Name: Optymalizacja i wykorzystanie produkcji białek przejściowych za pośrednictwem Agrobacterium w Nicotiana (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 23 min 21 s
Description: Poznaj metodę produkcji białek przejściowych w roślinach Nicotiana za pomocą agroinfiltracji próżniowej. Technika ta umożliwia skalowalną produkcję białek rekombinowanych, w tym szczepionek i białek terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology, iBio, Inc. oraz Defense Advanced Research Projects Agency (grant # HDTRA1-07-C-0054). Autorzy dziękują za hojne dary od dr Stantona Gelvina z Wydziału Nauk Biologicznych, Purdue University (szczepy Agrobacterium tumefaciens) i Wayne'a Fitzmaurice'a z Large Scale Biology Corp. (nasiona N. excelsiana), a także Jennifer Nicholson z US Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. excelsior nasiona). Autorzy dziękują Margaret Shillingford i Christopherowi Hullowi za dostarczenie roślin i doskonałą pomoc techniczną. Autorzy dziękują również doktorom Stephenowi Streatfieldowi i Natashy Kushnir za pomoc redakcyjną.

1. Uprawa roślin
Do późniejszej agroinfiltracji oceniliśmy dwa dzikie gatunki Nicotiana (N. benthamiana i N. excelsior) oraz hybrydę (N. excelsiana) uprawianą hydroponicznie na wełnie mineralnej w pomieszczeniach zamkniętych.
<ol>
	<li>Namocz płyty z wełny mineralnej w roztworze nawozu roślinnego.</li>
	<li>Wysiewaj nasiona N. benthamiana, N. excelsior i N. excelsiana typu dzikiego (hybryda N. benthamiana × N. excelsior) na nasączonej składnikami odżywczymi powierzchni wełny mineralnej.</li>
	<li>Rośliny z nasion należy uprawiać w kontrolowanych warunkach (24 °C i 40-65% wilgotności względnej) i fotoperiodzie długiego dnia (14 godzin światła i 10 godzin ciemności, przy oświetleniu 130-150 μE m-2 sec-1) przez 4-5 tygodni dla N. benthamiana i N. excelsiana oraz 5-6 tygodni dla N. excelsior. </li>
</ol>
2. Budowa wektorów do agroinfiltracji
<ol>
	<li>Wprowadzić syntetyczny gen reporterowy (białko zielonej fluorescencyjnej [GFP]), hemaglutyninę (HA) o pełnej długości ze szczepu wirusa grypy A/California/04/2009 (HAC1) i zmodyfikowany enzym porchanazy (LicKM)18 oddzielnie do wektora startowego pBID418 (wektor oparty na TMV) w celu uzyskania pBID4-GFP, pBID4-HAC1 i pBID4-LicKM, odpowiednio18,32,41,47. </li>
	<li>Wprowadzić 10-50 ng pBID4 przenoszącego GFP lub HAC1 do elektrokompetentnych komórek szczepu A. tumefaciens GV3101 i LicKM do elektrokompetentnych komórek szczepów A. tumefaciens GV3101, C58C1, GLA4404, At06, At10, At77 i A4 za pomocą elektroporatora genu MicroPulser.</li>
	<li>Użyj przekształconych agrobakterii do eksperymentów infiltracyjnych, chyba że zaznaczono inaczej.</li>
</ol>
3. Próżniowa infiltracja Agrobacterium do roślin Nicotiana
<ol>
	<li>Szczepy A. tumefaciens należy uprawiać przez noc (O/N) na pożywce LB, pożywce YEB lub pożywce AB uzupełnionej 50 mg/l kanamycyny w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem przy 200-250 obr./min.</li>
	<li>Rozcieńczyć agrobakterie w wodzie Milli-Q do gęstości optycznej przy 600 nm (A600) 0,5 lub odwirować komórki Agrobacterium wyhodowane w LB lub YEB lub AB w temperaturze 4 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić w pożywce indukcyjnej (1x sól MS, 10 mM MES, 200 μM acetosyringon, 2% sacharozy [MMA]) do A600 0,5, i mieszać w temperaturze pokojowej przez 1-3 godziny, chyba że zaznaczono inaczej.</li>
	<li>Naciekać rośliny w komorze próżniowej, zanurzając tkanki powietrzne rośliny Nicotiana w zawiesinie Agrobacterium i stosując próżnię 50-400 mbar na 30 lub 60 sekund. Optymalna infiltracja jest rutynowo stosowana przy ciśnieniu 50-100 mbar przez 60 sekund.</li>
