Rekombinowanie homologicznych konstruktów rekombinacji u Drosophila

Ogólnym celem tej procedury jest szybkie wygenerowanie dużych homologicznych wektorów rekombinacji, które można wykorzystać do celowania i manipulowania endogennymi loci oph. Osiąga się to poprzez wybór najpierw klonu wstecznego, obejmującego interesujący nas region genomu. Drugim krokiem procedury jest sklonowanie ramion homologii do homologicznego wektora rekombinacji.

Trzecim krokiem jest sklonowanie genomowego DNA do homologicznego wektora rekombinacji za pomocą naprawy luki. Ostatnim krokiem jest zastąpienie regionu genomowego kasetą celowniczą. Ostatecznie procedury te pozwolą na opracowanie wektora docelowego dla rekombinacji homologicznej Enzo w celu wygenerowania jednoznacznych mutacji zerowych lub znakowania białek endogennych u drosophila poprzez zastosowanie technik opartych na rekombinacji.

Dodatkowo, pisemny manuskrypt zawiera również protokół mobilizacji tych kaset in vivo w celu wygenerowania nokautu lub znakowanego genu za pomocą knockiny. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że można ją łatwo zastosować do wielu celów równolegle i zapewnia środki do manipulowania genomem oph w odpowiednim czasie i w skuteczny sposób. Aby osiągnąć ten cel, nasze metody łączą technologie rekombinacji i bramki w celu wygenerowania wektorów rekombinacji homo.

W przeciwieństwie do konwencjonalnych ograniczeń w klonowaniu ligazy, technologie te nie są ograniczone rozmiarem ani sekwencją DNA, co ułatwia proces klonowania. Chociaż protokół ten opisuje metodę generowania kasety celującej w nokaut genu, może być również używany do manipulowania dowolnym endogennym locus w praktycznie każdy pożądany sposób. Obejmuje to znakowanie genu będącego przedmiotem zainteresowania, zastąpienie interesującego genu GAL cztery lub wygenerowanie linii obcinania białka lub linii reporterowych Aby uzyskać plecy z genem zainteresowania, którym jest CG 3 2 0 9 5.

W tym przykładzie otwórz wyszukiwanie gene@flybased.org. Aby uzyskać listę pleców. Zajrzyj do sekcji dotyczącej zapasów i odczynników i sprawdź sekcję zatytułowaną klony genomowe.

Z dostępnych opcji znajdź klon, który zawiera co najmniej 10 kilozasad przed i pięć kilozasad za genem, który Cię interesuje. Regiony te są używane jako ramiona homologii. Można to zrobić, ustawiając pięć sekwencji pierwszego końca i trzy sekwencje pierwszego końca grzbietu do genomu drosophila.

Alternatywnie klony w wektorze Pac-Man mogą być również found@pacmanfly.org. Teraz wybierz startery, aby wzmocnić 500 par zasad na końcu każdego z ramion homologii. Te fragmenty zwane LA i RA są używane do rekombinacji regionu genomowego między ramionami homologii do Pacmana.

Plazmid KO 1.0. Upewnij się, że ramiona homologii 500 baz nie zawierają miejsc restrykcyjnych BAM H one, ponieważ zostaną one strawione w celu linearyzacji plazmidu. Ustaw dwie indywidualne reakcje PCR w celu amplifikacji fragmentów LA i RA dla fragmentu LA do startera do przodu, włącz sekwencje TTV i ISC one do startera odwrotnego.

Włącz AB MH jedno miejsce, siedem zasad, trzy pierwsze do komplementarnej sekwencji odpowiadającej przeciwnemu ramieniu homologii. Dla fragmentu RA obejmują AB MH jedno miejsce siedem zasad, trzy pierwsze do komplementarnej sekwencji odpowiadającej przeciwnemu ramieniu w starterze do przodu i w TB dwa, a ja sce E jedną sekwencję w starterze odwrotnym jako matrycę. Użyj jednego mikrolitra wstecznego DNA z brudnego mini preparatu lub pół mikrolitra wstecznego DNA zawierającego bakterie, które były hodowane przez noc i gotowane w tym i wszystkich kolejnych PCR.

