Techniki przetwarzania oczu z wszczepioną protezą siatkówki do miejscowej analizy histopatologicznej: Część 2 Implanty nasiatkówkowe z pinezkami siatkówkowymi

Protezy siatkówki z twardymi metalowymi komponentami nie są kompatybilne z tradycyjnymi procesami histologicznymi. W niniejszym materiale opisujemy techniki oceny stanu zdrowia oka bezpośrednio sąsiadującego z implantem siatkówki zamocowanym epiretinalnie za pomocą metalowego T. Jest to realizowane poprzez wstępną nukleację i utrwalenie oka zgodnie z protokołem opisanym w towarzyszącym filmie, a następnie wycięcie próbki tkanki obejmującej implant i T siatkówki. Drugim krokiem jest progresywne odwodnienie próbki tkanki, a następnie jej zatopienie w żywicy epoksydowej w pożądanej orientacji z wykorzystaniem dwuetapowego procesu zatapiania. Następnie końcowy blok żywicy jest montowany w specjalnym uchwycie i stopniowo szlifowany, aż do odsłonięcia przekroju poprzecznego przez implant i otaczającą tkankę gałki ocznej na pożądanym poziomie.

Ostatnim krokiem jest barwienie powierzchniowe odsłoniętej tkanki, a następnie obrazowanie i fotografowanie przy użyciu wysokorozdzielczego mikroskopu sekcyjnego w celu wizualizacji architektury komórkowej sąsiadującej z wszczepioną protezą. Kroki te powtarza się następnie kilkukrotnie, zgodnie z potrzebą. W końcowym etapie gromadzi się serię obrazów przekrojów przez próbkę tkanki, obejmujących implant in situ, które mogą zostać wykorzystane do udoskonalenia konstrukcji urządzenia lub metody chirurgicznej, a także do oceny bezpieczeństwa danej protezy.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjne cięcie histologiczne przy użyciu ostrza, jest fakt, że obiekty wszczepione do serca, w tym komponenty metaliczne, mogą pozostać in situ podczas procedury, co umożliwia wizualizację interfejsu między implantem a tkanką. Metoda ta pozwala na udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie protez siatkówki, takie jak ocena integralności strukturalnej delikatnej tkanki gałki ocznej sąsiadującej z wszczepioną protezą siatkówki. Po enukleacji oka i utrwaleniu, zgodnie z opisem w towarzyszącym filmie JoVE, należy zlokalizować implant oraz punkt, w którym jest on przymocowany do zewnętrznej części oka.

Używając ostrza 15 stopni, wykonaj okrężne nacięcie rogówki i usuń tzw. czapeczkę rogówkową, aby odsłonić wnętrze gałki ocznej. Należy zauważyć, że soczewka została wcześniej usunięta podczas lensektomii i witrektomii, które stanowią część procedury chirurgicznej przy tym implancie epiretinalnym.

Następnie przeprowadź dytsekcję, odsuwając tęczówkę oraz wszelkie pozostałe włókna Zona soczewki, aby odsłonić komorę tylną z wszczepem epiretinalnym i metalowym znacznikiem T in situ. W zależności od rodzaju implantu oraz prowadzonego badania, usuń zbędne elementy przed dalszą dytsekcją. W niniejszym przykładzie oceniany układ epiretinalny składa się z prototypowego hermetycznego pakietu z elektrodami diamentowymi i elektroniką, umieszczonego w dopasowanym nośniku silikonowym.

Ostrożnie wypreparuj próbkę zawierającą tackę oraz otaczającą ją tkankę w pożądanej orientacji. Za pomocą precyzyjnych nożyczek chirurgicznych wytnij paski o pełnej grubości z tyłu oka, obejmujące twardówkę, naczyniówkę i siatkówkę. Następnie za pomocą skalpela ostrożnie wyekstrahuj zestaw elektrod diamentowych poprzez precyzyjną dyssekcję.

Pozostaw silikonowy korpus implantu wraz z tacką siatkówkową oraz pozostałościami platynowego okablowania. Pobierz próbkę w przekroju podłużnym tacki, obejmującą wszystkie warstwy siatkówki przylegające do tacki. Następnie umieść próbkę z powrotem w 70%Ethanol.

Odwodnij próbkę przez trzy dni w kolejnych stężeniach etanolu. Najpierw odwodnij próbkę w 70%ethanol przez dwie godziny, powtarzając proces dwukrotnie. Następnie odwodnij próbkę w 80%ethanol przez dwie godziny, dwukrotnie, a następnego dnia przez noc odwodnij próbkę w 90%Ethanol przez dwie godziny, dwukrotnie; następnie przejdź do odwadniania próbki w 100%ethanol przez dwie godziny, dwukrotnie, a potem przez noc.

