Name: Rekombinowanie homologicznych konstruktów rekombinacji u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Poznaj metodę tworzenia wektorów rekombinacji homologicznej w Drosophila przy użyciu technik rekombineeringu. Technika umożliwia generowanie mutacji null oraz etykietowanie białek endogennych w badaniach genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Hugo Bellenowi i Bloomington Stock Center za odczynniki. Ponadto dziękujemy Koenowi Venkenowi, Hugo Bellenowi i wszystkim członkom laboratoriów Buszczak i Hiesinger za pomocne dyskusje. Prace te były wspierane przez granty z National Institute of Health dla ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) i MB (RO1GM086647), grant z Cancer Prevention Research Institute of Texas dla MB i PRH (RP100516) oraz Welch Foundation (I-1657) dla PRH. MB jest stypendystą E.E. i Greer Garson Fogelson w dziedzinie badań biomedycznych, a PRH jest stypendystą Eugene'a McDermotta w dziedzinie badań biomedycznych w UT Southwestern Medical Center.

<ol><li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+gene+knockout+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A targeted gene knockout in Drosophila.</a> Genetics. 157, 1307-1312 (2001).</li>
<li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in Drosophila.</a> Science. 288, 2013-2018 (2000).</li>
<li>Gong, W. J., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ends-out%2C+or+replacement%2C+gene+targeting+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36(2005).</li>
<li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering%3A+a+powerful+new+tool+for+mouse+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).</li>
<li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%5Bacman%5D%3A+a+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster.</a> Science. 314, 1747-1751 (2006).</li>
<li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+P%5Bacman%5D+BAC+libraries+for+transgenesis+studies+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster.</a> Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).</li>
<li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phiC31%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31.</a> Genetics. 166, 1775-1782 (2004).</li>
<li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).</li>
<li>Chan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Rab+GTPases+with+synaptic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila.</a> Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).</li>
<li>Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+recombineering+and+ends-out+homologous+recombination+to+systematically+characterize+Drosophila+gene+families%3A+Rab+GTPases+as+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study.</a> Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).</li>
<li>Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+DNA+electrotransformation+efficiency+in+Escherichia+coli+DH10B+electrocompetent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells.</a> Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).</li>
<li>Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+positive%2Fnegative+selection+scheme+for+precise+BAC+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering.</a> Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134, 3571-3584 (2007).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów w odniesieniu do przedstawionych tu technik.

Siła modelowych organizmów genetycznych w badaniach biomedycznych opiera się w dużej mierze na dostępnych narzędziach manipulacji genetycznej. W szczególności małe modele C. elegans i Drosophila pozwalają na niedrogie i szybkie molekularne analizy genetyczne kompletnych szlaków i rodzin genów zaangażowanych w rozwój lub funkcję wielokomórkową. W ostatnich latach nastąpił znaczny postęp w rozwoju narzędzi do manipulowania genami u Drosophila 14,15. Na przykład rekombinacja, która jest...