Upewnij się, że używasz polimerazy DNA z możliwością korekty. Nie jest to jednak konieczne w przypadku kontroli PCR. Uruchom próbki PCR na 1% żelu aros i wyekstrahuj produkty za pomocą zestawu do odzyskiwania czystego DNA XMO.

Odeluj DNA za pomocą 10 mikrolitrów sterylnej wody. Następnie użyj od 10 do 30 nanogramów z każdego amplifikowanego DNA. Wykonaj splicing przez nakładanie się przedłużenia PCR.

Zwykle zużywa się około jednej dwudziestej oczyszczonych produktów PCR. Teraz, używając reakcji BP zgodnie z protokołem producenta, sklonuj fragment stopiony LARA do plazmidu Pacman KA. Ten plazmid można pobrać z Boost Truck Lab zaszczepić SW 1 0 2 komórki zawierające tył zainteresowania w czterech mililitrach LB plus odpowiedni antybiotyk selekcyjny w tym przypadku, 25 mikrogramów na mililitr.

Chloramfenikol hoduje kulturę w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez noc przy 250 obr./min. Należy uważać, aby temperatura nie przekroczyła 32 stopni Celsjusza, w przeciwnym razie maszyneria rekombinacji komórek zostanie aktywowana następnego dnia. Strawić 0,4 mikrograma Pac-Man KO zawierającego LA i RA z około 20 jednostkami bmh.

Jeden na 25 mikrolitrów reakcji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przeprowadź długą reakcję trwającą co najmniej trzy godziny, ponieważ ma to kluczowe znaczenie dla wyeliminowania wyników fałszywie dodatnich. Następnie zaszczepić mililitr nasyconej kultury grzbietowej SW 1 0 2 w 44 mililitrach LB chloramfenikolem.

Uprawiaj go w temperaturze 32 stopni Celsjusza, potrząsając do OD 600 od 0,2 do 0,3, co zwykle zajmuje od 60 do 90 minut. Rozpocznij również równoległą hodowlę jako szok cieplny bez szoku cieplnego do kontroli negatywnej. Pojawienie się wielu kolonii w tej kontroli zwykle wskazuje na transformację z niestrawionym plazmidem.

Podczas gdy kultura rośnie. Uruchom BAM H jeden ograniczony plazmid na żelu, a następnie wyekstrahuj żel i rozcieńcz DNA w 10 mikrolitrach podgrzanej wody, ale zdecydowanie nie buforuj. W temperaturze do 55 stopni Celsjusza sól i będą zanieczyszczać.

Elektroporacja szokuje kulturę w temperaturze 42 stopni Celsjusza dokładnie przez 15 minut w łaźni wodnej, ale pozostawia kulturę kontrolną bez szoku cieplnego w temperaturze 32 stopni. Następnie natychmiast przenieś obie kultury do schłodzonych 50-mililitrowych stożkowych probówek i pozwól im siedzieć w zawiesinie lodowatej wody przez pięć minut. Utrzymywanie ogniw w niskich temperaturach ma kluczowe znaczenie dla ich kompetencji.

Nigdy nie należy ponownie zawieszać komórek przez wielokrotne pipetowanie lub wirowanie. Teraz odwiruj kultury, wyrzuć supernatant i umyj osad w lodowatym 10% glicerolu Najpierw dodaj pięć mililitrów glicerolu. Następny resus.

Zawieś ogniwa za pomocą stukania i wirowania, a następnie dodaj 20 dodatkowych mililitrów glicerolu. Powtórz wirowanie i zawiesinę resus w 10% glicerolu jeszcze dwa razy, a następnie ponownie odwiruj komórki. W tym momencie osad komórkowy może być bardzo luźny i należy zachować ostrożność podczas wyrzucania supernatantu.