	<li>Po przerwaniu próżni usuń rośliny z komory próżniowej, spłucz w wodzie i rosnąć przez 5-7 dni w tych samych warunkach wzrostu, które są używane do wzrostu przed infiltracją.</li>
	<li>W celu zbadania skuteczności substancji chemicznych indukujących gen Agrobacterium vir, do agrobakterii zawieszonych w buforze infiltracyjnym dodano różne stężenia acetosyringonu (0, 100, 200 lub 400 μM) (1x MS, 10 mM MES, 2% glukozy). Ze względu na wpływ monosacharydu na indukcję genu vir, różne procenty glukozy (0, 1, 2 lub 4%) dodawano do agrobakterii zawieszonych w buforze naciekowym (1x MS, 10 mM MES, 200 μM acetosyringonu). Rośliny N. benthamiana zostały zinfiltrowane, jak wspomniano powyżej w krokach 3.3 i 3.4).</li>
	<li>Szczepy laboratoryjne Agrobacterium GV3101, C58C1 i LBA4404 oraz szczepy typu dzikiego A4, At06, At10 i At77 zawierające wektor pBID4-LicKM rozcieńczono w wodzie Milli-Q do A600 0,5. Rośliny N. benthamiana zostały przesiąknięte każdym konkretnym szczepem, jak wspomniano powyżej w krokach 3.3 i 3.4.</li>
</ol>
4. Procedura ko-agroinfiltracji dla supresora wyciszającego wirusa
<ol>
	<li>Wymieszać rozcieńczone wodą kultury Milli-Q Agrobacterium GV3101 zawierające gen GFP i supresor wyciszający p19 wirusa krzaczastego karłowatości pomidora (TBSV) w proporcjach 1:1, 2:1, 3:1 i 4:1. Naciekać rośliny N. benthamiana zgodnie z powyższym opisem.</li>
	<li>Naciekać rośliny N. benthamiana mieszaniną dwóch rozcieńczonych wodą kultur Agrobacterium GV3101 rozcieńczonych w wodzie Milli-Q: pierwsza przenosząca plazmid pBID4-HAC1, a druga przenosząca jeden z supresorów wyciszających – p19 TBSV lub p23 wirusa Citrus tristeza, odpowiednio w plazmidzie pCassp (pCassp19) i w plazmidzie binarnym pGR pod promotorem 35S (pGR-P23), w stosunku 4:1.</li>
</ol>
5. Analiza Western Blot
<ol>
	<li>Zbierz losowe próbki liści z roślin N. benthamiana, N. excelsior lub N. excelsiana w temperaturze 4-7 dpi i sproszkowaj w ciekłym azocie na drobny proszek.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać trzy objętości buforu 1x PBS zawierającego 0,5% Triton X-100.</li>
	<li>Delikatnie wstrząsać wyekstrahowanymi próbkami przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wiruj ekstrakt przez 5 minut i zbierz całkowite rozpuszczalne białko do czystej probówki Eppendorfa.</li>
	<li>Rozcieńczyć ekstrakty do odpowiedniego rozcieńczenia (1:50 1:100) w 1x buforze ekstrakcyjnym PBS i dodać 5× buforu próbki (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], 10% SDS, 0,5% błękitu bromofenolowego, 50% glicerolu v/v i 500 mM DTT) do końcowego stężenia 1×.</li>
	<li>Gotuj próbki przez 5 minut.</li>
	<li>Oddziel białka przez 10% SDS-PAGE, przenieś na błonę transferową Immobilon-P i zablokuj 0,5% I-blokiem.</li>
	<li>Wykryć GFP za pomocą króliczej poliklonalnej surowicy anty-GFP w stosunku 1:5 000 i HAC1 za pomocą mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-polihistydyny w stosunku 1:1 000 w roztworze blokującym przez 1 godzinę.</li>
	<li>Po znakowaniu przeciwciałami pierwotnymi przemyć błony trzy razy przez 10 minut każdą 1× PBST-20 i inkubować z przeciwciałem antykróliczym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) w stosunku 1:5 000 lub przeciwciałem anty-mysim sprzężonym z HRP w stosunku 1:10 000 przez 1 godzinę, odpowiednio w celu wykrycia GFP i HAC1.</li>
	<li>Przetwarzaj Western blot przy użyciu substratu chemiluminescencyjnego SuperSignal West Pico.</li>
	<li>Użyj oprogramowania GeneTools, aby przeanalizować intensywność pasma białka i uzyskać skalibrowaną ilość prążka.</li>
</ol>
Produkcja białka: (Skalibrowana ilość x rozcieńczenie próbki)/ilość załadowanej próbki) x 4 = mg/kg. 
Równanie: produkcja białka (P), skalibrowana ilość (C), rozcieńczenie próbki (D) i ilość załadowanej próbki (S).

6. Test Zymogramu
<ol>
	<li>Zbierz losowe próbki tkanek N. benthamiana infiltrowane pBID4-LicKM.</li>
	<li>Ekstrahuj białka przy użyciu tych samych metod, które opisano powyżej, do analizy Western blot, a następnie analizuj za pomocą 10% SDS-PAGE z 0,1% porostem zawartym w żelach.</li>
	<li>Po elektroforezie przemyć żele dwa razy przez 10 minut każdy w buforze do przemywania (100 mM Tris-HCl [pH 8,0] i 0,1% Triton X-100), a następnie inkubować w buforze do przemywania w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Po inkubacji wyrzucić bufor do przemywania i zabarwić żele 0,5% czerwienią Kongo przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Opłucz żele w wodzie Milli-Q trzy razy przez 10 minut każdy i dodaj 1 M NaCl, aby uwidocznić aktywność liczenanazy. Oczyszczone białko porazazy bakteryjnej zastosowano jako pozytywną kontrolę aktywności enzymu.</li>
</ol>
7. Obrazowanie GFP
<ol>
	<li>Wykonaj wizualną detekcję fluorescencji GFP w całych przejściowo przekształconych roślinach za pomocą ręcznej lampy UV o długiej fali.</li>
	<li>Fotografuj przejściowo przekształcone rośliny aparatem cyfrowym przez filtr Yellow 8, ES 52 (czas naświetlania, 15 sekund).</li>
	<li>Uzyskaj obrazy z analiz Western blot za pomocą oprogramowania GeneSnap na GeneGnome i określ ilościowo wyniki za pomocą oprogramowania GeneTools, z krzywą kalibracyjną opartą na oczyszczonym wzorcu GFP.</li>
	<li>Określić ilościowo białko HAC1 za pomocą krzywej kalibracyjnej opartej na oczyszczonym wzorcu białka HAC ze szczepu A/Indonesia/05/05 wirusa grypy.</li>
	<li>Oblicz średnie wartości z 3–4 powtórzeń dla wszystkich eksperymentów.</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W tym badaniu opracowaliśmy prosty protokół agroinfiltracji do rutynowej przejściowej produkcji białka w wybranych gatunkach Nicotiana przy użyciu szczepów Agrobacterium przenoszących wektor startowy. Ponadto zidentyfikowaliśmy optymalne warunki do osiągnięcia najwyższego poziomu produkcji białka rekombinowanego w naszym przejściowym systemie ekspresji roślin.
Infiltracja próżniowa rozcieńczonego szczepu A. tumefaciens GV3101 zawierającego wektor startowy pBID4 do N. benthamiana, N. excelsiana i N. excelsior spowodowała wyższy poziom produkcji białka docelowego w granicach 7 dpi w porównaniu z innymi gatunkami roślin, takimi jak Pisum sativum infiltrowany GV3101 zawierającym wirusa mozaiki lucerny lub wirusa mozaiki ogórkawektory oparte na ekspresji genu reporterowego GFP pod promotorem 35S41 lub Lactuca sativa, Solanum lycopersicum i Arabidopsis thaliana naciekane szczepem C58C1 A. tumefaciens przenoszącym gen reporterowy beta-glukuronidazy57. N. benthamiana i N. excelsiana były łatwe do infiltracji próżniowej przy ciśnieniu 50 mbar przez 30-60 sekund, z wydajnością infiltracji 90-95%. Pozostałe 5-10% powierzchni liści nie zostało zinfiltrowane z powodu unoszenia się liści na powierzchni zawiesiny Agrobacterium podczas stosowania próżni. Ponieważ wektor startowy ma zdolność do przemieszczania się między komórkami18, przejściowa akumulacja białka występuje w całych liściach, a także ogonkach liściowych w temperaturze 7 dpi. Przy 10 dpi szacowana produkcja GFP była nieco niższa, ponieważ wektor ekspresji pBID4 jest w stanie przemieszczać się z komórki do komórki, ale nie przemieszczać się systemowo18; W związku z tym nowo wyrosłe liście nie zawierają wektora i nie przyczyniają się do produkcji celu. Ponadto degradacja rekombinowanego białka w czasie może przyczyniać się do obniżenia poziomu białka przy 10 dpi. Nasze wyniki wykazały, że infiltracja szczepu A. tumefaciens GV3101 pośredniczyła w wysokim poziomie przejściowej produkcji białka w N. benthamiana. Co więcej, białko docelowe może być zmodyfikowane jako N-końcowe, C-końcowe lub wewnętrzne fuzje z porchanazą (LicKM), β-1,3-1,4-glukanazą, która jest termostabilnym enzymem z Clostridium thermocellum i nadaje termostabilność wielu fuzjom białek docelowych18. Naciekanie N. benthamiana szczepami A. tumefaciens typu dzikiego (at6, at10 i at77) zawierającymi interesujący nas gen wywołało łagodne lub ciężkie objawy: zwijanie się liści, wydłużanie ogonków liściowych i zwijanie się. Nie zaobserwowano żadnych objawów patologicznych u N. benthamiana infiltrowanej laboratoryjnym szczepem GV3101 zawierającym pusty wektor pBID4, podczas gdy niektóre geny wprowadzone do pBID4 i przekształcone w szczepy laboratoryjne GV3101, C58C1 lub LBA4404 wywołały łagodne reakcje nekrotyczne i objawy chlorozy/żółknięcia liści w naciekanych obszarach liści. Objawy nekrotyczne wywołane przez dzikie szczepy Agrobacterium lub rozbrojone szczepy w roślinach psiankowatych zostały zgłoszone wcześniej56,57. Odpowiedź martwicza może wynikać z czynników wirulencji układu wydzielania typu III, białek bakteryjnych przenoszonych do komórki roślinnej przez system wydzielania typu IV i/lub wrażliwości na flagelinę58-60. Odkryliśmy, że przejściowa produkcja heterologicznych białek może również wywoływać patogenność i nadwrażliwość w naciekanych liściach roślin. Wielu badaczy stwierdziło, że agroinfiltracja różnych gatunków roślin za pomocą wektorów binarnych roślin wytworzyła do 5-20 razy wyższy poziom przejściowej produkcji białka w porównaniu ze stabilnie przekształconymi roślinami28,57. Nasze dane pokazują, że N. benthamiana infiltrowana przez GV3101 zawierającą pBID4-GFP przejściowo wyrażała wysokie poziomy GFP, co jest podobne do plonu GFP zgłoszonego dla N. benthamiana infiltrowanego przez Agrobacteria przenoszące wektor wirusowy pICH-GFPSYS (do 80% całkowitego rozpuszczalnego białka)44. Agroinfiltracja przy użyciu naszego wektora startowego zaowocowała wysoką produkcją termostabilnego białka LicKM, 50-krotnie wyższą niż obserwowana przy użyciu standardowego binarnego plazmidu18.
Aby przetestować zakaźność A. tumefaciens i stabilność wektora startowego, infiltrowaliśmy jedno mieszkanie N. benthamiana co godzinę przez okres do 8 godzin, używając tej samej rozcieńczonej wodą kultury Milli-Q GV3101 zawierającej plazmid pBID4-GFP. Nasze dane wykazały, że szczep GV3101 jest skutecznie zakaźny przez co najmniej 8 godzin, a pBID4 (wektor startowy) jest bardzo stabilny podczas 8-godzinnej infiltracji.
Wykazano, że zapas glicerolu szczepu GV3101 zawierający wektor startowy pBID4-HAC1 (bank komórek) przechowywany w temperaturze -80 °C jest bardzo stabilny przez trzy lata bez zmian w przejściowej produkcji białka w infiltrowanych roślinach.  
Rośliny N. benthamiana uprawiane w optymalnych warunkach i między 35 a 42 dniem po siewie były optymalne pod względem przejściowej ekspresji genów za pośrednictwem infiltracji próżniowej40. Młodsze rośliny (w wieku 3-4 tygodni) nie mogą być całkowicie infiltrowane z powodu liści unoszących się na powierzchni zawiesiny komórkowej i uszkodzenia tkanek w wyniku mechanicznych skutków zastosowania próżni. U roślin starszych niż 45 dni, w stadium kotwienia N. benthamiana , w stosowanych optymalnych warunkach oświetleniowych, poziom przejściowej ekspresji jest niski.
Wiadomo, że związki fenolowe o niskiej masie cząsteczkowej (acetosyringon) i monosacharydy (glukoza) indukują geny wiru w A. tumefaciens55,61. Ponadto wykazano, że naciekanie N. benthamiana wektorem binarnym pCAMBIA (gfp) w obecności acetosyringonu w stężeniach 50-600 μM nieznacznie zwiększa przejściową ekspresję genów40. Badaliśmy wpływ różnych stężeń acetosyringonu i glukozy w naszym systemie poprzez dodanie tych związków do kultur GV3101 zawierających pBID4-GFP w MMA przez 3 godziny i nie znaleźliśmy różnicy w ekspresji GFP. Co ciekawe, kultury GV3101 zawierające pBID4-GFP i rozcieńczone w wodzie Milli-Q do A600 0,5 i infiltrowane bez indukcji genu vir wyrażały te same ilości GFP, co te infiltrowane indukowanymi kulturami. Geny vir A. tumefaciens mogą być potencjalnie indukowane przez roślinne związki fenolowe (acetosyringon i kwas sinapinowy) oraz roślinne sacharydy proste (glukozę i fruktozę) obecne w tkance liści. Dlatego spekulujemy, że podobne poziomy ekspresji GFP w obecności lub braku egzogennych induktorów genów wirowych mogą wynikać z działania cytoplazmatycznych induktorów genów wirowych obecnych podczas replikacji wektora startowego eksprymującego GFP w komórkach roślinnych.
 N. benthamiana typu dzikiego została wykorzystana jako gospodarz modelowy do przejściowej produkcji białek49. Jednak stosunkowo niski plon biomasy N. benthamiana utrudnia jego zastosowanie do produkcji białek rekombinowanych na dużą skalę. Optymalny gospodarz powinien łączyć wysoki poziom przejściowej ekspresji, łatwy wzrost w szklarni i być podatny na infiltrację Agrobacterium 2. Aby wybrać alternatywnego żywiciela, przesączyliśmy dwa różne gatunki dzikich typów Nicotiana (N. benthamiana i N. excelsior) oraz hybrydę N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) ze szczepem A. tumefaciens GV3101 zawierającym plazmid pBID4-GFP. Spośród tych trzech gatunków poziom ekspresji GFP był nieco wyższy u N. benthamiana. Rośliny N. excelsior wykazywały trudności w agroinfiltracji próżniowej ze względu na skórzaste liście, a N. excelsiana wytwarzała około dwa razy więcej biomasy w tych samych warunkach wzrostu. Przejściowa produkcja GFP przy 7 dpi jest stosunkowo podobna u N. benthamiana i N. excelsiana. Dlatego N. excelsiana może być bardziej odpowiednim gospodarzem do produkcji białek rekombinowanych.
Produkcja białek przejściowych, w której pośredniczy Agrobacterium, jest ograniczona przez PTGS26, który można przezwyciężyć poprzez koekspresję supresorów wyciszających geny pochodzenia roślinnego62. Wcześniej wykazano, że produkcja białka przejściowego jest 50-krotnie zwiększona w obecności białka p19 TBSV, które hamuje PTGS w infiltrowanych tkankach34. W naszym badaniu oceniliśmy wpływ dwóch supresorów wyciszających wirusa (p19 i p23) oddzielnie infiltrowanych z wektorem startowym pBID4-HAC1. Współinfiltracja tych supresorów wyciszających wydawała się mieć niewielki wpływ na przejściową ekspresję HAC1, z tylko niewielkim wzrostem akumulacji białka HAC1 (15-25%) w obecności współinfiltrowanego p23 lub p19. Aby pozytywnie wpłynąć na produkcję białka, może być konieczne specjalne dobranie supresorów wyciszających, aby były skuteczne dla docelowych gatunków roślin i wektora wirusowego63. Helikaza TMV ma supresor o działaniu wyciszającym RNA64,65. Nasze dane potwierdzają tę obserwację, ponieważ jednoczesna infiltracja p23 lub p19 z pBID4-HAC1 nie spowodowała wzrostu GFP lub niewielkiego wzrostu przejściowej produkcji białka HAC1.
Podsumowując, zmodyfikowaliśmy i zoptymalizowaliśmy warunki wzrostu roślin i Agrobacterium oraz poprawiliśmy skuteczność infiltracji próżniowej. Ta technologia pozwoliła nam wyhodować i przeniknąć do setki kilogramów materiału roślinnego w ciągu kilku godzin. Udało nam się zautomatyzować technikę roślinnej ekspresji stanów nieustalonych w celu uzyskania wysokoprzepustowej produkcji szczepionek na skalę przemysłową w obecnych warunkach Dobrej Praktyki Produkcyjnej (cGMP). Więcej informacji na temat automatyzacji i wykorzystania roślinnego systemu produkcji białek przejściowych do produkcji białek rekombinowanych, w tym kandydatów na szczepionki podjednostkowe, w warunkach cGMP, czytelnicy są odsyłani do strony internetowej <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a>.

Rośliny są teraz uznawane za bezpieczną, niezawodną, skalowalną i tanią platformę do produkcji heterologicznych rekombinowanych biofarmaceutyków i białek przemysłowych1-3 i mają ważne zalety w porównaniu z systemami ekspresji mikroorganizmów i komórek zwierzęcych4. Rośliny są zdolne do ekspresji prawidłowo pofałdowanych białek z modyfikacjami potranslacyjnymi, w tym złożonymi przeciwciałami multimerycznymi5-7. Kilka rekombinowanych białek farmaceutycznych pochodzenia roślinnego jest obecnie poddawanych ocenie klinicznej8. Należą do nich specyficzne dla pacjenta rekombinowane szczepionki idiotypowe (scFv) stosowane w leczeniu chłoniaka nieziarniczego9, kandydaci na szczepionki przeciw grypie pandemicznej i sezonowej na bazie hemaglutyniny10,11 (Cummings i wsp., zgłoszone do szczepienia), przeciwciało antygenu powierzchniowego I/II przeciwko Streptococcus do leczenia próchnicyzębów 12 oraz insulina ludzka do leczenia cukrzycy13. Ponadto, ludzka rekombinowana glukocerebrozydaza do enzymatycznej terapii zastępczej u pacjentów z chorobą Gauchera została zatwierdzona w Izraelu i USA i jest dostarczana w ramach Programu Rozszerzonego Dostępu poza USA14,15.