Czyste, molekularnie zdefiniowane manipulacje pojedynczymi genami w ich endogennych loci oferują nieocenione narzędzie do badania niezliczonych pytań związanych z biologią eukariotyczną. Techniki odwróconej genetyki Drosophila do generowania alleli utraty funkcji okazały się trudne, dopóki Golic i współpracownicy nie wprowadzili celowania genowego in vivo za pomocą rekombinacji homologicznej do Drosophila 1-3. Wykazali, że określone loci genomowe mogą być celowane za pomocą liniowego fragmentu DNA ze zintegrowanego konstruktu transgenicznego. Ten liniowy "donorowy" DNA jest generowany in vivo poprzez rekombinację za pośrednictwem FRT (w celu wycięcia DNA z chromosomu jako cząsteczki kolistej), a następnie linearyzację za pomocą meganukleazy I-SceI. Chociaż metodologia ta została z powodzeniem wykorzystana do generowania różnych zdefiniowanych zmian chorobowych, technika ta nie była łatwo skalowalna do równoległej manipulacji wieloma genami, ponieważ każdy indywidualny konstrukt nokautujący wymaga odrębnego i niestandardowego projektu. Na przykład trudności w płynnym manipulowaniu dużymi fragmentami DNA (>5 kb) in vitro przy użyciu klasycznego klonowania enzymem restrykcyjnym/ligacją lub PCR, a także ograniczenia wielkości tradycyjnych wektorów transformacji in vivo często przeszkadzają w szybkim tworzeniu wektorów ukierunkowanych na rekonekcję homologiczną. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, połączyliśmy system rekombinerowania/transgenezy P[acman], który umożliwia subklonowanie i transgenezę do 100 kb DNA, z metodologią celowania genów typu ends-out, aby stworzyć wydajną i stosunkowo szybką platformę, która ułatwia celowanie w geny Drosophila.
Inżynieria genetyczna oparta na rekombinacji (rekombinacji) to potężna technologia klonowania oparta na rekombinacji homologicznej 4,5. W przeciwieństwie do konwencjonalnego klonowania enzymów restrykcyjnych/ligaz, rekombinacja nie jest ograniczona sekwencją lub rozmiarem zmanipulowanego DNA. Rekombinacja wykorzystuje specjalny szczep E. coli, który zawiera maszynerię rekombinacji zapewnioną przez wadliwy λ profag 4. Technika ta została niedawno przyjęta do stosowania u Drosophila 6,7. Rekombinacja u Drosophila opiera się na zmodyfikowanym, warunkowo amplifikowalnym wektorze sztucznego chromosomu bakteryjnego (BAC) o nazwie P[acman] 6,7. Wektor ten ma dwa źródła replikacji: OriV, który wytwarza wysoką liczbę kopii po indukcji chemicznej w celu oczyszczenia dużych ilości DNA wymaganych do sekwencjonowania i wstrzyknięcia zarodka oraz OriS, który utrzymuje niską liczbę kopii w warunkach podstawowych. Dodatkowo wektor P[acman] jest wyposażony w miejsce przyczepiania się bakterii (attB). Miejsce attB służy jako substrat dla transgenezy za pośrednictwem integrazy ΦC31, która umożliwia włączenie dużych fragmentów DNA do z góry określonego miejsca lądowania w genomie Drosophila 8,9.
Wygenerowano wektor P[acman] (określany jako P[acman]-KO 1.0), który może być używany jako wektor celowania dla rekombinacji homologicznej 10,11. Aby włączyć do systemu technologię celowania genowego typu ends-out, dodaliśmy dwa miejsca FRT i dwa I-SceI. Dołączyliśmy również kasetę Gateway do tego zmodyfikowanego wektora, aby usprawnić proces włączania ramion homologii do P[acman]-KO 1.0. Zapewnia to szybki i prosty sposób na wprowadzenie praktycznie każdego interesującego regionu genomu do wektora docelowego. W tym protokole opiszemy, jak zaprojektować wektor celowania za pomocą P[acman]-KO 1.0 i jak zmobilizować ten wektor in vivo do celowania w endogenne locus. Na potrzeby tego protokołu użyjemy kasety RFP/Kan do zastąpienia genu będącego przedmiotem zainteresowania, ale z tym protokołem można użyć różnych kaset, które zawierają marker selekcji antybiotyków. Zaprojektowaliśmy i z powodzeniem zastosowaliśmy zestaw kaset do wymiany genów i znakowania 10,11.