Teraz zawieś granulkę w jednym mililitrze zimnego, 10% glicerolu i przenieś komórki do 1,5 mililitrowej probówki. Odwiruj komórki przez 30 sekund w temperaturze 12 000 G w czterech stopniach Celsjusza i odrzuć większość supernatantu, pozostawiając około 90 mikrolitrów komórek w glicerolu. W tym momencie komórki mogą być przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Może to jednak obniżyć ich kompetencje. Teraz dodaj dwa mikrolitry lub 50 nanogramów jednego strawionego osocza BAM H do komórek i delikatnie je wymieszaj za pomocą końcówki do pipet. Przenieś mieszaninę do elektroporacji o długości jednego milimetra, qve i zjedz komórki.

Następnie dodaj 300 mikrolitrów SOC i pozwól komórkom zregenerować się przez dwie godziny w temperaturze 32 stopni Celsjusza bez wstrząsania. Po okresie rekonwalescencji płytki na agarze LB z 50 mikrogramami ampicyliny na mililitr roztworu. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez 24 do 30 godzin następnego dnia.

Badanie przesiewowe pod kątem prawidłowej naprawy kolonii szczelin metodą PCR. Użyj starterów kontrolnych T three i RA dla fragmentu RA oraz starterów kontrolnych T seven i LA. W przypadku fragmentu LA kluczowe znaczenie ma przetestowanie obu ramion, ponieważ czasami obserwuje się włączenie jednego ramienia, ale nie drugiego.

Startery kontrolne muszą być zaprojektowane od 100 do 200 par zasad w kierunku obszaru docelowego. Jeśli kolejne kroki zakończą się niepowodzeniem, te startery można zweryfikować przy użyciu sąsiednich starterów i oryginalnego grzbietu jako szablonu. Dodatnie kolonie z PCR pokażą prążek, który obejmuje od 800 do 1000 par zasad.

Wyhoduj dodatnie kolonie w temperaturze 32 stopni Celsjusza w czterech mililitrach pożywki Dzięki ampicylinie przez noc można uzyskać zamrożony zapas tych komórek do późniejszego wykorzystania. Zacznij od amplifikacji kasety RFP, która może wybić z linearyzowanego plazmidu za pomocą odpowiednich starterów. Następnie żel oczyść produkt i umieść go w 20 mikrolitrach sterylnej wody.

Kaseta z puszką RFP wraz z ramionami homologicznymi powinna przebiegać wokół trzech kilozasad inokulacji. Jeden mililitr nasyconej kultury SW 1 0 2 Pac-Man KO na 44 mililitry LB z ampicyliną. Zwiększ go w temperaturze 32 stopni Celsjusza na wytrząsarce do OD 600 od 0,2 do 0,3.

Należy również dołączyć identyczną próbkę do kontroli ujemnej bez szoku cieplnego. Gdy kultury osiągną pożądaną gęstość, oczyść je do elektroporacji, jak opisano w poprzednim rozdziale. Następnie przeprowadź elektroanalizę około 100 nanogramów kasety celowniczej na 90 mikrolitrów elektrokompetentnych ogniw przy użyciu tej samej metody, o której wcześniej informowano.

Po tym, jak komórki odzyskają siły przez dwie godziny, połóż je na LB agra z ampicyliną i możesz inkubować płytki mycyną przez 24 do 30 godzin w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Następnego dnia wyhoduj pięć mililitrowych kultur z pięciu różnych kolonii w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka wykonaj brudne mini przygotowanie i uruchom połowę uzyskanego DNA na 1% żelu agros, aby poszukać obecności plazmidu o niskiej masie cząsteczkowej.

Nie powinno być żadnego plazmidu, który biegnie poniżej 12 kilogramów, jak widać na drugim pasie tego żelu. Teraz wykonaj rozcieńczenie DNA od jednego do 500 z dodatniego klonu i użyj jednego mikrolitra rozcieńczonego DNA, aby zjeść 50 mikrolitrów komórek Tmax epi 300, pokryć odzyskane komórki epi 300 w agarze LB z ampicyliną i puszkować mycynę i inkubować je przez 18 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia. Zaszczep pojedynczą kolonię w 10 mililitrach funta plus antybiotyki i wyhoduj ją przez noc następnego ranka z nasyconych nasion kultury 100 mililitrów funtów.

