Optymalizacja i wykorzystanie produkcji białek przejściowych za pośrednictwem Agrobacterium w Nicotiana

Produkcja białka przejściowego w roślinach Nicotiana oparta na infiltracji próżniowej za pomocą agrobakterii przenoszących wektory startowe (oparte na wirusie mozaiki tytoniu) jest szybkim i ekonomicznym podejściem do produkcji antygenów szczepionkowych i białek terapeutycznych. Uprościliśmy procedurę i poprawiliśmy akumulację celu, optymalizując warunki hodowli bakterii, dobierając gatunki gospodarzy i współwprowadzając supresory wyciszające RNA.

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie prostej, wydajnej i skalowalnej metody przejściowej produkcji białek rekombinowanych w systemie roślinnym z wykorzystaniem techniki agroinfiltracji. Osiąga się to poprzez optymalizację warunków wzrostu roślin. Drugim krokiem jest przekształcenie agrobacterium za pomocą wektorów startowych, które łączą składniki wirusów roślinnych i plazmidów binarnych, a następnie hodowla przekształconego agrobacterium do wykorzystania w eksperymentach agro.

Podczas infiltracji agrobacterium rośliny są odwracane do góry nogami, a części nadziemne są zanurzane w zawiesinie agrobacterium. Następnie stosuje się podciśnienie, powodując ewakuację powietrza z przestrzeni międzykomórkowych w tkankach liści. Poprzez St Rapid ponowne zwiększenie ciśnienia po uwolnieniu próżni powoduje wlew zawiesiny agrobacterium do liści.

Ostatecznie stosuje się testy immunologiczne i fluorescencyjne, aby wykazać produkcję rekombinowanych białek w infiltrowanych roślinach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak infiltracja ręczna, jest to, że metodę infiltracji próżniowej można zwiększyć do przemysłowej produkcji białek rekombinowanych, w tym szczepionek i białek terapeutycznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biotechnologii roślin i jeszcze bardziej ułatwić wykorzystanie roślin jako alternatywnej platformy do komercyjnej produkcji białek rekombinowanych.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy dowiedzieliśmy się, że zwiększenie skali agrofiltracji roślin uprawiających w glebie jest wyzwaniem. Z kilku powodów gleba zawiera uchin, takich jak wirusy, bakterie, nicienie, a ponadto zawartość gleby i woda do nawadniania różnią się w zależności od partii i sezonu na sezon, a gleba jaja w czasie przechowywania. Co więcej, odwrócenie roślin rosnących w glebie spowodowałoby niepożądane kapanie gleby do kultury agrobacterium podczas infiltracji.

Procedurę tę zademonstrują Rebecca Snow, starszy asystent naukowy z laboratorium biologii roślin i inżynierii, oraz Emma Gut Robin Lobe. Ona, ona i Adam Trevor, którzy są asystentami naukowymi w moim laboratorium. W badaniu wykorzystano hydroponiczne podłoże do wzrostu roślin i pożywkę, aby zapewnić równomierność wzrostu roślin i wyeliminować złożoność związaną z wykorzystaniem gleby do uprawy roślin.

Aby rozpocząć tę procedurę, namocz płyty z wełny mineralnej w roztworze nawozu roślinnego na pięć minut, ręcznie wysiewaj nasiona na nasączonej składnikami odżywczym powierzchni wełny mineralnej. Używając cedru, w tym badaniu ocenione zostaną trzy gatunki Nico Oceana, dwa dzikie gatunki, Nico Oceana, Benham Ana i Nico Oceana Excelsior, oraz hybryda Benham, Ana i Excelsior o nazwie Nico Oceana. Excela uprawia rośliny z nasion w kontrolowanych warunkach i długim dniu zdjęciowym w hydroponicznym systemie kaskadowym.

Nico Oceana, Bentham Miana i Nico Oceana Excela przez cztery do pięciu tygodni oraz Nico Oceana Excelsior przez pięć do sześciu tygodni. Szczepy Agrobacterium tumor Fasion użyte w tym eksperymencie zostały przekształcone za pomocą odpowiednich wektorów startowych, jak opisano w dołączonym manuskrypcie. Do celów tej demonstracji wykorzystuje się pięć przekształconych szczepów agrobacterium.