<table><tbody><tr><td>SW102 Rekombinacja kompetentne bakterie</td> Bakterie rekombinacyjne <td>NCI-Frederick</td><td>(SW102, SW105 i SW106)</td><td><a href="http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx" target="_blank">http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx</a></td></tr><tr><td>Elektrokompetent TransforMax EPI300 E. coli</td><td>Epicentre</td><td>EC300110</td><td>Zawiera CopyControl roztwór indukcyjny</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS Polimeraza DNA Aligent</td><td>Technology Inc.</td><td>600670</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel Zestaw do odzyskiwania DNA</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>Użyj zestawu enzymatycznego Gateway BP ClonaseII</td><td>Invitrogen</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>P[acman]KO1.010</td><td>Buszczak and Hiesinger Labs</td><td>Na żądanie</td><td></td></tr><tr><td>pENTR RFP-Kan11</td><td>Buszczak i Hiesinger</td><td>Labs Upon request</td><td></td></tr><tr><td>Flystocks</td><td>Bloomington stock center</td><td>Numery magazynowe: 25680, 25679</td><td>y1 w*/Dp(2; Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2; Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1</td></tr><tr><td>Maszyna do elektroporacji</td><td>Biorad GenePulser Xcell z modułem PC</td><td>165-2662</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety</td><td>marki Fisher</td><td>#FB101</td><td></td></tr></tbody></table>

rekombinowanie homologicznych konstruktów rekombinacji u drosophila

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Ciągły rozwój technik szybkiego, wielkoskalowego manipulowania endogennymi loci genów poszerzy zastosowanie Drosophila melanogaster jako genetycznego organizmu modelowego do badań nad chorobami ludzkimi. W ostatnich latach nastąpił postęp techniczny, taki jak rekombinacja homologiczna i rekombinacja. Jednak generowanie jednoznacznych mutacji zerowych lub znakowanie białek endogennych pozostaje znacznym wysiłkiem dla większości genów. W tym miejscu opisujemy i demonstrujemy techniki stosowania metod klonowania opartych na rekombinacji do generowania wektorów, które można wykorzystać do celowania i manipulowania endogennymi loci in vivo. W szczególności opracowaliśmy kombinację trzech technologii: (1) transgenezy/rekombinacji BAC, (2) rekombinacji homologicznej typu ends-out oraz (3) technologii Gateway, aby zapewnić solidną, wydajną i elastyczną metodę manipulowania endogennymi loci genomowymi. W tym protokole podajemy szczegółowe informacje krok po kroku o tym, jak (1) projektować poszczególne wektory, (2) jak klonować duże fragmenty genomowego DNA do homologicznego wektora rekombinacji za pomocą naprawy luk oraz (3) jak zastąpić lub oznaczyć interesujące geny w tych wektorach za pomocą drugiej rundy rekombinacji. Na koniec przedstawimy również protokół, w jaki sposób zmobilizować te kasety in vivo w celu wygenerowania nokautu lub oznakowanego genu poprzez knock-in. Metody te można łatwo zastosować do wielu celów równolegle i zapewnić środki do manipulowania genomem Drosophila w odpowiednim czasie i w skuteczny sposób.

Amplifikacja ram homologicznych LA i RA powinna dać produkty o długości 500 bp, a reakcja PCR-SOE powinna przynieść produkt o długości 1,0 kb (sekcje 2.1-2.4; Rysunek 2). Reakcja BP przeprowadzona w sekcji 2.5 jest zazwyczaj bardzo wydajna, a transformacja bakteryjna produktu daje średnio od 5 do 100 kolonii. Prawie wszystkie kolonie sprawdzone za pomocą PCR wykazują oczekiwany produkt PCR.
Podczas pierwszej rundy rekombineeringu (Sekcja 3) należy spodziewać się uzyskania 20-4...

Techniki rekombinacji homologicznej znacznie rozwijają genetykę Drosophila, umożliwiając tworzenie molekularnie precyzyjnych mutacji. Niedawne zastosowanie rekombinacji pozwala na manipulowanie dużymi fragmentami DNA i przekształcanie ich w Drosophila6. Przedstawione tutaj metody łączą te techniki w celu szybkiego generowania dużych wektorów rekombinacji homologicznej.

