Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca²⁺ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar wewnątrzkomórkowych wahań stężenia wapnia w ludzkich plemnikach za pomocą barwników fluorescencyjnych. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie próbki nasienia metodą swim up i, jeśli to konieczne, promowanie pojemności. Drugim krokiem jest załadowanie plemników barwnikiem fluorescencyjnym wapnia.

Następnie, stosując konwencjonalną fluorometrię zatrzymanego przepływu, cytometrię przepływową lub obrazowanie pojedynczych komórek, wykonaj eksperyment i zapisz pomiary wapnia. Ostatecznie wyniki są analizowane w celu określenia zmian wewnątrzkomórkowych stężeń wapnia wywołanych przez progesteron lub podczas procesu kapacytacji. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak te z udziałem radioaktywności, jest to, że jest to bardzo czuła procedura.

Jest bezpieczny i łatwy do wykonania. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji wapniowej SPR, takie jak identyfikacja związków indukujących wewnątrzkomórkowy wapń, wzrost dzięki wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej oraz identyfikacja różnych subpopulacji komórkowych w próbce siemena. Implikacje stosowania np. techniki cytometrii przepływowej rozciągają się w kierunku diagnostyki problemów z płodnością poprzez analizę stanu fizjologicznego gamutów męskich.

Mimo że metoda ta może dostarczyć wglądu w badanie mobilizacji wapnia w ludzkich plemnikach, może być również stosowana do innych typów komórek, takich jak męskie gamuty innych gatunków lub różne typy komórek, takie jak neurony lub komórki mięśniowe. Ogólnie rzecz biorąc, osoby korzystające z tej metody będą miały trudności, ponieważ obsługa plemników nie jest łatwa i ważne jest utrzymanie odpowiednich warunków, aby uzyskać żywe i motoryczne komórki w wyniku eksperymentu. Wykorzystanie tych technik wdrożyliśmy łącząc strategie z wykorzystaniem różnych dziedzin.

Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ przygotowanie i obchodzenie się z próbką, a także dodawanie związków są trudne do nauczenia, ponieważ plemniki mogą zostać uszkodzone podczas zabiegu, a artefakty w odpowiedziach można uzyskać podczas edycji związków. Aby przygotować próbkę nasienia, jeden mililitr pożywki z szynki F 10 musi być ostrożnie ułożony warstwami na każdym 500 mikrolitrach skroplonego nasienia. Eloqua, dotknąć ścianki probówki końcówką mikropipety i delikatnie dozować pożywkę nad próbką.

Ważne jest, aby robić to powoli, aby uniknąć mieszania się próbki i warstwy podłoża. Pożywkę uzupełnia się dwoma milimolowymi chlorkami wapnia i pięcioma miligramami na mililitr BSA. Aby ułatwić uzyskanie pojemności in vitro, ostrożnie pochyl rurki pod kątem około 30 stopni.

Zwiększy to powierzchnię między dwiema cieczami, zwiększając w ten sposób przemieszczanie lub pływanie plemników z próbki do pożywki podczas inkubacji. Następnie umieść chude probówki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. 95% powietrza przez godzinę po godzinie.

Za pomocą mikropipety ostrożnie usuń z każdej probówki górne 700 mikrolitrów pożywki z szynki F 10, która zawiera teraz plemniki motylowe. Zbierz wszystkie pobrane próbki w jednej czystej szklanej probówce, unikając tworzenia się pęcherzyków. Umieścić 10 mikrolitrów próbki zbiorczej na płaskim szkle optycznym podstawy komory zliczania plamek żółtych i umieścić szkło nakrywkowe.

Upewnij się, że nie tworzysz się pęcherzyków wewnątrz komory, ponieważ spowodowałoby to niedokładną liczbę komórek. Obserwuj pod mikroskopem złożonym wyposażonym w obiektyw 20x. Szkło nakrywkowe komory liczenia plamek żółtych ma duży kwadrat złożony ze 100 mniejszych kwadratów.

Policz komórki w dowolnym pasku 10 kwadratów. Liczba ta reprezentuje stężenie komórek w milionach komórek na mililitr. Powtórz liczenie w dwóch dodatkowych 10 kwadratowych paskach i oblicz średnią z trzech zliczeń, aby obciążyć komórki barwnikiem fluorescencyjnym.