GV 3 1 0 1, przenoszący reporterowe białko zielonej fluorescencji lub gen GFP GV 3 1 0 1, przenoszący wirusowy gen supresora wyciszającego wirusa karłowatości pomidora P 19 i A cztery GV 3 1 0 1 i T 10. Przenosząc gen zmodyfikowanego białka nośnikowego liazy lub lizawki KM, szczepy agrobacterium rosną przez noc w pożywce LB, uzupełnionej 50 miligramami na litr mycyny w puszce w temperaturze 28 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 do 250 obr./min następnego dnia. Przygotuj zawiesiny agrobacterium do pożądanych eksperymentów w celu zbadania wykonalności użycia wielu szczepów agrobacterium do przejściowej produkcji białka, rozcieńczyć szczep laboratoryjny i dwa szczepy typu dzikiego, zawierając wektor PBI o długości czterech kilometrów lizawki w wodzie mili Q do gęstości optycznej przy 600 nanometrach 0,5.

Aby zbadać konieczność indukowania genów wirulencji agrobacterium przed infiltracją, najpierw odwiruj kultury agrobacterium przenoszące wektor P bid 4G FP hodowany na pożywce LB w temperaturze 4 000 razy G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Następnie ponownie zawiesić w pożywce indukcyjnej MMA do gęstości optycznej 0,5 nanometra 600 nanometrów i mieszać w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, aby sprawdzić, czy stożek acetylowy zwiększa przejściową produkcję białka, wirówkę i hodowlę agrobacterium. Przenoszenie wektora PBI 4G FP wyhodowanego przez noc w pożywce LB i ponownie zawieszonego w buforze infiltracyjnym zawierającym jedną sól X ms 10 milimolową, MES i 2% glukozy.

Podzielić zawiesinę komórek na cztery pojemniki. Dodać inne stężenie stożka aceto do każdej z zawiesin agrobacterium i inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Zbadanie wpływu infiltracji współczynnika supresora wyciszającego wirusa na przejściową mieszankę do produkcji białek GFP.

Kultura agrobacterium rozcieńczona wodą mili Q przenosząca gen GFP i kultura zawierająca wirusowy supresor wyciszający P 19 w stosunku cztery do jednego Podczas infiltracji próżniowej roślin, co zostanie zademonstrowane. Następnie bardzo ważne jest, aby kontrolować podciśnienie i czas infiltracji próżniowej roślin. Najpierw przenieś przygotowaną zawiesinę agrobacterium do pojemnika wewnątrz komory próżniowej.

Następnie odwróć roślinę do góry nogami w rozcieńczonym agrobacterium i zastosuj próżnię o ciśnieniu od 50 do 400 milibarów przez 30 lub 60 sekund. Optymalna infiltracja jest rutynowo stosowana przy ciśnieniu od 50 do 100 milibarów przez 60 sekund. Po przerwaniu próżni wyjmij rośliny z komory próżniowej, spłucz w wodzie i rosnąć przez pięć do siedmiu dni w tych samych warunkach wzrostu, które są używane do wzrostu przed filtracją.

Aby przygotować próbki do analizy zachodniej, najpierw zbierz losowe próbki liści z roślin Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior lub Nico Oceana Excela w ciągu czterech do siedmiu dni po infiltracji lub DPI sproszkowaj próbki liści w ciekłym azocie na drobny proszek. Do każdej próbki dodać trzy objętości jednego buforu XPBS zawierającego 0,5% Triton X 100 i przenieść próbkę do probówki einor. Delikatnie wstrząsać lub obracać wyekstrahowane próbki przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wiruj ekstrakt przez pięć minut i zbierz całkowite rozpuszczalne białko do czystej probówki einor. Rozcieńczyć ekstrakty do odpowiedniego rozcieńczenia w jednym buforze ekstrakcyjnym XPBS i dodać pięć razy bufor próbki do końcowego stężenia jeden X. Gotuj próbki przez pięć minut przed oddzieleniem białek za pomocą karty charakterystyki.