Na koniec odwodnij próbkę w 100% acetonie dwukrotnie przez dwie godziny. Wyjmij próbkę z acetonu i obserwuj ją pod mikroskopem świetlnym podczas wysychania na powietrzu w temperaturze pokojowej. Usunięcie cieczy z tkanek miękkich prowadzi do zapadania się komórek i kurczenia się próbki.

Próbkę przeniesie się do epoksydy tuż przed momentem, w którym zacznie ona zwijać się i zapadać. Wyczucie czasu, w którym następuje zwijanie i zapadanie tkanki, nabywa się wraz z doświadczeniem. Aby zatopić próbkę w przezroczystej żywicy epoksydowej, należy zanurzyć tkankę oka w upłynnionej epoksydzie w odpowiednim, szczelnym pojemniku.

Delikatnie odgazuj żywicę epoksydową w komorze próżniowej i pozostaw ją na noc w temperaturze pokojowej do utwardzenia. Należy zadbać o odpowiednią orientację próbki, przycinając utwardzoną żywicę wraz z próbką za pomocą piły taśmowej i szlifierki. Umieść przyciętą kostkę zawierającą tkankę oka w świeżej, upłynnionej żywicy epoksydowej w taki sposób, aby oś podłużna była zorientowana równolegle do dna formy. Użyj kropli kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować przyciętą próbkę do dna uchwytu na próbki.

Wypełnij uchwyt na próbkę upłynnioną żywicą epoksydową, odgazuj w opisany wcześniej sposób i pozostaw do utwardzenia na noc. Następnie zamocuj żywicę w uchwycie do szlifowania próbek i szlifuj próbkę ręcznie przy 230–250 RPM z włączonym dopływem wody, używając papieru ściernego z węglika krzemu. W celu barwienia zanurz szlifowaną powierzchnię w barwniku toine blue na trzy do pięciu minut lub do momentu pojawienia się zabarwienia.

Po opłukaniu próbki wodą z kranu, należy obrazować szlifowaną powierzchnię preparatu przy użyciu stereomikroskopu z większym powiększeniem. Aby zwizualizować warstwy komórkowe siatkówki, należy nanieść kroplę wody destylowanej na górną powierzchnię żywicy epoksydowej tuż nad preparatem, w celu wygładzenia dyfrakcji na granicy faz powietrze-żywica.

Do oświetlenia próbki należy użyć światłowodowego źródła światła z gęsią szyją. Należy powtarzać etapy szlifowania i obrazowania, za każdym razem szlifując próbkę o zaprogramowaną grubość. Minimalny precyzyjny i powtarzalny przyrost szlifowania uchwytu okładzin wynosi 20 mikronów.

Proces ten jest powtarzany stopniowo, aż do momentu odsłonięcia przekroju przez implant i otaczającą tkankę gałki ocznej na pożądanym poziomie. Poniżej przedstawiono przykładowe obrazy tkanki siatkówki wizualizowanej bezpośrednio w sąsiedztwie tytanowego tacka do siatkówki w różnych etapach procesu szlifowania. Obrazy przedstawiają przekroje podłużne tacka penetrującego oko i wychodzącego przez twardówkę, sąsiadującego z silikonem oraz siatkówką barwioną błękitem toluidynowym i niebarwioną.

Nieartefaktowe odwarstwienie i fałdowanie siatkówki można zaobserwować po obu stronach silikonu, zarówno przy małym, jak i dużym powiększeniu. Trzon tacki jest widoczny w silikonie, a główka tacki przebiła siatkówkę i twardówkę. Tutaj wyraźnie widać nieartefaktowe odwarstwienie niebarwionej siatkówki po obu stronach silikonu, widoczne zarówno przy małym, jak i dużym powiększeniu.

Przykład ten wykazał występowanie dezorganizacji siatkówki w sąsiedztwie tacki oraz kompresję siatkówki po jednej stronie wynikającą z ukośnego kąta wprowadzenia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o starannym zatopieniu, zorientowaniu i odczytaniu próbki, tak aby powstałe powierzchnie szlifowane były wyrównane w pożądanej płaszczyźnie. Ponadto, na każdym etapie szlifowania należy wykonać wiele fotografii, ponieważ próbki szlifowane nie mogą zostać odzyskanym w późniejszym czasie.

Metoda ta pozwala na analizę histologiczną protez siatkówki. Może być również stosowana do wizualizacji interfejsu między urządzeniem a tkanką w innych systemach wykorzystujących twarde komponenty implantowane, takich jak implanty głęboko mózgowe, stenty naczyniowe lub protezy ortopedyczne.