Name: Ekspresja rekombinowanej celulazy Cel5A z Trichoderma reesei w roślinach tytoniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Poznaj metodę ekspresji przejściowej celulazy TrCel5A w liściach tytoniu przy użyciu infiltracji Agrobacterium. Technika ta umożliwia szybką produkcję enzymów do konwersji biomasy roślinnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez inicjatywę BMBF Forschungsinitiative "BioEnergie 2021 – Forschung für die Nutzung von Biomasse" oraz Klaster Doskonałości "Dostosowane do potrzeb paliwa z biomasy", który jest finansowany przez Inicjatywę Doskonałości przez niemiecki rząd federalny i rządy krajów związkowych w celu promowania nauki i badań na niemieckich uniwersytetach.

1. Wzrost dzikich roślin typu N. tabacum
<ol>
	<li>Aby wyhodować rośliny N. tabacum L. cv. Petit Havana SR1 na glebie, umieść nasiona tytoniu w odpowiednich doniczkach wypełnionych normalną ziemią doniczkową do kiełkowania. Po 2 tygodniach przenieś sadzonki do pojedynczych doniczek. Inkubuj rośliny w szklarni o stałej temperaturze 22 °C (okres ciemny) lub 25 °C (okres jasny) i wilgotności względnej powietrza 70%. Zapewnij oświetlenie w 16/8 godzinnym cyklu światło/ciemność (np. lampy Philips IP65 400 W; 180 μmol·sec-1·m-2; λ= 400-700 nm) i wodę.</li>
</ol>
2. Przejściowa ekspresja białek TrCel5A i TrCel5A-mCherry
<ol>
	<li>W sterylnych warunkach pobrać pojedyncze kolonie Agarobacterium tumefaciens (GV3101::p MP90RK GmR, KmR, RifR) zawierające pTRAkc-ER-TrCel5A lub pTRAkc-ER -TrCel5A-mCherry i przenieść do kolby Erlenmeyera zawierającej 10 ml bulionu z ekstraktu drożdżowego (YEB, przygotowanego zgodnie ze specyfikacją producenta), pożywki i kanamycyny (50 mg/ml), ryfampicyny (50 mg/ml) i karbenicyliny (100 mg/ml) do selekcji. Inkubować przez 36-40 godzin w temperaturze 26 °C i 180 obr./min. Uwaga: Projektowanie odpowiednich konstruktów do ekspresji białek wykracza poza zakres tego artykułu, ale jako wskazówkę znajdują się metody Macleana i wsp. 13 oraz Munro i Pellham14 mogą być śledzone przy projektowaniu konstrukcji.</li>
	<li>Pobrać 200 μl każdej kultury, aby zaszczepić 20 ml YEB antybiotykami o stężeniach wymienionych powyżej i inkubować w tych samych warunkach, co poprzednio.</li>
	<li>Po 36-40 godzinach należy wstępnie wyindukować hodowle, dodając 2 μl acetosyringonu (stężenie końcowe 200 μM), 100 μl 40% (m/v) roztworu glukozy i 200 μl 1 M buforu MES o pH 5,6. Inkubować przez noc.</li>
	<li>Przygotować 100 ml 2x buforu infiltracyjnego (100 g/l sacharozy, 3,6 g/l glukozy, 8,6 g/l soli bazowych Murashige i Skoog, dostosować pH do 5,6 za pomocą wodorotlenku potasu).</li>
	<li>Zmierzyć OD600 kultur rozcieńczeniami 1:5, aż osiągnie OD600 5-6. Obliczyć objętość kultury potrzebną do uzyskania 30 ml pożywki infiltracyjnej o średnicyzewnętrznej 600. Dodać 15 ml 2x buforu infiltracyjnego, a następnie dodać dejonizowanyH2O, aby uzyskać bufor do 30 ml.</li>
	<li>Weź rośliny ze szklarni i użyj końcówki pipety, aby naciąć stronę odbytową od 3do 5 liścia od góry, aby ułatwić infiltrację.</li>
	<li>Użyj końcówki pipety, aby naciąć axialną stronę liści, aby ułatwić infiltrację.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę podłożem naciekowym i umieść ją (bez igły) na jednym z wcześniej wykonanych nacięć. Podeprzeć strzykawkę palcem po stronie liścia przyosiowego. Ostrożnie wciśnij podłoże w tkankę międzynerwowych stref liściowych. Uwaga: Po infiltracji uprawiaj rośliny w szklarni w takich samych warunkach, jak opisano powyżej. Należy również utrzymać równą proporcję niepoddanych działaniu substancji roślin o nieprzejściowej ekspresji (NTEP) jako roślin kontrolnych, w takich samych warunkach, jak w przypadku roślin infiltrowanych.</li>
</ol>
3. Ocena ekspresji TrCel5A-mCherry w liściach roślin
<ol>
	<li>Po 4-6 dniach wyjmij ze szklarni rośliny naciekane A. tumefaciens zawierające pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry i umieść je w ciemnym pomieszczeniu do analizy fluorescencyjnej.</li>
	<li>Aby uwidocznić fluorescencję w odcinkach liści wyrażających TrCel5A-mCherry, należy oświetlić rośliny za pomocą przenośnego źródła światła emitującego zielone światło o długości fali 515 nm z czerwonym filtrem (620-750 nm). Uwaga: Dogłębną charakterystykę ekspresji białek w liściach roślin można osiągnąć poprzez cienkowarstwowe liście za pomocą wibratomu i badanie pod mikroskopem świetlnym i fluorescencyjnym. W tym celu wykonaj poniższe czynności:
	<ol>
		<li>Wyciąć małe kawałki o wymiarach około 5 x 5 mm z naciekanego liścia i zanurzyć je w 4% agarozie rozpuszczonej w 50 mM buforze fosforanowym (pH 5,7).</li>
		<li>Wytnij odcinek o rozmiarze 80-90 μm z osadzonych liści za pomocą wibratomu. Umieścić je na szkiełku mikroskopowym, przykryć buforem lub szkiełkiem nakrywkowym i zbadać za pomocą mikroskopu przy 10-krotnym powiększeniu z detektorem fluorescencji, przy użyciu tej samej długości fali i filtra, jak opisano powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ekstrakcja TrCel5A z liści tytoniu
<ol>