Rekombinowanie homologicznych konstruktów rekombinacji u Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybkie generowanie dużych wektorów do rekombinacji homologicznej, które mogą być wykorzystane do celowania i manipulowania endogennymi loci oph. Jest to osiągane poprzez wstępną selekcję klonu zwrotnego, obejmującego interesujący region genomiczny. Drugim krokiem procedury jest klonowanie ramion homologii do wektora rekombinacji homologicznej.Trzecim krokiem jest klonowanie DNA genomowego do wektora rekombinacji homologicznej z wykorzystaniem naprawy luk (gap repair). Ostatnim etapem jest zastąpienie regionu genomowego kasetą celującą. Ostatecznie procedury te pozwolą na stworzenie wektora celującego do rekombinacji homologicznej w celu wygenerowania jednoznacznych mutacji null lub znakowania białek endogennych u drosophila przy użyciu technik opartych na rekombinacji.Dodatkowo, tekst manuskryptu zawiera protokół mobilizacji tych kaset in vivo w celu generowania nokautu lub genu z tagiem poprzez nokin. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami jest możliwość jej łatwego zastosowania dla wielu celów równolegle, co umożliwia modyfikację genomu oph w sposób szybki i wydajny. Aby osiągnąć ten cel, nasze metody łączą technologie rekombinacji i gateway w celu generowania wektorów do rekombinacji homologicznej.W przeciwieństwie do konwencjonalnego klonowania z użyciem enzymów restrykcyjnych i ligazy, technologie te nie są ograniczone rozmiarem ani sekwencją DNA, co ułatwia proces klonowania. Choć niniejszy protokół opisuje metodę generowania kasety celującej do wyłączenia genu (knockout), może on zostać wykorzystany do manipulacji dowolnym locus endogennym w niemal każdy pożądany sposób. Obejmuje to znakowanie genu zainteresowania, zastąpienie genu zainteresowania markerem GAL4 oraz generowanie linii z białkami skróconymi lub liniami reporterowymi. W celu uzyskania wektora z genem zainteresowania, którym jest CG 3 2 0 9 5.W tym przykładzie otwórz wyszukiwarkę dla genu@flybased.org, aby uzyskać listę szczepów. Sprawdź sekcję „stocks and reagent” (zasoby i odczynniki) oraz przejrzyj część zatytułowaną „genomic clones” (klony genomiczne).Z dostępnych opcji należy wybrać klon, który obejmuje co najmniej 10 kb powyżej (upstream) i 5 kb poniżej (downstream) genu docelowego. Regiony te służą jako ramiona homologii. Można to osiągnąć poprzez dopasowanie sekwencji końca 5' oraz końca 3' do genomu drosofilid.Alternatywnie, klony w wektorze Pac-Man można znaleźć pod adresem @pacmanfly.org. Teraz należy dobrać startery do amplifikacji 500 par zasad na końcach każdego z ramion homologii. Fragmenty te, nazywane LA i RA, służą do rekombinacji regionu genomicznego znajdującego się między ramionami homologii do wektora Pacman.Plazmid KO 1.0. Należy upewnić się, że 500-parowe ramiona homologii nie zawierają miejsc restrykcyjnych BAM H I, ponieważ zostaną one przetrawione w celu linearyzacji plazmidu. Przygotować dwie oddzielne reakcje PCR w celu amplifikacji fragmentów LA i RA; w przypadku fragmentu LA w starterze forward należy uwzględnić sekwencje TTV I oraz ISC I w starterze reverse.Wprowadź sekwencję AB MH one site siedmiu zasad 3' do sekwencji komplementarnej odpowiadającej przeciwległemu ramieniu homologii. Dla fragmentu RA w starterze forward uwzględnij sekwencję AB MH one site siedmiu zasad 3' do sekwencji komplementarnej odpowiadającej przeciwległemu ramieniu, a w