Ekspresja rekombinowanej celulazy Cel5A z Trichoderma reesei w roślinach tytoniu

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przejściowa ekspresja białek docelowych w tytoniu, aby ocenić możliwość ekspresji enzymów w roślinach w krótkim czasie. Ekspresja przejściowa jest osiągana poprzez infiltrację liści tytoniu szczepem agrobacterium tumor fain, który zawiera wektor z genem zainteresowania. W drugim kroku, po inkubacji, zinfiltrowane liście roślin są zbierane, a ekstrakty białkowe poddawane częściowemu oczyszczaniu w celu otrzymania roboczego roztworu enzymu. Następnie przeprowadzana jest analiza białka w celu oceny wpływu ekspresji roślinnej na enzym oraz weryfikacji jego aktywności enzymatycznej.

Uzyskano wyniki wykazujące wielkość białka, możliwe efekty glikozylacji oraz aktywność enzymatyczną na podstawie western blottingu, analizy zy oraz testów degradacji substratu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące konwersji biomasy roślinnej, a także dostarczyć informacji na temat aktywności enzymów po ich przejściowej ekspresji w tytoniu. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy infiltracji są trudne do opanowania ze względu na łatwe uszkadzanie liści przez strzykawkę, a eksperymenty będą prowadzone w warunkach sterylnych.

Pojedyncze kolonie agrobacterium przenieś do kolby Erlenmeyera zawierającej 10 ml bulionu z ekstraktem drożdżowym z dodatkiem antybiotyków. Następnie inkubuj zaszczepiony bulion przez 36 do 40 godzin w temperaturze 26 °C przy wytrząsaniu z prędkością 180 RPM. Następnie zaszczep 200 µl każdej kultury do 20 ml bulionu z ekstraktem drożdżowym z tymi samymi antybiotykami co wcześniej i inkubuj w tych samych warunkach przez 36 do 40 godzin.

Indukcję kultur przeprowadź, dodając 2 µL acetofenonu, 100 µL 40% roztworu glukozy oraz 200 µL 1 M buforu MES o pH 5,6, a następnie kontynuuj inkubację przez noc. Wyjmij rośliny z szklarni i za pomocą końcówki pipety wykonaj nacięcie po stronie osiowej AB trzeciego do piątego liścia od góry rośliny, aby ułatwić infiltrację. Następnie napełnij strzykawkę medium do infiltracji i przyłóż ją do jednego z wcześniej wykonanych nacięć.

Podtrzymaj strzykawkę palcem od strony liścia osiowego i ostrożnie wstrzyknij pożywkę do strefy dożylnej liścia. Aby zwizualizować fluorescencję w przekrojach liści wykazujących ekspresję TR cell 5:00 AM cherry, oświetl rośliny przenośnym źródłem światła emitującym światło zielone. Po obserwacji przez czerwony filtr fluorescencja TR cell 5:00 AM cherry będzie wyraźnie widoczna.

Aby wyekstrahować ekspresowane białka, należy wybrać liście tytoniu, które zostały infiltrowane AUM zawierającym P track ERTR cell five A, i pociąć je na kawałki o masie 1 g. Następnie należy umieścić je w schłodzonym moździerzu i dodać do próbek odpowiednią ilość ciekłego azotu. Liście należy rozetrzeć tłuczkiem na proszek.

Powtórz proces z nieinfiltrowanymi liśćmi tytoniu, aby uzyskać próbki kontrolne. Następnie dodaj 2 mL PBS zawierającego 1 mM fluorku fenylometylosulfonilu do zmielonej tkanki liściowej i mieszaj, aż większość tkanki znajdzie się w zawiesinie. Odwiruj ekstrakt przy 15 000 ×g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.

Następnie odrzuć osad, częściowo oczyszczone komórki TR cell five A, inkubując białko zawierające S natin w temperaturze 55 °C przez 10 minut, a następnie pozostaw je w temperaturze pokojowej na kolejne 10 minut. Następnie odwiruj SNAT przy 15 000 ×g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzuć osad i wykorzystaj białko zawierające snat do dalszych etapów.

