Name: Skuteczna strategia generowania specyficznych tkankowo binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez edycję genomu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Poznaj metodę generowania tkankowo specyficznych systemów transkrypcyjnych w Drosophila przy użyciu CRISPR/Cas9. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę ekspresji genów w czasie i przestrzeni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. F. Portowi, Dr. K. O'Connor-Gilesowi i Dr. S. Fengowi za dyskusje na temat strategii CRISPR; Dr. T.B. Kornbergowi i Bloomington Stock Center za odczynniki; Podstawowe urządzenie do obrazowania UMD; oraz finansowanie z NIH: R00HL114867 i R35GM124878 do SR.

1. Projektowanie i konstruowanie wektora ekspresji gRNA
<ol>
	<li>Aby precyzyjnie zastąpić długi zdefiniowany region eksonu, należy użyć podejścia z podwójnym gRNA6, w którym każdy gRNA może specyficznie celować w dwa końce wybranego regionu zainteresowania. Aby uzyskać dokładną, specyficzną dla genu czasoprzestrzenną ekspresję sterownika, wybierz dwa miejsca docelowe gRNA w pierwszym egzonie kodującym genu.</li>
	<li>W przypadku Drosophila melanogaster wybierz miejsca docelowe gRNA za pomocą narzędzia flyCRISPR Optimal Target Finder (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). Można również korzystać z innych dostępnych narzędzi do projektowania CRISPR, w tym narzędzia Optimized CRISPR Design (http://crispr.mit.edu), FlyCas9 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9) i E-CRISP (www.e-crisp.org/E-CRISP). 
	UWAGA: Poniższe protokoły projektowania i klonowania gRNA zostały zaadoptowane z metod opisanych wcześniej6,7.
	<ol>
		<li>Skopiuj rzeczywistą sekwencję do pola znajdującego się w narzędziu online. Wybierz najnowszą wersję adnotacji genomu Drosophila melanogaster, "r_6", z menu rozwijanego "Wybierz genom". W polu "Wybierz długość prowadnicy (nt)" wprowadź"20. Wybierz, aby znaleźć "Wszystkie cele CRISPR" i kliknij "Znajdź cele CRISPR".</li>
		<li>Oceń wszystkie kandydujące cele gRNA, ustawiając "Maksimum" dla "Rygorystyczności" i "Tylko NGG" dla "PAM". Spróbuj wybrać miejsca gRNA bez żadnych potencjalnych niedocelowych lub minimalnej możliwej liczby niedocelowych. Użyj narzędzia internetowego opisanego w Doench et al. 2014 8, aby wybrać gRNA z potencjalnym "dobrym" wynikiem aktywności.</li>
		<li>Jednocześnie upewnij się, że nie ma polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w celach gRNA w genomie macierzystej linii muchowej wybranej do wstrzyknięcia (np. nos-Cas9 na chromosomie X, BL# 54591). Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w Gratz et al. 20157, aby wyodrębnić genomowe DNA z macierzystej linii muchy. PCR amplifikuje w przybliżeniu regiony 500-1,000 nt za pomocą starterów, które otaczają sekwencję zainteresowania i polimerazy DNA o wysokiej wierności; zweryfikuj sekwencyjnie produkty amplifikowane metodą PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wygenerować tandemowy wektor ekspresji gRNA, postępuj zgodnie z niezależnym od ligacji protokołem klonowania6, aby wprowadzić dwie sekwencje protospacer do wektora ekspresji RNA pCFD4. Należy zauważyć, że obecnie dostępny jest ulepszony wektor ekspresji multi-gRNA (pCFD5), w którym oba sgRNA są wyrażane z silnych promotorów U6:39 (https://www.crisprflydesign.org). Użyj metody składania DNA, aby sklonować gRNA do wektora pCFD4.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj i uporządkuj startery do przodu i do tyłu do wprowadzenia dwóch sekwencji protospacerowych do wektora ekspresji RNA pCFD4 (tabela 1A). Jak wcześniej opisano6, starter forward zawiera pierwszą sekwencję protospacer otoczoną regionami odpowiadającymi promotorowi U6-1 i rdzeniowi gRNA w pCFD4; odwrócony starter zawiera odwrotną sekwencję dopełniacza drugiego protospacera otoczoną regionami odpowiadającymi rdzeniowi gRNA i promotorowi U6-3 w pCDF4.</li>
		<li>Zawiesić startery do 100 μM za pomocą wody podwójnie destylowanej wolnej od DNaz i RNaz (ddH2O). Wykonaj 10 μM podkład o stężeniu roboczym. Użyj plazmidu pCFD4 jako matrycy i ustaw reakcję PCR przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności i zalecanych ustawień dla reakcji PCR6.</li>
		<li>Aby sklonować amplifikowany produkt do pCFD4, należy przetrawić plazmid pCFD4 z enzymem BbsI, przeprowadzając następującą reakcję: 2–5 μg plazmidu pCFD4, 5 μl 10x buforu do wytrawiania, 1 μl enzymu BbsI i ddH2O, aby doprowadzić końcową objętość do 50 μL. Wymieszaj zawartość reakcji, delikatnie stukając w probówkę i zbierając wszystkie rozproszone kropelki ze ścianki probówki do dno przez krótkie obrócenie. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Uruchom produkt PCR z kroku 2, a produkt strawiony z kroku 3 na 1% żelu agarozowym. Wykonuj elektroforezę przez wystarczająco dużo czasu, aby całkowicie oddzielić prążki DNA. Wytnij pasma DNA o odpowiedniej wielkości pod oświetlaczem UV przed oczyszczeniem oczekiwanych produktów za pomocą kolumny elucyjnej żelu zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Iloczyn PCR powinien mieć wartość 600 pz, a zlinearyzowany plazmid pCFD4 powinien mieć wartość ~6,4 kb 6.</li>
		<li>Ustawić reakcję składania DNA w probówce do PCR, zgodnie z instrukcją producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Przekształć 2 μl produktu zespołu w kompetentne bakterie (DH5α lub podobne szczepy z ΔrecA1, ΔendA1), ułożyć na płytce agarowej z ampicyliną (100 μg/ml) zawierającą LB (LB/Amp) i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Należy pamiętać, że mieszanka złożeniowa DNA może być toksyczna dla niektórych szczepów bakterii, ale rozcieńczenie mieszanki montażowej może zmniejszyć toksyczność.</li>
		<li>Wybierz 3-4 kolonie odporne na ampicylinę z płytki inkubowanej przez noc, zaszczep kolonię w 3 ml LB zawierającym 100 μg/ml ampicyliny i hoduj zaszczepione bakterie w wytrząsarce o temperaturze 37 °C przez noc. Ekstrahuj plazmid z bakterii hodowanych przez noc za pomocą zestawu mini-przygotowania plazmidu zgodnie z instrukcją producenta (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Sekwencjonuj plazmidy za pomocą uniwersalnego startera T3, aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem prawidłowych klonów zawierających tandemową insercję gRNA. Utwórz zapas glicerolu bakterii przekształconych za pomocą zweryfikowanego sekwencyjnie pCFD4-gRNA w 20% glicerolu i przechowuj w zamrażarce o temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Projektowanie i budowa dawcy HDR
<ol>
	<li>W celu genomowego knock-in sekwencji Gal4 lub LexA należy zaprojektować dwuniciowy donor HDR zawierający sekwencję transaktywatora otoczoną dwoma ramionami homologicznymi.
	<ol>
		<li>Użyj >1,5 kb lewego i prawego ramienia homologicznego otaczającego miejsce (miejsca) celowania gRNA. Rozszerzone ramiona homologiczne zwiększają wydajność HDR podczas procesu naprawy 10.</li>
