cichymi transkrypcyjnie i translacyjnie, te ruchliwe komórki w dużym stopniu polegają na różnych mechanizmach sygnalizacyjnych, aby zorientować się i pływać w ukierunkowany sposób oraz zmagać się z trudnymi warunkami środowiskowymi podczas podróży w celu znalezienia jaja. W szczególności sygnalizacja za pośrednictwem Ca2 + ma kluczowe znaczenie dla kilku funkcji plemników: aktywacji ruchliwości, kapacytacji (złożonego procesu, który przygotowuje plemniki do reakcji akrosomowej) i reakcji akrosomowej (zdarzenie egzocytotyczne, które umożliwia fuzję plemnika z komórką jajową). Zastosowanie barwników fluorescencyjnych do śledzenia wewnątrzkomórkowych fluktuacji tego jonu ma niezwykłe znaczenie ze względu na ich łatwość aplikacji, czułość i wszechstronność wykrywania. Korzystając z jednego protokołu ładowania barwnika, wykorzystujemy cztery różne techniki fluorometryczne do monitorowania dynamiki Ca2+ plemników. Każda technika dostarcza odrębnych informacji, które umożliwiają rozdzielczość przestrzenną i/lub czasową, generując dane zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji komórek.

<img alt="Schemat procesu kapacytacji nasienia; obejmuje przygotowanie próbki, inkubację i liczenie komórek przy użyciu siatki." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Schemat protokołu eksperymentalnego dla przygotowania próbki plemników metodą swim-up. Przedstawiono główne etapy oddzielania ruchomych plemników ora...

Wewnątrzkomórkowa dynamika Ca2+ jest bardzo ważna w fizjologii plemników, a barwniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca2+ stanowią wszechstronne narzędzie do ich badania. Eksperymenty populacyjne (fluorometria i fluorometria zatrzymanego przepływu) oraz eksperymenty z pojedynczymi komórkami (cytometria przepływowa i obrazowanie pojedynczych komórek) są wykorzystywane do śledzenia zmian czasoprzestrzennych [Ca2+] w plemnikach ludzkich.

Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar wewnątrzkomórkowych fluktuacji wapnia w ludzkich plemnikach przy użyciu barwników fluorescencyjnych. Jest to realizowane poprzez wstępne przygotowanie próbki nasienia metodą swim-up i, w razie potrzeby, indukcję kapacytacji. Drugim krokiem jest załadowanie plemników fluorescencyjnego barwnika wapnia.Następnie, wykorzystując konwencjonalną fluorometrię, fluorometrię z zatrzymanym przepływem (stopped flow), cytometrię przepływową lub obrazowanie pojedynczych komórek, przeprowadza się eksperyment i rejestruje pomiary wapnia. Ostatecznie wyniki są analizowane w celu określenia zmian w wewnątrzkomórkowych stężeniach wapnia wywołanych przez progesteron lub występujących podczas procesu kapacytacji. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak te wykorzystujące radioaktywność, jest fakt, że jest to procedura o bardzo wysokiej czułości.Metoda ta jest bezpieczna i łatwa w wykonaniu. Może ona pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji wapniowej w SPR, takie jak identyfikacja związków indukujących wzrost poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową oraz identyfikacja różnych subpopulacji komórkowych w próbce nasienia. Zastosowanie, na przykład, techniki cytometrii przepływowej znajduje odzwierciedlenie w diagnostyce problemów z płodnością poprzez analizę stanu fizjologicznego gamet męskich.Mimo że metoda ta pozwala na zgłębienie mobilizacji wapnia w ludzkich plemnikach, można ją zastosować również do innych rodzajów komórek, takich jak gamety męskie innych gatunków lub inne typy komórek, na przykład neurony czy komórki mięśniowe. Zazwyczaj osoby stosujące tę metodę napotykają trudności, ponieważ obsługa plemników nie jest łatwa i kluczowe jest utrzymanie odpowiednich warunków, aby przez cały czas trwania eksperymentu komórki pozostawały żywotne i ruchliwe. Wdrożyliśmy zastosowanie tych technik, łącząc strategie z różnych dziedzin.Wizualna demonstracja tej metody jest istotna, ponieważ przygotowanie i obchodzenie się z próbką, a także dodawanie związków są trudne do opanowania, gdyż komórki plemników mogą ulec uszkodzeniu podczas procedury, a podczas dodawania związków mogą powstać artefakty w odpowiedziach. Aby przygotować próbkę plemników, jeden mililitr medium hams F 10 należy ostrożnie nanieść warstwowo na wierzch każdego 500 µl upłynnionego nasienia. Należy dotknąć ścianki probówki końcówką mikropipety i delikatnie dozować medium nad próbką.Kluczowe jest, aby wykonywać tę czynność powoli, aby uniknąć zmieszania warstw próbki i medium. Medium jest uzupełnione o 2 mM chlorku wapnia oraz 5 mg/mL BSA. Aby wspomóc kapacytację in vitro, należy ostrożnie przechylić probówki pod kątem około 30 stopni.Zwiększy to powierzchnię styku między dwoma cieczami, co usprawni przemieszczanie się lub wypływanie plemników z próbki do medium podczas inkubacji. Następnie należy umieścić nachylone probówki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i atmosferze 5% carbon dioxide oraz 95% air na jedną godzinę.Za pomocą mikropipety ostrożnie pobierz z każdej probówki górne 700 µL pożywki hams F 10, w której znajdują się obecnie ruchliwe plemniki. Połącz wszystkie zebrane próbki w jednej czystej probówce szklanej, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Nanieś 10 µL połączonej próbki na płaskie szkło optyczne podstawy komory licznikowej Macleod i nałóż szkiełko nakrywkowe.Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza wewnątrz komory, ponieważ mogłoby to doprowadzić do uzyskania niedokładnej liczby komórek. Obserwację należy przeprowadzić pod mikroskopem złożonym wyposażonym w obiektyw 20 x. Szkiełko nakrywkowe komory licznikowej posiada duży kwadrat składający się ze 100 mniejszych kwadratów.Policz komórki w dowolnym pasie 10 kwadratów. Liczba ta reprezentuje stężenie komórek w milionach komórek na mililitr. Powtórz liczenie w dwóch dodatkowych pasach po 10 kwadratów i oblicz średnią z trzech pomiarów, aby przystąpić do obciążania komórek barwnikiem fluorescencyjnym.W probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml połączyć wymaganą objętość zawiesiny plemników z odpowiednią ilością 1 mM roztworu stokowego Fluo-3 AM, aby uzyskać końcowe stężenie 2 µM Fluo-3 AM. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem. Wirować probówkę przy 750 ×g przez pięć minut. Powstanie obłoku zamiast zbitego osadu świadczy o dobrym stanie komórek. Odessać i odrzucić nadsącz, a następnie resuspender osad w odpowiedniej objętości pożywki dla ludzkich plemników (human sperm medium, HSM). Aby rozpocząć eksperyment, połączyć w szklanej probówce z płaskim dnem 570 µL HSM oraz 30 µL zawiesiny komórek plemników uprzednio załadowanych Fluo-3 AM i resuspenderowanych w HSM, aby uzyskać stężenie 1 × 10⁸ komórek/ml.Włożyć mieszadło magnetyczne do szklanej probówki, a następnie wprowadzić probówkę do komory pomiarowej spektrometru wstępnie podgrzanego do 37 °C. Próbka musi być mieszana przez cały czas trwania pomiaru. Rozpocząć eksperyment za pomocą oprogramowania oli i przystąpić do pomiaru wartości fluorescencji z częstotliwością 0,5 Hz przez 300 sekund.Po zarejestrowaniu fluorescencji bazowej przez 30 sekund, należy użyć mikrostrzykawki Hamiltona, aby w 100 sekundzie wstrzyknąć odpowiednią objętość związku testowego – w tym przypadku progesteronu o stężeniu mikromolarnym. W celu uzyskania maksymalnej wartości fluorescencji, jako kontrolę pozytywną, należy zastosować ionomycin w stężeniu 20 µM. W tym eksperymencie zmiany stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego są mierzone z wysoką rozdzielczością czasową.Używając miksera przepływu zatrzymanego SFM 20 połączonego z optycznym systemem do kinetyki szybkiej, należy napełnić jedną z strzykawek urządzenia jednym mililitrem komórek plemników załadowanych o 3:00 rano, a drugą strzykawką jednym mililitrem badanego związku: 20 µM progesteronu rozpuszczonego w HSM.W tym przykładzie kluczowe jest unikanie powstawania pęcherzyków powietrza podczas nabierania cieczy do strzykawek. Podnieś tłoki obu instrumentów, aż dotkną końcówek tłoków strzykawek. W tym przypadku ustaw całkowity czas próbkowania na 50 seconds, a częstotliwość na 10 milliseconds, aby zminimalizować uszkodzenia komórek; prędkość przepływu ustaw na minimalną wartość, która zapewni mierzalny sygnał wyzwalający.Po zmieszaniu odczynników na ekranie komputera zostanie wyświetlona krzywa surowej fluorescencji w funkcji czasu. Powtórz tę procedurę, zastępując progesteron medium HSM jako kontrolą ujemną oraz 10 µM ionomycyny jako kontrolą dodatnią przed przeprowadzeniem cytometrii przepływowej. Przygotuj próbki eksperymentalne, umieszczając po 500 µL zawiesiny komórkowej w probówce do cytometru dla każdego badanego wariantu.Skonfiguruj eksperyment za pomocą oprogramowania sprzętowego. Najpierw utwórz nowy folder, okaz eksperymentalny i określ liczbę probówek. Następnie wybierz odpowiednie ustawienia cytometru dla flu O 3:00 AM. Użyj filtrów dla izotiocyjanianu fluoresceiny i jodku propidyny.Przeanalizuj w cytometrze niebarwione probówki kontrolne jeden i dwa. Zbierz dane dotyczące rozproszenia światła w przód (forward scatter) oraz prostopadle (side scatter), aby zweryfikować poprawność ustawień progu oraz stworzyć odpowiednią bramkę w celu odróżnienia detrytusu od komórek. Przeanalizuj probówki eksperymentalne i zbierz dane fluorescencji z 10 000 zdarzeń na próbkę.Na koniec wyeksportuj wszystkie dane do oprogramowania dostępnego do analizy. Przygotuj okrągłe szkiełka nakrywkowe niezbędne do tej procedury, nakładając kroplę 5 µL roztworu poli-L-lizyny na środek każdego szkiełka.Pozostawić na co najmniej jedną godzinę; przed użyciem wypłukać obszar poddany obróbce wodą. Usunie to nadmiar polilizyny i pozwoli plemnikom przytwierdzić