Dodać odpowiednie antybiotyki i dodać 100 mikrolitrów 1000 x roztwór kontrolny do kopiowania. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do sześciu godzin z potrząsaniem później tego samego dnia. Wykonaj maksymalne przygotowanie i sprawdź, czy kaseta została włożona we właściwe miejsce poprzez sekwencjonowanie.

Teraz zaprojektuj i wykonaj test trawienia enzymu restrykcyjnego przy użyciu klonu z prawidłowymi wynikami sekwencjonowania, aby scharakteryzować wektor kombiera. W tym przykładzie wektor kierowania CG 3 2 0 9 5 był seryjnie trawiony za pomocą PAC jeden, ASC jeden, BH jeden i T dwa. Pojawienie się wszystkich przewidywanych pasm i brak jakichkolwiek błędnych banów potwierdza, że wektor kierowania został poprawnie zmapowany.

Wektor może teraz zostać przekształcony w muchy. Ekspresja rekombinazy transformowana muchy mogą być wybierane z ich potomstwa. Należy pamiętać, że duże wektory są wrażliwe na ścinanie.

Unikamy cykli zamrażania i rozmrażania i przygotowujemy świeże DNA do wstrzyknięcia. Powstałe w ten sposób transgeniczne muchy zawierają konstrukt celujący w predefiniowanym miejscu lądowania, ale jeszcze nie w endogennym locus w genomie. Ostatni etap zastąpienia endogennej szarańczy nie wymaga dalszej biologii molekularnej, a jedynie opublikowanych standardowych metod Drosophila, które obejmują mobilizację kasety celowniczej za pośrednictwem szoku cieplnego i moskitierę do reintegracji kasety celowniczej z dala od pierwotnego miejsca lądowania.

Metody te zostały opisane w najnowszych publikacjach. Amplifikacja ramion homologii LA i RA powinna dać 500 iloczynów par zasad, a reakcja P-C-R-S-O-E powinna dać iloczyn jednej kilozasady. Reakcja BP jest zazwyczaj bardzo wydajna.

Transformacja bakteryjna jego produktu zwykle daje od pięciu do 100 kolonii. Prawie wszystkie kolonie testowane za pomocą testu PCR wykazują oczekiwany produkt podczas pierwszej rundy rekwizycji, spodziewają się uzyskać od 20 do 40 kolonii po przekształceniu strawionego Pacman KO 1.0 zawierającego ramiona LA i RA w komórki SW 1 0 2 zawierające tył zainteresowania. Od 40 do 60% tych klonów będzie zawierało pożądany produkt rekombinacji.

W tym przykładzie uzyskano około 60 kolonii, a kontrola PCR wykazała, że około 60% kolonii zawierało pożądany produkt rekombinacji. Druga runda rekombinacji jest zazwyczaj znacznie bardziej wydajna. Zwykle po transformacji obserwuje się od trzech do 50 kolonii, z których 90 do 95% zawiera pożądany konstrukt Plazmid poniżej 12 kilozasad identyfikuje fałszywie dodatnie kolonie, takie jak klon drugi.

W tym przykładzie. Próbując zastosować ten protokół, należy pamiętać, że u bakterii rekombinacja dużych fragmentów DNA jest bardzo nieefektywna. Dlatego uzyskanie optymalnych wyników ma kluczowe znaczenie dla przygotowania wysokiej jakości kompetentnych komórek i wykorzystania świeżego DNA.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł, jak wygenerować wektor kierowania dla rekombinacji homologicznej N out u Drosophila. Wektor ten może być wykorzystany do dowolnej czystej, molekularnie zdefiniowanej manipulacji pojedynczymi genami w ich endogennych loci.