		<li>PCR amplifikuje ramiona homologii z genomowego DNA (gDNA) wyekstrahowanego z macierzystej linii muchowej wybranej do wstrzyknięcia (np. nos-Cas9 (na chromosomie X), BL# 54591). Użyj enzymu polimerazy Taq-DNA o gorącym starcie, odpowiedniego do długiego wydłużania PCR (patrz tabela materiałów). Weryfikacja sekwencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby uniknąć przekierowania gRNA do zmodyfikowanego locus, zaprojektuj zastępczego dawcę w taki sposób, aby miejsca rozpoznawania gRNA zostały zakłócone przez wprowadzoną sekwencję egzogenną. 
	UWAGA: aby uniknąć zmiany przypuszczalnych elementów cis-regulatorowych, zawsze wybieraj miejsca rozpoznawania gRNA w regionie egzonu kodującego.</li>
	<li>Aby wygenerować kasetę zastępczą, zaplanuj strategię składania DNA, aby połączyć ze sobą cztery segmenty: ramiona homologii 5' i 3', środkową egzogenną sekwencję DNA transaktywatora i zlinearyzowany szkielet wektora klonowania (np. pUC19 lub inne powszechnie używane wektory klonujące). Postępując zgodnie z wytycznymi producenta dotyczącymi składania DNA (patrz Tabela materiałów), zaprojektuj odpowiednie startery do amplifikacji PCR i montażu każdego segmentu. Zawiesić podkłady do 100 μM za pomocą ddH2O. Wykonać 10 μM podkład o stężeniu roboczym. Używaj polimerazy o wysokiej wierności do wszystkich reakcji PCR. Postępuj zgodnie z następującym protokołem:
	<ol>
		<li>PCR amplifikuje kasetę ekspresji Gal4 lub LexA z dostępnego wektora (np. nls-LexA: p65; idealne plazmidy ekspresji Gal4 / LexA / QF2 można znaleźć i uzyskać z powszechnych zasobów, takich jak Addgen) przy użyciu starterów wymienionych w tabeli 1B.
		<ol>
			<li>Aby zachować wszystkie oryginalne regulacje transkrypcyjne i potranskrypcyjne zastąpionego eksonu dotyczące ekspresji sekwencji DNA transaktywatora, zaprojektuj kasetę w taki sposób, aby edytowany allel genomowy wyrażał chimeryczne mRNA transaktywatora i genu. Zachowaj koniec 5' i 3' docelowego eksonu, aby zachować wszelki sygnał splicingu.</li>
			<li>Włącz sekwencję peptydu samorozszczepiającego T2A między resztkowym eksonem kodującym 5' a sekwencją transaktywatora, aby zapobiec translacji do białka chimerycznego. Dodaj kodon stop translacji po egzogennej sekwencji transaktywatora (Rysunek 5).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>PCR amplifikuje ramiona homologii z genomowego DNA (gDNA) wyekstrahowanego z rodzicielskiej linii muchowej wybranej do wstrzyknięcia (np. nos-Cas9 (na chromosomie X), BL# 54591) przy użyciu starterów wymienionych w tabeli 1B. Używaj polimerazy o wysokiej wierności do wszystkich reakcji PCR przy użyciu systemów w następujący sposób: 5 μl 5x buforu reakcyjnego, 0,5 μl 10 mM dNTP, 1,25 μl 10 μM startera do przodu, 1,25 μl 10 μM startera odwrotnego, 0,5 μl matrycy DNA, 0,25 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności, 16,25 μL ddH2O.</li>
		<li>Użyj linearyzowanego wektora klonowania, takiego jak pUC19. Obecnie dostępnych jest wiele wektorów dawcy. Zobacz pełną listę na następującej stronie internetowej: http://flycrispr.molbio.wisc.edu.</li>
		<li>Uruchom produkty PCR na 1% żelu agarozowym. Wykonuj elektroforezę przez wystarczająco dużo czasu, aby zapewnić wyraźne oddzielenie pożądanego pasma od niepożądanych pasm niespecyficznych (jeśli występują). Żelem oczyść oczekiwane fragmenty DNA. Zmierzyć stężenie każdego oczyszczonego fragmentu DNA za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>Ustaw reakcję składania DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Wymieszać zlinearyzowany wektor klonowania i fragmenty docelowe z etapu 3 i kroku 4 w następującej reakcji: 1 μl liniowego wektora klonowania (50 ng/μL), 2–3-krotny nadmiar każdego fragmentu docelowego, 10 μL 2x mieszanina główna zespołu DNA, doprowadzić końcową objętość reakcji do 20 μl za pomocą ddH2O. Inkubować mieszaninę reakcyjną przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C.</li>
		<li>Przekształć 2 μl produktu montażowego w kompetentne bakterie, płytka na płytkach agarowych LB/Amp zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Dodaj również X-Gal + IPTG na płytce, aby uzyskać niebieskie/białe ekranowanie.</li>
		<li>Wybierz 3-4 białe kolonie z płytki inkubowanej przez noc, zaszczep kolonię w 3 ml LB zawierającym 100 μg/ml ampicyliny i hoduj w temperaturze 37 °C przez noc w shakerze. Ekstrahuj plazmid z bakterii hodowanych przez noc za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu zgodnie z instrukcją producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Przebadaj dodatnią kolonię za pomocą PCR lub trawienia restrykcyjnego.</li>
		<li>Sekwencja zweryfikuj region dawcy HDR końcowego plazmidu. Zachowaj zapas bakterii przekształcony za pomocą odpowiednich klonów w 20% glicerolu w temperaturze -80 °C do przyszłej inokulacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wstrzykiwanie zarodków, genetyka much i badania przesiewowe w celu edycji genomu
<ol>
	<li>Przygotuj wektor ekspresyjny gRNA wolny od endotoksyn o wysokiej czystości, a także plazmid dawcy HDR za pomocą zestawu maxiprep plazmidu (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Jednoczesne wstrzyknięcie plazmidu ekspresji gRNA (100 ng / μL) i dawcy zastępczego (500 ng / μL) do linii zarodkowej zarodków nos-Cas9 6. Uwaga: korzystamy z komercyjnej usługi iniekcji, ale ta procedura może być również wykonana w laboratorium.</li>
	<li>Genetyka much i badania przesiewowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3):
	<ol>
		<li>Kiedy wstrzyknięte zarodki rozwiną się w dorosłe osobniki, skrzyżuj każdą pojedynczą muchę G0 z muchami równoważącymi. Należy wybrać odpowiedni równoważnik dla chromosomu zawierającego docelowy allel.</li>
		<li>Znieczulij potomstwo F1 z każdej krzyżówki G0 na podkładce CO2 i losowo wybierz 10-20 samców pod mikroskopem stereoskopowym. Skrzyżuj je pojedynczo z samicami balansera, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 3.</li>
		<li>Kiedy wykluwają się larwy F2, wybierz pojedynczego ojca F1 z każdej krzyżówki i wyekstrahuj gDNA za pomocą protokołu przygotowania genomowego DNA pojedynczej muchy:
		<ol>
			<li>Przygotuj bufor do ekstrakcji gDNA: 10 mM Tris-Cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, przechowywać w temperaturze pokojowej. Przygotować 20 mg/ml roztworu podstawowego proteinazy K i przechowywać w zamrażarce.</li>
			<li>Umieść każdą muchę w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i oznacz probówkę. Przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez noc.</li>
			<li>Przygotować świeżą objętość roboczą buforu do ekstrakcji gDNA zawierającego 200 μg/ml końcowego stężenia proteinazy K. 
			Uwaga: Na tym etapie nie używaj starego bufora.</li>
			<li>Zgniataj każdą muchę przez 10–15 s za pomocą końcówki pipety zawierającej 50 μl buforu do zgniatania bez dozowania płynu. Wlej pozostały bufor do probówki i dobrze wymieszaj. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20–30 minut.</li>
			<li>Umieścić probówki w bloku grzewczym o temperaturze 95 °C na 1-2 minuty, aby dezaktywować proteinazę K.</li>
