Name: Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Poznaj metodę przejściowej ekspresji białek fluorescencyjnych w komórkach owadów SF9 i Tni. Technika umożliwia szybką ocenę lokalizacji komórkowej i funkcji białek bez użycia bakulowirusów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Lynn Forlow-Jech i Dannialle LeRoy za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez podstawowe finansowanie CRIS dla USDA ARS, National Program 304 - Crop Protection and Quarantine [Project #2020-22620-022-00D] dla J.A.F. i J.J.H. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tym artykule służy wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznacza rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą.

1. OE-PCR do budowy plazmidów ekspresyjnych
Uwaga: Zobacz Tabelę 1 dla wszystkich starterów używanych w OE-PCR. Stosowanie polimerazy DNA o wysokiej wierności jest zalecane w przypadku wszystkich amplifikacji. Ponieważ jednak enzymy te często nie opuszczają 3' A, konieczne jest wykonanie krótkiej, nieamplifikującej inkubacji z polimerazą DNA Taq w celu "ogona" produktów PCR przed sklonowaniem ich do wektora ekspresji komórek owadów TA. Protokół ten demonstruje metodę generowania plazmidów ekspresji owadów zawierających białka chimeryczne, z białkami fluorescencyjnymi połączonymi w ramce z końcem karboksylowym interesujących genów (w tym przypadku z dwoma białkami akwaporyny Bemisia tabaci) lub z subkomórkowymi białkami markerowymi (Figura 1).
<ol>
	<li>Użyj OE-PCR, który składa się z dwóch niezależnych rund amplifikacji, aby wygenerować: (1) sekwencje kodujące interesujące geny (B. tabaci akwaporyna 1: BtDrip1; B. tabaci akwaporyna 2: BtDrip2_v1) połączona w ramce z zielonym wariantem białka fluorescencyjnego zwanym EGFP lub (2) markerami subkomórkowymi (receptor peptydu płciowego Drosophila melanogaster: DmSPR; Homo sapiens fosfolipaza A2: HsPLA2) z sekwencją kodującą mCherry. Bezpośrednio podwiązywać końcowe produkty OE-PCR do plazmidu pIB/V5-His-TA.
	<ol>
		<li>W pierwszej rundzie OE-PCR (oznaczonej przez A-D i A'-D' na rysunku 1) należy użyć startera zmysłowego specyficznego dla genu (pokazanego pogrubioną czcionką w tabeli 1) i chimerycznego startera antysensownego (kursywą w tabeli 1) odpowiadającego końcowym 15 pz (bez kodonu stop) genu będącego przedmiotem zainteresowania/markera subkomórkowego i 15 pz końca 5' pożądanego białka fluorescencyjnego (EGFP lub mCherry) w celu wytworzenia produktu z wysięgiem 3'. 
		Uwaga: Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z warunkami PCR.</li>
		<li>W osobnej probówce użyj specyficznego dla genu startera antysensownego białka fluorescencyjnego (pokazanego z podkreśleniem w Tabeli 1) i chimerycznego startera zmysłowego, który zawiera 15 pz od końca 3' genu będącego przedmiotem zainteresowania / markera subkomórkowego i 15 pz od końca 5' pożądanego białka fluorescencyjnego, aby wytworzyć produkt o zwisie 5'. 
		Uwaga: Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z warunkami PCR. Matryca PCR może być albo produktem PCR zwalidowanym sekwencyjnie, albo, co bardziej pożądane, plazmidowym DNA zawierającym pożądaną sekwencję. Opisane tutaj badanie wykorzystuje plazmidy zwalidowane sekwencyjnie.</li>
		<li>Oddzielić produkty PCR za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym (przy użyciu standardowej agarozy molekularnej).</li>
		<li>Należy wyciąć i oczyścić produkty o oczekiwanych rozmiarach (zob. tabela 2) przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelem DNA (zob. tabela materiałów dla konkretnego zestawu stosowanego w niniejszym protokole).</li>
		<li>Użyj oczyszczonych w żelu produktów PCR z kroku 1.1.4, aby wygenerować końcowe produkty przedłużające zakładkę (wskazane przez A''-D'' na rysunku 1). Użyj specyficznego dla genu startera zmysłowego dla genu będącego przedmiotem zainteresowania/markera subkomórkowego i odpowiadającego mu specyficznego dla genu startera antysensownego dla białka fluorescencyjnego, aby wygenerować pożądaną sekwencję chimeryczną. 
		Uwaga: Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z warunkami PCR. Konieczne może być empiryczne określenie optymalnych ilości produktów pierwszej rundy rozszerzania nakładania się, które należy dodać do mieszaniny reakcyjnej w celu uzyskania końcowego, pełnego produktu chimerycznego PCR.</li>
		<li>Oddzielić produkty OE-PCR drugiej rundy za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym. Wyciąć i oczyścić produkty za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu DNA.</li>
		<li>Inkubować oczyszczone żelem produkty OE-PCR drugiej rundy z 1 jednostką głównej mieszanki polimerazy DNA Taq przez 10 minut w temperaturze 72 °C w celu wytworzenia 3' adenylowanych (tj. A-ogoniastych) produktów potrzebnych do klonowania TA.</li>
		<li>Związać powstałe produkty adenylowane z wektorem ekspresyjnym pIB i zastosować standardowe techniki klonowania molekularnego w celu przekształcenia chemicznie kompetentnych (szok cieplny) lub elektrokompetentnych (elektroporacja) komórek Escherichia coli. Płytkę przez noc umieszczać na podłożu zawierającym odpowiedni znacznik selekcyjny (tj. ampicylinę lub karbenicylinę).</li>
		<li>Wykonaj PCR12 przy użyciu startera specyficznego dla wektora i startera specyficznego dla insertu, aby zidentyfikować kolonie dodatnie dla insercji, które zostały przekształcone z plazmidami ekspresyjnymi zawierającymi insert w orientacji 5'-3'. Przygotuj nocne kultury kolonii, uzyskując produkty PCR o oczekiwanych rozmiarach.</li>
		<li>Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania DNA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się z konkretnym zestawem używanym w tym protokole). Zweryfikuj integralność sekwencji każdej wstawki za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania DNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Utrzymanie hodowli komórek owadów
Uwaga: Aby utrzymać sterylne warunki, przeprowadzaj wszystkie manipulacje komórkami wymagające otwarcia kolby do hodowli tkankowej w kapturze z przepływem laminarnym. Włącz lampę bakteriobójczą UV z przepływem laminarnym co najmniej 1 godzinę przed manipulacją komórkami. Nosić rękawice nitrylowe i przed użyciem odkazić powierzchnię stołu, pipet, przyborów kuchennych, probówek i kolb 70% etanolem. Zalecana znajomość podstawowych technik hodowli komórkowych13.
<ol>
	<li>Należy użyć komórek Tni (ustalonej linii hodowli komórkowych pochodzącej z tkanki jajnika Trichoplusia ni), które są przystosowane do podłoża bez surowicy, i utrzymywać je jako przylegającą hodowlę jednowarstwową w pożywce dla owadów bez surowicy w temperaturze 28 °C w kolbach do hodowli tkankowych T25.</li>
	<li>Utrzymuj komórki Sf9 (ustaloną linię hodowli komórkowych pochodzącą z tkanki jajnika Spodoptera frugiperda) podobnie, ale przy użyciu pożywki do hodowli owadów TNM-FH uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).</li>
	<li>Wysiewać początkową kulturę z zamrożonych komórek Sf9 lub Tni, wyjmując fiolki podstawowe z temperatury -80 °C i pozwalając im rozmrozić się w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po rozmrożeniu odkazić fiolki 70% etanolem i umieścić je na lodzie.</li>
	<li>Dodać 4 ml pożywki z komórek owadów do nowej kolby T25 i przenieść 1 ml zawiesiny rozmrożonych komórek owadów. Umieścić kolbę w nienawilżanym inkubatorze o temperaturze 28 °C i pozostawić komórki do przyczepienia się na 30-45 minut.</li>