się do szkiełka nakrywki za pomocą główek, podczas gdy ich flagella będą mogły nadal się poruszać. Zamontować szkiełko nakrywkę wewnątrz komory rejestrującej.Nanieś 10 µL zawiesiny naładowanych komórek flu oh 3:00 AM w stężeniu 1 × 10⁷ komórek/mL na środek szkiełka podstawowego. Przykryj komórki 200 µL uprzednio ogrzanego medium HSM.Umieść komorę na stoliku mikroskopu, uprzednio podgrzanym do 37 °C, i obserwuj komórki w kontraście fazowym. Wybierz obszar, w którym gęstość komórek jest odpowiednia do obrazowania. Zbyt duża liczba komórek utrudnia analizę ze względu na nakładanie się sygnałów.Komórki powinny być ściśle przytwierdzone do szkiełka podstawowego za pomocą głowy, lecz wykazywać ruch wici, co potwierdza ich żywotność. Eksperyment należy rozpocząć od aktywacji oprogramowania do akwizycji obrazów w serii czasowej. Zazwyczaj wymagane jest wykonanie czterech obrazów na sekundę przy czasie naświetlania wynoszącym dwie milisekundy na obraz.Należy pozyskać obrazy fluorescencyjne w trybie na żywo. Dostosuj ostrość oraz jasność obrazu. Za pomocą mikropipety ostrożnie, kroplami, dodaj badany związek (w tym przypadku progesteron) i kontynuuj akwizycję obrazów zgodnie z potrzebami.Wykonaj dwa sekwencyjne dodatki kontrolne do tej samej komory. 20 µM ionomycin w celu uzyskania maksymalnej fluorescencji oraz 5 mM chlorku manganu w celu uzyskania minimalnej fluorescencji. Przeprowadź analizę obrazów w trybie offline przy użyciu oprogramowania IQ.Wyznacz obszary zainteresowania (ROI) wokół każdej komórki lub jej fragmentu. Dodatkowo wybierz obszar wolny od komórek w celu automatycznego odjęcia tła przez oprogramowanie. Następnie dla każdego ROI uzyskuje się serię czasową intensywności fluorescencji, a dane te można wyeksportować do programu Microsoft Excel w celu dalszej analizy.Progesteron jest jednym ze znanych induktorów reakcji akrosomalnej i, zgodnie z oczekiwaniami, wywołuje przejściowy wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w ludzkich plemnikach, co zmierzono za pomocą konwencjonalnej fluorometrii. Czerwony ślad fluorescencji w funkcji czasu pokazuje zmiany stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego spowodowane dodaniem 4 µM progesteronu; jako kontrolę negatywną dodano HSM, który nie wywołał żadnych zmian w poziomach stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego, co wskazuje niebieski ślad fluorescencji. Dla każdego śladu pokazano zmianę wywołaną przez 10 µM jonomycyny jako kontrolę pozytywną.Dodanie tego jonoforu wapniowego powoduje maksymalny wzrost stężenia wapnia w komórkach RA, który nie powraca do poziomów podstawowych. Ten wykres słupkowy przedstawia średnią zmianę fluorescencji delta F dla każdego warunku, plus lub minus błąd standardowy, gdzie N wynosi trzy, a gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,001 w porównaniu z kontrolą. Wzrost stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego indukowany progesteronem został zmierzony z większą rozdzielczością czasową za pomocą fluorometrii stop-flow, a reprezentatywne wyniki przedstawiono tutaj.Surowe zapisy przedstawiono na panelu A; zarówno progesteron (linia czerwona), jak i jonomycyna (linia niebieska) wywołały szybki wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Zielony zapis to kontrola negatywna, w której komórki zmieszano z HSM. Panel B przedstawia skorygowane zapisy sygnałów wywołanych progesteronem lub jonomycyną, uzyskane poprzez odjęcie sygnału kontrolnego od odpowiadających im sygnałów surowych.Progesteron wywołał bardzo szybki i przejściowy wzrost wewnątrzkomórkowej stężenia wapnia, przy czym maksymalna wartość fluorescencji wystąpiła 2,7 sekundy po dodaniu induktora. Z kolei CIN spowodował szybki i trwały wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia utrzymujący się przez 50 sekund. Wstawka w panelu B przedstawia powiększony widok pierwszych 500 milisekund