Optymalizacja i wykorzystanie produkcji białek przejściowych za pośrednictwem Agrobacterium w Nicotiana

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie prostej, wydajnej i skalowalnej metody przejściowej produkcji białek rekombinowanych w systemie roślinnym z wykorzystaniem techniki agroinfiltracji. Zostanie to osiągnięte poprzez optymalizację warunków wzrostu roślin w pierwszej kolejności. Drugim krokiem jest transformacja agrobakterii wektorami startowymi, które łączą komponenty wirusów roślinnych i plazmidów binarnych, a następnie hodowla przekształconej agrobakterii do wykorzystania w eksperymentach agro.

Podczas infiltracji agrobakteriami rośliny odwraca się do góry nogami, a ich części nadziemne zanurza w zawiesinie agrobakterii. Następnie przykłada się podciśnienie, co powoduje usunięcie powietrza z przestrzeni międzykomórkowych w tkankach liści. Gwałtowne ponowne zwiększenie ciśnienia po zwolnieniu próżni skutkuje wtłoczeniem zawiesiny agrobakterii do wnętrza liści.

W końcowej fazie zastosowano immunoblotting oraz analizy fluorescencyjne, aby wykazać produkcję białka rekombinowanego w roślinach poddanych infiltracji. Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak infiltracja ręczna, jest możliwość przeskalowania metody infiltracji próżniowej na potrzeby przemysłowej produkcji białek rekombinowanych, w tym szczepionek i białek terapeutycznych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biotechnologii roślin oraz w dalszym usprawnieniu wykorzystania roślin jako alternatywnej platformy do komercyjnej produkcji białek rekombinowanych.

Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy, że skalowanie procesu agrofiltracji w roślinach hodowanych w glebie jest problematyczne. Z kilku powodów gleba zawiera zanieczyszczenia, takie jak wirusy, bakterie i nicienie, a ponadto skład gleby oraz woda do nawadniania różnią się między partiami i sezonami, a gleba ulega starzeniu podczas przechowywania. Co więcej, odwracanie roślin hodowanych w glebie prowadziłoby do niepożądanego ściekania ziemi do kultury agrobakterii podczas infiltracji.

Procedurę tę zaprezentują Rebecca Snow, starsza asystentka badawcza z laboratorium biologii roślin i inżynierii, oraz Emma Gut Robin Lobe. Ona, wraz z Adamem Trevorem, są asystentami badawczymi w moim laboratorium. W badaniu tym wykorzystano hydroponiczne podłoże do wzrostu roślin oraz roztwór odżywczy, aby zapewnić jednolitość wzrostu roślin i wyeliminować komplikacje związane z wykorzystaniem gleby w uprawie roślin.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy namoczyć płyty z wełny mineralnej w roztworze nawozu dla roślin przez pięć minut, a następnie ręcznie wysiać nasiona na powierzchni wełny mineralnej nasączonej składnikami odżywczymi. W badaniu tym zostaną ocenione trzy gatunki Nico Oceana z serii Cedar: dwa gatunki typu dzikiego, Nico Oceana, Benham Ana i Nico Oceana Excelsior, oraz hybryda Benhama, Any i Excelsior o nazwie Nico Oceana Excela. Rośliny z nasion należy hodować w warunkach kontrolowanych i przy długim fotoperiodzie w kaskadowym systemie hydroponicznym.

Nico Oceana, Bentham Miana i Nico Oceana Excela przez cztery do pięciu tygodni, a Nico Oceana Excelsior przez pięć do sześciu tygodni. Szczepy Agrobacterium tumor Fasion użyte w tym eksperymencie zostały przekształcone odpowiednimi wektorami startowymi, zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. Na potrzeby niniejszej demonstracji wykorzystano pięć przekształconych szczepów agrobacterium.

Szczepy Agrobacterium GV 3 1 0 1 zawierające gen reporterowy zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) GV 3 1 0 1, zawierające gen wirusowego supresora wyciszania P 19 wirusa pomidorowego stunt virus oraz GV 3 1 0 1 A four i T 10 zawierające gen białka nośnikowego zmodyfikowanej liazy lub lick KM, hodowano przez noc w pożywce LB uzupełnionej o 50 mg/L kanamycyny w temperaturze 28 °C przy wstrząsaniu z prędkością od 200 do 250 RPM. Następnego dnia przygotowano zawiesiny Agrobacterium do planowanych eksperymentów. Aby zbadać możliwość wykorzystania wielu szczepów Agrobacterium do przejściowej produkcji białek, rozcieńczono szczep laboratoryjny oraz dwa szczepy dzikie zawierające wektor PBI four lick km w wodzie milli Q do gęstości optycznej 0,5 przy 600 nm.

Aby zbadać konieczność indukowania genów wirulencji agrobacterium przed infiltracją, najpierw należy odwirować kultury agrobacterium niosące wektor P bid 4G FP, hodowane w medium LB, przy 4 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Następnie resuspender je w medium indukcyjnym MMA do gęstości optycznej przy 600 nm wynoszącej 0,5 i mieszać w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Aby sprawdzić, czy acetyl kon enhances przejściową produkcję białka, należy odwirować kulturę agrobacterium niosącą wektor PBI 4G FP, hodowaną przez noc w medium LB, a następnie resuspender ją w buforze do infiltracji zawierającym 1× soli ms, 10 mM MES i 2% glukozy.

Podziel zawiesinę komórkową do czterech pojemników. Do każdej z zawiesin Agrobacterium dodaj aceto cone w innym stężeniu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Aby przetestować wpływ ko-infiltracji supresora wyciszania wirusowego na przejściową produkcję białka GFP, wymieszaj.

Kulturę agrobacterium niosącą gen GFP oraz kulturę niosącą viralny supresor wyciszania P19 rozcieńczono wodą Milli-Q i zmieszano w stosunku cztery do jednego przed przeprowadzeniem infiltracji próżniowej roślin, co zostanie zademonstrowane. Następnie, aby przeprowadzić infiltrację próżniową roślin, kluczowe jest kontrolowanie ciśnienia próżni oraz czasu trwania infiltracji. W pierwszej kolejności należy przenieść przygotowaną zawiesinę agrobacterium do pojemnika znajdującego się wewnątrz komory próżniowej.

Następnie odwróć roślinę do góry nogami w rozcieńczonej zawiesinie agrobakterii i zastosuj próżnię od 50 do 400 mbar przez 30 lub 60 sekund. Optymalną infiltrację rutynowo przeprowadza się przy 50 do 100 mbar przez 60 sekund. Po przerwaniu próżni wyjmij rośliny z komory próżniowej, opłucz w wodzie i hoduj przez pięć do siedmiu dni w tych samych warunkach wzrostu, które stosowano przed filtracją.

Aby przygotować próbki do analizy Western, najpierw należy pobrać losowe próbki liści z roślin Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior lub Nico Oceana Excela od czterech do siedmiu dni po infiltracji (DPI), a następnie sproszkować próbki liści w ciekłym azocie do postaci drobnego proszku. Do każdej próbki należy dodać trzy objętości buforu 1x PBS zawierającego 0,5% Triton X 100 i przenieść próbkę do probówki typu Eppendorf. Próbki poddać delikatnemu wstrząsaniu lub rotacji przez 15 minut w temperaturze 4 °C.

Odwirować ekstrakt przez pięć minut i zebrać całkowite białka rozpuszczalne do czystej probówki typu eppendorf. Rozcieńczyć ekstrakty do odpowiedniego stężenia w buforze ekstrakcyjnym 1X PBS, a następnie dodać bufor do próbek 5X do końcowego stężenia 1X. Gotować próbki przez pięć minut przed rozdzieleniem białek metodą SDS-PAGE.

Po przeniesieniu białek na nieruchomą membranę transferową P należy wykryć GFP, stosując królicze poliklonalne antiserum anty-GFP w rozcieńczeniu 1:5 000 w roztworze blokującym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę przy delikatnym kołysaniu, po uprzednim trzykrotnym przemyciu membran roztworem 1X PBST 20. Następnie inkubować przez jedną godzinę z przeciwciałem anty-króliczym sprzężonym z peroksydazą chrzanową w rozcieńczeniu 1:5 000 w celu detekcji GFP.

Następnie analizuje się wyniki western blotu oraz intensywność prążków odpowiadających białkom zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. Wizualną detekcję fluorescencji GFP w całych roślinach poddanych transformacji przejściowej przeprowadza się przy użyciu ręcznej lampy UV o długiej fali; do fotografowania roślin poddanych transformacji przejściowej przez żółty filtr ES 52 należy użyć aparatu cyfrowego z czasem naświetlania wynoszącym 15 sekund. Obrazy z analiz western blot uzyskuje się przy użyciu oprogramowania Gene Snap na komputerze.

Ilościowo określ wyniki za pomocą oprogramowania gene tool, wykorzystując krzywą kalibracyjną opartą na oczyszczonym standardzie GFP. Nick Oceana Bentham Miana hodowano na płytkach Rockwool nasączonych dostępnymi w handlu nawozami, aby określić optymalne warunki wzrostu roślin i akumulacji biomasy. Obecność fosforu jest krytyczna dla uzyskania kiełkowania i wzrostu nasion NICO Oceana. Bentham, co obrazują te sześciotygodniowe rośliny rosnące albo w roztworze nawozu zawierającym 4,8% fosforu, albo w roztworze nawozu zawierającym 0% fosforu.

Wpływ pożywek do wzrostu i infiltracji agrobacterium na zdrowie roślin oraz produkcję białek zbadano poprzez porównanie produkcji GFP w roślinach Nicotiana hamana, które poddano infiltracji próżniowej kulturami agrobacterium PBI 4G FP hodowanymi w trzech różnych pożywkach. Kultury YEB, AB i LB hodowane przez noc w pożywkach YEB lub LB wirowano z niską prędkością i resuspenderowano w pożywce indukcyjnej MMA, lub hodowano przez noc w pożywkach YEB, LB lub AB i rozcieńczano bezpośrednio w stosunku 1:5 lub 1:10 wodą Milli Q. Jak pokazano na tym wyniku western blot, rośliny infiltrowane kulturami agrobacterium hodowanymi w pożywkach YEB, LB lub AB i rozcieńczanymi wodą Milli Q nie wykazały istotnych różnic w średniej produkcji GFP w porównaniu z kulturami wirowanymi i resuspenderowanymi w MMA.

W związku z tym do rozcieńczania kultur agrobacterium w celu infiltracji roślin zaleca się stosowanie wody milli Q, która była rutynowo używana w kolejnych eksperymentach do uzyskania gęstości optycznej przy 600 nanometrach wynoszącej 0,5. Następnie zbadano wpływ gęstości zawiesiny komórek agrobacterium oraz czasu przebiegu na ekspresję docelową. Oceńiono cztery różne gęstości zawiesiny komórek agrobacterium niosących PBI 4G FP, a próbki liści pobrano w czwartym, siódmym i dziesiątym dniu po infiltracji (DPI) w celu przeprowadzenia analizy western blot. W czwartym dniu DPI zaobserwowano wyraźne różnice w fluorescencji GFP wśród roślin infiltrowanych zawiesinami komórek agrobacterium o różnej gęstości; przy gęstości 600 wynoszącej 0,05 nie stwierdzono ekspresji GFP w siódmym dniu DPI GFP.

Fluorescencja była podobna w roślinach infiltrowanych zawiesiną komórkową o gęstościach 1,0, 0,5 i 0,1, natomiast była niższa w roślinach infiltrowanych przy A 600 wynoszącym 0,05, co zaobserwowano w 10 DPI. Nie odnotowano różnic w produkcji GFP pomiędzy roślinami infiltrowanymi czterema różnymi gęstościami zawiesiny komórkowej, co pozwala na zwiększenie różnorodności szczepów agrobacterium dostępnych do przejściowej produkcji białek.

Rośliny Nicotiana benthamiana poddano infiltracji próżniowej siedmioma różnymi szczepami bakterii agrobacteria zawierającymi wektor KBI four lick km. Infiltrowane liście zebrano w siódmym dniu po inkubacji (7 DPI), a poziom ekspresji kinazy określono metodą Western blot. Jak pokazano na tym wykresie, najwyższy poziom produkcji liazy uzyskano przy użyciu szczepów GV 3 1 10, 1 A four oraz LBA 4 4 0 4, z niewielkimi różnicami.

Podczas gdy najniższy poziom ekspresji odnotowano dla C58 C1, średnią produkcję liaz uzyskano w szczepach AT77, AT06 i AT10. Aktywność enzymatyczna liaz została wykazana przy użyciu testu XMO Graham. Oczyszczone bakteryjne białko liazy posłużyło jako kontrola pozytywna aktywności enzymu. Warto zauważyć, że rośliny Nicotiana benthamiana zainfiltrowane szczepami Agrobacterium typu dzikiego A4 i AT77 wykazywały objawy patologiczne, takie jak zahamowanie wzrostu, wydłużenie ogonków liściowych oraz zwijanie się liści w 7. dniu po inokulacji (DPI).

Objawy były łagodne u roślin nicotiana benham infiltrowanych szczepem T 10 typu dzikiego. Nie zaobserwowano żadnych objawów u roślin Nico Oceana Benham infiltrowanych szczepem laboratoryjnym GV 3 1 0 1. Porównanie produkcji biomasy roślin u gatunków typu dzikiego wykazało, że w tych samych warunkach wzrostu, maksymalna biomasa liści, jaką można uzyskać z Nico Oceana Excela, jest około dwukrotnie wyższa w porównaniu z Nico Oceana.

Produkcję białka Benham badano w odmianach Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior oraz Nico Oceana Excela zainfiltrowanych szczepem agrobacterium GV 3 1 0 1 zawierającym PBI 4G F-P-G-F-P. Akumulację oceniano w 7. dniu po inokulacji (DPI) w całych zainfiltrowanych liściach. Wizualna ocena ekspresji GFP w świetle UV wykazała równomierne rozmieszczenie GFP w Nico Oceana Hamana i Nico Oceana Excela oraz nierównomierne rozmieszczenie w Nico Oceana Excelsior, co wynikało z trudności w infiltracji całej powierzchni liścia Nico Oceana Excelsior. Analiza Western blot akumulacji GFP w tych zainfiltrowanych liściach w 7. dniu DPI wykazała, że poziom GFP był wyższy w Nico Oceana Hamana niż w Nico Oceana Excela i Nico Oceana Excelsior, co wskazuje na niski poziom produkcji białka w Nico Oceana.

Zjawisko to wynika z nierównomiernej infiltracji oraz nierównomiernego rozkładu nagromadzonego GFP w pobranym liściu. Aby przetestować wpływ ciśnienia próżniowego na liście, rośliny Nico Oceana Benham poddano infiltracji szczepem agrobacterium GV 3 1 0 1 zawierającym PBI 4G FP przy ciśnieniach próżniowych 400, 200, 100 lub 50 milibar, przy czasie utrzymywania próżni wynoszącym 30 lub 60 sekund. Nie zaobserwowano różnic w produkcji GFP oraz odnotowano niewielki lub żaden negatywny wpływ na zdrowie roślin przy zastosowaniu ciśnień próżniowych 5, 100 i 200 milibar przez 30 lub 60 sekund.

Wpływ czasu trwania próżni na ekspresję docelową oceniono poprzez infiltrowanie jednej kuwety roślin Nico Oceana Benham co godzinę przez osiem godzin, używając GV 3 1 0 1 zawierającego PBI 4G FP o wartości A 600 wynoszącej 0,5. W tej samej kulturze agrobacterium, jak pokazano w tym reprezentatywnym wyniku, poziom produkcji GFP był podobny we wszystkich punktach czasowych do ośmiu godzin, co sugeruje, że w tym okresie agrobacterium zachowuje zdolność do wprowadzania jednoniciowego DNA. Ponieważ zgłoszono, że wiele substancji chemicznych i monosacharydów zwiększa przejściową produkcję białek u różnych gatunków roślin.

W niniejszym badaniu oceniono również wpływ różnych stężeń aceto- syringonu i glukozy na przejściową produkcję białka GFP w liściach Nicotiana benthamiana zainfiltracjach szczepem agrobacterium GV3101 zawierającym plazmid PBI4G FP. Agrobakterie hodowano przez noc w pożywce YEB, następnie wirowano i resuspendowano do wartości OD₆₀₀ wynoszącej 0,5 albo w pożywce MMA zawierającej 2% glukozy z aceto-syringonem w określonych stężeniach, albo w pożywce MMA zawierającej 200 µM aceto-syringonu z glukozą w określonych stężeniach. Jak pokazano tutaj, żadne z przetestowanych stężeń tych związków nie wywołało istotnego wzrostu produkcji białka GFP w porównaniu z kontrolą, w której pożywka indukcyjna nie zawierała aceto-syringonu ani glukozy.

Następnie zbadano wpływ współinfiltracji supresora wyciszania na przejściową ekspresję genów GFP oraz HAC one w liściach Nico Oceana. Benham. Przed infiltracją kultury Agrobacterium GV 3101 zawierające PBI 4G FP oraz wirusowy supresor wyciszania P 19 wirusa pomarszczonych liści pomidora (tomato bushy stunt virus) zmieszano odpowiednio w stosunkach 1:1, 2:1, 3:1 i 4:1. Jak wskazują wyniki analizy Western blot w 7. dniu po inokulacji (DPI), obecność P 19 nie zwiększyła ani nie zmniejszyła produkcji GFP w nicotiana Benham Miana przy żadnym stosunku obu zawiesin Agrobacterium.

Dodatkowo zbadano wpływ dwóch viralnych supresorów wyciszania genów, P 23 i P 19, na zapobieganie posttranskrypcyjnemu wyciszaniu genów dla HAC one. Odmiany agrobacterium zawierające wektor startowy PBI four HAC one oraz jeden z dwóch plazmidów supresorów wyciszania viralnego zmieszano w stosunku odpowiednio cztery do jednego i ko-infiltrowano do Nicotiana Bentham Miana. Próbki infiltrowanych liści pobrano od trzech do ośmiu DPI.

Wykres ten przedstawia średnie poziomy ekspresji HAC one z trzech eksperymentów, określone za pomocą analizy Western blot. Ko-infiltracja Nico Oceana Benham z P 23 lub P 19 doprowadziła do zwiększenia produkcji HAC one w porównaniu z brakiem stosowania supresora wyciszania w 60 pi. Sugeruje to, że P 23 i P 19 są efektywne w tym systemie.

Zaobserwowano również, że zarówno w obecności, jak i w przypadku braku supresora wyciszania, poziom produkcji białka HAC one zaczął spadać w siódmej dobie po inokulacji (DPI). Wskazuje to na to, że czas spadku przejściowej produkcji białka w roślinach Nicotiana benthamiana infiltrowanych wektorem startowym jest specyficzny dla danego celu. Na koniec, stabilność banku komórek Agrobacterium jest oceniana co roku poprzez infiltrowanie roślin Nicotiana benthamiana tą samą partią banku komórek Agrobacterium w celu oceny akumulacji białka.

Te reprezentatywne wyniki wskazują, że produkcja białka HA one jest bardzo stabilna od ponad trzech lat. Średnia produkcja HAC one w roślinach Nicotiana benam wynosi 651 ± 49,4 mg/kg. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat zastosowania techniki agroinfiltracji w produkcji białek rekombinowanych na dużą skalę, która może być wykorzystywana do wytwarzania szczepionek podjednostkowych, przeciwciał przeciwko białkom oraz antygenów diagnostycznych.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby kontrolować krzyżowanie roślin hydroponicznie, używać żywotnych bakterii agro, kontrolować ciśnienie i czas próżni oraz monitorować nośnik ekspresji białka. Po opanowaniu techniki, filtracja agro może zostać przeprowadzona w ciągu 24 godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo w kontrolowanych warunkach.