			<li>Wiruj przez 5 minut przy 10 000 x g. Przechowywać preparat w temperaturze 4 °C do dalszej analizy PCR.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj tej samej metody do przygotowania gDNA z muchy nos-Cas9, która służy jako kontrola negatywna. Wykonaj trzyetapowe badania przesiewowe oparte na PCR, aby zidentyfikować prawidłowy HDR "kończy się" (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, <silna klasa="xfig">Rysunek 5) przy użyciu gDNA każdego samca F1 jako szablonu5. Użyj 1 μl preparatu DNA w następującym systemie reakcyjnym PCR: 10 μl 2x PCR Master Mix z barwnikiem, 1 μl każdego startera (10 μM), 1 μl matrycy DNA i 7 μl ddH2O.</li>
	<li>Jak pokazano na Rysunek 5A, wykonaj PCR przy użyciu starterów fwd1 i rev1, aby sprawdzić, czy doszło do insercji lub wymiany; wykonaj PCR przy użyciu starterów fwd2 i rev2, aby zweryfikować wstawienie lub zamianę z regionu 3'; wykonaj PCR przy użyciu starterów M13F i rev3, aby sprawdzić "ends-in" HDR (Tabela 1C).</li>
	<li>Utrzymuj linki muchowe z potwierdzonym HDR na końcu i ustal zrównoważone zapasy od generacji F2. Krzyżowanie z balanserem leci ponownie, aby usunąć wszelkie niezamierzone mutacje na innych chromosomach.</li>
	<li>Przygotuj wysokiej jakości gDNA z uznanych zapasów do amplifikacji długiego PCR (>800–1,000 nt) za pomocą polimerazy Taq o wysokiej wierności i w pełni zweryfikuj amplikony uzyskane ze zmodyfikowanych regionów genomu. Alternatywnie, użyj surowego ekstraktu gDNA, jak opisano wcześniej, aby amplifikować krótsze (<800 nt), nakładające się na siebie produkty PCR w celu walidacji sekwencjonowania edytowanego genomu. Użyj następującego protokołu, aby przygotować dobrej jakości genomowe DNA Drosophila:
	<ol>
		<li>Umieść około 25 dorosłych much w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i zamrażaj w zamrażarce o temperaturze -20 °C lub -80 °C przez co najmniej 1 godzinę.</li>
		<li>Dodać 250 μl roztworu A (pH 9,0, Tris HCl 0,1 M, EDTA 0,1 M, SDS 1%).</li>
		<li>Homogenizować muchy za pomocą tłuczków homogenizujących w probówkach do mikrowirówek i umieścić probówkę na lodzie.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 70 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Dodać 35 μl KOAc (5 M), wstrząsnąć i dobrze wymieszać, ale nie wirować.</li>
		<li>Inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Wirować z prędkością 12 000 x g przez 15 minut.</li>
		<li>Za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml ostrożnie przenieść tylko klarowny supernatant do nowej probówki, pozostawiając osad lub interfazę.</li>
		<li>Dodać 150 μl izopropanolu do supernatantu. Delikatnie wymieszaj przez odwrócenie.</li>
		<li>Wirować z prędkością 10 000 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant i pozostawić osad w probówce.</li>
		<li>Przemyć granulki 1 ml 70% EtOH.</li>
		<li>Wirować z prędkością 12 000 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Usunąć supernatant. Suszyć pelety na powietrzu przez 15 do 20 minut. Nie przesuszaj granulek.</li>
		<li>Rozpuścić osad w 100 μl ddH2O.</li>
		<li>Użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności odpowiedniej dla długich amplikonów (>800 pz), aby amplifikować cały edytowany region. Najlepiej wziąć dwa startery na zewnątrz włożonej kasety, aby wzmocnić region genomu. Żel oczyść produkt PCR i, jak opisano wcześniej, zweryfikuj produkt sekwencyjnie za pomocą wielu nakładających się starterów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zweryfikuj prawidłowe wzorce ekspresji czasoprzestrzennej z wypreparowanych tkanek/zarodków zmodyfikowanych linii much:
	<ol>
		<li>Wykonaj RT-PCR z całkowitego RNA, aby zweryfikować ekspresję hybrydowego produktu mRNA (Tabela 1D).</li>
		<li>Przeprowadzić hybrydyzację in situ produktu mRNA będącego przedmiotem zainteresowania w tkankach larwalnych/zarodku, aby potwierdzić ekspresję.</li>
		<li>Aby przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem dokładnych specyficznych dla tkanki wzorców ekspresji czasoprzestrzennej wśród zweryfikowanych sekwencyjnie linii końcowych, skrzyżuj każdą z edytowanych linii uzyskanych dla binarnego sterownika ekspresji z linią LexO-GFP lub LexO-RFP (dla sterownika LexA) (dostępną w centrach magazynowych Bloomington) i obserwuj ekspresję genu reporterowego sterowanego przez LexA lub Gal4 w tkankach zarodka, larwy i dorosłego pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Lai, S. -L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+system%3A+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression%2C+lineage+tracing%2C+and+mosaic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li>
<li>Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+targeted+expression+system+for+branchless+and+characterization+of+novel+cellular+expression+patterns+of+the+gene+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila.</a> Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).</li>
<li>Port, F., Chen, H. -M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+CRISPR%2FCas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li>
<li>Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+Genome+Editing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), 31.2.1-20 (2015).</li>
<li>Doench, J. G., Hartenian, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li>
<li>Port, F., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmenting+CRISPR+applications+in+Drosophila+with+tRNA-flanked+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs.</a> Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).</li>
<li>Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+DNA+Utilization+During+Gene+Targeting+with+Zinc-Finger+Nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases.</a> G3. 3 (4), Bethesda, Md. 657-664 (2013).</li>
<li>Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+tools+for+targeted+gene+expression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila.</a> Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).</li>
<li>Lin, C. -C., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+Transgenic+DNA+Components+by+Inducible+Gene+Replacement+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).</li>
<li>Li, W., Köster, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control%2C+modeling%2C+and+visualization+of+CRISPR+screens+with+MAGeCK-VISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR.</a> Genome Biology. 16 (1), 281(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Tradycyjnie, pułapki wzmacniające Drosophila były generowane dwiema różnymi metodami. Jednym ze sposobów jest losowa insercja sekwencji sterownika (np. Gal4) do genomu poprzez transpozycję (np. transpozycję elementu P)1 . Alternatywnie, sekwencje sterujące można umieścić pod kontrolą transkrypcyjną domniemanego regionu wzmacniacza / promotora w konstrukcie plazmidowym, który następnie zostałby zintegrowany z ektopowym miejscem genomu 3,11</su...