starterze reverse sekwencje at TB two oraz I sce E one jako matrycę. W tej oraz we wszystkich kolejnych reakcjach PCR użyj 1 µL DNA bakteryjnego z brudnego mini-prepu lub 0,5 µL bakterii hodowanych przez noc i poddanych gotowaniu.Należy upewnić się, że użyta polimeraza DNA posiada zdolność korekty błędów. Nie jest to jednak konieczne w przypadku kontroli PCR. Próbki PCR należy poddać elektroforezie na żelu agarozowym 1% i wyekstrahować produkty za pomocą zestawu do odzyskiwania czystego DNA XMO.Eluuj DNA za pomocą 10 µL wody sterylnej. Następnie, wykorzystując od 10 do 30 ng każdego amplifikowanego DNA, przeprowadź splicing metodą PCR z nakładaniem się końców (overlapping extension PCR).Zazwyczaj wykorzystuje się do tego około jednej dwudziestej oczyszczonych produktów PCR. Następnie, przeprowadzając reakcję BP zgodnie z protokołem producenta, należy sklonować fragment fuzyjny LARA do plazmidu Pacman KA. Plazmid ten można zamówić z Boost Truck Lab. Zaszczepić komórki SW 1 0 2 zawierające interesowany wektor w czterech mililitrach pożywki LB z odpowiednim antybiotykiem selekcyjnym, w tym przypadku w stężeniu 25 µg/mL.Chloramphenicol; hodowlę inkubować w temperaturze 32°C przez noc przy 250 RPM. Należy dopilnować, aby temperatura nie przekroczyła 32°C, w przeciwnym razie następnego dnia zostanie aktywowany mechanizm rekombinacji komórek. 0,4 µg Pac-Man KO zawierającego LA i RA poddać trawieniu za pomocą około 20 jednostek bmh.Jedną w 25 µL reakcji w temperaturze 37 °C. Przeprowadź długą reakcję trwającą co najmniej trzy godziny, ponieważ jest to kluczowe dla wyeliminowania wyników fałszywie dodatnich. Następnie zaszczep 1 mL nasyconej kultury wstępnej SW 1 0 2 w 44 mL LB z chloramfenikolem.Inkubować w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem do uzyskania gęstości optycznej OD 600 w zakresie od 0,2 do 0,3, co zazwyczaj trwa od 60 do 90 minut. Równolegle należy prowadzić hodowlę bez szoku termicznego jako kontrolę negatywną. Pojawienie się wielu kolonii w tej kontroli zazwyczaj wskazuje na transformację nieprzetrawionym plazmidem.Podczas wzrostu kultury, przeprowadź elektroforezę plazmidu BAM H one z ograniczonym miejscem restrykcyjnym na żelu, a następnie wyizoluj DNA z żelu i rozcieńcz je w 10 µL podgrzanej wody, zdecydowanie nie w buforze. W temperaturze do 55 °C sole i bufory mogą ulec zanieczyszczeniu.W procesie elektroporacji poddaj kulturę szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez dokładnie 15 minut w łaźni wodnej, natomiast kulturę kontrolną, która nie podlega szokowi termicznemu, pozostaw w temperaturze 32 °C. Następnie niezwłocznie przenieś obie kultury do schłodzonych stożkowych probówek o pojemności 50 ml i pozostaw je w mieszaninie lodu z wodą na pięć minut. Utrzymywanie komórek w niskich temperaturach jest kluczowe dla ich kompetencji.Nigdy nie resuspenduj komórek poprzez wielokrotne pipetowanie lub wirowanie w wirówce vortex. Następnie odwirować kultury, odrzucić nadsącz i przemyć osad w lodowatym 10%glycerol, najpierw dodając pięć mililitrów glycerolu. Następnie resusp.Zresuspenduj komórki, delikatnie opukując i obracając probówkę, a następnie dodaj kolejne 20 ml glicerolu. Powtórz wirowanie i resuspendowanie w 10% glicerolu jeszcze dwukrotnie, a następnie ponownie odwirowuj komórki. Na tym etapie osad komórkowy może być bardzo luźny, dlatego należy zachować ostrożność podczas usuwania nadsączu.Następnie zawiesić osad w 1 mL zimnego, 