	<li>Pokrój kawałki z liści tytoniu na około 1 g z roślin porażonych A. tumefaciens zawierających pTRAkc-ER-TrCel5A i umieść w moździerzu schłodzonym ciekłym azotem. Dodać odpowiednią ilość ciekłego azotu do próbek. Zmiel liście na proszek za pomocą schłodzonego tłuczka.</li>
	<li>Dodać 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu do zmielonej masy liści i mieszać, aż większość masy liści znajdzie się w zawiesinie. Odwirować ekstrakt w temperaturze 15 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i pobrać sklarowany sklarant zawierający białko.</li>
	<li>Odwirować ekstrakt w temperaturze 15 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i pobrać sklarowany sklarant zawierający białko, uważając, aby nie naruszyć osadu. Wyrzuć granulkę.</li>
	<li>Częściowo oczyścić TrCel5A przez inkubację supernatantu zawierającego białko w temperaturze 55 °C przez 10 minut. Pozostawić do odpoczynku w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 minut, a następnie odwirować przy 15 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórzyć proces częściowego oczyszczania dla roślin nieinfiltrowanych w celu uzyskania próbek kontrolnych. Użyj tych przykładów we wszystkich kolejnych eksperymentach. Uwaga: Roztwory białkowe można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia lub w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
	<li>Powtórzyć proces częściowego oczyszczania w przypadku roślin nieinfiltrowanych w celu uzyskania próbek kontrolnych. Użyj tych przykładów we wszystkich kolejnych eksperymentach. Uwaga: Roztwory białkowe można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia lub w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
</ol>
5. SDS-PAGE, Western Blotting i Azo-CMC Zymography TrCel5A-mCherry
<ol>
	<li>Kup lub przygotuj 12% (w/v) żele SDS-PAGE zgodnie z ustalonymi metodami15.</li>
	<li>Rozpuścić CMC w wodzie, aby uzyskać 1,5% (w/v) roztwór. Aby zrobić żele CMC-SDS-PAGE, zastąp 1 ml 1,5% CMC 1 ml wody w 10 ml roztworu żelu SDS-PAGE, co daje 0,1% (w/v) CMC + 12% (w/v) mieszanki żelu SDS-PAGE. Wlej żel normalnie. Uwaga: Upewnij się, że CMC w oryginalnym roztworze jest całkowicie rozpuszczony przez połączenie mieszania i podgrzewania do temperatury 40 °C (czynność powtórzyć bezpośrednio przed przygotowaniem roztworu żelu).</li>
	<li>Denaturacja próbek przez gotowanie w obecności SDS, zgodnie z ustalonymi metodami12. Jako kontrolę dodatnią należy użyć rozcieńczenia 1:500 dostępnej w handlu mieszaniny celulazy T. reesei, takiej jak T. reesei ATCC 26921. Jako kontrolę ujemną należy użyć podobnie przygotowanego roztworu białkowego z nienaciekanych liści (NTEP).</li>
	<li>Przeprowadź elektroforezę zgodnie z normalnymi protokołami15, np. użyj 200 V przez ~50 minut z zatrzymaniem elektroforezy, gdy czoło barwnika dotrze do dna żelu.</li>
	<li>Barwić jeden żel SDS-PAGE za pomocą 0,1% (w/v) Coomassie brilliant blue i odbarwić za pomocą mieszaniny metanolu i lodowatego kwasu octowego. Uwaga: Szybkie barwienie i odbarwianie można przeprowadzić poprzez delikatne podgrzanie roztworów barwiących i odbarwiających, tj. za pomocą kuchenki mikrofalowej przez ~15 sekund w celu ogrzania (ale nie wrzenia) najpierw roztworów barwiących, a następnie roztworów odbarwiających, zmieniając roztwór odbarwiający po 10 minutach lub po schłodzeniu i powtórz z nowym roztworem odbarwiającym.</li>
	<li>Wykonaj Western blot jednego żelu SDS-PAGE przy użyciu ustalonych protokołów16,17. Należy stosować następujące przeciwciała: poliklonalne przeciwciało królika przeciwko znacznikowi Hisa (pierwszorzędowe) i poliklonalne kozie przeciwciało anty-królicze region Fc, które zostało sprzężone z fosfatazą alkaliczną (drugorzędowe). Uwaga: należy wybrać przeciwciała drugorzędowe, aby umożliwić wizualizację przy użyciu soli p-toluidynowej chlorku tetrazolu nitroniebieskiego / 5-bromo-4-chloro-3′′-indolifosforanu (NBT/BCIP), jak opisano18.</li>
	<li>Przeprowadzić ponowne fałdowanie białek w żelu na 0,15% (w/v) żelu CMC SDS-PAGE, inkubując żel w 1,5% (w/v) β-cyklodekstrynie, 20 mM buforze fosforanowo-cytrynianowym, pH 6,5, w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem przez 15 minut19.</li>
	<li>Odrzucić roztwór β-cyklodekstryny i krótko przemyć żelH2O. Inkubować w temperaturze pokojowej w 50 mM buforze octanu sodu (pH 4,8) przez kolejne 15 minut. Wykonać symulację CMC przy użyciu ponownie złożonego 0,15% żelu CMC SDS-PAGE, inkubując żel w 30 mM buforze octanu sodu o pH 4,8 przez 20 minut w temperaturze 50 °C.</li>
	<li>Wykonać symulację CMC przy użyciu ponownie złożonego żelu CMC SDS-PAGE o skruchach 0,15% (w/v), inkubując żel w 30 mM buforze octanu sodu (pH 4,8) przez 20 minut w temperaturze 50 °C.</li>
	<li>Barwić żel przez 10 minut roztworem czerwieni Kongo o stężeniu 0,1% i odbarwiać przez 30 minut lub do momentu zaobserwowania czystych prążków przy użyciu 1 M NaCl. Umyj żel 0,3% (v/v) kwasem octowym, aby uzyskać wyraźniejsze obrazowanie.</li>
</ol>
6. Test aktywności 4-MUC TrCel5A