Genetyczny zestaw narzędzi do ukierunkowanej ekspresji genów został dobrze rozwinięty u Drosophila, co czyni go jednym z najlepszych systemów modelowych do badania funkcji genów zaangażowanych w różnorodne procesy komórkowe. Binarne systemy ekspresji, takie jak drożdże Gal4/UAS (sekwencja aktywacji upstream), zostały po raz pierwszy przyjęte do wychwytywania specyficznych tkankowo wzmacniaczy i nieprawidłowej ekspresji genów w modelu genetycznym Drosophila1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). System ten umożliwił opracowanie wielu technik, takich jak czasoprzestrzenna regulacja nadekspresji genów, błędna ekspresja, nokaut w wybranych grupach komórek, a także ablacja komórek, znakowanie komórek, śledzenie na żywo procesów komórkowych i molekularnych w zarodkach i tkankach, śledzenie linii i analizy mozaiki podczas rozwoju. Wiele binarnych systemów transkrypcji, takich jak bakteryjny system operacyjny LexA/LexA (<silna klasa="xfig">Ryc. 1) i system Q Neurospora, to potężne narzędzia genetyczne, które są obecnie szeroko stosowane u Drosophila, oprócz oryginalnego systemu Gal4/UAS do ukierunkowanej ekspresji genów1,2,3.
Tutaj prezentujemy metodę generowania wysoce niezawodnego systemu ekspresji binarnej specyficznego dla tkanki za pomocą techniki edycji genomu. Ostatnie postępy w technologii edycji genomu CRISPR/Cas9 umożliwiły bezprecedensowe możliwości dokonywania ukierunkowanych zmian w genomie w szerokim zakresie organizmów. W porównaniu z innymi dostępnymi technikami edycji genomu, system CRISPR/Cas9 jest niedrogi, wydajny i niezawodny. Technologia ta wykorzystuje składniki bakteryjnego adaptacyjnego układu odpornościowego: endonukleazę Cas9 Streptococcus pyogenes, która tworzy pęknięcie dwuniciowe (DSB), oraz chimeryczny przewodnik RNA (gRNA), który kieruje Cas9 do określonego miejsca genomu dla docelowego DSB4. Komórki zawierają maszynerię do naprawy DSB przy użyciu różnych ścieżek. Niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) prowadzi do małych insercji lub delecji w celu zakłócenia funkcji genu, podczas gdy naprawa ukierunkowana na homologię (HDR) wprowadza zdefiniowane ukierunkowane/pożądane genomowe wejście/nokaut poprzez użycie egzogennego dawcy HDR jako szablonu. Strategia zastępowania oparta na HDR może być skutecznie wykorzystana do wygenerowania wysoce niezawodnego specyficznego tkankowo systemu ekspresji binarnej, który może przezwyciężyć wszystkie ograniczenia tradycyjnych metod pułapek wzmacniających. Opisujemy krok po kroku procedurę wykorzystania naprawy HDR opartej na CRISPR / Cas9 w generowaniu binarnej linii sterownika transkrypcji, która ulega ekspresji pod kontrolą endogennej regulacji transkrypcyjnej i potranskrypcyjnej genu Drosophila. W tym protokole demonstrujemy generowanie linii sterującej specyficznej dla genu bezgałęziowego (bnl) kodującego białko z rodziny FGF, które reguluje rozgałęzioną morfogenezę nabłonka tchawicy dróg oddechowych5. W tym przykładzie pierwszy kodujący egzon genu bnl został zastąpiony sekwencją bakteryjnej sekwencji transaktywatora LexA bez zmiany jakichkolwiek endogennych sekwencji cis-regulatorowych genu bln. Pokazujemy, że strategia wygenerowała linię napędową bnl-LexA, która czasoprzestrzennie kontroluje ekspresję genu reporterowego umieszczonego poniżej LexAoperator (LexAop lub LexO) wyłącznie w komórkach nabłonkowych / mezenchymalnych / neuronalnych wykazujących ekspresję bnl.