Połączyć w 1,5 mililitrowej probówce fuge wymaganą objętość zawiesiny nasienia z wystarczającą ilością jednego milimolowego roztworu podstawowego grypy o 3:00 rano, aby uzyskać końcowe stężenie dwóch mikromolowych grypy o 3:00 rano, inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i chronić przed światłem, odwirować probówkę o stężeniu 750 G przez pięć minut. Tworzenie się chmury, a nie osadu, wskazuje, że komórki są w dobrym stanie, odessują i odrzucają supernatant oraz ponownie zawieszają osad w odpowiedniej objętości pożywki dla nasienia ludzkiego lub HSM. Aby rozpocząć ten eksperyment, połącz w szklanej probówce z płaskim dnem 570 mikrolitrów HSM i 30 mikrolitrów zawiesiny plemników uprzednio załadowanej grypą o 3:00 nad ranem i ponownie zawieszonej w HSM, aby uzyskać od 10 do 8 komórek na mililitr.

Umieść mieszadło magnetyczne wewnątrz szklanej rurki i włóż rurkę do komory odczytu spektrometru nagrzanego do 37 stopni Celsjusza. Próbka musi być mieszana przez cały czas pobierania. Rozpocznij eksperyment za pomocą oprogramowania oli i przystąp do uzyskiwania wartości fluorescencji z częstotliwością 0,5 herca przez 300 sekund.

Po uzyskaniu podstawowej fluorescencji przez 30 sekund, należy użyć strzykawki Hamilton Micro, aby wstrzyknąć odpowiednią objętość badanego związku, w tym przypadku dla progesteronu mikromolowego, po 100 sekundach. Przy 20 jonach mikromolowych mycyna jako kontrola pozytywna w celu uzyskania maksymalnej wartości fluorescencji. W tym eksperymencie wewnątrzkomórkowe zmiany wapnia są mierzone z wysoką rozdzielczością czasową.

Używając mieszalnika SFM 20 z zatrzymanym przepływem sprzężonego z wściekłym układem optycznym kinetycznym, napełnij jedną ze strzykawek instrumentu jednym mililitrem grypy. 3:00 rano załadowane plemniki, a drugą strzykawkę jednym mililitrem badanego związku. 20 mikromolowy progesteron rozpuszczony w HSM.

W tym przykładzie bardzo ważne jest, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków podczas pobierania płynów do strzykawek. Podnieś oba tłoki instrumentu, aż dotkną końcówki tłoków strzykawki. Ustaw całkowity czas próbkowania w tym przypadku na 50 sekund, a częstotliwość na 10 milisekund, aby zminimalizować uszkodzenie ogniwa, ustaw natężenie przepływu na minimalną wartość, która zapewni mierzalny wyzwalacz odpowiedzi.

Mieszanie odczynników, ślad surowej fluorescencji w porównaniu z tymiankiem zostanie wyświetlony na ekranie komputera. Powtórz tę procedurę, zastępując progesteron HSM jako kontrolę ujemną i mycynę jonów 10 mikromolowych jako kontrolę pozytywną przed cytometrią przepływową. Przygotować próbki doświadczalne, umieszczając 500 mikrolitrów zawiesiny komórek na probówkę cytometru w każdych warunkach, które mają być badane.

Skonfiguruj eksperyment za pomocą oprogramowania sprzętowego. Najpierw utwórz nowy folder, próbkę eksperymentalną i liczbę probówek. Następnie wybierz odpowiednie ustawienia cytometru dla grypy O 3:00 AM. Stosować filtry izotiocyjanianu fluoresceiny i jodku propidyny.

Uruchom niezabarwione probówki kontrolne pierwszą i drugą w cytometrze. Zbierz dane rozproszenia do przodu i z boku, aby sprawdzić, czy ustawienia progowe są odpowiednie i utworzyć odpowiednią bramkę w celu odróżnienia zanieczyszczeń od komórek. Uruchom probówki eksperymentalne i zbierz dane fluorescencyjne z 10 000 zdarzeń na próbkę.

Na końcu. Eksportuj wszystkie dane do oprogramowania dostępnego do analizy. Przygotuj okrągłe szkiełka nakrywkowe potrzebne do tej procedury, nakładając pięciomikrolitrową kroplę roztworu poli L lizyny na środek każdego szkiełka nakrywkowego.

Pozostaw na co najmniej godzinę przed użyciem, aby spłukać leczony obszar wodą. Spowoduje to usunięcie nadmiaru polilizyny i pozwoli plemnikom przylgnąć do szkiełka nakrywkowego z głowy, podczas gdy ich wici mogą się nadal poruszać. Zamontuj szkiełko nakrywkowe w komorze nagrywania.

Umieść 10 mikrolitrów komórek obciążonych grypą o 3:00 w nocy w stężeniu od jednego razy 10 do siódmych komórek na mililitr. Na środku szkiełka nakrywkowego. Przykryj komórki 200 mikrolitrami wstępnie podgrzanego HSM.

Umieść komorę na stoliku mikroskopu, podgrzanym do 37 stopni Celsjusza, i obejrzyj komórki za pomocą kontrastu fazowego. Wybierz obszar, w którym gęstość komórek jest odpowiednia do obrazowania. Zbyt wiele komórek utrudnia analizę ze względu na nakładające się sygnały.

Komórki powinny być mocno przymocowane do szkiełka nakrywkowego za głowę, ale wykazują ruch wici, co potwierdza żywotność. Rozpocznij eksperyment, aktywując oprogramowanie do akwizycji obrazów szeregów czasowych. Zazwyczaj wymagane są cztery obrazy na sekundę przy oświetleniu wynoszącym dwie milisekundy na obraz.

Rejestruj obrazy fluorescencyjne w trybie na żywo. Aby dostosować ostrość i jasność. Użyj mikropipety, aby ostrożnie dodać kroplami badany związek progesteron, w tym przypadku i kontynuuj akwizycję obrazu w razie potrzeby.

Wykonaj dwa sekwencyjne dodawanie kontrolne do tej samej komory. 20 mikromolowych jonów mycyny w celu uzyskania maksymalnej fluorescencji i pięciu milimolowych chlorków manganu w celu uzyskania minimalnej fluorescencji. Wykonuj analizę obrazu w trybie offline za pomocą oprogramowania IQ.

Narysuj obszary zainteresowania lub obszary zainteresowania wokół każdej komórki lub części komórki. Ponadto wybierz obszar wolny od komórek, który ma być automatycznie odejmowany przez oprogramowanie. Następnie uzyskuje się szereg intensywności fluorescencji w czasie dla każdego zwrotu z inwestycji, a dane te można wyeksportować do programu Microsoft Excel w celu dalszej analizy.

Progesteron jest jednym ze znanych induktorów reakcji akrosomów i zgodnie z oczekiwaniami wywołuje przejściowy wewnątrzkomórkowy wzrost stężenia wapnia w ludzkich plemnikach, mierzony za pomocą konwencjonalnej fluorometrii. Ślad czerwonej fluorescencji w funkcji czasu pokazuje wewnątrzkomórkowe zmiany stężenia wapnia spowodowane dodaniem czterech mikromolowych progesteronów jako kontroli ujemnej HSM, która nie spowodowała żadnej zmiany w wewnątrzkomórkowych poziomach stężenia wapnia, jak wskazuje niebieski ślad fluorescencji jako kontrola pozytywna. Zmiana wywołana przez 10-mikromolową mycynę jonową jest pokazana dla każdego śladu.

Dodatek tego jonoforu wapnia powoduje maksymalny wzrost stężenia wapnia w komórkach RA, który nie wraca do poziomu podstawowego. Ten wykres słupkowy pokazał średnią zmianę fluorescencji delta F z każdego warunku, plus lub minus błąd standardowy, gdzie N jest równe trzy, a gwiazdka wskazuje wartość P mniejszą niż 0,001 w porównaniu z kontrolą. Indukowany progesteronem wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia mierzono z większą rozdzielczością czasową za pomocą fluorometrii zatrzymanego przepływu, a reprezentatywne wyniki przedstawiono tutaj.

Surowe ślady są pokazane w panelu A, zarówno progesteron reprezentowany przez czerwoną linię, jak i jonowa mycyna reprezentowana przez niebieską linię powodowały szybki wewnątrzkomórkowy wzrost stężenia wapnia. Zielony ślad to kontrola ujemna, w której komórki zostały zmieszane z HSM. Panel B pokazuje skorygowane ślady dla sygnałów indukowanych progesteronem lub mycyną jonową otrzymanych przez odjęcie sygnału sterującego od odpowiadających im sygnałów surowych.

Progesteron powodował bardzo szybki i przejściowy wzrost stężenia wapnia w komórkach, przy czym maksymalna wartość fluorescencji występowała 2,7 sekundy po dodaniu cewki indukcyjnej. Z drugiej strony, CIN spowodował szybki i trwały wzrost stężenia wapnia w komórkach w ciągu 50 sekund. Wstawka w panelu B pokazuje rozszerzony widok pierwszych 500 milisekund dla każdej odpowiedzi.

Brak opóźnienia w wewnątrzkomórkowym wzroście stężenia wapnia wywołanym progesteronem jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami sugerującymi, że progesteron bezpośrednio aktywuje ostrogę kanału wapniowego bez sygnalizacji pośredniej. Wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia mierzono również w zpojemnościowych i niepojemnościowych plemnikach ludzkich za pomocą cytometrii przepływowej. Na tych reprezentatywnych wykresach punktowych do przodu i z boku.

Ogniwa pojemnościowe są oznaczone kolorem niebieskim, a ogniwa niepojemnościowe kolorem czerwonym. Wybrana bramka jest oznaczona niebieską linią i tylko komórki w tym obszarze zostały wykorzystane do dalszej analizy. Panel B pokazuje histogram fluorescencji w kanale Fitzy od niebarwionych plemników, a panel D pokazuje histogram fluorescencji w kanale FZ z plemników barwionych grypą o 3:00 AM, jak zaobserwowano w Panelu D. Rozkład wartości fluorescencji dla plemników kafekultatowanych reprezentowanych przez niebieski ślad jest przesunięty do wyższych wartości w porównaniu z plemnikami bez pojemności reprezentowanymi przez czerwony ślad.

Panel C pokazuje histogram fluorescencji w kanale PI z niebarwionych komórek, a panel E pokazuje histogram fluorescencji w kanale PI z martwych komórek. Wartości fluorescencji dla każdej pojedynczej komórki można zaobserwować na dwuwymiarowych wykresach kropkowych fluorescencji pokazanych tutaj. W przypadku komórek niebarwionych i komórek podwójnie barwionych grypą oh 3:00 AM i liczbą pi, procent komórek zarejestrowanych w każdym kwadrancie jest oznaczony czerwoną liczbą.

Co ważne, sygnał powstający z martwych komórek może zostać wyeliminowany. Wreszcie, indukowaną progesteronem wewnątrzkomórkową zmianę stężenia wapnia mierzono w pojedynczych plemnikach poprzez obrazowanie tych reprezentatywnych pseudokolorowych obrazów pokazujących komórki uwidocznione na początku i po dodaniu progesteronu, CIN i chlorku manganu. Dodanie progesteronu powoduje wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, zarówno w główce plemnika, jak i w lum chlorku manganu stosuje się w celu zmniejszenia grypy.

Oh 3:00 AM fluorescencja przez wygaszanie reprezentatywnych znormalizowanych śladów fluorescencji dziewięciu pojedynczych komórek z eksperymentu pokazano na tym rysunku. Jak zaobserwowano w eksperymentach populacyjnych, analiza pojedynczych komórek wykazała przejściowy i trwały wzrost odpowiednio progesteronu i mycyny jonowej. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zweryfikowaniu żywotności komórek i wykonaniu odpowiednich kontroli Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak elektrofizjologia, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak identyfikacja określonych kanałów jonowych zaangażowanych we wzrost wapnia przy użyciu roztworów proppe i protokołów symulacji po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się fizjologią komórek do zbadania dynamiki wapnia w żywych komórkach z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wybrać najbardziej odpowiednią technikę pomiaru wewnątrzkomórkowego wzrostu wapnia za pomocą fluorescencji w dowolnym typie komórki, w zależności od konkretnego pytania, na które chciałbyś odpowiedzieć. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi próbkami Siemen może być niebezpieczna i środki ostrożności, takie jak korzystanie z dawców o udowodnionym zdrowiu. Podczas wykonywania tego zabiegu należy zawsze zachować stosowanie kul lateksowych oraz odpowiednią utylizację roztworu i materiałów.