Dalsze analizy. Należy również przeprowadzić proces częściowego oczyszczania dla roślin nieinfiltrowanych w celu uzyskania próbek kontrolnych. W tej procedurze należy zmieszać etylocelulozę z wodą, aby uzyskać 1,5% roztwór, a następnie inkubować przy mieszaniu do czasu rozpuszczenia.

Aby przygotować żel A-C-M-C-S-D-S, w 10 ml roztworu mieszaniny do żelu SDS-PAGE należy zastąpić 1 ml wody 1 ml 1,5%CMC, a następnie wylać żel w sposób standardowy. Następnie próbki należy zdenaturować poprzez gotowanie w obecności SDS. Elektroforezę prowadzić przy napięciu 200 V przez 50 minut, aż front barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu. Teraz przeprowadzić refolding białek w żelu na punkcie 15%C-M-C-S-D-S page gel.

Należy użyć 1,5% beta-cyklodekstryny w 20 milimolarnym buforze fosforanowo-cytrynianowym o pH 6,5. Żel należy inkubować w tym roztworze w temperaturze pokojowej przy delikatnym wstrząsaniu przez 15 minut. Następnie należy odlać roztwór beta-cyklodekstryny i krótko przemyć żel wodą, a następnie inkubować go w 50 milimolarnym buforze octanu sodu o pH 4,8 przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie przeprowadź analizę CMC, wykorzystując żel poliakrylamidowy 15%C-M-C-S-D-S z refoldowanymi punktami, inkubując żel w 30 mM buforze octanu sodu przez 20 minut w temperaturze 50 °C. Aby zwizualizować miejsca degradacji CMC, barw żel przez 10 minut w 0,1% roztworze czerwieni kongowego, a następnie odbarwiaj go w 1 M roztworze chlorku sodu przez 30 minut lub do momentu zaobserwowania wyraźnych prążków; na koniec przemyj żel 0,3% kwasem octowym. W celu uzyskania wyraźniejszych obrazów, bezpośrednio przed przeprowadzeniem analizy, przygotuj dwukrotny roztwór roboczy four MUC, a następnie pipetuj 100 µL roztworu roboczego four MUC do oddzielnych dołków płytki 96-dołkowej.

Następnie dodaj 100 µL każdej próbki do odpowiednich dołków, wykonując pomiary dla każdej próbki w trzech powtórzeniach, stosując długość fali wzbudzenia 360 nm i długość fali emisji 465 nm. Wyznacz punkt czasowy zero dla fluorescencji mu za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej. Następnie inkubuj płytki przykryte przylepnymi pokrywkami w temperaturze 50 °C przez 20 minut.

Następnie zatrzymać reakcję poprzez zamrożenie. Po tym kroku zmierzyć fluorescencję końcową, stosując te same parametry, co dla punktu czasowego zero minut. Odjąć wartość fluorescencji w zerowej minucie od wartości fluorescencji w dwudziestej minucie, aby określić zmianę fluorescencji spowodowaną aktywnością enzymatyczną bezpośrednio przed przeprowadzeniem testu.

Przygotować 2X roztwór roboczy A-O-C-M-C. Następnie połączyć 50 µL próbki i 50 µL roztworu roboczego w probówce o pojemności 1,5 mL. Następnie inkubować próbki przez 20 minut w temperaturze 50 °C.

Zatrzymać reakcję, dodając 250 µL roztworu wytrącanego. Następnie każdą próbkę energicznie wymieszać na wirówce typu vortex przez 10 sekund, aby zapewnić całkowite połączenie próbki z roztworem wytrącającym. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, ponownie wymieszać na vortexie, a następnie odwirować z prędkością 1000 Gs przez 10 minut.