10% glicerolu i przenieść komórki do probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować komórki przez 30 s przy 12 000 ×g w temperaturze 4 °C i odpiąć większość nadsączu, pozostawiając około 90 µL komórek w glicerolu. Na tym etapie komórki można przechowywać w temperaturze -80 °C.Może to jednak obniżyć ich kompetencję. Teraz należy dodać dwie mikrolitry lub 50 nanogramów strawionej plazmy BAM H one do komórek i delikatnie wymieszać je za pomocą końcówki pipety. Przenieś mieszaninę do kuwety do elektroporacji o szerokości jednego milimetra i przeprowadź elektroporację komórek.Następnie dodaj 300 µL pożywki SOC i pozostaw komórki do regeneracji na dwie godziny w temperaturze 32 °C bez wytrząsania. Po okresie regeneracji wysiej komórki na agar LB z dodatkiem ampicyliny w stężeniu 50 µg/mL. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 32 °C przez 24 do 30 godzin następnego dnia.Przeprowadź przesiewanie kolonii pod kątem prawidłowej naprawy luki za pomocą PCR. Do fragmentu RA użyj starterów T three oraz RA check, a do fragmentu LA starterów T seven oraz LA check. W przypadku fragmentu LA kluczowe jest przetestowanie obu ramion, ponieważ czasami obserwuje się wbudowanie tylko jednego z nich.Startery kontrolne muszą zostać zaprojektowane w odległości od 100 do 200 par zasad od regionu docelowego. W przypadku niepowodzenia kolejnych etapów, startery te można zwalidować, wykorzystując startery sąsiednie oraz pierwotny wektor jako matrycę. Pozytywne kolonie po reakcji PCR wykażą prążek o wielkości od 800 do 1000 par zasad.Hoduj pozytywne kolonie w temperaturze 32 °C w czterech mililitrach pożywki z ampicyliną przez noc; z tych komórek można przygotować mrożony stok do późniejszego wykorzystania. Rozpocznij od amplifikacji kasety knockout RFP z linearnego plazmidu przy użyciu odpowiednich starterów. Następnie oczyść produkt w żelu i rozpuść go w 20 µl sterylnej wody.Kaseta RFP wraz z ramionami homologii powinna mieć wielkość około trzech kilobaz. Zaszczep 1 ml nasyconej kultury SW 1 0 2 Pac-Man KO do 44 ml LB z ampicyliną. Hoduj w 32 °C na wytrząsarce do uzyskania OD 600 na poziomie 0,2 do 0,3.Należy również przygotować identyczną próbkę dla ujemnej kontroli bez szoku termicznego. Po osiągnięciu przez kultury pożądanej gęstości, należy je oczyścić do elektroporacji zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji. Następnie należy przeprowadzić elektroporację około 100 nanogramów kasety celującej do 90 mikrolitrów komórek kompetentnych do elektroporacji, stosując metodę opisaną wcześniej.Po dwugodzinnej regeneracji komórek należy wysiać je na agar LB z ampicyliną i kanamycyną, a następnie inkubować płytki przez 24 do 30 godzin w temperaturze 32 °C. Następnego dnia należy wyhodować kultury o objętości 5 mL z pięciu różnych kolonii, inkubując je przez noc w temperaturze 32 °C. Następnego ranka należy przeprowadzić szybki mini-prep i poddać połowę uzyskanego DNA elektroforezie na żelu agarozowym 1%, aby sprawdzić obecność plazmidu o niskiej masie cząsteczkowej.Nie powinno być żadnego plazmidu migrującego poniżej 12 kb, tak jak widać w ścieżce drugiej tego żelu. Teraz należy przygotować rozcieńczenie DNA z pozytywnego klonu w stosunku 1:500 i użyć 1 µL rozcieńczonego DNA do transformacji 50 µL komórek Tmax epi 300. Odzyskane komórki epi 300 wysiać na agar LB z ampicyliną i kanamycyną i inkubować przez 18–24 h w temperaturze 37 °C. Następnego dnia zaszczepić pojedynczą kolonię w 10 mL LB z antybiotykami i hodować przez noc. Następnego ranka z nasyconej kultury zaszczepić 100 mL LB.Dodać odpowiednie antybiotyki oraz 100 µL roztworu kontroli kopii 1000x. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C przez pięć do sześciu godzin z wytrząsaniem w późniejszym czasie tego samego dnia. Przeprowadzić preparatykę typu maxi prep i zweryfikować wstawienie kasety w odpowiednie miejsce za pomocą sekwencjonowania.Następnie należy zaplanować i przeprowadzić test trawienia enzymami restrykcyjnymi z wykorzystaniem klonu o prawidłowych wynikach sekwencjonowania, aby scharakteryzować wektor combier. W tym przykładzie wektor celujący CG 3 2 0 9 5 poddano trawieniu seryjnemu za pomocą PAC one, ASC one, BH one oraz T two. Pojawienie się wszystkich przewidywanych prążków oraz brak jakichkolwiek nieprawidłowych prążków potwierdza, że wektor celujący został prawidłowo przekształcony metodą combier.Wektor można teraz wprowadzić do much za pomocą transformacji. Muchy transformowane wykazujące ekspresję rekombinazy można wyselekcjonować spośród ich potomstwa. Należy pamiętać, że duże wektory są podatne na ścinanie.Unikamy cykli zamrażania i rozmrażania oraz przygotowujemy świeże DNA do iniekcji. Powstałe muchy transgeniczne zawierają konstrukt celujący w zdefiniowanym miejscu lądowania, ale nie w endogennym locus w genomie. Końcowy etap zastąpienia locus endogennego nie wymaga dalszych prac z zakresu biologii molekularnej, a jedynie zastosowania opublikowanych standardowych metod dla drosophila, które obejmują mobilizację kasety celującej za pomocą szoku termicznego oraz przesiew mutantów w celu zidentyfikowania reintegracji kasety celującej poza pierwotnym miejscem lądowania.Metody te zostały opisane w niedawnych publikacjach. Amplifikacja ram homologii LA i RA powinna przynieść produkty o długości 500 par zasad, a reakcja P-C-R-S-O-E powinna dać produkt o długości jednej kilobazy. Reakcja BP jest zazwyczaj bardzo wydajna.Transformacja bakteryjna produktu zazwyczaj daje od pięciu do 100 kolonii. Prawie wszystkie kolonie przebadane za pomocą PCR wykazują oczekiwany produkt podczas pierwszej rundy rekrutacji; należy spodziewać się uzyskania od 20 do 40 kolonii po transformacji trawionego Pacman KO 1.0 zawierającego ramiona LA i RA do komórek SW 1 0 2 zawierających interesujący wektor. 40 do 60% tych klonów będzie posiadać pożądany produkt rekombinacji.W tym przykładzie uzyskano około 60 kolonii, a weryfikacja za pomocą PCR wykazała, że około 60% kolonii zawierało pożądany produkt rekombinacji. Druga runda rekombinacji jest zazwyczaj znacznie bardziej wydajna. Normalnie po transformacji obserwuje się od 3 do 50 kolonii, z czego 90–95% zawiera pożądany konstrukt. Plazmid o rozmiarze poniżej 12 kilobaz pozwala zidentyfikować kolonie fałszywie dodatnie, takie jak klon dwa.W tym przykładzie. Podczas realizacji tego protokołu należy pamiętać, że rekombinacja dużych fragmentów DNA w bakteriach jest bardzo mało wydajna. Dlatego w celu uzyskania optymalnych wyników kluczowe jest przygotowanie wysokiej jakości komórek kompetentnych oraz użycie świeżego DNA.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo wiedzieć, jak wygenerować wektor celujący dla rekombinacji homologicznej N-out u Drosophila. Wektor ten może zostać wykorzystany do wprowadzenia dowolnej, precyzyjnie zdefiniowanej molekularnie modyfikacji pojedynczych genów w ich endogennych locusach.

