Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

Ogólnym celem tej procedury jest ekspresja fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania w komercyjnie dostępnych komórkach owadów w celu lepszego wyjaśnienia funkcji białek i/lub komórkowego transportu białek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania oparte na biologii i biochemii komórki dotyczące funkcjonalności białek, interakcji białek i/lub lokalizacji białek subkomórkowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że konstrukty mogą być szybko generowane, a ekspresja białek funkcjonalnie oceniana w żywych komórkach bez szkodliwych skutków związanych z ekspresją bakulowirusa, co poprawia przepustowość.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w badanie białek owadów, może być również zastosowana do każdego systemu, dla którego pożądane jest badanie funkcji białka lub lokalizacji komórkowej. Procedurę hodowli i transfekcji komórek owadów zademonstruje Danni LeRoy, technik z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, wyjmij fiolki z zamrożonymi komórkami SF9 i Tni z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i pozostaw je do rozmrożenia w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po rozmrożeniu odkaż fiolki 70% etanolem i umieść je na lodzie. Wszystkie manipulacje komórkami wymagające otwarcia fiolek i kolb do hodowli tkankowych muszą być wykonywane w kapturze z przepływem laminarnym w celu utrzymania sterylnych warunków. Dodać cztery mililitry pożywki dla owadów bez surowicy do nowej kolby T25 i cztery mililitry pożywki TNM-FH do innej kolby T25.

Przenieść jeden mililitr rozmrożonych komórek Tni do kolby z pożywką dla owadów bez surowicy i jeden mililitr rozmrożonych komórek SF9 do kolby z pożywką TNM-FH. Umieścić kolby w nienawilżanym inkubatorze o temperaturze 28 stopni Celsjusza i pozostawić komórki na 30 do 45 minut. Zastąp podłoże wysiewające pięcioma mililitrami odpowiedniego podłoża.

I włóż kolby z powrotem do nienawilżanego inkubatora o temperaturze 28 stopni Celsjusza. Codziennie monitoruj zbieg komórek. Przejdź przez komórki, gdy osiągną 90% zbiegu, jak pokazano na tych reprezentatywnych obrazach.

Przechylić kolbę zawierającą zbiegające się komórki tak, aby pożywka spływała w kierunku jednego rogu od monowarstwy komórek i użyć sterylnej pięciomililitrowej pipety serologicznej w celu ostrożnego usunięcia pożywki bez naruszania komórek. W przypadku komórek Tni użyj nowej sterylnej pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby delikatnie dodać cztery mililitry pożywki dla owadów bez surowicy na zlewającą się monowarstwę. Przesunąć końcówkę pipety w poprzek kolby i powoli irygować, aby usunąć komórki luźno przylegające do dna kolby.

Aby sprawdzić, czy komórki są odpowiednio oderwane, usunąć wszystkie podłoża, obrócić kolbę i obserwować, czy dno kolby jest czyste. W przypadku ogniw SF9, które przylegają ściślej, dodaj cztery mililitry świeżej pożywki TNM-FH i użyj skrobaka do komórek, aby usunąć przyłączone ogniwa. Użyj pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby delikatnie wymieszać i zmniejszyć zlepianie się komórek.

Po odłączeniu komórek przenieś około 0,1 mililitra każdej mieszanki komórek i pożywki do 1,5 mililitrowej probówki do mikrofuge. W osobnej 0,5 mililitrowej probówce do mikrofuge dodaj 10 mikrolitrów każdej komórki i mieszaniny pożywki do 10 mikrolitrów błękitu trypanowego. Wyjąć szkiełko komory licznika komórek z opakowania i dodać 10 mikrolitrów mieszaniny trypanu niebieskiego w pożywce komórkowej z każdej strony szkiełka liczącego.

Włóż szkiełko do automatycznego licznika komórek i określ gęstość komórek oraz żywotność. Przenieść w przybliżeniu jedną do 1,5 razy 10 do 6 komórki do kolb T25 ze świeżą pożywką. Oznaczyć kolby linią komórkową, datą, użytą pożywką, liczbą dodanych komórek i numerem przejścia.

Umieść kolby w inkubatorze o temperaturze 28 stopni Celsjusza na okres do 72 godzin. Procedura transfekcji komórek owadów musi być również wykonywana w okapie z przepływem laminarnym. Wysiewać kolbę T25 z maksymalnie 10 do 6 komórek Tni lub SF9 w odpowiednim podłożu dla komórek owadów.

W tej demonstracji wykorzystano komórki TN. Hoduj komórki do zbiegu przez 72 godziny w temperaturze 18 stopni Celsjusza. 72 godziny później usuń i wyrzuć starą pożywkę i usuń komórki Tni czterema mililitrami świeżej pożywki dla owadów bez surowicy, jak pokazano wcześniej.

Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest uzyskanie odpowiedniej gęstości komórek przymocowanych do naczyń ze szklanym dnem podczas transfekcji. Do każdego naczynia należy dodać nie więcej niż siedem razy 10 do 5 komórki. Po użyciu automatycznego licznika komórek do oszacowania gęstości komórek, dokładnie, ale delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek, odwracając probówkę i dodaj około siedem razy 10 do 5 komórek do indywidualnych naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 milimetrów.