<table><tbody><tr><td>X-Gal/IPTG</td><td>Gentrox (Genesee Scientific)</td><td>18-218</td><td>klonowanie</td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td>BD Difco</td><td>BD&nbsp; 244520</td><td>klonowanie</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td>Biologia molekularna</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1161</td><td>Biologia molekularna</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Biologia molekularna</td></tr><tr><td>UltraPure Woda wolna od DNaz / RNaz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977-023</td><td>Biologia molekularna</td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71736</td><td>Biologia molekularna</td></tr><tr><td>KOAc</td><td>Fisher-Scientific</td><td>P1190</td><td>Biologia molekularna</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher-Scientific</td><td>04-355-451</td><td>Biologia molekularna</td></tr><tr><td>GeneJET Miniprep</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific K0503</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep PureLink HiPure Plasmid Maxipep Zestawy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210006</td><td>Maxiprep</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>NEB</td><td>R0539S</td><td>Resrogacyjne</td></tr><tr><td>startery</td><td>enzymatyczne IDT-DNA</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>pCFD4</td><td>Kornberg Lab</td><td></td><td>Matryca i wektor DNA dla gRNA</td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)</td><td>Kapa biosystems</td><td>KK2601</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Q5-wysoka wierność Taq</td><td>NEB</td><td>NEB #M0491</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>NEB #E2611</td><td>Składanie DNA</td></tr><tr><td>pBPnlsLexA:p65Uw</td><td>Addgene</td><td></td><td>Matryca DNA do amplifikacji LexA</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25530049</td><td>Molecular Biology</td></tr><tr><td>2x PCR PreMix, z barwnikiem (czerwony)</td><td>Sydlab</td><td>MB067-EQ2R</td><td>Biologia molekularna</td></tr><tr><td>Zestaw do elucji żelu</td><td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td><td>11-300</td><td>Odczynnik</td></tr> <tr><td></td><td>TRI do biologii molekularnejSigma-Aldrich</td><td></td><td>Biologia molekularna</td></tr><tr><td>Zestawy do oczyszczania RNA z bezpośrednim zolem</td><td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td><td>11-330</td><td>Biologia molekularna</td></tr><tr><td>OneTaq Jednoetapowy zestaw RT-PCR</td><td>NEB</td><td>E5315S</td><td>Biologia molekularna</td></tr><tr><td>lexO-CherryCAAX</td><td>Kornberg Lab</td><td></td><td>Fly line</td></tr><tr><td>UAS-CD8: GFP</td><td>Laboratorium Kornberga</td><td></td><td>Linia muchowa</td></tr><tr><td>btl-Gal4</td><td>Kornberg lab</td><td></td><td>Fly line</td></tr><tr><td>MKRS/TB6B</td><td>Kornberg lab</td><td></td><td>Fly line</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny SP5X</td><td>Leica</td><td></td><td>Imaging Wzór ekspresji</td></tr><tr><td>CO2 stacja</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td>pchanie muchy</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZ-61</td><td>pchanie muchy</td></tr><tr><td>Tłuczki homogenizujące do mikroprobówek</td><td>Fisher-Scientific</td><td>03-421-217</td> spektrofotometr <td>do izolacji genomowego DNA</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>Kwantyfikacja DNA</td></tr></tbody></table>