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 10 mM 4-MUC w 50% (v/v) metanolu i przechowywać go w ciemności w temperaturze pokojowej</li>
	<li>Bezpośrednio przed badaniem należy przygotować roztwór roboczy 4-MUC 2x, składający się z 1 mM 4-MUC i 60 mM octanu sodu o pH 4,8.</li>
	<li>Przeprowadzić ten test na próbkach zawierających odpowiednio 100 μl białka liści (z indukowaną ekspresją TrCel5A lub bez), 100 μl dostępnej w handlu mieszaniny celulazy T. reesei 1:1,000 i czystegoH2O. Zbadaj każdą próbkę w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Pobrać pipetę 100 μl roztworu roboczego 4-MUC do oddzielnych studzienek na 96-dołkowej płytce, a następnie dodać 100 μl każdej próbki.</li>
	<li>Określić punkt czasowy fluorescencji 4-MU w czasie 0 minut za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej, używając długości fali wzbudzenia 360 nm i długości fali emisji 465 nm.</li>
	<li>Inkubować płytki przez 20 minut w temperaturze 50 °C, przykryte przykrytymi klejonymi pokrywkami, aby zapobiec parowaniu. Zatrzymać reakcję przez zamrożenie (lub przez połączenie 100 μl 0,15 M glicyny, pH 10,0 i 100 μl próbki na osobnej płytce).</li>
	<li>Określić punkt końcowy fluorescencji 4-MU za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej, używając długości fali wzbudzenia 360 nm i długości fali emisji 465 nm. Odejmij 0 min od punktu końcowego (20 min), aby uzyskać zmianę wartości fluorescencji.</li>
</ol>
7. Test aktywności azo-karboksymetylocelulozy TrCel5A
<ol>
	<li>Przygotować zapas 1,5% (w/v) Azo-CMC, który jest przechowywany w temperaturze pokojowej, oraz roztwór wytrącający zawierający 18 mM octanu, 0,5 M octanu sodu, pH 5 i 80% etanolu (v/v), przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Bezpośrednio przed badaniem należy przygotować roztwór roboczy Azo-CMC 2x, składający się z 1% (w/v) Azo-CMC (wH2O) i 60 mM octanu sodu o pH 4,8.</li>
	<li>Połączyć 50 μl próbki i 50 μl roztworu roboczego w probówkach o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Badane próbki zawierające 50 μl białka liścia (z lub bez TrCel5A o przejściowej ekspresji); 100 μl dostępnej w handlu mieszaniny celulazy z T. reesei rozcieńczonej w stosunku 1:1 000 oraz czystyH2O. Próbki i wzorce należy pobrać w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Inkubować próbki przez 20 minut w temperaturze 50 °C. Zatrzymać reakcję przez dodanie 250 μl roztworu strącającego. Energicznie wiruj każdą próbkę przez 10 sekund, aby upewnić się, że roztwory są całkowicie połączone.</li>
	<li>Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie ponownie wirować. Odwirować próbki o masie 1 000 x g przez 10 minut. Pobrać 200 μl supernatantu z każdej próbki na płytkę 96-dołkową, uważając, aby nie naruszyć osadu.</li>
	<li>Oznaczenie z użyciem spektroskopii absorbancji przy długości fali 590 nm.</li>
</ol>
8. Test PAHBAH TrCel5A
<ol>
	<li>Użyj dziurkacza, aby wyciąć okrąg (o średnicy ~5,5 mm) bibuły filtracyjnej. Dodać 100 μl 60 mM NaAc, pH 4,8 i 100 μl próbek, zawierających białko liści (z indukowalnie wyrażonym TrCel5A lub bez) lub dostępną w handlu mieszaninę celulazy T. reesei, rozcieńczoną w stosunku 1:1000 i inkubować z kółkami z bibuły filtracyjnej przez 20 godzin w temperaturze 50 °C z wytrząsaniem 300 obr./min. Dla każdej próbki inkubowanej z bibułą filtracyjną należy również inkubować zduplikowany roztwór bez bibuły filtracyjnej jako indywidualną próbkę kontrolną.</li>
	<li>Przygotować 330 mM roztwór hydrazydu kwasu p-hydroksybenzoesowego (WWA) A, rozpuszczając WWA wH2Oz dodatkiem 5 ml stężonego HCl, co daje w sumie 100 ml roztworu, i przechowywać w temperaturze pokojowej. Uwaga: Najlepsze wyniki osiąga się dodając HCl do mniejszej objętości zawiesiny WWA, tj. 30 ml, który miesza się w temperaturze, aby ułatwić rozpuszczenie, przed uzupełnieniem objętości do 100 ml za pomocąH2O.</li>
	<li>Przygotować roztwór WWA B zawierający 50 mM cytrynianu sodu, 10 mM chlorku wapnia i 500 mM NaOH i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Bezpośrednio przed badaniem należy przygotować 1,5-krotny roztwór roboczy 1 ml odczynnika WWA do 9 ml roztworu buforowego, przechowywać na lodzie do czasu użycia (należy zużyć w ciągu 4 godzin).</li>
	<li>Przygotować próbki w termostabilnych probówkach o pojemności 0,2 lub 0,5 ml. Połączyć 5 μl każdego roztworu inkubowanego z bibułą filtracyjną (etap 8.1), 45 μlH2Oi 100 μl roztworu roboczego WWA. Kontrole próbek (próbki inkubowane bez bibuły filtracyjnej) powinny być przeprowadzane w tych samych stężeniach (5 μl próbki, 45 μlH2O, 100 μl roztworu roboczego WWA). Przetestuj również 5 wzorców (5 μl) zawierających od 0 do 0,2 g/l glukozy i czystegoH2O. Zbadaj próbki i wzorce w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Inkubować próbki dokładnie przez 10 minut w temperaturze 100 °C, a następnie schłodzić w temperaturze pokojowej dokładnie przez 10 minut. Pipetować roztwory na 96-dołkową płytkę i oznaczać spektroskopowo na długości fali 410 nm. Odjąć poszczególne próbki kontrolne (inkubowane bez bibuły filtracyjnej) od próbek, aby uzyskać wartości końcowe.</li>
</ol>