	<li>Zastąpić podłoże wysiewające 5 ml odpowiedniego podłoża i przenieść kolby do inkubatora bez nawilżania o temperaturze 28 °C. Codziennie monitoruj zbieg komórek. Przejdź przez komórki, gdy osiągną 90% konfluencji. 
	Uwaga: Pełne pokrycie kolby T25 odpowiada ~5 x 106 komórek.</li>
	<li>Przejście komórek owadów.
	<ol>
		<li>Aby przejść przez komórki, należy najpierw usunąć wyczerpane podłoże z kolby zawierającej zbiegające się komórki za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Przechylić kolbę tak, aby pożywka spływała do jednego rogu, z dala od monowarstwy komórek. Ostrożnie usunąć pożywkę za pomocą pipety, nie naruszając komórek.</li>
		<li>Usunąć komórki Tni poprzez delikatne przepłukanie kolb T25 zawierających zlewającą się monowarstwę 4 ml pożywki dla owadów bez surowicy za pomocą nowej, sterylnej pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Przesunąć końcówkę pipety w poprzek kolby i powoli irygować, aby usunąć komórki luźno przylegające do dna kolby.
		<ol>
			<li>Sprawdzić, czy komórki są odpowiednio oderwane, usuwając wszystkie media, obracając kolbę i obserwując, czy dno kolby jest czyste.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku komórek Sf9, które przylegają ściślej, dodaj 4 ml świeżej pożywki TNM-FH i użyj skrobaka do komórek, aby usunąć przyczepione komórki. Użyj pipety serologicznej o pojemności 5 ml, aby delikatnie wymieszać i zmniejszyć zbrylanie komórek.</li>
		<li>Użyj automatycznego licznika komórek, aby oszacować liczbę żywotnych komórek owadów na objętość pożywki. Przenieś 0,1 ml mieszaniny komórek/pożywki do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. W oddzielnej probówce do mikrofuge o pojemności 0,5 ml dodaj 10 μl mieszaniny komórek/pożywki do 10 μl błękitu trypanowego.</li>
		<li>Wyjąć z opakowania szkiełko z komorą licznika komórek i dodać 10 μl mieszaniny komórek/pożywki/błękitu trypanowego z każdej strony szkiełka zliczającego. Włóż szkiełko do licznika komórek i określ gęstość komórek i żywotność.</li>
		<li>Korzystając z gęstości komórek, oblicz i dodaj odpowiednią objętość pożywki z komórek owadów (do 5 ml) do nowych, sterylnych kolb T25.</li>
		<li>Przenieść około 1-1,5 x 106 komórek do kolb T25 ze świeżą pożywką; oznaczyć kolby linią komórkową, datą, użytą pożywką, liczbą dodanych komórek i numerem pasażu (Pn + 1 pokolenie, gdzie Pn jest numerem pasażu dla poprzedniego pokolenia komórek); i umieścić kolby w inkubatorze o temperaturze 28 °C na czas do 72 godzin 
Uwaga: Komórki owadów mogą być rozmnażane w sposób ciągły, chociaż komórki mogą być mniej podatne na transfekcję i/lub ekspresję białek heterologicznych po 30 przejściach. Przed wyrzuceniem potraktuj wszystkie wyrzucone komórki/pożywki 10% roztworem wybielacza i autoklaw jednorazowe plastikowe naczynia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Transfekcja komórek owadów
<ol>
	<li>Umieścić kolbę T25 z maksymalnie 1 x 10 6 komórek Tni lub Sf9 w odpowiednim podłożu dla komórek owadów (pożywka dla owadów niezawierająca surowicy dla Tni i TNM-FH dla Sf9) i rosnąć do zbiegu przez 72 godziny w temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Usunąć i wyrzucić starą pożywkę i usunąć komórki za pomocą 4 ml świeżej pożywki dla owadów bez surowicy (patrz kroki 2.6.2 i 2.6.3 powyżej).</li>
	<li>Oszacuj gęstość komórek za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz krok 2.6.4 powyżej).</li>
	<li>Dodać około 7 x 105 komórek do pojedynczych naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i pozostawić komórki na 20-25 minut w temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Do każdej transfekcji dodać 2 μg plazmidowego DNA (z jednego plazmidu w przypadku pojedynczych transfekcji lub 2 μg z każdego z dwóch plazmidów w przypadku podwójnej transfekcji) do 0,1 ml pożywki dla owadów bez surowicy (bez FBS zarówno dla transfekcji Sf9, jak i Tni) w sterylnej probówce do mikrofugowania o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>W osobnej probówce wymieszaj 8 μl odczynnika do transfekcji z 0,1 ml pożywki dla owadów bez surowicy, a następnie przenieś ten roztwór do probówki zawierającej plazmidowe DNA, które Cię interesuje. Lekko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 - 30 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć mieszaninę transfekcji plazmidu z etapów 3.5 i 3.6 0,8 ml pożywki dla owadów niezawierających surowicy, tak aby całkowita objętość wynosiła 1 ml.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij nośnik ze szklanych naczyń zawierających przyczepione komórki. Nałóż przyłączone komórki na rozcieńczoną pożywkę do transfekcji plazmidu.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 28 °C przez 5 h. 
	Uwaga: Warunki transfekcji wymagają empirycznej optymalizacji w celu uzyskania maksymalnej wydajności transfekcji (np. transfekcja przez noc zamiast 5 godzin, ilość użytego plazmidowego DNA, skład chemiczny użytego odczynnika do transfekcji itp.).</li>
	<li>Usunąć i wyrzucić pożywkę do transfekcji i delikatnie umyć komórki 1 ml pożywki dla owadów bez surowicy, uważając, aby nie usunąć komórek.</li>
	<li>Dodać 2 ml świeżej pożywki z komórek owadów (pożywki dla owadów bez surowicy dla Tni i TNM-FH dla Sf9) i inkubować w temperaturze 28 °C przez 48-72 godz. 
	Uwaga: Ponownie, warunki wymagają empirycznej optymalizacji dla maksymalnej ekspresji białka heterologicznego.</li>
</ol>
4. Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna
<ol>
	<li>Po 48-72 godzinach od transfekcji przemyj komórki raz 1 ml pożywki dla owadów IPL-41, a następnie przykryj 2 ml IPL-41 do obrazowania. 
	Uwaga: Ten etap mycia zmniejsza autofluorescencję tła obserwowaną w przypadku pożywki z komórek owadów używanej do normalnej konserwacji komórek.</li>
	<li>Dodać 4 krople odczynnika do barwienia żywych komórek Hoechst (patrz tabela materiałów dla specyficznego barwnika jądrowego stosowanego w niniejszym protokole) do pożywki i inkubować w temperaturze 28 °C przez 20-25 min. 
	Uwaga: Można zastąpić dodatkowe barwniki jądrowe, chociaż barwnik powinien mieć profil fluorescencyjny unikalny dla EGFP i mCherry.</li>
	<li>Umieść czaszę o średnicy 35 mm w samozamykającym się laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym (patrz tabela materiałów dla konkretnego instrumentu używanego w tym protokole).</li>
	<li>Dostosuj mikroskop do warunków obserwacji Hoechst, EGFP i mCherry: wzbudzenie/emisja Hoechsta - 359/461 nm; wzbudzenie/emisja EGFP - 489/510 nm; mWzbudzenie/emisja wiśni - 580/610 nm.</li>
	<li>Wykonaj wstępne skanowanie przy użyciu obiektywu 10x, aby potwierdzić ekspresję fluorescencyjną, a następnie przełącz się w tryb skanowania za pomocą obiektywu zanurzonego w wodzie z kontrastem fazowym 60x.</li>
	<li>Dostosuj moc lasera (5-7%), czułość detektora (47-49%), prędkość skanowania, głębokość osi Z i zoom cyfrowy, aby zoptymalizować kontrast i rozdzielczość obrazu. Zobrazuj komórki z 1,5-krotnym zoomem cyfrowym, aby uzyskać łączne 90-krotne wzmocnienie. 
	Uwaga: Parametry mikroskopu wymagają empirycznej regulacji w celu optymalnego zbierania obrazu i mogą być specyficzne dla używanego instrumentu.</li>
	<li>Eksportuj surowe dane jako pliki obrazów TIFF i modyfikuj (przycinaj i nakładaj) w celu wygenerowania figury.</li>
</ol>