dla każdej z odpowiedzi.Brak opóźnienia w indukowanym przez progesteron wzroście wewnątrzkomórkowej stężenia wapnia jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami sugerującymi, że progesteron bezpośrednio aktywuje kanał wapniowy CatSper bez pośrednictwa sygnalizacji. Wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia zmierzono również w uwrażliwionych i nieuwrażliwionych plemnikach ludzkich przy użyciu cytometrii przepływowej. Przedstawiono to na reprezentatywnych wykresach rozrzutu rozproszenia przedniego i bocznego.Komórki zdolne do akrosomu są zaznaczone na niebiesko, a komórki niezdolne do akrosomu na czerwono. Wybrany bramka jest wskazana niebieską linią i tylko komórki znajdujące się w tym obszarze zostały wykorzystane do dalszej analizy. Panel B przedstawia histogram fluorescencji w kanale Fitzy dla niebarwionych plemników, a panel D przedstawia histogram fluorescencji w kanale FZ dla plemników zabarwionych flu oh 3:00 AM, zgodnie z obserwacjami w Panelu D. Rozkład wartości fluorescencji dla plemników zdolnych do akrosomu, reprezentowany przez niebieską linię, jest przesunięty w stronę wyższych wartości w porównaniu do plemników niezdolnych do akrosomu, reprezentowanych przez czerwoną linię.Panel C przedstawia histogram fluorescencji w kanale PI dla komórek niebarwionych, a panel E przedstawia histogram fluorescencji w kanale PI dla komórek martwych. Wartości fluorescencji dla każdej pojedynczej komórki można zaobserwować na przedstawionych tutaj dwuwymiarowych wykresach kropkowych fluorescencji. Dla komórek niebarwionych oraz komórek podwójnie barwionych flu oh 3:00 AM i pi, procent komórek zarejestrowanych w każdym kwadrancie jest wskazany przez czerwoną liczbę.Co ważne, sygnał pochodzący z martwych komórek może zostać wyeliminowany. Na koniec, zmianę wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia indukowaną progesteronem zmierzono w pojedynczych komórkach plemników za pomocą obrazowania; te reprezentatywne obrazy w pseudokolorach pokazują komórki wizualizowane na początku oraz po dodaniu progesteronu, CIN i chlorku manganu. Dodanie progesteronu powoduje wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia zarówno w główce plemnika, jak i w lum, natomiast chlorek manganu jest stosowany w celu zmniejszenia flu.Na rysunku przedstawiono reprezentatywne znormalizowane przebiegi fluorescencji z godziny 3:00 AM w badaniu wygaszania fluorescencji dla dziewięciu poszczególnych komórek z eksperymentu. Podobnie jak w eksperymentach populacyjnych, analiza pojedynczych komórek wykazała odpowiednio przejściowy wzrost w przypadku progesteronu oraz trwały wzrost w przypadku jonomycyny. Po opanowaniu metody, jej przeprowadzenie zajmuje od trzech do czterech godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o weryfikacji żywotności komórek oraz przeprowadzeniu odpowiednich prób kontrolnych po zakończeniu procedury. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak identyfikacja konkretnych kanałów jonowych zaangażowanych w wzrost poziomu wapnia, można zastosować inne metody, np. elektrofizjologię, wykorzystując odpowiednie roztwory i protokoły symulacyjne po ich opracowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny fizjologii komórki do badania dynamiki wapnia w żywych komórkach z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wyboru najodpowiedniejszej techniki pomiaru wzrostu poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego z wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych w dowolnym typie komórek, w zależności od konkretnego pytania badawczego, na które chcą Państwo odpowiedzieć. Należy pamiętać, że praca z ludzkimi próbkami biologicznymi może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak korzystanie z próbek od dawców o potwierdzonym stanie zdrowia, stosowanie rękawiczek lateksowych oraz właściwa utylizacja roztworów i materiałów.

