Skuteczna strategia generowania specyficznych tkankowo binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez edycję genomu

Ogólnym celem tej metody jest wygenerowanie wysoce specyficznego tkankowo ukierunkowanego systemu ekspresji. W tej metodzie zademonstrowaliśmy generowanie binarnego sterownika transkrypcyjnego specyficznego dla naszego homologu Drosophila FGF, bezgałęziowego. Dynamiczna, czasoprzestrzenna ekspresja bezgałęziowa reguluje hemogenezę gałęzi nabłonka tchawicy dróg oddechowych.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat czasoprzestrzennej ekspresji i migracji komórek wytwarzających bez gałęzi, można ją łatwo zastosować do innych genów i tkanek u Drosophila lub w innych organizmach modelowych, takich jak C.Elegans i danio pręgowany. Główną zaletą tej techniki jest to, że generuje ona systemy ekspresji, które są wysoce niezawodne, specyficzne dla tkanek i genów oraz aktywne wyłącznie w komórkach, w których funkcjonalne są elementy regulatorowe cis zastąpionego genu. Binarne systemy transkrypcyjne są niezbędnymi narzędziami do ukierunkowanej ekspresji genów i manipulacji.

Aktywator trans, taki jak GAL4 lub LexA, ulegający ekspresji pod kontrolą cis elementów regulatorowych genu, napędza efekt genu trans, który jest umieszczony poniżej określonych miejsc wiązania transkrypcji, takich jak UAS dla GAL4 i / lub LexO dla LexA. Metodologia ta zastępuje pierwszy egzon kodujący genu bezgałęziowego sterownikiem transkrypcji. Metoda oparta na CRISPR Cas9 umieszcza sekwencję aktywatora trans LexA pod endogenną regulacją genu bezgałęziowego, a w konsekwencji ułatwia ekspresję aktywatora trans wyłącznie w bezgałęziowych specyficznych wzorcach czasoprzestrzennych.

Zacznij od wybrania dwóch docelowych miejsc przewodnika RNA, które są ukierunkowane na dwa końce wybranego regionu zainteresowania. Otwórz wybrane narzędzie do projektowania CRISPR. Używany jest tutaj Fly CRISPR Optimal Target Finder.

Kliknij Wybierz genom, wstaw sekwencję, która Cię interesuje, i wybierz z menu rozwijanego najnowszą przesłaną adnotację genomu Drosophila melanogaster, obecnie R podkreślenie sześć. Następnie kliknij Wybierz długość prowadnicy'i wprowadź 20. Zaznacz Wszystkie cele CRISPR" i kliknij Znajdź cele CRISPR.

Oceń wszystkie docelowe RNA przewodnika kandydującego, ustawiając maksimum dla rygorystyczności i tylko NGG dla PAM. Aby wygenerować tandemowy wektor ekspresji RNA przewodnika, najpierw PCR amplifikuje fragment DNA, aby wprowadzić dwie sekwencje proto spacer do szkieletu wektora ekspresji RNA pCFD4. Użyj startera do przodu i do tyłu, każdy z sekwencją proto spacer, i nałóż na sekwencję wektorową pCFD4 w PCR przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności i matrycy DNA pCFD4.

Aby przygotować pCFD4 do klonowania, należy strawić plazmid enzymem Bbs1. Ustawić reakcję w odpowiednim buforze do wytrawiania zawierającym od dwóch do pięciu mikrogramów plazmidu pCFD4 i jeden mikrolitr enzymu Bbs1 oraz końcową objętość 50 mikrolitrów. Wymieszaj zawartość reakcji, delikatnie stukając w probówkę i zbierając wszystkie rozproszone kropelki od ścianki probówki do dna przez krótkie wirowanie.

Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny po uruchomieniu produktu PCR i strawionego plazmidu na jednoprocentowym żelu agarozowym. Oczyść liniowy plazmid o długości 6,4 kilopary zasad i produkt PCR o mocy 600 par zasad za pomocą standardowych kolumn do oczyszczania żelu. Ustaw reakcję składania DNA zgodnie z protokołem producenta.

W celu genomowego knock-ina sekwencji GAL4 lub LexA należy zaprojektować dwuniciowy donor HDR zawierający sekwencję aktywatora trans, otoczony dwoma ramionami homologicznymi. Aby uniknąć ponownego ukierunkowania przewodnika RNA na zmodyfikowane locus, należy zaprojektować zastępczego dawcę w taki sposób, aby miejsca rozpoznawania przewodnikowego RNA zostały zakłócone przez wprowadzoną sekwencję egzogenną. Ponadto, aby uniknąć zmiany czystości elementów regulatorowych cis, zawsze wybieraj przewodnikowe miejsca rozpoznawania RNA w regionie kodującym ekson.