<ol><li>Kost, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).</li>
<li>van Oers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty+years+of+baculovirus-insect+cell+protein+expression%3A+from+dark+horse+to+mainstream+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology.</a> J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).</li>
<li>Contreras-Gòmez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+using+the+baculovirus-insect+cell+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Progr%22%5BJournal%5D)">Protein production using the baculovirus-insect cell expression system.</a> Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).</li>
<li>Hunt, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+to+protein%3A+a+review+of+new+and+enabling+technologies+for+multi-parallel+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expres.+Purif%22%5BJournal%5D)">From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression.</a> Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).</li>
<li>Kollewe, C., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://thescipub.com/abstract/10.3844/ajbbsp.2013.255.271">Production of recombinant proteins in insect cells.</a> Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).</li>
<li>Altmann, F., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltmann%2C+F+%22Glycotechnology%22">Glycotechnology</a>. Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D. , Springer. Boston, MA. 29-43 (1999).</li>
<li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+plasmid-based+transient+gene+expression+method+using+High+Five+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells.</a> J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+of+membrane+protein+expression+in+transiently+transfected+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expres.+Purif%22%5BJournal%5D)">Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells.</a> Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).</li>
<li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-free+transient+protein+production+in+Sf9+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Virus-free transient protein production in Sf9 cells.</a> J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).</li>
<li>Loomis, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InsectDirect+System%3A+rapid%2C+high-level+protein+expression+and+purification+from+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Funct.+Genomics%22%5BJournal%5D)">InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).</li>
<li>Wurch, T., et al. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1023%2FA%3A1008848517221">A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes.</a> Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).</li>
<li>Woodman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+PCR+of+intact+bacteria+%28colony+PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct PCR of intact bacteria (colony PCR).</a> Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).</li>
<li>Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0">http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0</a> (2014).</li>
<li>Mathew, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+functional+aquaporin+water+channel+protein+from+alimentary+tract+of+whitefly%2C+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).</li>
<li>Van Ekert, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characterization+of+Bemisia+tabaci+aquaporins+reveals+the+water+channel+diversity+of+hemipteran+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).</li>
<li>Hull, J. J., Brent, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+sex+peptide+receptor-like+transcript+from+the+western+tarnished+plant+bug+Lygus+hesperus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus.</a> Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).</li>
<li>Maroniche, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+set+of+Gateway-compatible+vectors+for+live+imaging+in+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells.</a> Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).</li>
<li>Hull, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+western+tarnished+plant+but+%28Lygus+hesperus%29+olfactory+co-receptor+ORCO%3A+Expression+profile+and+confirmation+of+atypical+membrane+topology%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology.</a> Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).</li>
<li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+the+PBAN+receptor+molecule%3A+Characterization+of+PBANR+variants+expressed+in+the+pheromone+glands+of+moths%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths.</a> Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).</li>
<li>Fabrick, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characterization+of+multiple+aquaporin+water+channel+proteins+from+the+western+tarnished+plant+bug%2C+Lygus+hesperus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).</li>
<li>Lu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+baculovirus+%28Bombyx+mori+nuclear+polyhedrosis+virus%29+repeat+element+functions+as+a+powerful+constitutive+enhancer+in+transfected+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells.</a> J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).</li>
<li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/286814771_Comparative_analysis_of_the_activity_of_two_promoters_in_insect_cells">Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells.</a> African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).</li>
<li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+a+cell+biologist%27s+user+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).</li>
<li>Kohnhorst, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+functions+of+proteins+under+fluorescence+single-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).</li>
<li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+quantitative+colocalization+analysis%3A+focus+on+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>Chalfie, M., et al. <a target="_blank" href="http://science.sciencemag.org/content/263/5148/802">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Heterologiczne systemy ekspresji białek są ważnymi narzędziami do produkcji białek rekombinowanych wykorzystywanych w licznych dalszych zastosowaniach4. Wybór spośród różnych dostępnych systemów ekspresji zależy od celu końcowego dla interesującego nas białka. Dostępnych jest kilka systemów ekspresji komórek owadów, które stanowią elastyczną alternatywę dla prokariotycznych i eukariotycznych systemów ekspresji komórek 5,6. Systemy owadzie,...