Po przeniesieniu białek na nieruchomą błonę transferową P i wykryciu GFP za pomocą króliczej poliklonalnej surowicy anty GFP w rozcieńczeniu od jednego do 5 000 w roztworze blokującym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę z delikatnym kołysaniem po trzykrotnym umyciu membran jednym X-P-B-S-T 20. Inkubować z peroksydazą chrzanową sprzężoną przeciwciałem przeciw wściekłości, dodać rozcieńczenie od jednego do 5 000 przez jedną godzinę w celu wykrycia GFP.

Następnie western blot jest przetwarzany, a intensywność pasm odpowiadająca białkom jest analizowana zgodnie z opisem w dołączonym manuskrypcie. Wizualna detekcja fluorescencji GFP w całych przejściowo przekształconych roślinach odbywa się za pomocą ręcznej lampy UV o długiej długości fali, przy użyciu aparatu cyfrowego i czasu naświetlania 15 sekund do fotografowania przejściowo przekształconych roślin przez żółty filtr ES 52. Uzyskaj obrazy z analiz western blot za pomocą oprogramowania do pobierania genów w genomie.

Określ ilościowo wyniki za pomocą oprogramowania narzędzia genetycznego z krzywą kalibracyjną opartą na oczyszczonym wzorcu GFP, Nick Oceana Bentham Miana została wyhodowana na płytach Rockwell nasączonych dostępnymi na rynku nawozami w celu określenia optymalnych warunków wzrostu roślin i akumulacji biomasy. Obecność fosforu ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia kiełkowania i wzrostu NICO Oceana. Nasiona benthama, jak pokazano na przykładzie tych sześciotygodniowych roślin rosnących w roztworze nawozu zawierającym 4,8% fosforu lub roztworze nawozu zawierającym 0% fosforu.

Zbadano wpływ wzrostu i pożywki infiltracyjnej agrobacterium na zdrowie roślin i produkcję białek, porównując produkcję GFP w nicotiana. Rośliny Hamana infiltrowane próżniowo PBI 4G FP zawierające kultury agrobacterium hodowane w trzech różnych podłożach. Kultury YEB AB i LB wyhodowane przez noc na pożywce YEB lub LB odwirowano z niską prędkością i ponownie zawieszono w pożywce indukcyjnej MMA lub wyhodowano przez noc w pożywce YEB LB lub AB i bezpośrednio rozcieńczono od 1 do 5 lub od 1 do 10 wodą Milli Q, jak pokazano w tym wyniku western blot, rośliny infiltrowane kulturami agrobacterium uprawiane w pożywkach YEB LB lub AB i rozcieńczane Milli Q. Woda nie wykazała znaczącej różnicy w średniej produkcji GFP z kultur odwirowanych i ponownie zawieszonych w MMA.

Dlatego woda milli Q jest zalecana do rozcieńczania kultur agrobacterium do infiltracji roślin i była rutynowo stosowana w kolejnych eksperymentach w celu uzyskania gęstości optycznej 0,5 przy 600 nanometrach. Następnie zbadano wpływ gęstości zawiesiny komórek agrobacterium i przebiegu w czasie na ekspresję docelową. Oceniono cztery różne gęstości zawiesiny komórek agrobacterium przenoszących PBI 4G FP i pobrano próbki liści po czterech, siedmiu i 10 dniach po infiltracji lub DPI w przypadku analizy western blot przy czterech DPI, zauważalne były różnice we fluorescencji GFP wśród roślin naciekanych o różnych gęstościach zawiesiny komórkowej agrobacterium nie zaobserwowano ekspresji GFP przy 600 0,05 przy siedmiu D-P-I-G-F-P.

Fluorescencja była podobna u roślin naciekanych w zawiesinie komórek. Gęstości 601.0 0,5 i 0,1, ale dolne implanty infiltrowane przy A 600 0,05 w przeciwieństwie do 10 DPI. Nie zaobserwowano różnic w produkcji GFP wśród roślin naciekanych którąkolwiek z czterech gęstości zawiesiny komórkowej w celu zwiększenia różnorodności szczepów Agrobacterium dostępnych do przejściowej produkcji białka.

Rośliny Nicotiana Benham miana zostały zinfiltrowane próżniowo siedmioma różnymi szczepami agrobakterii zawierających wektor KBI o średnicy czterech kilometrów. Naciekane liście zebrano w temperaturze siedmiu DPI, a poziom ekspresji kinazy oszacowano za pomocą Western blot. Jak pokazano na poniższym wykresie, najwyższy poziom produkcji liazy osiągnięto w przypadku szczepów GV 3 1 10, 1 A four i LBA 4 4 0 4 z niewielkimi różnicami.

Podczas gdy najniższy poziom ekspresji odnotowano w przypadku C, pięć, osiem, C, jedną pośrednią produkcję liazy osiągnięto w przypadku szczepów, aktywność enzymatyczna liazy T 77, A, T zero sześć i T 10 wykazano za pomocą testu XMO Grahama. Oczyszczone białko liazy bakteryjnej zastosowano jako pozytywną kontrolę aktywności enzymu. Warto zauważyć, że rośliny nicotiana Benham miana infiltrowane szczepami A four i T seven seven wild type agrobacterium wykazywały patologiczne objawy, takie jak karłowatość, wydłużanie i zwijanie się zwierząt domowych oraz zwijanie się liści przy siedmiu DPI.

Objawy były łagodne u roślin nicotiana benham przesiąkniętych dzikim typem szczepu T 10. Nie zaobserwowano żadnych objawów w roślinach Nico Oceana Benham przenikniętych laboratoryjnym szczepem GV 3 1 0 1. Porównanie produkcji biomasy roślinnej u gatunków dziko żyjących wykazało, że w tych samych warunkach wzrostu najwyższa biomasa liści, jaką można wygenerować z Nico Oceana Excela, jest około dwukrotnie wyższa w porównaniu z Nico Oceana.

Produkcja białka Benham była badana w Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior i Nico Oceana Excela infiltrowanych szczepem agrobacterium. GV 3 1 0 1 z akumulacją PBI 4G F-P-G-F-P oceniano na poziomie siedmiu DPI w całych naciekanych liściach. Wizualne badanie ekspresji GFP w świetle UV wykazało równomierny rozkład GFP w Nico Oceana Hamana i Nico Oceana Excela oraz nierównomierny rozkład w Nico Oceana Excelsior ze względu na trudności w infiltracji całego obszaru liści Nico Oceana Excelsior Analiza Western blot akumulacji GFP w tych naciekanych liściach przy siedmiu DPI wykazała, że poziom GFP był wyższy w Nico Oceana Hamana niż w Nico Oceana Excela i Nico Oceana Excelsior niski poziom produkcji białka w Nico Oceana.

Excelsior jest spowodowany nierównomierną infiltracją i nierównomiernym rozmieszczeniem nagromadzonej GFP w zebranym liściu. Aby przetestować wpływ podciśnienia na liście, rośliny Nico Oceana Benham zostały przesiąknięte szczepem agrobacterium, GV 3 1 0 1 zawierającym PBI 4G FP pod ciśnieniem 400, 200, 100 lub 50 milibarów w czasie utrzymywania próżni wynoszącym 30 lub 60 sekund. Nie zaobserwowano różnic w produkcji GFP i łagodnego lub żadnego szkodliwego wpływu na zdrowie roślin, gdy zastosowano podciśnienie 5, 100 i 200 milibarów przez 30 lub 60 sekund.

Wpływ czasu trwania próżni na ekspresję docelową oceniano poprzez infiltrację jednego mieszkania z zakładów Nico Oceana Benham co godzinę za pomocą A 600 0,5 GV 3 1 0 1 zawierającego PBI 4G FP przez osiem godzin. W tej samej kulturze agrobacterium, jak pokazano w tym reprezentatywnym wyniku, poziom produkcji GFP był podobny przez cały czas, punkty do ośmiu godzin, co sugeruje, że w tym okresie czasu agrobacterium zachowuje zdolność do uruchamiania jednoniciowego DNA. Ponieważ doniesiono, że wiele substancji chemicznych i cukrów prostych zwiększa przejściową produkcję białek u różnych gatunków roślin.