measuring-intracellular-ca2-changes-human-sperm-using-four-techniques

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomiar zmian poziomu Ca2+ wewnątrz komórki plemnika człowieka za pomocą czterech technik: konwencjonalnej fluorometrii, zatrzymanego przepływu fluorometrii, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Oceniono sygnały [Ca2+]i wywołane bodźcem w pojedynczych ludzkich plemnikach. Ruchome komórki obciążono fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na Ca2+ (metodą estru AM) i unieruchomiono w komorze przepływowej. Obrazowanie komórek przeprowadzono za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej, a stymulację wykonano poprzez medium perfuzyjne. Odpowiedzi pojedynczych komórek (lub obszarów) przeanalizowano offline przy użyciu programu Excel.

Techniki obrazowania sygnalizacji Ca2+ w ludzkich plemnikach

Wapń bierze udział w licznych fizjologicznych i patofizjologicznych szlakach sygnałowych. Obrazowanie żywych komórek wymaga specjalistycznego sprzętu i może być czasochłonne. Zoptymalizowano szybką, prostą metodę wykorzystującą cytometr przepływowy do określenia względnych zmian wapnia cytozolowego w przylegających komórkach nabłonka wprowadzonych do zawiesiny.

Cytozolowe pomiary wapnia w komórkach nabłonka nerek za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy metodologie oceny integralności błony plemników, cechy komórkowej związanej z kompetencją zapłodnienia plemników. Opisujemy trzy techniki fluorymetrycznej oceny błon plemników: jednoczesne barwienie za pomocą specyficznych sond fluorescencyjnych, mikroskopię fluorescencyjną oraz zaawansowaną cytometrię przepływową dedykowaną plemnikom. Przedstawiono również przykłady łączenia metodyk.

Techniki fluorymetryczne do oceny błon plemników

Tutaj opisane są dwa średnioprzepustowe testy do oceny wpływu na sygnalizację Ca2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich. Testy te można wykorzystać do szybkiego i łatwego badania przesiewowego dużych ilości związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2 + i reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach.

Średnioprzepustowe testy przesiewowe do oceny wpływu na sygnalizacjęCa2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich

Protokół ten opisuje, jak przeprowadzać rejestracje elektryczne z komórek plemników ssaków w konfiguracji całej komórki, z celem bezpośredniego rejestrowania aktywności kanałów jonowych. Metoda ta odegrała kluczową rolę w opisie elektrofizjologicznych profili kilku kanałów jonowych plemników i pomogła ujawnić ich tożsamość molekularną oraz regulację.

Rejestrowanie prądów elektrycznych przez błonę plazmatyczną plemników ssaków

Obecny protokół dostarcza praktycznego rozwiązania, które pozwala na pomiar apoptozy, potencjału błony mitochondrialnej i uszkodzeń DNA w plemnikach ludzkich za pomocą pojedynczego cytometru.

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów do wykrywania wad funkcjonalnych plemników ludzkich

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Opisano wydajną metodę otrzymywania wysokiej czystości żywych frakcji meiotycznych z jądra myszy, która łączy udoskonalony protokół dysocjacji komórek z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS). Metoda ta wykorzystuje różnice w zawartości DNA oraz gęstości jąder poszczególnych frakcji meiotycznych.

Oczyszczanie komórek meiotycznych myszy metodą cytometrii przepływowej

Śledzenie subtelnych zmian w progresji i kinetyce etapów cyklu komórkowego można przeprowadzić, stosując połączenie metabolicznego znakowania kwasów nukleinowych BrdU oraz barwienia całkowitej genomowej DNA jodeczkiem propidyny. Metoda ta eliminuje konieczność chemicznej synchronizacji dzielących się komórek, zapobiegając tym samym wprowadzaniu nieswoistych uszkodzeń DNA, które z kolei wpływają na przebieg cyklu komórkowego.

Pomiar kinetyki progresji cyklu komórkowego z wykorzystaniem znakowania metabolicznego i cytometrii przepływowej

Skuteczne zastosowanie barwników do śledzenia komórek w celu monitorowania funkcji i proliferacji komórek odpornościowych obejmuje kilka krytycznych etapów. Opisujemy metody: 1) uzyskiwania jasnego, jednorodnego i powtarzalnego znakowania barwnikami błonowymi; 2) wyboru fluorochromów i warunków akwizycji danych; oraz 3) wyboru modelu do ilościowego określania proliferacji komórek na podstawie rozcieńczenia barwnika.

Zoptymalizowane metody barwienia i modelowania proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników do śledzenia komórek

Poznaj cztery techniki pomiaru wewnątrzkomórkowych zmian Ca²⁺ w ludzkich plemnikach: fluorometrię konwencjonalną, fluorometrię zatrzymanego przepływu, cytometrię przepływową i obrazowanie pojedynczych komórek.

Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca²⁺ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Przeglądaj więcej filmów