Produkcja białek rekombinowanych za pomocą systemów ekspresji komórek owadów oferuje liczne korzyści dla badania białek eukariotycznych. Mianowicie, komórki owadów mają podobne modyfikacje potranslacyjne, mechanizmy przetwarzania i sortowania, jak te obecne w komórkach ssaków, co jest korzystne dla produkcji prawidłowo pofałdowanych białek1,2,3. Systemy komórkowe owadów zazwyczaj wymagają również mniej zasobów oraz mniej czasu i wysiłku na utrzymanie niż linie komórkowe ssaków4,5. System ekspresji bakulowirusa jest jednym z takich systemów opartych na komórkach owadów, który jest obecnie szeroko stosowany w wielu dyscyplinach, w tym w produkcji rekombinowanych białek do charakteryzacji białek i terapii, immunogennej prezentacji obcych peptydów i białek wirusowych do produkcji szczepionek, syntezie kompleksów wielobiałkowych, produkcji białek glikozylowanych itp. 1,2,4,6. Istnieją jednak sytuacje, w których ekspresja bakulowirusa może nie mieć zastosowania3,7, a użycie nielitycznych i przejściowych systemów ekspresji owadów może być bardziej odpowiednie. W szczególności przejściowa ekspresja komórek owadów daje możliwość szybkiej syntezy rekombinowanego białka, wymaga mniej rozwoju i konserwacji, nie wiąże się z lizą komórek narzuconą przez wirusa i zapewnia środki do lepszego badania transportu komórkowego podczas syntezy białek7,8,9,10.
Ten protokół opisuje szybkie generowanie wektorów ekspresyjnych za pomocą dwuetapowego nakładania się PCR (OE-PCR) 11 oraz standardowego klonowania plazmidowego DNA u Escherichia coli. Plazmidy są używane do podwójnej transfekcji dostępnych na rynku hodowanych komórek owadów i do produkcji reprezentatywnych białek. Protokół opisuje produkcję i wykorzystanie dwóch różnych, znakowanych fluorescencyjnie subkomórkowych białek markerowych i wykazuje kolokalizację z dwoma białkami akwaporyny owada Bemisia tabaci. Poniższy protokół zawiera podstawową metodologię OE-PCR, utrzymania i transfekcji komórek owadów oraz mikroskopii fluorescencyjnej do lokalizacji komórkowej docelowych białek.