skuteczna strategia generowania specyficznych tkankowo binarnych systemów transkrypcyjnych u drosophila poprzez edycję genomu

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binarne systemy transkrypcyjne to potężne narzędzia genetyczne szeroko stosowane do wizualizacji i manipulowania losem komórek oraz ekspresją genów w określonych grupach komórek lub tkanek w organizmach modelowych. Systemy te zawierają dwa składniki jako oddzielne linie transgeniczne. Linia sterująca wyraża aktywator transkrypcji pod kontrolą specyficznych tkankowo promotorów / wzmacniaczy, a linia reporterowa / efektorowa zawiera gen docelowy umieszczony poniżej miejsca wiązania aktywatora transkrypcji. Zwierzęta, w których znajdują się oba składniki, indukują specyficzną tkankowo transaktywację docelowej ekspresji genu. Precyzyjna czasoprzestrzenna ekspresja genu w docelowych tkankach ma kluczowe znaczenie dla bezstronnej interpretacji aktywności komórki/genu. W związku z tym niezbędne jest opracowanie metody generowania wyłącznych linii sterujących specyficznych dla komórek/tkanek. W tym miejscu przedstawiamy metodę generowania wysoce specyficznego tkankowo ukierunkowanego systemu ekspresji poprzez zastosowanie techniki edycji genomu opartej na "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated" (CRISPR/Cas). W tej metodzie endonukleaza Cas9 jest kierowana przez dwa chimeryczne przewodnikowe RNA (gRNA) do określonych miejsc w pierwszym egzonie kodującym genu w genomie Drosophila w celu wytworzenia pęknięć dwuniciowych (DSB). Następnie, wykorzystując egzogenny plazmid dawcy zawierający sekwencję transaktywatora, autonomiczna maszyneria naprawcza komórki umożliwia naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR) DSB, co skutkuje precyzyjną delecją i zastąpieniem eksonu sekwencją transaktywatora. Wbity transaktywator ulega ekspresji wyłącznie w komórkach, w których funkcjonalne są cis-regulatorowe elementy zastąpionego genu. Przedstawiony tutaj szczegółowy protokół krok po kroku do generowania binarnego sterownika transkrypcyjnego ulegającego ekspresji w komórkach nabłonkowych/neuronalnych Drosophila fgf / bezgałęziowych może być przyjęty do dowolnej ekspresji specyficznej dla genu lub tkanki.

Niniejszy protokół został z sukcesem wykorzystany do stworzenia ukierunkowanego binarnego systemu reporterowego specyficznego dla komórek wykazujących ekspresję bnl5. Elementy regulacyjne cis (CREs), które kontrolują złożoną ekspresję spatiotemporalną bnl, nie zostały scharakteryzowane. W związku z tym, aby uzyskać ekspresję spatiotemporalną pod kontrolą endogennej sekwencji regulacyjnej bnl, zaplanowano zastąpienie jedynie pierw...

Tutaj prezentujemy metodę generowania specyficznych dla tkanek binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez zastąpienie pierwszego kodującego eksonu genów sterownikami transkrypcji. Metoda oparta na CRISPR/Cas9 umieszcza sekwencję transaktywatora pod endogenną regulacją zastąpionego genu, a w konsekwencji ułatwia ekspresję transktywatora wyłącznie we wzorcach czasoprzestrzennych specyficznych dla genu.

Skuteczna strategia generowania specyficznych tkankowo binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez edycję genomu

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Ogólnym celem tej metody jest wygenerowanie wysoce specyficznego tkankowo ukierunkowanego systemu ekspresji. W tej metodzie zademonstrowaliśmy generowanie binarnego sterownika transkrypcyjnego specyficznego dla naszego homologu Drosophila FGF, bezgałęziowego. Dynamiczna, czasoprzestrzenna ekspresja bezgałęziowa reguluje hemogenezę gałęzi nabłonka tchawicy dróg oddechowych.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat czasoprzestrzennej ekspresji i migracji komórek wytwarzających bez gałęzi, można ją łatwo zastosować do innych genów i tkanek u Drosophila lub w innych organizmach modelowych, takich jak C.Elegans i danio pręgowany. Główną zaletą tej techniki jest to, że generuje ona systemy ekspresji, które są wysoce niezawodne, specyficzne dla tkanek i genów oraz aktywne wyłącznie w komórkach, w których funkcjonalne są elementy regulatorowe cis zastąpionego genu. Binarne systemy transkrypcyjne są niezbędnymi narzędziami do ukierunkowanej ekspresji genów i manipulacji.Aktywator trans, taki jak GAL4 lub LexA, ulegający ekspresji pod kontrolą cis elementów regulatorowych genu, napędza efekt genu trans, który jest umieszczony poniżej określonych miejsc wiązania transkrypcji, takich jak UAS dla GAL4 i / lub LexO dla LexA. Metodologia ta zastępuje pierwszy egzon kodujący genu bezgałęziowego sterownikiem transkrypcji. Metoda oparta na CRISPR Cas9 umieszcza sekwencję aktywatora trans LexA pod endogenną regulacją genu bezgałęziowego, a w konsekwencji ułatwia ekspresję aktywatora trans wyłącznie w bezgałęziowych specyficznych wzorcach czasoprzestrzennych.Zacznij od wybrania dwóch docelowych miejsc przewodnika RNA, które są ukierunkowane na dwa końce wybranego regionu zainteresowania. Otwórz wybrane narzędzie do projektowania CRISPR. Używany jest tutaj Fly CRISPR Optimal Target Finder.Kliknij Wybierz genom, wstaw sekwencję, która Cię interesuje, i wybierz z menu rozwijanego najnowszą przesłaną adnotację genomu Drosophila melanogaster, obecnie R podkreślenie sześć. Następnie kliknij Wybierz długość prowadnicy'i wprowadź 20. Zaznacz Wszystkie cele CRISPR" i kliknij Znajdź cele CRISPR.Oceń wszystkie docelowe RNA przewodnika kandydującego, ustawiając maksimum dla rygorystyczności i tylko NGG dla PAM. Aby wygenerować tandemowy wektor ekspresji RNA przewodnika, najpierw PCR amplifikuje fragment DNA, aby wprowadzić dwie sekwencje proto spacer do szkieletu wektora ekspresji RNA pCFD4. Użyj startera do przodu i do tyłu, każdy z sekwencją proto spacer, i nałóż na sekwencję wektorową pCFD4 w PCR przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności i matrycy DNA pCFD4.Aby przygotować pCFD4 do klonowania, należy strawić plazmid enzymem Bbs1. Ustawić reakcję w odpowiednim buforze do wytrawiania zawierającym od dwóch do pięciu mikrogramów plazmidu pCFD4 i jeden mikrolitr enzymu Bbs1 oraz końcową objętość 50 mikrolitrów. Wymieszaj zawartość reakcji, delikatnie stukając w probówkę i zbierając wszystkie rozproszone kropelki od ścianki probówki do dna przez krótkie wirowanie.Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny po uruchomieniu produktu PCR i strawionego plazmidu na jednoprocentowym żelu agarozowym. Oczyść liniowy plazmid o długości 6,4 kilopary zasad i produkt PCR o mocy 600 par zasad za pomocą standardowych kolumn do oczyszczania żelu. Ustaw reakcję składania DNA zgodnie z protokołem producenta.W celu genomowego knock-ina sekwencji GAL4 lub LexA należy zaprojektować dwuniciowy donor HDR zawierający sekwencję aktywatora trans, otoczony dwoma ramionami homologicznymi. Aby uniknąć ponownego ukierunkowania przewodnika RNA na zmodyfikowane locus, należy zaprojektować zastępczego dawcę w taki sposób, aby miejsca rozpoznawania przewodnikowego RNA zostały zakłócone przez wprowadzoną sekwencję egzogenną. Ponadto, aby uniknąć zmiany czystości elementów regulatorowych cis, zawsze wybieraj przewodnikowe miejsca rozpoznawania RNA w regionie kodującym ekson.Aby wygenerować zastępczą kasetę, zaplanuj strategię składania DNA tak, aby połączyć ze sobą cztery segmenty. Pięć pierwszych i trzech głównych ramion homologii, środkowa egzogenna sekwencja DNA aktywatora trans i zlinearyzowany szkielet wektora klonowania. PCR amplifikuje kasetę ekspresyjną GAL4 lub LexA z odpowiedniego wektora, a PCR amplifikuje ramiona homologii z genomowego DNA wyekstrahowanego z macierzystej linii muchowej wybranej do wstrzyknięcia.Użyj polimerazy o wysokiej wierności w każdym PCR, aby wygenerować docelowe fragmenty. Aby ustawić reakcję składania DNA, wymieszaj zlinearyzowany wektor klonowania i fragmenty docelowe wygenerowane przez klonowanie PCR z mastermixem do składania DNA i końcową objętością reakcji do 20 mikrolitrów zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować mieszaninę reakcyjną przez godzinę w temperaturze 50 stopni Celsjusza.Kiedy zarodki Nos-Cas9, którym wcześniej wstrzyknięto zarówno plazmid prowadzący ekspresję RNA, jak i dawcę zastępczego, rozwijają się w dorosłe osobniki, krzyżują muchy G0 indywidualnie, aby zrównoważyć muchy z linii odpowiedniej dla docelowego allelu. Znieczulenie potomstwa F1 z każdej krzyżówki G0 na podkładce z dwutlenkiem węgla. Losowo wybierz od 10 do 20 samców pod mikroskopem stereoskopowym.Indywidualnie skrzyżuj każdego wybranego samca z samicą równoważącą z linią odpowiednią dla docelowego allelu. Kiedy wykluwają się larwy F2, wybierz ojca F1 z każdej krzyżówki. Ekstrahuj genomowe DNA, zgniatając każdą muchę przez 10 do 15 sekund za pomocą końcówki pipety, zawierającej 50 mikrolitrów buforu do zgniatania bez dozowania buforu.Następnie wlej pozostały bufor do probówki i dobrze wymieszaj. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut. Po inkubacji umieść probówki w bloku grzewczym o temperaturze 95 stopni Celsjusza na jedną do dwóch minut, aby dezaktywować proteinazę K. Po odwirowaniu przez pięć minut przy 10 000 razy G, przechowuj preparat w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszej analizy PCR.Wykonaj trzyetapowe badania przesiewowe oparte na PCR, używając starterów do przodu i do tyłu do ekranu pod kątem istnienia insercji lub wymiany. Wykonaj PCR przy użyciu dwóch starterów do przodu i do tyłu dwóch, aby zweryfikować wstawienie lub zamianę z trzech głównych regionów. Wykonaj PCR przy użyciu starterów M13F i odwróć trzy, aby sprawdzić końce w HDR.Utrzymuj linie muchowe z potwierdzonym HDR ends-out i ustal zrównoważone zapasy od generacji F2. Na zewnątrz równoważnik ponownie wylatuje, aby usunąć wszelkie niezamierzone mutacje na innych chromosomach. Ekspresja bezgałęziowa lub bnl jest pokazana tutaj na czerwono w trzecim krążku skrzydeł larwy w stadium rozwojowym, z komórkami wyrażającymi receptor bez tchu, pokazanymi na zielono, w rosnącym zawiązku worka powietrznego.Bezrozgałęzione komórki eksprymujące są pokazane tutaj w poprzecznej gałęzi łącznej TR5 i gałęzi grzbietowej TR2. Komórki tchawicy wykazujące ekspresję bez oddechu są pokazane na zielono. Komórki wykazujące ekspresję bez oddechu są pokazane na zielono, oznaczając rozwijającą się tchawicę embrionalną od stadium dziewiątego do stadium 14, a komórki wykazujące ekspresję bez gałęzi są pokazane na czerwono.Obraz ten pokazuje bezgałęziową ekspresję indukowaną w lokalizacjach tkanek ektopowych w warunkach niedotlenienia, w stosunku do kontroli. Metoda ta została zaprojektowana w celu zachowania wszystkich pierwotnych czasoprzestrzennych regulacji bezgałęziowej transkrypcji genów. Dlatego ważne było, aby zastąpić tylko pierwszy kodujący ekson genu sekwencją kodującą aktywator trans LexA.Po jego opracowaniu, ten nowy zestaw narzędzi genetycznych utorował drogę do zbadania nowych wzorców ekspresji tkankowej genu bezgałęziowego. Umożliwiło to również nieprawidłową ekspresję genów i wyeliminowanie ich wyłącznie w komórkach o ekspresji bezgałęziowej, a także pomogło w monitorowaniu migracji liniowej i interakcji sygnalizacyjnych komórek.

an-efficient-strategy-for-generating-tissue-specific-binary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film opisuje metodę przesiewową w celu identyfikacji transgenicznych muszek Drosophila, których genom został zmodyfikowany za pomocą CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 to potężne narzędzie do edycji genomu, które zrewolucjonizowało sposób, w jaki naukowcy mogą manipulować genomem organizmu. W przykładowym protokole zobaczymy, jak zidentyfikować mutanty generowane przez CRISPR, w których insercja sekwencji transaktywacyjnej zastępuje pierwszy ekson genu bezgałęziowego (bnl), tworząc w ten sposób linię...

Badania przesiewowe pod kątem modyfikacji genomu: metoda identyfikacji mutantów generowanych przez CRISPR u Drosophila

Techniki rekombinacji homologicznej znacznie rozwijają genetykę Drosophila, umożliwiając tworzenie molekularnie precyzyjnych mutacji.  Niedawne zastosowanie rekombinacji pozwala na manipulowanie dużymi fragmentami DNA i przekształcanie ich w Drosophila6. Przedstawione tutaj metody łączą te techniki w celu szybkiego generowania dużych wektorów rekombinacji homologicznej.

Rekombinowanie homologicznych konstruktów rekombinacji u Drosophila

Designerskie nukleazy, takie jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów (TALENs) mogą być używane do modyfikacji genomu mysich zarodków preimplantacyjnych poprzez aktywowanie zarówno szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), jak i homologicznej rekombinacji (HR). Postępy te umożliwiają szybkie generowanie myszy z precyzyjnymi modyfikacjami genetycznymi.

Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Eksperymentalne potwierdzenie aktywności wzmacniacza najlepiej podejść poprzez analizę utraty funkcji. Przedstawiono tutaj skuteczny protokół, który wykorzystuje delecję za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do badania specyficznej dla alleli regulacji transkrypcji genów w komórkach F1 ES, które zawierają genom hybrydowy (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół użycia enzymu Cas13D ukierunkowanego na RNA (RfxCas13D) u much.

Wszechobecne i specyficzne tkankowo celowanie RNA u Drosophila melanogaster przy użyciu CRISPR/CasRx

Ten artykuł przedstawia krok po kroku protokoły mutagenezy CRISPR/Cas9 orientalnej muszki owocowej Bactrocera dorsalis. Szczegółowe kroki przewidziane w tym ustandaryzowanym protokole posłużą jako przydatny przewodnik do generowania zmutowanych much do funkcjonalnych badań genów u B. dorsalis.

Protokoły mutagenezy CRISPR/Cas9 muszki owocowej Bactrocera dorsalis

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

Tutaj prezentujemy uproszczony protokół endogennego znakowania genów dla Drosophila, który wykorzystuje technikę opartą na PCR do bezmarkerowej identyfikacji udanych modyfikacji genetycznych, ułatwiając rozwój stabilnych linii knock-in.

Jednoetapowa strategia endogennego znakowania genów w oparciu o CRISPR u Drosophila melanogaster

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Dostarczanie edytorów genomu jako RNA jest szczególnie skuteczną metodą modyfikacji genomów komórek pierwotnych ssaków i linii komórkowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie edytorów genomu jako mRNA do pierwotnych komórek ssaków i linii komórkowych, po którym następuje ukierunkowane sekwencjonowanie i analiza Illumina w celu ilościowego określenia wyników edycji.

Edycja genomu w pierwotnych komórkach ssaków poprzez elektroporację edytora RNA

Poznaj metodę generowania tkankowo specyficznych systemów transkrypcyjnych w Drosophila przy użyciu CRISPR/Cas9. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę ekspresji genów w czasie i przestrzeni.

Skuteczna strategia generowania specyficznych tkankowo binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez edycję genomu

Przeglądaj więcej filmów