Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca²⁺ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar wewnątrzkomórkowych fluktuacji wapnia w ludzkich plemnikach przy użyciu barwników fluorescencyjnych. Jest to realizowane poprzez wstępne przygotowanie próbki nasienia metodą swim-up i, w razie potrzeby, indukcję kapacytacji. Drugim krokiem jest załadowanie plemników fluorescencyjnego barwnika wapnia.

Następnie, wykorzystując konwencjonalną fluorometrię, fluorometrię z zatrzymanym przepływem (stopped flow), cytometrię przepływową lub obrazowanie pojedynczych komórek, przeprowadza się eksperyment i rejestruje pomiary wapnia. Ostatecznie wyniki są analizowane w celu określenia zmian w wewnątrzkomórkowych stężeniach wapnia wywołanych przez progesteron lub występujących podczas procesu kapacytacji. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak te wykorzystujące radioaktywność, jest fakt, że jest to procedura o bardzo wysokiej czułości.

Metoda ta jest bezpieczna i łatwa w wykonaniu. Może ona pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji wapniowej w SPR, takie jak identyfikacja związków indukujących wzrost poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową oraz identyfikacja różnych subpopulacji komórkowych w próbce nasienia. Zastosowanie, na przykład, techniki cytometrii przepływowej znajduje odzwierciedlenie w diagnostyce problemów z płodnością poprzez analizę stanu fizjologicznego gamet męskich.

Mimo że metoda ta pozwala na zgłębienie mobilizacji wapnia w ludzkich plemnikach, można ją zastosować również do innych rodzajów komórek, takich jak gamety męskie innych gatunków lub inne typy komórek, na przykład neurony czy komórki mięśniowe. Zazwyczaj osoby stosujące tę metodę napotykają trudności, ponieważ obsługa plemników nie jest łatwa i kluczowe jest utrzymanie odpowiednich warunków, aby przez cały czas trwania eksperymentu komórki pozostawały żywotne i ruchliwe. Wdrożyliśmy zastosowanie tych technik, łącząc strategie z różnych dziedzin.

Wizualna demonstracja tej metody jest istotna, ponieważ przygotowanie i obchodzenie się z próbką, a także dodawanie związków są trudne do opanowania, gdyż komórki plemników mogą ulec uszkodzeniu podczas procedury, a podczas dodawania związków mogą powstać artefakty w odpowiedziach. Aby przygotować próbkę plemników, jeden mililitr medium hams F 10 należy ostrożnie nanieść warstwowo na wierzch każdego 500 µl upłynnionego nasienia. Należy dotknąć ścianki probówki końcówką mikropipety i delikatnie dozować medium nad próbką.

Kluczowe jest, aby wykonywać tę czynność powoli, aby uniknąć zmieszania warstw próbki i medium. Medium jest uzupełnione o 2 mM chlorku wapnia oraz 5 mg/mL BSA. Aby wspomóc kapacytację in vitro, należy ostrożnie przechylić probówki pod kątem około 30 stopni.

Zwiększy to powierzchnię styku między dwoma cieczami, co usprawni przemieszczanie się lub wypływanie plemników z próbki do medium podczas inkubacji. Następnie należy umieścić nachylone probówki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i atmosferze 5% carbon dioxide oraz 95% air na jedną godzinę.

Za pomocą mikropipety ostrożnie pobierz z każdej probówki górne 700 µL pożywki hams F 10, w której znajdują się obecnie ruchliwe plemniki. Połącz wszystkie zebrane próbki w jednej czystej probówce szklanej, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Nanieś 10 µL połączonej próbki na płaskie szkło optyczne podstawy komory licznikowej Macleod i nałóż szkiełko nakrywkowe.

Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza wewnątrz komory, ponieważ mogłoby to doprowadzić do uzyskania niedokładnej liczby komórek. Obserwację należy przeprowadzić pod mikroskopem złożonym wyposażonym w obiektyw 20 x. Szkiełko nakrywkowe komory licznikowej posiada duży kwadrat składający się ze 100 mniejszych kwadratów.

Policz komórki w dowolnym pasie 10 kwadratów. Liczba ta reprezentuje stężenie komórek w milionach komórek na mililitr. Powtórz liczenie w dwóch dodatkowych pasach po 10 kwadratów i oblicz średnią z trzech pomiarów, aby przystąpić do obciążania komórek barwnikiem fluorescencyjnym.

W probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml połączyć wymaganą objętość zawiesiny plemników z odpowiednią ilością 1 mM roztworu stokowego Fluo-3 AM, aby uzyskać końcowe stężenie 2 µM Fluo-3 AM. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem. Wirować probówkę przy 750 ×g przez pięć minut. Powstanie obłoku zamiast zbitego osadu świadczy o dobrym stanie komórek. Odessać i odrzucić nadsącz, a następnie resuspender osad w odpowiedniej objętości pożywki dla ludzkich plemników (human sperm medium, HSM). Aby rozpocząć eksperyment, połączyć w szklanej probówce z płaskim dnem 570 µL HSM oraz 30 µL zawiesiny komórek plemników uprzednio załadowanych Fluo-3 AM i resuspenderowanych w HSM, aby uzyskać stężenie 1 × 10⁸ komórek/ml.

Włożyć mieszadło magnetyczne do szklanej probówki, a następnie wprowadzić probówkę do komory pomiarowej spektrometru wstępnie podgrzanego do 37 °C. Próbka musi być mieszana przez cały czas trwania pomiaru. Rozpocząć eksperyment za pomocą oprogramowania oli i przystąpić do pomiaru wartości fluorescencji z częstotliwością 0,5 Hz przez 300 sekund.

Po zarejestrowaniu fluorescencji bazowej przez 30 sekund, należy użyć mikrostrzykawki Hamiltona, aby w 100 sekundzie wstrzyknąć odpowiednią objętość związku testowego – w tym przypadku progesteronu o stężeniu mikromolarnym. W celu uzyskania maksymalnej wartości fluorescencji, jako kontrolę pozytywną, należy zastosować ionomycin w stężeniu 20 µM. W tym eksperymencie zmiany stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego są mierzone z wysoką rozdzielczością czasową.

Używając miksera przepływu zatrzymanego SFM 20 połączonego z optycznym systemem do kinetyki szybkiej, należy napełnić jedną z strzykawek urządzenia jednym mililitrem komórek plemników załadowanych o 3:00 rano, a drugą strzykawką jednym mililitrem badanego związku: 20 µM progesteronu rozpuszczonego w HSM.

W tym przykładzie kluczowe jest unikanie powstawania pęcherzyków powietrza podczas nabierania cieczy do strzykawek. Podnieś tłoki obu instrumentów, aż dotkną końcówek tłoków strzykawek. W tym przypadku ustaw całkowity czas próbkowania na 50 seconds, a częstotliwość na 10 milliseconds, aby zminimalizować uszkodzenia komórek; prędkość przepływu ustaw na minimalną wartość, która zapewni mierzalny sygnał wyzwalający.

Po zmieszaniu odczynników na ekranie komputera zostanie wyświetlona krzywa surowej fluorescencji w funkcji czasu. Powtórz tę procedurę, zastępując progesteron medium HSM jako kontrolą ujemną oraz 10 µM ionomycyny jako kontrolą dodatnią przed przeprowadzeniem cytometrii przepływowej. Przygotuj próbki eksperymentalne, umieszczając po 500 µL zawiesiny komórkowej w probówce do cytometru dla każdego badanego wariantu.

Skonfiguruj eksperyment za pomocą oprogramowania sprzętowego. Najpierw utwórz nowy folder, okaz eksperymentalny i określ liczbę probówek. Następnie wybierz odpowiednie ustawienia cytometru dla flu O 3:00 AM. Użyj filtrów dla izotiocyjanianu fluoresceiny i jodku propidyny.

Przeanalizuj w cytometrze niebarwione probówki kontrolne jeden i dwa. Zbierz dane dotyczące rozproszenia światła w przód (forward scatter) oraz prostopadle (side scatter), aby zweryfikować poprawność ustawień progu oraz stworzyć odpowiednią bramkę w celu odróżnienia detrytusu od komórek. Przeanalizuj probówki eksperymentalne i zbierz dane fluorescencji z 10 000 zdarzeń na próbkę.

Na koniec wyeksportuj wszystkie dane do oprogramowania dostępnego do analizy. Przygotuj okrągłe szkiełka nakrywkowe niezbędne do tej procedury, nakładając kroplę 5 µL roztworu poli-L-lizyny na środek każdego szkiełka.