<table><tbody><tr><td>Polimeraza DNA KOD</td><td>EMD Millipore</td><td>71085-3</td><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności stosowana do amplifikacji PCR PCR z amplifikacją rozszerzania nakładania się produktów PCR</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA ExTaq Polimeraza DNA</td><td>TaKaRa-Clontech</td><td>RR001B</td><td>stosowana do ogonowania A produktów PCR</td></tr><tr><td>EconoTaq PLUS ZIELONY 2x Polimeraza DNA Master Mix</td><td>Lucigen</td><td>30033-1</td><td>Polimeraza DNA stosowana do PCR</td></tr> <tr><td>kolonii bakteryjnychProfesjonalny termocykler gradientowy</td><td>Biometra/LABRepCo</td><td>070-851</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza LE</td><td>Benchmark Scientific</td><td>A1705</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Bezpieczne barwienie żelem DNA</td><td>ThermoFisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu DNA do montażu</td><td>EMD Millipore</td><td>LSKGEL050</td><td></td></tr><tr><td>pIB/V5-His Zestaw do ekspresji TOPO TA</td><td>ThermoFisher</td><td>K89020</td><td>Zawiera składniki potrzebne do klonowania produktów PCR z rozszerzeniem nakładania się, w tym linearyzowany i aktywowany topoizomerazą wektor pIB / V5-His-TOPO, chemicznie kompetentny E. coli One Shot TOP10 i roztwór soli.</td></tr><tr><td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube Robotic Workstation</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td></td></tr><tr><td>Purifier Vertical Clean Bench</td><td>Labconco</td><td>3970401</td><td></td></tr><tr><td>Allel linii komórek owadów z hodowlą Tni</td><td>Biotech</td><td>ABP-CEL-10005</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 Allel linii komórek owadów</td><td>Biotech</td><td>ABP-CEL-10002</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli owadów bez surowicy</td><td>Biotech</td><td>ABP-MED-10002</td><td></td></tr><tr><td>TNM-FH Pożywka do hodowli owadów</td><td>Biotech</td><td>ABP-MED-10001</td><td></td></tr><tr><td>IPL-41 Pożywka dla owadów</td><td>ThermoFisher</td><td>11405081</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Cellfectin II</td><td>ThermoFisher</td><td>10362100</td><td></td></tr><tr><td>16 cm Jednorazowe skrobaki do komórek</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td>Cell skrobaki z ostrzem dwupozycyjnym</td></tr><tr><td>25 cm2 (T25) Kolby do hodowli tkankowych z nasadkami filtra odpowietrzającego Produkty</td><td>z branży nauk przyrodniczych</td><td>CT-229331</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Fisher</td><td>1371120</td><td></td></tr><tr><td>sterylne, 50 ml Probówki do bioreakcji</td> Produkty dla <td>nauk przyrodniczych</td><td>CT-229475</td><td></td></tr><tr><td>PipeBoy</td><td>VWR</td><td>14222-180</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serologiczne Pipety</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml probówki do PCR z płaską nasadką</td><td>Fisher</td><td>14230200</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowe worki autoklawe Biohazard</td><td>Fisher</td><td>01828C</td><td></td></tr><tr><td>35 mm #1,5 Naczynia ze szklanym dnem</td><td>Matsunami Glass</td><td>D35-14-1.5-U</td><td>Średnica czaszy 35 mm, średnica szkła 14 mm, grubość szkła 1,5 mm, niepowlekany</td></tr><tr><td>Inkubator, model 1510E</td><td>VWR</td><td>35823-961</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek Countess II FL</td><td>ThermoFisher</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka komory do liczenia komórek Countess z 0,4% odczynnikiem błękitu trypanowego</td><td>ThermoFisher</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview FV10i-LIV Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV10i-LIV</td><td></td></tr><tr><td>HsPLA2/pCS6 plazmidowe DNA</td><td>transOMIC Technologies</td><td>TCH1303</td><td></td></tr><tr><td>pmCherry Vector</td><td>Clontech</td><td>632522</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37605</td><td></td></tr></tbody></table>

przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologiczne systemy ekspresji białek są używane do produkcji białek rekombinowanych, interpretacji transportu/lokalizacji komórkowej oraz określania funkcji biochemicznej białek na poziomie suborganizmów. Chociaż systemy ekspresji bakulowirusa są coraz częściej wykorzystywane do produkcji białek w licznych zastosowaniach biotechnologicznych, farmaceutycznych i przemysłowych, systemy nielityczne, które nie wiążą się z infekcją wirusową, przynoszą wyraźne korzyści, ale często są pomijane i niedostatecznie wykorzystywane. W tym miejscu opisujemy metodę generowania nielitycznych wektorów ekspresyjnych i przejściowej ekspresji białek rekombinowanych. Protokół ten pozwala na efektywną lokalizację komórkową rekombinowanych białek i może być wykorzystany do szybkiego rozpoznania transportu białek w komórce. Pokazujemy ekspresję czterech rekombinowanych białek w dostępnej na rynku linii komórkowej owadów, w tym dwóch białek akwaporyny z owada Bemisia tabaci, a także subkomórkowych białek markerowych specyficznych dla błony komórkowej plazmatyki i lizosomów wewnątrzkomórkowych. Wszystkie rekombinowane białka wyprodukowano jako chimery z fluorescencyjnymi markerami białkowymi na ich końcach karboksylowych, co pozwala na bezpośrednie wykrycie rekombinowanych białek. Podwójna transfekcja komórek z plazmidami zawierającymi konstrukty dla genów będących przedmiotem zainteresowania i znanym markerem subkomórkowym pozwala na obrazowanie żywych komórek i lepszą walidację lokalizacji białek komórkowych.

OE-PCR
Metoda OE-PCR umożliwia syntezę chimerycznych produktów DNA, które po wprowadzeniu do wektora ekspresyjnego pozwalają na produkcję rekombinowanych białek chimerycznych odpowiadających dowolnemu badanemu genowi oraz białku markerowemu fluorescencyjnemu. Rycina 1 przedstawia ogólny schemat produkcji wektorów ekspresyjnych pIB zawierających sekwencje kodujące akwaporyny B. tabaci (BtDrip1 i BtDrip2_v1)...

Nielityczne systemy ekspresji komórek owadów są niedostatecznie wykorzystywane do produkcji, transportu/lokalizacji komórkowej i analizy funkcjonalnej białek rekombinowanych. W tym miejscu opisujemy metody generowania wektorów ekspresyjnych i późniejszej przejściowej ekspresji białek w dostępnych na rynku liniach komórkowych lepidoptera. Przedstawiono również kolokalizację akwaporyn Bemisia tabaci z subkomórkowymi białkami markerowymi fluorescencyjnymi.

Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ekspresja białek zainteresowania z fluorescencyjnym znacznikiem w komercyjnie dostępnych liniach komórkowych owadów w celu dokładniejszego wyjaśnienia funkcji białek lub ich transportu wewnątrzkomórkowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki i biochemii dotyczące funkcjonalności białek, oddziaływań białkowych lub subkomórkowej lokalizacji białek. Główną zaletą tej techniki jest możliwość szybkiego generowania konstruktów oraz funkcjonalnej oceny ekspresowanych białek w żywych komórkach bez efektów szkodliwych związanych z ekspresją za pomocą bakulowirusów, co zwiększa wydajność procesu.Choć metoda ta może dostarczyć cennych informacji w badaniach białek owadziego pochodzenia, można ją zastosować w każdym systemie, w którym pożądane jest badanie funkcji białka lub jego lokalizacji komórkowej. Procedurę hodowli i transfekcji komórek owadziech zaprezentuje Danni LeRoy, technik z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyjąć fiolki z zamrożonymi zapasami komórek SF9 i Tni z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozwolić im się rozmrozić w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.Po rozmrożeniu odkaź fiolki 70% etanolem i umieść je w lodzie. Wszystkie manipulacje z komórkami wymagające otwierania fiolek i kolb do hodowli tkankowej muszą być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu zachowania warunków sterylnych. Do nowej kolby T25 dodaj cztery mililitry bezsurowiczego medium dla owadów, a do drugiej kolby T25 cztery mililitry medium TNM-FH.Przenieś jeden mililitr rozmrożonych komórek Tni do kolby z bezzsrerowym medium dla owadów oraz jeden mililitr rozmrożonych komórek SF9 do kolby z medium TNM-FH. Umieść kolby w nieuwilgotnionej inkubatorze w temperaturze 28 °C i pozwól komórkom przytwierdzić się przez 30 do 45 minut. Zastąp medium do wysiewu pięcioma mililitrami odpowiedniego medium.Następnie należy przenieść kolby z powrotem do inkubatora nieuwilgotnionego o temperaturze 28 °C. Codziennie monitorować konfluencję komórek. Pasażować komórki po osiągnięciu przez nie 90% konfluencji, co przedstawiają poniższe reprezentatywne obrazy.Przechyl kolbę z konfluentnymi komórkami tak, aby pożywka spłynęła w stronę jednego z narożników, z dala od monowarstwy komórek, a następnie za pomocą sterylnej pipety serologicznej o objętości 5 ml ostrożnie usuń pożywkę, nie naruszając komórek. W przypadku komórek Tni użyj nowej sterylnej pipety serologicznej o objętości 5 ml, aby delikatnie dodać 4 ml bezzserwatkowej pożywki dla owadów na konfluentną monowarstwę. Przesuwaj końcówkę pipety po kolbie i powoli płucz, aby usunąć komórki słabo przytwierdzone do dna kolby.Aby sprawdzić, czy komórki zostały odpowiednio odspojone, należy usunąć całą pożywkę, odwrócić kolbę i upewnić się, że dno kolby jest czyste. W przypadku komórek SF9, które przylegają mocniej, należy dodać 4 mL świeżej pożywki TNM-FH i użyć skrobaka do komórek, aby odspoić przytwierdzone komórki. Należy użyć pipety serologicznej o pojemności 5 mL, aby delikatnie wymieszać zawiesinę i zredukować agregację komórek.Po odłączeniu komórek przenieś około 0,1 ml każdej mieszaniny komórek i medium do probówki do wirówki o pojemności 1,5 ml. W oddzielnej probówce do wirówki o pojemności 0,5 ml dodaj 10 µL każdej mieszaniny komórek i medium do 10 µL błękitu trypanu. Wyjmij preparat do komory licznika komórek z opakowania i nanieś 10 µL mieszaniny medium komórkowego i błękitu trypanu na każdą stronę preparatu do liczenia.Włóż preparat do automatycznego licznika komórek i określ gęstość oraz żywotność komórek. Przenieś około 1 do 1,5 × 10⁶ komórek do kolb T25 ze świeżą pożywką. Oznacz kolby, podając linię komórkową, datę, użytą pożywkę, liczbę dodanych komórek oraz numer pasażu.Umieść kolby w inkubatorze w temperaturze 28 °C na maksymalnie 72 godziny. Procedura transfekcji komórek owadziego musi być również przeprowadzona w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Zaszczep kolbę T25 do 1 × 10⁶ komórek Tni lub SF9 w odpowiedniej pożywce dla komórek owadziego.W tym pokazie wykorzystano komórki Tni. Hoduj komórki do uzyskania konfluencji przez 72 hours w temperaturze 18 degrees celsius. Po 72 hours usuń i wylej zużytą pożywkę, a następnie odseparuj komórki Tni za pomocą czterech milliliters świeżej pożywki dla owadów bez surowicy, zgodnie z wcześniejszą instrukcją.Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest uzyskanie odpowiedniej gęstości komórek przytwierdzonych do szalek z szklanym dnem podczas transfekcji. Do każdej szalki nie należy dodawać więcej niż 7 × 10⁵ komórek. Po użyciu automatycznego licznika komórek do oszacowania ich gęstości, należy dokładnie, ale delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową poprzez odwracanie probówki, a następnie dodać około 7 × 10⁵ komórek do poszczególnych szalek z szklanym dnem o średnicy 35 mm.Pozostawić komórki do przyczepienia na 20 do 25 minut w temperaturze 28 °C. Dla każdej transfekcji dodać 2 µg plazmidowego DNA do 0,1 ml bezserwatkowego medium dla owadów bez FBS w sterylnym probówce mikrocentryfugacyjnej o pojemności 1,5 ml. W oddzielnej probówce zmieszać 8 µl odczynnika do transfekcji z 0,1 ml bezserwatkowego medium dla owadów.Następnie przenieś roztwór do probówki zawierającej odpowiedni plazmidowy DNA. Delikatnie wymieszaj na wirówce typu vortex i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut. Następnie rozcieńcz mieszaninę do transfekcji plazmidowej 0,8 mililitrów bezserwatkowego medium dla owadów, tak aby uzyskać całkowitą objętość jednego mililitra.Ostrożnie usuń medium z szalki szklanej zawierającej przytwierdzone komórki. Przykryj przytwierdzone komórki rozcieńczonym medium do transfekcji plazmidowej. Inkubuj komórki w temperaturze 28 °C przez pięć godzin.Po pięciu godzinach usunąć i wylać medium do transfekcji, a następnie delikatnie przemyć komórki jednym mililitrem bezsurowiczego medium dla owadów, uważając, aby nie oderwać komórek od podłoża. Dodać dwa mililitry świeżego bezsurowiczego medium dla komórek owadów i inkubować w temperaturze 28 °C przez 48 do 72 godzin. Od 48 do 72 godzin po transfekcji komórek owadów przemyć komórki raz jednym mililitrem medium dla owadów IPL-41, a następnie przykryć dwoma mililitrami IPL-41 w celu obrazowania.Dodać cztery krople odczynnika do barwienia żywych komórek Hoechst do pożywki i inkubować w temperaturze 28 °C przez 20 do 25 minut. Umieścić 35 mm szalkę w zamkniętym skanerze konfokalnym z laserem. Chociaż na rynku dostępnych jest wiele szalek szklanych, ważne jest, aby pasowały one do stolika mikroskopu; konieczne może być empiryczne ustalenie, które szkło jest najbardziej odpowiednie dla adhezji komórek.Ustaw mikroskop dla warunków obserwacji Hoechst, EGFP i mCherry. 359 nanometrów i 461 nanometrów dla wzbudzenia i emisji Hoechst. 489 nanometrów i 510 nanometrów dla wzbudzenia i emisji EGFP.Podczerwień 580 nanometrów i 610 nanometrów dla wzbudzenia i emisji mCherry. Używając obiektywu 10X, wykonaj wstępny skan w celu potwierdzenia ekspresji fluorescencyjnej. Następnie przełącz się w tryb skanowania, korzystając z obiektywu 60X z kontrastem fazowym i imersją wodną.Dostosuj moc lasera, czułość detektora, prędkość skanowania, głębokość osi Z oraz powiększenie cyfrowe, aby zoptymalizować kontrast i rozdzielczość obrazu. Wykonaj obrazowanie komórek przy 1,5-krotnym powiększeniu cyfrowym, aby uzyskać całkowite powiększenie 90X. Zapisz i wyeksportuj surowe dane jako pliki obrazów TIFF w celu późniejszej analizy.Komórki Tni przetransfekowano wskazanymi plazmidami, a ekspresję białek rekombinowanych zwizualizowano za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Pomyślna transfekcja i ekspresja rekombinowanego białka BtDrip1-EGFP jest widoczna poprzez obecność zielonej fluorescencji na powierzchni komórek. Komórki przetransfekowane wersją jedną BtDrip2 EGFP wykazują zieloną fluorescencję wewnątrzkomórkową, co wskazuje na wewnątrzkomórkową ekspresję wersji pierwszej BtDrip2.Podobnie, komórki przetransfekowane PIB DmSPR-mCherry lub PIB PLA2G15-mCherry wykazują czerwoną fluorescencję, co wskazuje na ekspresję odpowiednich chimer. Na nałożonych obrazach obszary pomarańczowe lub żółte wskazują na ekspresję zarówno EGFP, jak i mCherry, co sugeruje, że białka te współlokalizują się w tych samych strukturach podkomórkowych. Nałożenie obrazów komórek podwójnie przetransfekowanych PIB BtDrip1-EGFP i PIB DmSPR-mCherry sugeruje współlokalizację BtDrip1-EGFP i DmSPR-mCherry na powierzchni komórki.Komórki poddane podwójnej transfekcji wersją pierwszą BtDrip2 EGFP oraz PIB DmSPR-mCherry wykazują niewielką ko-lokalizację sygnałów fluorescencji zielonej i czerwonej, co potwierdza wewnątrzkomórkową ekspresję wersji pierwszej BtDrip2. W przeciwieństwie do tego, ko-ekspresja PIB BtDrip2 wersji pierwszej EGFP oraz markeru lizosomalnego PIB PLA2G15-mCherry doprowadziła do znacznego nakładania się cytoplazmatycznych sygnałów fluorescencji zielonej i czerwonej. Silnie sugeruje to, że BtDrip2 jest transportowany do wewnątrzkomórkowych lizosomów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób ekspresji chimer białek fluorescencyjnych w hodowlanych komórkach owadów. System ten umożliwia szybką konstrukcję wektorów w syntezie białek, pozwala uniknąć problemów związanych z wirusowymi systemami ekspresji i stanowi skuteczny sposób obserwacji transportu białek wewnątrzkomórkowych.

transient-expression-cellular-localization-recombinant-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Transdukcja białek umożliwia bezpośrednie dostarczanie biologicznie czynnych białek do komórek. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, takich jak transfekcja DNA czy transdukcja wirusowa, ten nieinwazyjny paradygmat pozwala na wysoce efektywną manipulację komórkową w sposób miareczkowalny, unikając toksyczności komórkowej oraz ryzyka transformacji onkogennej wynikającej z trwałej modyfikacji genetycznej.

Inżynieria białek przenikających przez błony komórkowe

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Rośliny tytoniu zostały użyte do produkcji celulazy grzybowej, TrCel5A, za pomocą systemu ekspresji przejściowej. Ekspresję można było monitorować za pomocą fluorescencyjnego białka fuzyjnego, a aktywność białka scharakteryzowano po ekspresji.

Ekspresja rekombinowanej celulazy Cel5A z Trichoderma reesei w roślinach tytoniu

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

W tym badaniu porównano ekspresję docelowego ludzkiego białka rekombinowanego na różnych platformach produkcyjnych. Skupiliśmy się na tradycyjnych kulturach fermentorowych i roślinach, opisując konfigurację każdego systemu i podkreślając, na podstawie zgłoszonych wyników, nieodłączne ograniczenia i zalety każdej platformy.

Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Ten protokół opisuje system ekspresji białek wywołany szokiem cieplnym (system komórkowy pDHsp/V5-His/sf9), który może być używany zarówno do ekspresji obcych białek, jak i oceny antyapoptotycznej aktywności potencjalnych obcych białek i ich skróconych aminokwasów w komórkach owadów.

Przejściowa ekspresja obcych genów w komórkach owadów (sf9) do testu funkcjonalnego białka

Tutaj prezentujemy protokoły wykorzystania systemu ekspresji białek komórek owadów i bakulowirusa do produkcji dużych ilości białek wydzielanych przez rośliny do krystalizacji białek. Wektor ekspresyjny bakulowirusa został zmodyfikowany za pomocą GP67 lub peptydu sygnałowego hemoliny owadów w celu ekspresji wydzielania białek roślinnych w komórkach owadów.

Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (rAAV) jest szeroko stosowany do klinicznego i przedklinicznego dostarczania genów. Niedocenianym zastosowaniem rAAV jest silna transdukcja hodowanych komórek bez konieczności oczyszczania. Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w rAAV, udostępniamy protokół klonowania kaset transgenowych, produkcji prymitywnych wektorów i transdukcji kultur komórkowych.

Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Poznaj metodę przejściowej ekspresji białek fluorescencyjnych w komórkach owadów SF9 i Tni. Technika umożliwia szybką ocenę lokalizacji komórkowej i funkcji białek bez użycia bakulowirusów.

Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

Przeglądaj więcej filmów