<ol><li>Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulases+for+biomass+degradation%3A+comparing+recombinant+cellulase+expression+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms.</a> Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).</li>
<li>Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+inducible+expression+of+a+mesophilic+cellulase+avoids+adverse+effects+on+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development.</a> Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).</li>
<li>Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperthermophilic+endoglucanase+for+in+planta+lignocellulose+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion.</a> Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).</li>
<li>Sharma, A. K., Sharma, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plants+as+bioreactors%3A+recent+developments+and+emerging+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities.</a> Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).</li>
<li>Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco%2C+a+highly+efficient+green+bioreactor+for+production+of+therapeutic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins.</a> Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).</li>
<li>Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+study+of+Hypocrea+jecorina+Cel5A%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A.</a> Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).</li>
<li>Saloheimo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGIII%2C+a+new+endoglucanase+from+Trichoderma+reesei%3A+the+characterization+of+both+gene+and+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme.</a> Gene. 63, 11-21 (1988).</li>
<li>Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+fluorescent+proteins%3A+innovations+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineered fluorescent proteins: innovations and applications.</a> Nature Methods. 6, 713-717 (2009).</li>
<li>Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retention+signal+for+soluble+proteins+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum.</a> Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).</li>
<li>Béguin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+cellulase+activity+in+polyacrylamide+gels+using+Congo+red-stained+agar+replicas%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas.</a> Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).</li>
<li>Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+enzyme+production+by+three+Penicillium+species+on+monosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides.</a> Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).</li>
<li>Lever, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+reaction+for+colorimetric+determination+of+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates.</a> Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).</li>
<li>Maclean, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+human+papillomavirus+type+16+%28HPV-16%29+L1+expression+in+plants%3A+comparison+of+the+suitability+of+different+HPV-16+L1+gene+variants+and+different+cell-compartment+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization.</a> Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).</li>
<li>Munro, S., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+signal+prevents+secretion+of+luminal+ER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins.</a> Cell. 48, 899-907 (1987).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%E2%80%9CWestern+Blotting%E2%80%9D%3A+Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">“Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elelctrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets+-+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+sensitive+method+for+detection+of+alkaline+phosphatase-conjugated+anti-antibody+on+Western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots.</a> Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).</li>
<li>Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+%CE%B2-cyclodextrin+on+the+renaturation+of+enzymes+after+sodium+dodecyl+sulfate%E2%80%93polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).</li>
<li>Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+molecular+farming+in+the+future%3A+transient+protein+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).</li>
<li>Sammond, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulase+linkers+are+optimized+based+on+domain+type+and+function%3A+Insights+from+sequence+analysis%2C+biophysical+measurements%2C+and+molecular+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+heterologous+expression+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+II+and+cellobiohydrolase+II+in+the+yeasts+Pichia+pastoris+and+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica.</a> Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rekombinowana ekspresja celulaz jest dziedziną dużego zainteresowania ze względu na pragnienie bardziej wydajnych systemów produkcji biopaliw1. Rośliny oferują wiele możliwości udanej produkcji celulazy, a cechy takie jak ekonomiczne techniki zbioru i metody autohydrolizy są bardzo pożądanymi właściwościami przy produkcji biopaliw na dużą skalę. Co więcej, zastosowanie różnych lokalizacji do produkcji białek pozwala, w razie potrzeby, na modyfikacje potranslacyjne20. Modyfikowanie roślin w celu umoż...

Degradacja biomasy lignocelulozowej i jej przekształcenie w paliwo płynne zostało przewidziane jako metoda zmniejszenia zależności od paliw kopalnych. Jedną z istotnych przeszkód w tworzeniu ekonomicznie opłacalnych systemów przetwarzania biomasy jest enzymatyczna degradacja celulozy i hemicelulozy1. Systemy ekspresji roślinnej wykazują duży potencjał w zakresie produkcji enzymów na skalę przemysłową. Systemy rolnicze mające na celu ekonomiczne i ilościowe zbieranie roślin są już ugruntowane, tak jak to miało miejsce przez tysiące lat. Produkcja celulazy w roślinach jest pożądana ze względu na takie czynniki, jak łatwość autohydrolizy2 oraz potencjał maksymalizacji wykorzystania niższych poziomów enzymów poprzez zwiększenie strawności ścian komórkowych roślin1. Wreszcie, systemy roślinne umożliwiają kierowanie białek rekombinowanych do określonych obszarów komórek roślinnych i są w stanie w razie potrzeby modyfikować enzymy po translacji3.

Nicotiana tabacum (tytoń) jest bardzo często używana jako organizm modelowy do badań nad ekspresją białek heterologicznych u roślin, ze względu na jej szybki wzrost i cechy akumulacji biomasy4. Przejściowa ekspresja białek rekombinowanych jest techniką, która umożliwia wytwarzanie białek w krótkich okresachczasu5, przy zachowaniu elastyczności co do lokalizacji, a tym samym modyfikacji potranslacyjnych wybranych białek, tj. celulaz. Umożliwia to produkcję celulazy do podstawowej analizy, a jednocześnie kładzie podwaliny pod dalsze strategie ekspresji w roślinach. Stosując taką przejściową strategię ekspresji, wytwarza się endoglukanazę z rodziny hydrolazy glikozylowej 5, Cel5A, pochodzącą z gospodarza grzyba Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina)6 (zwanego dalej TrCel5A). TrCel5A jest białkiem o masie 42 kDa, które jest natywnie glikozylowane i jest wysoce aktywne w hydroylizacji łańcuchów celulozy7.

Opisana tutaj technika ekspresji przejściowej opiera się na stosunkowo powszechnie używanym systemie, infiltrującym liście roślin agrobakteriami przenoszącymi interesujący nas gen w odpowiednim wektorze ekspresji. Aby umożliwić szybką analizę udanej ekspresji w roślinie, TrCel5A może być również wyrażony jako białko fuzyjne z mCherry, monomerycznym białkiem fluorescencyjnym pierwotnie pochodzącym z białka Discosoma sp. DsRed 8, z dodatkowymi sześcioma resztami histydyny (His-tag) połączonymi z C-końcem (TrCel5A-mCherry). Ekspresja heterologicznego białka fuzyjnego, TrCel5A-mCherry, może być zatem monitorowana w rosnącej roślinie za pomocą zielonego światła do badania dyspersji mCherry. W razie potrzeby cienkie fragmenty materiału roślinnego można badać mikroskopowo w zielonym świetle, aby ustalić specyficzną lokalizację białka. Na potrzeby tej pracy do konstruktu włączono peptydy sygnałowe i tranzytowe, aby zlokalizować eksport białka heterologicznego do retikulum endoplazmatycznego9.

Aby przeanalizować aktywność celulaz wyrażanych roślinnie, w tym TrCel5A, można przeprowadzić szereg testów aktywności celulazy. Po ekstrakcji wszystkich rozpuszczalnych białek roślinnych, TrCel5A może być częściowo oczyszczony przy użyciu techniki inkubacji termicznej. Wielkość białka ustala się za pomocą SDS-PAGE, a następnie Western blot. Zymografia może być wykorzystywana do analizy aktywności w stosunku do substratów, np. celulozy, która została karboksymetylowana (wytwarzając karboksymetylocelulozę: CMC) pod kątem rozpuszczalności10. Aktywność celulazy i glukozydazy można monitorować za pomocą fluoroforu 4-metylolumbelliferylu (4-MU) związanego z β-D-celobiozydem (w skojarzeniu: 4-MUC). Inną metodą oceny aktywności endoglukanazy jest analiza spektrometryczna CMC, który jest związany z barwnikiem azowym (Remazolbrilliant Blue R)11. Ponadto aktywność białkową zarówno endoglukanaz, jak i szeregu celulaz można monitorować za pomocą testu analizy cukru, takiego jak test hydrazydu kwasu p-hydroksybenzoesowego (PAHBAH)12. Techniki te można wykorzystać do wyjaśnienia i ilościowego określenia aktywności wyrażonej celulazy będącej przedmiotem zainteresowania.

<table><tbody><tr><td>4-metylolumbelliferyl &beta;-D-celobiozyd</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M6018</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>ROTH</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringon (skoncentrowany)</td><td>ROTH</td><td>6003</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk - kanamycyna</td><td>ROTH</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk - ryfampicyna</td><td>ROTH</td><td>4163</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk - karbenicylina</td><td>ROTH</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało - królicze anty His(6) pAb</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-382</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało - koza anty królik AP, FC pAb</td><td>DIANOVA</td><td>111-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Azo-karboksymetyloceluloza</td><td>MEGAZYME</td><td>S-ACMC</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-cyklodekstryna</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C4805</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Karboksymetyloceluloza</td><td>ROTH</td><td>3333.1</td><td></td></tr><tr><td>Celulaza z Trichoderma reesei ATCC 26921</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C2730</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień kongijska</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>75768</td><td></td></tr><tr><td>Coomasie brylantowy niebieski G 250</td><td>ROTH</td><td>9598.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glukoza</td><td>ROTH</td><td>8337</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>ROTH</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna - bibuła Rotilabo</td><td>ROTH</td><td>CL67</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72091</td><td></td></tr><tr><td>Bufor MES</td><td>ROTH</td><td>4256</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>ROTH</td><td>8388</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>ROTH</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>SERVA</td><td>20765</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>ROTH</td><td>6771</td><td></td></tr><tr><td>Gleba, Einheitserde classic&nbsp;</td><td>Spektrometr PATZER GMBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S-5390</td><td></td></tr><tr><td>4-hydroksybenzhydrazyd&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H9882</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła UV buforowane fosforanem ROTH</td><td></td><td>1058</td><td></td></tr><tr><td>- BLAK RAY</td><td>UVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome - VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ekspresja rekombinowanej celulazy cel5a z trichoderma reesei w roślinach tytoniu

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Enzymy rozkładające celulozę, celulazy, są przedmiotem zarówno badań, jak i zainteresowań przemysłowych. Przewaga tych enzymów w organizmach trudnych do hodowli, takich jak grzyby budujące strzępki i bakterie beztlenowe, przyspieszyła stosowanie technologii rekombinowanych w tej dziedzinie. Metody ekspresji roślin są pożądanym systemem do produkcji enzymów i innych białek użytecznych w przemyśle na dużą skalę. W niniejszym artykule przedstawiono metody przejściowej ekspresji endoglukanazy grzybowej, Trichoderma reesei Cel5A, w Nicotiana tabacum. Pokazano udaną ekspresję białka, monitorowaną przez fluorescencję przy użyciu białka fuzyjnego mCherry-enzym. Dodatkowo do badania aktywności przejściowo eksprymowanego T. reesei Cel5A wykorzystuje się zestaw podstawowych testów, w tym SDS-PAGE, Western blotting, zymografię, a także testy fluorescencji i degradacji substratów na bazie barwników. Opisany tutaj system może być wykorzystany do wytworzenia aktywnej celulazy w krótkim czasie, tak aby ocenić potencjał do dalszej produkcji w roślinach za pomocą konstytutywnych lub indukowalnych systemów ekspresji.

TrCel5A oraz TrCel5A-mCherry zostały pomyślnie wyekspresowane w roślinach tytoniu z wykorzystaniem systemu ekspresji przejściowej (Rycina 1A i 1B). Analiza wzorca ekspresji białka fuzyjnego TrCel5A-mCherry wykazała obecność zdrowych liści (Rycina 1C), w których pod wpływem zielonego światła zaobserwowano rozległą ekspresję białka (Rycina 1D).
Ekstrakcję całkowitych białek rozpuszczalnych przeprowadzono z roślin tytoniu, któryc...

Rośliny tytoniu zostały użyte do produkcji celulazy grzybowej, TrCel5A, za pomocą systemu ekspresji przejściowej. Ekspresję można było monitorować za pomocą fluorescencyjnego białka fuzyjnego, a aktywność białka scharakteryzowano po ekspresji.

Ekspresja rekombinowanej celulazy Cel5A z Trichoderma reesei w roślinach tytoniu

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przejściowa ekspresja białek docelowych w tytoniu, aby ocenić możliwość ekspresji enzymów w roślinach w krótkim czasie. Ekspresja przejściowa jest osiągana poprzez infiltrację liści tytoniu szczepem agrobacterium tumor fain, który zawiera wektor z genem zainteresowania. W drugim kroku, po inkubacji, zinfiltrowane liście roślin są zbierane, a ekstrakty białkowe poddawane częściowemu oczyszczaniu w celu otrzymania roboczego roztworu enzymu. Następnie przeprowadzana jest analiza białka w celu oceny wpływu ekspresji roślinnej na enzym oraz weryfikacji jego aktywności enzymatycznej.Uzyskano wyniki wykazujące wielkość białka, możliwe efekty glikozylacji oraz aktywność enzymatyczną na podstawie western blottingu, analizy zy oraz testów degradacji substratu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące konwersji biomasy roślinnej, a także dostarczyć informacji na temat aktywności enzymów po ich przejściowej ekspresji w tytoniu. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy infiltracji są trudne do opanowania ze względu na łatwe uszkadzanie liści przez strzykawkę, a eksperymenty będą prowadzone w warunkach sterylnych.Pojedyncze kolonie agrobacterium przenieś do kolby Erlenmeyera zawierającej 10 ml bulionu z ekstraktem drożdżowym z dodatkiem antybiotyków. Następnie inkubuj zaszczepiony bulion przez 36 do 40 godzin w temperaturze 26 °C przy wytrząsaniu z prędkością 180 RPM. Następnie zaszczep 200 µl każdej kultury do 20 ml bulionu z ekstraktem drożdżowym z tymi samymi antybiotykami co wcześniej i inkubuj w tych samych warunkach przez 36 do 40 godzin.Indukcję kultur przeprowadź, dodając 2 µL acetofenonu, 100 µL 40% roztworu glukozy oraz 200 µL 1 M buforu MES o pH 5,6, a następnie kontynuuj inkubację przez noc. Wyjmij rośliny z szklarni i za pomocą końcówki pipety wykonaj nacięcie po stronie osiowej AB trzeciego do piątego liścia od góry rośliny, aby ułatwić infiltrację. Następnie napełnij strzykawkę medium do infiltracji i przyłóż ją do jednego z wcześniej wykonanych nacięć.Podtrzymaj strzykawkę palcem od strony liścia osiowego i ostrożnie wstrzyknij pożywkę do strefy dożylnej liścia. Aby zwizualizować fluorescencję w przekrojach liści wykazujących ekspresję TR cell 5:00 AM cherry, oświetl rośliny przenośnym źródłem światła emitującym światło zielone. Po obserwacji przez czerwony filtr fluorescencja TR cell 5:00 AM cherry będzie wyraźnie widoczna.Aby wyekstrahować ekspresowane białka, należy wybrać liście tytoniu, które zostały infiltrowane AUM zawierającym P track ERTR cell five A, i pociąć je na kawałki o masie 1 g. Następnie należy umieścić je w schłodzonym moździerzu i dodać do próbek odpowiednią ilość ciekłego azotu. Liście należy rozetrzeć tłuczkiem na proszek.Powtórz proces z nieinfiltrowanymi liśćmi tytoniu, aby uzyskać próbki kontrolne. Następnie dodaj 2 mL PBS zawierającego 1 mM fluorku fenylometylosulfonilu do zmielonej tkanki liściowej i mieszaj, aż większość tkanki znajdzie się w zawiesinie. Odwiruj ekstrakt przy 15 000 ×g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.Następnie odrzuć osad, częściowo oczyszczone komórki TR cell five A, inkubując białko zawierające S natin w temperaturze 55 °C przez 10 minut, a następnie pozostaw je w temperaturze pokojowej na kolejne 10 minut. Następnie odwiruj SNAT przy 15 000 ×g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzuć osad i wykorzystaj białko zawierające snat do dalszych etapów.Dalsze analizy. Należy również przeprowadzić proces częściowego oczyszczania dla roślin nieinfiltrowanych w celu uzyskania próbek kontrolnych. W tej procedurze należy zmieszać etylocelulozę z wodą, aby uzyskać 1,5% roztwór, a następnie inkubować przy mieszaniu do czasu rozpuszczenia.Aby przygotować żel A-C-M-C-S-D-S, w 10 ml roztworu mieszaniny do żelu SDS-PAGE należy zastąpić 1 ml wody 1 ml 1,5%CMC, a następnie wylać żel w sposób standardowy. Następnie próbki należy zdenaturować poprzez gotowanie w obecności SDS. Elektroforezę prowadzić przy napięciu 200 V przez 50 minut, aż front barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu. Teraz przeprowadzić refolding białek w żelu na punkcie 15%C-M-C-S-D-S page gel.Należy użyć 1,5% beta-cyklodekstryny w 20 milimolarnym buforze fosforanowo-cytrynianowym o pH 6,5. Żel należy inkubować w tym roztworze w temperaturze pokojowej przy delikatnym wstrząsaniu przez 15 minut. Następnie należy odlać roztwór beta-cyklodekstryny i krótko przemyć żel wodą, a następnie inkubować go w 50 milimolarnym buforze octanu sodu o pH 4,8 przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej.Następnie przeprowadź analizę CMC, wykorzystując żel poliakrylamidowy 15%C-M-C-S-D-S z refoldowanymi punktami, inkubując żel w 30 mM buforze octanu sodu przez 20 minut w temperaturze 50 °C. Aby zwizualizować miejsca degradacji CMC, barw żel przez 10 minut w 0,1% roztworze czerwieni kongowego, a następnie odbarwiaj go w 1 M roztworze chlorku sodu przez 30 minut lub do momentu zaobserwowania wyraźnych prążków; na koniec przemyj żel 0,3% kwasem octowym. W celu uzyskania wyraźniejszych obrazów, bezpośrednio przed przeprowadzeniem analizy, przygotuj dwukrotny roztwór roboczy four MUC, a następnie pipetuj 100 µL roztworu roboczego four MUC do oddzielnych dołków płytki 96-dołkowej.Następnie dodaj 100 µL każdej próbki do odpowiednich dołków, wykonując pomiary dla każdej próbki w trzech powtórzeniach, stosując długość fali wzbudzenia 360 nm i długość fali emisji 465 nm. Wyznacz punkt czasowy zero dla fluorescencji mu za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej. Następnie inkubuj płytki przykryte przylepnymi pokrywkami w temperaturze 50 °C przez 20 minut.Następnie zatrzymać reakcję poprzez zamrożenie. Po tym kroku zmierzyć fluorescencję końcową, stosując te same parametry, co dla punktu czasowego zero minut. Odjąć wartość fluorescencji w zerowej minucie od wartości fluorescencji w dwudziestej minucie, aby określić zmianę fluorescencji spowodowaną aktywnością enzymatyczną bezpośrednio przed przeprowadzeniem testu.Przygotować 2X roztwór roboczy A-O-C-M-C. Następnie połączyć 50 µL próbki i 50 µL roztworu roboczego w probówce o pojemności 1,5 mL. Następnie inkubować próbki przez 20 minut w temperaturze 50 °C.Zatrzymać reakcję, dodając 250 µL roztworu wytrącanego. Następnie każdą próbkę energicznie wymieszać na wirówce typu vortex przez 10 sekund, aby zapewnić całkowite połączenie próbki z roztworem wytrącającym. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, ponownie wymieszać na vortexie, a następnie odwirować z prędkością 1000 Gs przez 10 minut.Następnie, bez mieszania, przenieś 200 µL SNAT z każdej próbki do płytki 96-dołkowej. Aktywność enzymatyczna osadu przejawia się wyższym poziomem rozpuszczonego barwnika. Zmierz ją za pomocą spektroskopii absorbancyjnej przy długości fali 590 nm.W tym kroku należy umieścić krążki papieru filtracyjnego w probówkach o pojemności 1,5 lub 2 ml. Do krążków papieru filtracyjnego dodać 100 µL 60 mM octanu sodu oraz 100 µL próbek, a następnie inkubować przez 20 godzin w temperaturze 50 °C przy wytrząsaniu z prędkością 300 RPM.Dodatkowo, bezpośrednio przed przeprowadzeniem analizy, inkubuj poszczególne próbki bez papieru filtracyjnego w celu uzyskania kontroli. Przygotuj 1,5 x roztwór roboczy PABA, zawierający jeden mililitr roztworu PABA A i dziewięć mililitrów roztworu PABA B. Przechowuj na lodzie do momentu użycia. Następnie przygotuj próbki w termostabilnych probówkach o pojemności 0,5 mililitra.Próbki składają się z 45 µL wody, pięciu µL każdego roztworu inkubowanego z papierem filtrowanym oraz 100 µL roztworu roboczego PABA. Następnie należy przeprowadzić analizę kontroli próbek oraz pięciu standardów przygotowanych w ten sam sposób. Potem inkubować próbki, kontrole i standardy przez dokładnie 10 minut w temperaturze 100 °C i chłodzić w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 minut.Pipetuj 100 µL roztworu do płytki 96-dołkowej i przeprowadź pomiar za pomocą spektrofotometru przy długości fali 410 nm. Od wartości próbek z papieru filtrującego odejmij wartości kontrolne dla poszczególnych próbek, aby określić ilość uwolnionych cukrów redukujących. Poniżej znajduje się obraz przedstawiający kasety ekspresyjne oraz ekspresję białek w roślinach tytoniu.Tak wygląda zinfiltrowany liść tytoniu w świetle normalnym oraz w świetle zielonym z czerwonym filtrem, gdzie wyraźnie widoczna jest czerwona barwa wskazująca na ekspresję TR cell 5:00 AM cherry. Żel SDS-PAGE, western blot i zymogram CMC pokazują wielkość i aktywność T cell five A. Całkowite białka rozpuszczalne zostały rozdzielone, co możemy zwizualizować za pomocą barwienia błękitem Coomassie. Western blotting przeciwko regionowi hist-tag białka T cell five A potwierdza wielkość białka, a dodatkowo aktywność celulazy względem CMC jest wykazana na zymogramie barwionym czerwienią Kongo. Przedstawiono tutaj całkowite białka rozpuszczalne z liści rośliny tytoniu, w których transientnie eksprimowano TR cell five A, przed i po oczyszczaniu przez wytrącanie termiczne, gdzie TR cell five A stanowi największy widoczny prążek i jest również widoczny w western blocie oraz na zymogramie CMC.Widzimy również całkowitą zawartość białek rozpuszczalnych z roślin tytoniu, w których Tcell five A nie była obecna po wytrącaniu termicznym, oraz białka z komercyjnie dostępnej mieszaniny tresa cellulase. Rycina ta przedstawia ilościowe oznaczenie aktywności enzymatycznej TR cell five A; TR cell five A inkubowano z four MUC Azo CMC lub papierem filtrowanym, a degradację substratu mierzono poprzez uwalnianie barwnika azowego fluoro four four mu lub poprzez ilościowe oznaczenie cukrów redukujących na podstawie zmiany barwy PBA po przeprowadzeniu tej procedury. Do dostarczenia dodatkowych informacji na temat tego, jak lokalizacja białka może wpływać na stabilność i aktywność enzymu, można zastosować inne metody, takie jak targetowanie białek.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak przeprowadzić przejściową ekspresję białek w tytoniu, a także posiadać wiedzę na temat oceny aktywności enzymatycznej w konwersji biomasy celulozowej.

expression-recombinant-cellulase-cel5a-from-trichoderma-reesei

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Ekspresja rekombinowanej celulozy Cel5A z Trichoderma reesei w roślinach tytoniu

Opisujemy niskokosztową, wysokoprzepustową metodę przesiewania aktywności endoglukanazy grzybowej w E. coli. Metoda opiera się na prostym wizualnym odczycie degradacji substratu, nie wymaga oczyszczania enzymu i jest wysoce skalowalna. Umożliwia to szybkie przesiewanie dużych bibliotek wariantów enzymatycznych.

Wysokoprzepustowy screening aktywności grzybowej endoglukanazy w Escherichia coli

Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Produkcja białka przejściowego w roślinach Nicotiana oparta na infiltracji próżniowej za pomocą agrobakterii przenoszących wektory startowe (oparte na wirusie mozaiki tytoniu) jest szybkim i ekonomicznym podejściem do produkcji antygenów szczepionkowych i białek terapeutycznych. Uprościliśmy procedurę i poprawiliśmy akumulację celu, optymalizując warunki hodowli bakterii, dobierając gatunki gospodarzy i współwprowadzając supresory wyciszające RNA.

Optymalizacja i wykorzystanie produkcji białek przejściowych za pośrednictwem Agrobacterium w Nicotiana

Opisujemy podejście do projektowania eksperymentów, które może być użyte do określenia i modelowania wpływu elementów regulatorowych transgenu, parametrów wzrostu i rozwoju roślin oraz warunków inkubacji na przejściową ekspresję przeciwciał monoklonalnych i białek reporterowych w roślinach.

Charakterystyka układów złożonych z wykorzystaniem podejścia Design of Experiments: przejściowa ekspresja białek w tytoniu jako studium przypadku

Ta praca opisuje nowatorską metodę selektywnego celowania w organelle subkomórkowe u roślin, testowaną za pomocą BioRad Gene Gun.

Przejściowa ekspresja genów w tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

W tym badaniu porównano ekspresję docelowego ludzkiego białka rekombinowanego na różnych platformach produkcyjnych. Skupiliśmy się na tradycyjnych kulturach fermentorowych i roślinach, opisując konfigurację każdego systemu i podkreślając, na podstawie zgłoszonych wyników, nieodłączne ograniczenia i zalety każdej platformy.

Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych

Na poziomie subkomórkowym, zdarzenia sygnalizacyjne są dynamicznie modulowane przez sygnały rozwojowe i środowiskowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje system przejściowej ekspresji tytoniu do monitorowania dynamicznej interakcji białko-białko i ujawniania przestrzennej organizacji transdukcji sygnału w komórkach roślinnych.

Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

Opracowaliśmy nową metodę współekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach, aby przezwyciężyć trudności konwencjonalnych metod. Wykorzystuje wykorzystanie plazmidu o pojedynczej ekspresji, który zawiera wiele funkcjonalnie niezależnych kaset z ekspresją białek, aby osiągnąć koekspresję białka.

Efektywna koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach

Przejściowa heterologiczna ekspresja enzymów biosyntetycznych w liściach Nicotiana benthamiana może przekierować endogenne dostawy 2,3-oksydoskwalenu na produkcję nowych produktów triterpenowych o wysokiej wartości. W niniejszym dokumencie opisano szczegółowy protokół szybkiej (5 dni) produkcji triterpenów i analogów na skalę preparatywną z wykorzystaniem tej potężnej platformy roślinnej.

Przejściowa ekspresja w liściach Nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej

Tutaj prezentujemy protokoły wykorzystania systemu ekspresji białek komórek owadów i bakulowirusa do produkcji dużych ilości białek wydzielanych przez rośliny do krystalizacji białek. Wektor ekspresyjny bakulowirusa został zmodyfikowany za pomocą GP67 lub peptydu sygnałowego hemoliny owadów w celu ekspresji wydzielania białek roślinnych w komórkach owadów.

Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

Poznaj metodę ekspresji przejściowej celulazy TrCel5A w liściach tytoniu przy użyciu infiltracji Agrobacterium. Technika ta umożliwia szybką produkcję enzymów do konwersji biomasy roślinnej.

Ekspresja rekombinowanej celulazy Cel5A z Trichoderma reesei w roślinach tytoniu

Przeglądaj więcej filmów