Pozwól komórkom przyczepić się przez 20 do 25 minut w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Do każdej transfekcji dodaj dwa mikrogramy plazmidowego DNA do 0,1 mililitra pożywki dla owadów bez surowicy bez FBS w sterylnej 1,5-mililitrowej probówce do mikrofuge. W osobnej probówce wymieszaj osiem mikrolitrów odczynnika do transfekcji z 0,1 mililitra pożywki dla owadów bez surowicy.

Następnie przenieś roztwór do probówki zawierającej plazmidowe DNA, które Cię interesuje. Lekko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut. Następnie rozcieńczyć mieszaninę transfekcji plazmidu 0,8 mililitra pożywki dla owadów bez surowicy, zwiększając całkowitą objętość do jednego mililitra.

Ostrożnie wyjmij nośnik ze szklanego naczynia zawierającego dołączone komórki. Nałóż przyłączone komórki na rozcieńczoną pożywkę do transfekcji plazmidu. Inkubuj komórki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez pięć godzin.

Po pięciu godzinach usuń i wyrzuć pożywkę do transfekcji i delikatnie umyj komórki jednym mililitrem pożywki dla owadów bez surowicy, uważając, aby nie usunąć komórek. Dodaj dwa mililitry świeżej pożywki z komórek owadów bez surowicy i inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 48 do 72 godzin. 48 do 72 godzin po transfekcji komórek owadów umyj komórki raz jednym mililitrem pożywki dla owadów IPL-41, a następnie przykryj dwoma mililitrami IPL-41 do obrazowania.

Dodać cztery krople odczynnika do barwienia żywych komórek Hoechst do pożywki i inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 20 do 25 minut. Umieść 35-milimetrową miskę w samodzielnie zamkniętym laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym. Chociaż wiele szklanych naczyń jest dostępnych na rynku, ważne jest, aby pasowały one do stolika mikroskopu i może być konieczne empiryczne określenie, które szkło jest najbardziej kompatybilne z mocowaniem komórek.

Dostosuj mikroskop do warunków obserwacji Hoechst, EGFP i mCherry. 359 nanometrów i 461 nanometrów do wzbudzenia i emisji Hoechsta. 489 nanometrów i 510 nanometrów do wzbudzenia i emisji EGFP.

Oraz 580 nanometrów i 610 nanometrów dla wzbudzenia i emisji mCherry. Używając obiektywu 10X, wykonaj wstępne skanowanie, aby potwierdzić ekspresję fluorescencyjną. Następnie przełącz się w tryb skanowania, korzystając z obiektywu z 60-krotnym kontrastem fazowym.

Dostosuj moc lasera, czułość detektora, prędkość skanowania, głębokość osi Z i zoom cyfrowy, aby zoptymalizować kontrast i rozdzielczość obrazu. Zobrazuj komórki z 1,5-krotnym zoomem cyfrowym, aby uzyskać łącznie 90-krotne wzmocnienie. Zapisz i wyeksportuj surowe dane jako pliki obrazów TIFF do późniejszej analizy.

Komórki Tni transfekowano wskazanymi plazmidami, a ekspresję białek rekombinowanych wizualizowano za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Udana transfekcja i ekspresja rekombinowanego BtDrip1-EGFP jest widoczna w obecności zielonej fluorescencji na powierzchni komórki. Komórki transfekowane BtDrip2 wersja pierwsza EGFP wykazują zieloną fluorescencję w środku, wskazując na wewnątrzkomórkową ekspresję BtDrip2 wersji pierwszej.

Podobnie, komórki transfekowane PIB DmSPR-mCherry lub PIB PLA2G15-mCherry wykazują czerwoną fluorescencję wskazującą na ekspresję odpowiednich chimer. Na połączonych obrazach pomarańczowe lub żółte obszary wskazują na ekspresję zarówno EGFP, jak i mCherry, co sugeruje, że białka są kolokalizowane w tych samych strukturach subkomórkowych. Nakładanie komórek podwójnie transfekowanych PIB BtDrip1-EGFP i PIB DmSPR-mCherry sugeruje kolokalizację BtDrip1-EGFP i DmSPR-mCherry na powierzchni komórki.

Komórki podwójnie transfekowane BtDrip2 w wersji pierwszej, EGFP i PIB DmSPR-mCherry wykazują niewielką kolokalizację sygnałów fluorescencyjnej zielonej i czerwonej potwierdzającej wewnątrzkomórkową ekspresję BtDrip2 w wersji pierwszej. W przeciwieństwie do tego, koekspresja PIB BtDrip2 wersja jedna EGFP i marker lizosomalny PIB PLA2G15-mCherry spowodowała znaczne nakładanie się cytoplazmatycznych sygnałów fluorescencyjnych zieleni i czerwieni. To zdecydowanie sugeruje, że BtDrip2 to ruch do lizosomów międzykomórkowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyrażać fluorescencyjne chimery białkowe w hodowanych komórkach owadów. System ten oferuje szybką budowę wektorów w syntezie białek, pozwala uniknąć wyzwań związanych z systemami ekspresji opartymi na wirusach i zapewnia solidne środki do obserwacji białek transportu komórkowego.