W badaniu tym oceniano również wpływ różnych stężeń aceto, krynonu i glukozy. Podczas przejściowej produkcji białka GFP w Nico Oceana Benham, Ana naciekała szczepem agrobacterium, GV 3 1 0 1 zawierającym PBI 4G FP. Agrobakterie hodowano przez noc w pożywkach YEB, odwirowano i ponownie zawieszono do 600 0,5 albo w MMA zawierającym 2% glukozy z acetyloseronem we wskazanych stężeniach, albo w MMA zawierającym 200 mikromolowych acetofenonów z glukozą we wskazanych stężeniach. Jak wykazano tutaj, żadne z badanych stężeń tych związków nie wywołało znaczącego wzrostu produkcji białka GFP w porównaniu z kontrolą, w której pożywki indukcyjne nie zawierały acetofenonu ani glukozy.

Następnie wpływ współinfiltracji supresora wyciszającego na przejściową ekspresję genów GFP i HAC one w Nico Oceana. Liście Benham badano przed infiltracją, agrobacterium GV trzy jeden dziesięć jeden kultury zawierające PBI 4G FP i wirusowy supresor wyciszający P 19 wirusa krzaczastego karłowatości pomidora zmieszano odpowiednio w proporcjach jeden do jednego, dwa do jednego, trzy do jednego i cztery do jednego. Jak wskazują wyniki analizy Western blot przy siedmiu DPI, obecność P 19 nie zwiększała ani nie zmniejszała produkcji GFP u nicotiana Benham Miana w żadnym stosunku dwóch zawiesin agrobacterium.

Ponadto zbadano wpływ dwóch wirusowych supresorów wyciszania genów P 23 i P 19 na zapobieganie potranskrypcyjnemu wyciszaniu genów dla HAC one. POS agrobacterium przenoszący wektor startowy PBI, cztery HAC jeden i jeden z dwóch plazmidów supresorowych wyciszających wirusa zmieszano odpowiednio w stosunku cztery do jednego i jednocześnie infiltrowano do Nicotiana Bentham Miana. Próbki naciekanych liści pobierano od trzech do ośmiu DPI.

Ten wykres przedstawia średnie poziomy HAC jednej ekspresji z trzech eksperymentów, określone za pomocą analizy Western blot. Jednoczesna infiltracja Nico Oceana Benham za pomocą P 23 lub P 19 spowodowała wzrost produkcji HAC one w porównaniu z brakiem stosowania tłumika przy 60 pi. Sugeruje to, że P 23 i P 19 są wydajne w tym systemie.

Zaobserwowano również, że zarówno w obecności, jak i braku supresora wyciszającego, poziom produkcji białka HAC one zaczął spadać przy siedmiu DPI. Wskazuje to, że czas spadku produkcji białka przejściowego w Nico Oceana Benham Miana przenikniętym do wektora startowego jest specyficzny dla celu. Wreszcie, stabilność banku komórek Agrobacterium jest oceniana co roku poprzez infiltrację roślin nicotiana benham tą samą partią banku komórek Agrobacterium w celu oceny akumulacji białka.

Te reprezentatywne wyniki wskazują, że produkcja białka HA one jest bardzo stabilna od ponad trzech lat. Średnia produkcja HAC one w roślinach Nicotiana benam wynosi 651 plus minus 49,4 miligramów na kilogram. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować technikę infiltracji agro do produkcji rekombinowanych białek na dużą skalę, które można wykorzystać do produkcji szczepionki podjednostkowej, przeciwciał białka teo i antygenów diagnostycznych.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o kontrolowaniu rośliny krzyżowo hydroponicznej, stosowaniu żywotnych bakterii agro, kontrolowaniu podciśnienia i podciśnienia oraz monitorowaniu nośnika ekspresji białka. Po opanowaniu technikę agrofiltracji można wykonać w ciągu 24 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo w kontrolowanych warunkach.