recombineering-homologous-recombination-constructs-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rekombinacja homologiczna Konstruktów rekombinacyjnych w Drosophila

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

W tym filmie opisujemy technikę Southern blotting w celu identyfikacji homologicznych zdarzeń rekombinacji w genomie embrionalnych komórek macierzystych myszy za pomocą sond znakowanych radioaktywnie. Regiony DNA zawierające zdarzenia rekombinacji homologicznej pojawiają się jako wyraźne prążki, gdy błona zawierająca DNA związane z sondą jest wystawiona na działanie promieni rentgenowskich.

Southern blotting w celu wykrycia rekombinacji homologicznej w genomie embrionalnych komórek macierzystych myszy

Metodologie celowania w geny mogą być używane do generowania transgenicznych myszy z allelami knockout, knock-in i taged.  W tym miejscu opisujemy ulepszoną metodę rekombinacji u E. coli, którą nazywamy "subklonowaniem plus insercją", która może być wykorzystana do szybkiego generowania niestandardowych wektorów docelowych genów.

Subklonowanie plus insercja (SPI) - nowatorska metoda rekombinacji do szybkiej budowy wektorów celowania w geny

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Białka często zawierają wiele domen, które mogą pełnić różne funkcje komórkowe. Nokauty genów (KO) nie uwzględniają tej różnorodności funkcjonalnej. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na wymianie kasetowej za pośrednictwem rekombinacji (RMCE) oparte na strukturze i funkcji w embrionalnych komórkach macierzystych KO, które pozwala na molekularną sekcję różnych domen funkcjonalnych lub wariantów białka.

Badania strukturyczno-funkcjonalne w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy

Tutaj prezentujemy metodę generowania specyficznych dla tkanek binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez zastąpienie pierwszego kodującego eksonu genów sterownikami transkrypcji. Metoda oparta na CRISPR/Cas9 umieszcza sekwencję transaktywatora pod endogenną regulacją zastąpionego genu, a w konsekwencji ułatwia ekspresję transktywatora wyłącznie we wzorcach czasoprzestrzennych specyficznych dla genu.

Skuteczna strategia generowania specyficznych tkankowo binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez edycję genomu

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół identyfikacji zdarzeń rekombinacji homologicznej, które wystąpiły w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą Southern blotting i/lub PCR. Przykładem tej metody jest generowanie modeli myszy zastępujących genetyczną miozynę II bez mięśni przy użyciu tradycyjnej technologii celowania opartej na embrionalnych komórkach macierzystych opartej na rekombinacji homologicznej.

Identyfikacja zdarzeń rekombinacji homologicznej w embrionalnych komórkach macierzystych myszy przy użyciu Southern blotting i reakcji łańcuchowej polimerazy

Celem tego protokołu jest przedstawienie projektu i wydajności eksperymentów in vivo na Drosophila melanogaster w celu oceny funkcjonalnych konsekwencji rzadkich wariantów genów związanych z chorobami ludzkimi.

Badanie funkcjonalne in vivo rzadkich wariantów ludzkich związanych z chorobą przy użyciu Drosophila

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Zakażenie bakterią Wolbachia u Drosophila

Poznaj metodę tworzenia wektorów rekombinacji homologicznej w Drosophila przy użyciu technik rekombineeringu. Technika umożliwia generowanie mutacji null oraz etykietowanie białek endogennych w badaniach genetycznych.

Rekombinowanie homologicznych konstruktów rekombinacji u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów