Ekspresja rekombinowanej celulazy Cel5A z Trichoderma reesei w roślinach tytoniu

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przejściowa ekspresja docelowych białek w tytoniu, aby uzyskać wyobrażenie o wykonalności ekspresji enzymów roślinnych w krótkim czasie. Tę przejściową ekspresję osiąga się poprzez infiltrację liści tytoniu szczepem agrobacterium tumor fain, który zawiera wektor zawierający gen będący przedmiotem zainteresowania jako drugi krok Po inkubacji zbiera się infiltrowane liście roślin, a ekstrakty białkowe są częściowo oczyszczane w celu uzyskania działającego roztworu enzymu. Następnie przeprowadzana jest analiza białka w celu oceny wpływu ekspresji roślinnej na enzym i zweryfikowania jego aktywności enzymatycznej.

Uzyskano wyniki, które pokazują wielkość białka, możliwe efekty glikozylacji i aktywność enzymatyczną w oparciu o testy western blot, zy i degradacji substratu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące konwersji biomasy roślinnej, a także może dostarczyć informacji na temat aktywności enzymów po ich przejściowej ekspresji w tytoniu. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy infiltracji są trudne do nauczenia się, ponieważ liście są łatwo uszkadzane przez ubrania pasterza strzykawek, a ja będę przeprowadzał eksperymenty w sterylnych warunkach.

Przenieść pojedyncze kolonie agrobacterium toan do kolby Erlenmeyera zawierającej 10 mililitrów. Rosół z ekstraktu drożdżowego z antybiotykami. Następnie inkubować zaszczepiony bulion przez 36 do 40 godzin w temperaturze 26 stopni Celsjusza z prędkością 180 obr./min, wstrząsając, następnie zaszczepić 200 mikrolitrów każdej kultury w 20 mililitrach bulionu z ekstraktu drożdżowego tymi samymi antybiotykami, co poprzednio i inkubować w tych samych warunkach po 36 do 40 godzinach.

Wyindukować kultury za pomocą dwóch mikrolitrów acetofenonu, 100 mikrolitrów 40% roztworu glukozy i 200 mikrolitrów jednego molowego buforu MES o pH 5,6 i kontynuować inkubację przez noc. Teraz wyjmij rośliny ze szklarni i użyj końcówki pipety, aby naciąć osiową stronę AB od trzeciego do piątego liścia od wierzchołka rośliny, aby ułatwić infiltrację. Następnie napełnij strzykawkę pożywką infiltracyjną i umieść ją na jednym z wcześniej wykonanych nacięć.

Podeprzeć strzykawkę palcem po stronie liścia aksjo i ostrożnie wstrzyknąć pożywkę do dożylnej strefy liściowej. Aby uwidocznić fluorescencję w sekcjach liści wyrażających komórkę TR o godzinie 5:00 rano, wiśnia zaświeci rośliny przenośnym źródłem światła emitującym zielone światło. Patrząc przez czerwony filtr, fluorescencja z komórki TR 5:00 rano wiśni będzie wyraźnie widoczna.

Aby wyekstrahować wyrażone białka, wybierz liście tytoniu, które zostały naciekane AUM zawierającym P, śledź komórkę ERTR piątą A i pokrój je na jednogramowe kawałki. Następnie umieszczamy je w chłodnym moździerzu i dodajemy do próbek odpowiednią ilość ciekłego azotu. Zmiel liście na proszek za pomocą tłuczka.

Powtórzyć proces z nieinfiltrowanymi liśćmi tytoniu w celu uzyskania próbek kontrolnych. Następnie dodać dwa mililitry PBS zawierającego jeden milimolowy fluorek fenylu metylu suenu do zmielonej masy liści i mieszać, aż większość masy liści znajdzie się w zawiesinie. Odwirować ekstrakt w temperaturze 15 000 GS przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie wyrzuć osad, częściowo oczyszczoną komórkę TR piątą A, inkubując białko zawierające S natin w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 10 minut i pozwól mu odpocząć w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 minut. Następnie odwirować SNAT przy 15 000 GS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć osad i użyj białka zawierającego snat dla wszystkich.

Dalsze testy. Należy również przeprowadzić proces częściowego oczyszczania roślin nieinfiltrowanych, aby uzyskać próbki kontrolne. W tej procedurze należy zmieszać etylocelulozę i wodę, aby uzyskać 1,5% roztwór i inkubować, mieszając, aż do rozpuszczenia.

Aby zrobić żel stronicowy A-C-M-C-S-D-S, zastąp jeden mililitr 1,5% CMC jednym mililitrem wody w 10-mililitrowym roztworze żelu SDS i wlej żel normalnie następny, zdenaturuj próbki, gotując je w obecności SDS. Przeprowadzaj elektroforezę przy napięciu 200 woltów przez 50 minut, aż przód barwnika dotrze do dna żelu. Teraz wykonaj w żelu ponowne fałdowanie białek na stronie żelu punktowego 15%C-M-C-S-D-S.

Stosowanie 1,5% beta cyklodekstryny w 20-milimolowym buforze cytrynianu fosforanowego o pH 6,5. Inkubuj żel w tym roztworze w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając przez 15 minut. Odrzucić roztwór beta-cyklodekstryny i krótko przemyć żel wodą inkubowaną w temperaturze pokojowej w 50-milimolowym buforze octanu sodu o pH 4,8 przez kolejne 15 minut.

Następnie wykonaj CMC zy przy użyciu ponownie złożonego żelu punktowego 15%C-M-C-S-D-S, inkubując żel w 30-milimolowym buforze octanu sodu przez 20 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Aby uwidocznić, gdzie CMC uległ degradacji, należy barwić żel przez 10 minut 0,1% roztworem czerwieni kongijskiej i zatrzymywać go za pomocą jednego molowego chlorku sodu przez 30 minut lub do momentu, gdy na końcu zaobserwuje się wyraźne prążki, przemyć żel 0,3% kwasem octowym. Aby uzyskać wyraźniejsze obrazowanie bezpośrednio przed uruchomieniem testu, należy przygotować pipetę z czterema roztworami roboczymi MUC z dwoma X 100 mikrolitrów czterech roztworów roboczych MUC do oddzielnych studzienek na płytce 96-dołkowej.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów każdej próbki do odpowiednich studzienek, uruchamiając każdą próbkę w trzech egzemplarzach, używając długości fali wzbudzenia 360 nanometrów i długości fali emisji 465 nanometrów. Określ punkt czasowy zero minut fluorescencji czterech mu za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej. Następnie inkubuj płytki pokryte samoprzylepnymi pokrywkami w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Następnie zatrzymaj reakcję przez zamrożenie. Następnie zmierz punkt końcowy mu fluorescencji przy użyciu tych samych parametrów, co dla punktu czasu zero minut. Odejmij wartość fluorescencji po zerowej minucie od wartości fluorescencji po 20 minutach, aby określić zmianę fluorescencji spowodowaną aktywnością enzymatyczną bezpośrednio przed uruchomieniem testu.

Przygotuj roztwór roboczy A-O-C-M-C dwa X. Następnie połącz 50 mikrolitrów próbki i 50 mikrolitrów roztworu roboczego w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Następnie inkubuj próbki przez 20 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza.

Zatrzymaj reakcję, dodając 250 mikrolitrów roztworu strącającego. Następnie energicznie wiruj każdą próbkę przez 10 sekund, aby zapewnić całkowite wymieszanie próbki z roztworem strącającym. Następnie inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut i ponownie je wirować przed odwirowaniem w temperaturze 1000 G przez 10 minut.

Następnie przenieś 200 mikrolitrów SNAT z każdej próbki na płytkę 96-dołkową bez zakłócania. Aktywność enzymatyczna granulek przejawia się w wyższych poziomach rozpuszczonego barwnika. Zmierz to za pomocą spektroskopii absorpcyjnej o długości fali 590 nanometrów.

W tym kroku. Umieść krążki bibuły filtracyjnej w 1,5 lub dwóch mililitrowych probówkach. Dodać 100 mikrolitrów 60-milimolowego octanu sodu i 100 mikrolitrów próbek do kółek bibuły filtracyjnej i inkubować przez 20 godzin w temperaturze 50 stopni Celsjusza z wytrząsaniem 300 obr./min.

Ponadto należy inkubować poszczególne próbki bez bibuły filtracyjnej jako kontrolę bezpośrednio przed przeprowadzeniem testu. Przygotować 1,5 x roztwór roboczy PABA zawierający jeden mililitr roztworu PBA A i dziewięć mililitrów roztworu PABA B.Store na lodzie do momentu użycia. Następnie przygotuj próbki w 0,5 mililitrowych probówkach termostabilnych.

Próbki składają się z 45 mikrolitrów wody, pięciu mikrolitrów każdego roztworu inkubowanego z bibułą filtracyjną i 100 mikrolitrów roztworu roboczego PABA. Następnie uruchom próbne kontrole i pięć wzorców przygotowanych w ten sam sposób. Następnie inkubować próbki, kontrole i wzorce dokładnie przez 10 minut w temperaturze 100 stopni Celsjusza i schładzać w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 minut.

Odpipetować 100 mikrolitrów roztworu na 96-dołkową płytkę do testu za pomocą spektrofotometru o długości fali 410 nanometrów. Odejmij wartości kontrolne poszczególnych próbek od wartości próbki bibuły filtracyjnej, aby określić ilość uwolnionych cukrów redukujących. Oto zdjęcie przedstawiające kasety z ekspresją, a także ekspresję białek w roślinach tytoniu.

W ten sposób naciekany liść tytoniu pojawia się w normalnym świetle i w zielonym świetle z czerwonym filtrem, gdzie wyraźnie widoczna jest tutaj ekspresja wiśni komórki TR o 5:00 rano, wskazywana przez czerwony kolor. Strona SDS żel western lot i CMC zy, które pokazują rozmiar i aktywność limfocytu T pięć A. Całkowite rozpuszczalne białka zostały oddzielone i możemy je uwidocznić za pomocą niebieskiego barwienia kumasi Western blot w regionie znacznika hist komórki T piątej A potwierdza wielkość białka, a dodatkowo aktywność celulazy przeciwko CMC wykazuje ksenoprzeszczep zabarwiony czerwienią Kongo. To, co można tutaj zobaczyć, to całkowite rozpuszczalne białka z liści rośliny tytoniu, w których komórka TR piąta A uległa przejściowej ekspresji przed i po termicznym oczyszczaniu wytrącającym, gdzie komórka TR piąta A jest największym widocznym pasmem i jest również widoczna w zachodniej partii i CMC.

Widzimy również całkowite rozpuszczalne białka z roślin tytoniu, w których Tcell 5 A nie był, również po wytrącaniu termicznym oraz białka z dostępnej na rynku mieszaniny celulazy tresa. Rysunek ten przedstawia kwantyfikację aktywności enzymatycznej komórki TR piątej Komórka TR piąta A inkubowana z czterema MUC Azo CMC lub bibułą filtracyjną, a degradację substratu mierzono przez uwalnianie barwnika azowego fluoro cztery cztery mu lub przez ilościowe oznaczanie cukrów redukujących ze zmiany koloru PBA zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak celowanie w białka, mogą być wykorzystane do uzyskania dodatkowych informacji na temat tego, w jaki sposób lokalizacja białka może wpływać na stabilność i aktywność enzymu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś teraz dobrze zrozumieć, jak przejściowo eksprymować białka w tytoniu, a także dobrą wiedzę na temat oceny aktywności enzymatycznej. Konwersja biomasy celulozowej Foro.