Następnie, bez mieszania, przenieś 200 µL SNAT z każdej próbki do płytki 96-dołkowej. Aktywność enzymatyczna osadu przejawia się wyższym poziomem rozpuszczonego barwnika. Zmierz ją za pomocą spektroskopii absorbancyjnej przy długości fali 590 nm.

W tym kroku należy umieścić krążki papieru filtracyjnego w probówkach o pojemności 1,5 lub 2 ml. Do krążków papieru filtracyjnego dodać 100 µL 60 mM octanu sodu oraz 100 µL próbek, a następnie inkubować przez 20 godzin w temperaturze 50 °C przy wytrząsaniu z prędkością 300 RPM.

Dodatkowo, bezpośrednio przed przeprowadzeniem analizy, inkubuj poszczególne próbki bez papieru filtracyjnego w celu uzyskania kontroli. Przygotuj 1,5 x roztwór roboczy PABA, zawierający jeden mililitr roztworu PABA A i dziewięć mililitrów roztworu PABA B. Przechowuj na lodzie do momentu użycia. Następnie przygotuj próbki w termostabilnych probówkach o pojemności 0,5 mililitra.

Próbki składają się z 45 µL wody, pięciu µL każdego roztworu inkubowanego z papierem filtrowanym oraz 100 µL roztworu roboczego PABA. Następnie należy przeprowadzić analizę kontroli próbek oraz pięciu standardów przygotowanych w ten sam sposób. Potem inkubować próbki, kontrole i standardy przez dokładnie 10 minut w temperaturze 100 °C i chłodzić w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 minut.

Pipetuj 100 µL roztworu do płytki 96-dołkowej i przeprowadź pomiar za pomocą spektrofotometru przy długości fali 410 nm. Od wartości próbek z papieru filtrującego odejmij wartości kontrolne dla poszczególnych próbek, aby określić ilość uwolnionych cukrów redukujących. Poniżej znajduje się obraz przedstawiający kasety ekspresyjne oraz ekspresję białek w roślinach tytoniu.

Tak wygląda zinfiltrowany liść tytoniu w świetle normalnym oraz w świetle zielonym z czerwonym filtrem, gdzie wyraźnie widoczna jest czerwona barwa wskazująca na ekspresję TR cell 5:00 AM cherry. Żel SDS-PAGE, western blot i zymogram CMC pokazują wielkość i aktywność T cell five A. Całkowite białka rozpuszczalne zostały rozdzielone, co możemy zwizualizować za pomocą barwienia błękitem Coomassie. Western blotting przeciwko regionowi hist-tag białka T cell five A potwierdza wielkość białka, a dodatkowo aktywność celulazy względem CMC jest wykazana na zymogramie barwionym czerwienią Kongo. Przedstawiono tutaj całkowite białka rozpuszczalne z liści rośliny tytoniu, w których transientnie eksprimowano TR cell five A, przed i po oczyszczaniu przez wytrącanie termiczne, gdzie TR cell five A stanowi największy widoczny prążek i jest również widoczny w western blocie oraz na zymogramie CMC.

Widzimy również całkowitą zawartość białek rozpuszczalnych z roślin tytoniu, w których Tcell five A nie była obecna po wytrącaniu termicznym, oraz białka z komercyjnie dostępnej mieszaniny tresa cellulase. Rycina ta przedstawia ilościowe oznaczenie aktywności enzymatycznej TR cell five A; TR cell five A inkubowano z four MUC Azo CMC lub papierem filtrowanym, a degradację substratu mierzono poprzez uwalnianie barwnika azowego fluoro four four mu lub poprzez ilościowe oznaczenie cukrów redukujących na podstawie zmiany barwy PBA po przeprowadzeniu tej procedury. Do dostarczenia dodatkowych informacji na temat tego, jak lokalizacja białka może wpływać na stabilność i aktywność enzymu, można zastosować inne metody, takie jak targetowanie białek.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak przeprowadzić przejściową ekspresję białek w tytoniu, a także posiadać wiedzę na temat oceny aktywności enzymatycznej w konwersji biomasy celulozowej.