Aby wygenerować zastępczą kasetę, zaplanuj strategię składania DNA tak, aby połączyć ze sobą cztery segmenty. Pięć pierwszych i trzech głównych ramion homologii, środkowa egzogenna sekwencja DNA aktywatora trans i zlinearyzowany szkielet wektora klonowania. PCR amplifikuje kasetę ekspresyjną GAL4 lub LexA z odpowiedniego wektora, a PCR amplifikuje ramiona homologii z genomowego DNA wyekstrahowanego z macierzystej linii muchowej wybranej do wstrzyknięcia.

Użyj polimerazy o wysokiej wierności w każdym PCR, aby wygenerować docelowe fragmenty. Aby ustawić reakcję składania DNA, wymieszaj zlinearyzowany wektor klonowania i fragmenty docelowe wygenerowane przez klonowanie PCR z mastermixem do składania DNA i końcową objętością reakcji do 20 mikrolitrów zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować mieszaninę reakcyjną przez godzinę w temperaturze 50 stopni Celsjusza.

Kiedy zarodki Nos-Cas9, którym wcześniej wstrzyknięto zarówno plazmid prowadzący ekspresję RNA, jak i dawcę zastępczego, rozwijają się w dorosłe osobniki, krzyżują muchy G0 indywidualnie, aby zrównoważyć muchy z linii odpowiedniej dla docelowego allelu. Znieczulenie potomstwa F1 z każdej krzyżówki G0 na podkładce z dwutlenkiem węgla. Losowo wybierz od 10 do 20 samców pod mikroskopem stereoskopowym.

Indywidualnie skrzyżuj każdego wybranego samca z samicą równoważącą z linią odpowiednią dla docelowego allelu. Kiedy wykluwają się larwy F2, wybierz ojca F1 z każdej krzyżówki. Ekstrahuj genomowe DNA, zgniatając każdą muchę przez 10 do 15 sekund za pomocą końcówki pipety, zawierającej 50 mikrolitrów buforu do zgniatania bez dozowania buforu.

Następnie wlej pozostały bufor do probówki i dobrze wymieszaj. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut. Po inkubacji umieść probówki w bloku grzewczym o temperaturze 95 stopni Celsjusza na jedną do dwóch minut, aby dezaktywować proteinazę K. Po odwirowaniu przez pięć minut przy 10 000 razy G, przechowuj preparat w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszej analizy PCR.

Wykonaj trzyetapowe badania przesiewowe oparte na PCR, używając starterów do przodu i do tyłu do ekranu pod kątem istnienia insercji lub wymiany. Wykonaj PCR przy użyciu dwóch starterów do przodu i do tyłu dwóch, aby zweryfikować wstawienie lub zamianę z trzech głównych regionów. Wykonaj PCR przy użyciu starterów M13F i odwróć trzy, aby sprawdzić końce w HDR.

Utrzymuj linie muchowe z potwierdzonym HDR ends-out i ustal zrównoważone zapasy od generacji F2. Na zewnątrz równoważnik ponownie wylatuje, aby usunąć wszelkie niezamierzone mutacje na innych chromosomach. Ekspresja bezgałęziowa lub bnl jest pokazana tutaj na czerwono w trzecim krążku skrzydeł larwy w stadium rozwojowym, z komórkami wyrażającymi receptor bez tchu, pokazanymi na zielono, w rosnącym zawiązku worka powietrznego.

Bezrozgałęzione komórki eksprymujące są pokazane tutaj w poprzecznej gałęzi łącznej TR5 i gałęzi grzbietowej TR2. Komórki tchawicy wykazujące ekspresję bez oddechu są pokazane na zielono. Komórki wykazujące ekspresję bez oddechu są pokazane na zielono, oznaczając rozwijającą się tchawicę embrionalną od stadium dziewiątego do stadium 14, a komórki wykazujące ekspresję bez gałęzi są pokazane na czerwono.

Obraz ten pokazuje bezgałęziową ekspresję indukowaną w lokalizacjach tkanek ektopowych w warunkach niedotlenienia, w stosunku do kontroli. Metoda ta została zaprojektowana w celu zachowania wszystkich pierwotnych czasoprzestrzennych regulacji bezgałęziowej transkrypcji genów. Dlatego ważne było, aby zastąpić tylko pierwszy kodujący ekson genu sekwencją kodującą aktywator trans LexA.

Po jego opracowaniu, ten nowy zestaw narzędzi genetycznych utorował drogę do zbadania nowych wzorców ekspresji tkankowej genu bezgałęziowego. Umożliwiło to również nieprawidłową ekspresję genów i wyeliminowanie ich wyłącznie w komórkach o ekspresji bezgałęziowej, a także pomogło w monitorowaniu migracji liniowej i interakcji sygnalizacyjnych komórek.