Pozostawić na co najmniej jedną godzinę; przed użyciem wypłukać obszar poddany obróbce wodą. Usunie to nadmiar polilizyny i pozwoli plemnikom przytwierdzić się do szkiełka nakrywki za pomocą główek, podczas gdy ich flagella będą mogły nadal się poruszać. Zamontować szkiełko nakrywkę wewnątrz komory rejestrującej.

Nanieś 10 µL zawiesiny naładowanych komórek flu oh 3:00 AM w stężeniu 1 × 10⁷ komórek/mL na środek szkiełka podstawowego. Przykryj komórki 200 µL uprzednio ogrzanego medium HSM.

Umieść komorę na stoliku mikroskopu, uprzednio podgrzanym do 37 °C, i obserwuj komórki w kontraście fazowym. Wybierz obszar, w którym gęstość komórek jest odpowiednia do obrazowania. Zbyt duża liczba komórek utrudnia analizę ze względu na nakładanie się sygnałów.

Komórki powinny być ściśle przytwierdzone do szkiełka podstawowego za pomocą głowy, lecz wykazywać ruch wici, co potwierdza ich żywotność. Eksperyment należy rozpocząć od aktywacji oprogramowania do akwizycji obrazów w serii czasowej. Zazwyczaj wymagane jest wykonanie czterech obrazów na sekundę przy czasie naświetlania wynoszącym dwie milisekundy na obraz.

Należy pozyskać obrazy fluorescencyjne w trybie na żywo. Dostosuj ostrość oraz jasność obrazu. Za pomocą mikropipety ostrożnie, kroplami, dodaj badany związek (w tym przypadku progesteron) i kontynuuj akwizycję obrazów zgodnie z potrzebami.

Wykonaj dwa sekwencyjne dodatki kontrolne do tej samej komory. 20 µM ionomycin w celu uzyskania maksymalnej fluorescencji oraz 5 mM chlorku manganu w celu uzyskania minimalnej fluorescencji. Przeprowadź analizę obrazów w trybie offline przy użyciu oprogramowania IQ.

Wyznacz obszary zainteresowania (ROI) wokół każdej komórki lub jej fragmentu. Dodatkowo wybierz obszar wolny od komórek w celu automatycznego odjęcia tła przez oprogramowanie. Następnie dla każdego ROI uzyskuje się serię czasową intensywności fluorescencji, a dane te można wyeksportować do programu Microsoft Excel w celu dalszej analizy.

Progesteron jest jednym ze znanych induktorów reakcji akrosomalnej i, zgodnie z oczekiwaniami, wywołuje przejściowy wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w ludzkich plemnikach, co zmierzono za pomocą konwencjonalnej fluorometrii. Czerwony ślad fluorescencji w funkcji czasu pokazuje zmiany stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego spowodowane dodaniem 4 µM progesteronu; jako kontrolę negatywną dodano HSM, który nie wywołał żadnych zmian w poziomach stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego, co wskazuje niebieski ślad fluorescencji. Dla każdego śladu pokazano zmianę wywołaną przez 10 µM jonomycyny jako kontrolę pozytywną.

Dodanie tego jonoforu wapniowego powoduje maksymalny wzrost stężenia wapnia w komórkach RA, który nie powraca do poziomów podstawowych. Ten wykres słupkowy przedstawia średnią zmianę fluorescencji delta F dla każdego warunku, plus lub minus błąd standardowy, gdzie N wynosi trzy, a gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,001 w porównaniu z kontrolą. Wzrost stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego indukowany progesteronem został zmierzony z większą rozdzielczością czasową za pomocą fluorometrii stop-flow, a reprezentatywne wyniki przedstawiono tutaj.

Surowe zapisy przedstawiono na panelu A; zarówno progesteron (linia czerwona), jak i jonomycyna (linia niebieska) wywołały szybki wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Zielony zapis to kontrola negatywna, w której komórki zmieszano z HSM. Panel B przedstawia skorygowane zapisy sygnałów wywołanych progesteronem lub jonomycyną, uzyskane poprzez odjęcie sygnału kontrolnego od odpowiadających im sygnałów surowych.

Progesteron wywołał bardzo szybki i przejściowy wzrost wewnątrzkomórkowej stężenia wapnia, przy czym maksymalna wartość fluorescencji wystąpiła 2,7 sekundy po dodaniu induktora. Z kolei CIN spowodował szybki i trwały wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia utrzymujący się przez 50 sekund. Wstawka w panelu B przedstawia powiększony widok pierwszych 500 milisekund dla każdej z odpowiedzi.

Brak opóźnienia w indukowanym przez progesteron wzroście wewnątrzkomórkowej stężenia wapnia jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami sugerującymi, że progesteron bezpośrednio aktywuje kanał wapniowy CatSper bez pośrednictwa sygnalizacji. Wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia zmierzono również w uwrażliwionych i nieuwrażliwionych plemnikach ludzkich przy użyciu cytometrii przepływowej. Przedstawiono to na reprezentatywnych wykresach rozrzutu rozproszenia przedniego i bocznego.

Komórki zdolne do akrosomu są zaznaczone na niebiesko, a komórki niezdolne do akrosomu na czerwono. Wybrany bramka jest wskazana niebieską linią i tylko komórki znajdujące się w tym obszarze zostały wykorzystane do dalszej analizy. Panel B przedstawia histogram fluorescencji w kanale Fitzy dla niebarwionych plemników, a panel D przedstawia histogram fluorescencji w kanale FZ dla plemników zabarwionych flu oh 3:00 AM, zgodnie z obserwacjami w Panelu D. Rozkład wartości fluorescencji dla plemników zdolnych do akrosomu, reprezentowany przez niebieską linię, jest przesunięty w stronę wyższych wartości w porównaniu do plemników niezdolnych do akrosomu, reprezentowanych przez czerwoną linię.

Panel C przedstawia histogram fluorescencji w kanale PI dla komórek niebarwionych, a panel E przedstawia histogram fluorescencji w kanale PI dla komórek martwych. Wartości fluorescencji dla każdej pojedynczej komórki można zaobserwować na przedstawionych tutaj dwuwymiarowych wykresach kropkowych fluorescencji. Dla komórek niebarwionych oraz komórek podwójnie barwionych flu oh 3:00 AM i pi, procent komórek zarejestrowanych w każdym kwadrancie jest wskazany przez czerwoną liczbę.

Co ważne, sygnał pochodzący z martwych komórek może zostać wyeliminowany. Na koniec, zmianę wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia indukowaną progesteronem zmierzono w pojedynczych komórkach plemników za pomocą obrazowania; te reprezentatywne obrazy w pseudokolorach pokazują komórki wizualizowane na początku oraz po dodaniu progesteronu, CIN i chlorku manganu. Dodanie progesteronu powoduje wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia zarówno w główce plemnika, jak i w lum, natomiast chlorek manganu jest stosowany w celu zmniejszenia flu.

Na rysunku przedstawiono reprezentatywne znormalizowane przebiegi fluorescencji z godziny 3:00 AM w badaniu wygaszania fluorescencji dla dziewięciu poszczególnych komórek z eksperymentu. Podobnie jak w eksperymentach populacyjnych, analiza pojedynczych komórek wykazała odpowiednio przejściowy wzrost w przypadku progesteronu oraz trwały wzrost w przypadku jonomycyny. Po opanowaniu metody, jej przeprowadzenie zajmuje od trzech do czterech godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o weryfikacji żywotności komórek oraz przeprowadzeniu odpowiednich prób kontrolnych po zakończeniu procedury. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak identyfikacja konkretnych kanałów jonowych zaangażowanych w wzrost poziomu wapnia, można zastosować inne metody, np. elektrofizjologię, wykorzystując odpowiednie roztwory i protokoły symulacyjne po ich opracowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny fizjologii komórki do badania dynamiki wapnia w żywych komórkach z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wyboru najodpowiedniejszej techniki pomiaru wzrostu poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego z wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych w dowolnym typie komórek, w zależności od konkretnego pytania badawczego, na które chcą Państwo odpowiedzieć. Należy pamiętać, że praca z ludzkimi próbkami biologicznymi może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak korzystanie z próbek od dawców o potwierdzonym stanie zdrowia, stosowanie rękawiczek lateksowych oraz właściwa utylizacja roztworów i materiałów.