Heterologiczne białka mogą być wytwarzane w stabilnie przekształconych (transgenicznych lub transplastomicznych) lub przejściowo przekształconych roślinach. Przejściowa produkcja białek ma kilka zalet w porównaniu z produkcją w roślinach transgenicznych, w tym krótki czas na osiągnięcie ekspresji i akumulacji16 i może być osiągnięta poprzez wprowadzenie bakteryjnych wektorów binarnych lub rekombinowanych roślinnych wektorów wirusowych do tkanek roślinnych4. Najbardziej zaawansowany system ekspresji stanów przejściowych opiera się na wykorzystaniu "wektorów startowych", które łączą składniki wirusów roślinnych i plazmidów binarnych i są dostarczane przez agroinfiltrację17,18. Agroinfiltracja wektora startowego opartego na wirusie mozaiki tytoniu (TMV) została z powodzeniem zastosowana na skalę laboratoryjną do produkcji antygenów szczepionkowych przeciwko patogenom, takim jak wirus brodawczaka ludzkiego19, Yersinia pestis20, wirusy grypy A21,22, Bacillus anthracis23 i wirus ospy prawdziwej24 w liściach N. benthamiana. Ekspresja przejściowa za pośrednictwem Agrobacterium jest również obiecującą metodą jednoczesnej produkcji wielu białek2,25-27. Na przykład roślinne przejściowe systemy ekspresji wykorzystano do produkcji rekombinowanych przeciwciał specyficznych dla nowotworu28,29, glikozylowanego rekombinowanego przeciwciała przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu30 oraz przeciwciała monoklonalnego specyficznego dla antygenu ochronnego wąglika31,32. Jednoczesna infiltracja roślin Nicotiana benthamiana za pomocą genu docelowego i supresora wyciszania genów powoduje zwiększoną ekspresję białka docelowego33,34.
Agroinfiltracja to powszechna metoda równomiernego wprowadzania bakterii zawierających interesujący gen do tkanek roślinnych35-37. Infiltracja próżniowa Agrobacterium w celu przejściowej ekspresji genów w nienaruszonych liściach roślin jest szybką, skalowalną i użyteczną metodą produkcji obcych białek bez konieczności generowania roślin transgenicznych38-41. Podczas agroinfiltracji próżniowej rośliny są odwracane do góry nogami, a części nadziemne zanurzane w zawiesinie Agrobacterium. Następnie stosuje się próżnię, powodując ewakuację gazów z przestrzeni międzykomórkowych liści przez aparaty szparkowe. Szybki wzrost ciśnienia po uwolnieniu podciśnienia powoduje wlew zawiesiny Agrobacterium do liścia. Po infiltracji próżniowej agrobakterii rośliny są dalej uprawiane i monitorowana jest ekspresja celu. Najwyższe poziomy ekspresji docelowej obserwuje się zwykle 2-3 dni po infiltracji (dpi) w przypadku wektora binarnego i 4-7 dpi w przypadku wektora startowego, po czym poziom ekspresji zwykle spada17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens jest najczęściej stosowanym nośnikiem do dostarczania interesującego genu do rośliny w celu produkcji białka. Agroinfiltracja działa wyjątkowo dobrze w przypadku N. benthamiana, ale stosunkowo słabo w przypadku większości innych roślin, w tym Arabidopsis thaliana46.
W tym badaniu opracowaliśmy prostą, efektywną i ekonomiczną metodę przejściowej produkcji białka u 5-6 tygodniowego N. benthamiana za pomocą infiltracji A. tumefaciens. Główną wadą przemysłowego skalowania techniki agroinfiltracji jest odwirowanie zebranych bakterii i ponowne zawieszenie osadu bakteryjnego w pożywce zawierającej 4'-hydroksy-3',5'-dimetoksyacetofenon (acetosyringon), monosacharydy i bufor kwasu 2-(N-morfolino)-etanosulfonowego (MES) do indukcji genów wirusa. Udało nam się przezwyciężyć te problemy poprzez optymalizację wzrostu Agrobacterium w pożywce AB (pożywka minimalna), a następnie bezpośrednie rozcieńczenie w wodzie Milli-Q oraz kontrolowanie czasu i warunków infiltracji. Porównaliśmy również docelową produkcję białka w gatunkach żywicieli tytoniu typu dzikiego N. benthamiana i N. excelsior, a także w hybrydach N. excelsiana.

<table><tbody><tr><td>Nicotiana benthamiana</td><td>Kolekcja plazmy zarodkowej tytoniu, Dział Nauk o Uprawach, Uniwersytet Stanowy Karoliny Północnej</td><td>PI 555478 Infiltracja TW16</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana excelsiorKolekcja plazmy</td> <td>zarodkowej tytoniu, Departament Nauk o Uprawach, Uniwersytet Stanowy Karoliny Północnej</td><td>PI 555685 TW47</td><td>Infiltracja</td></tr><tr><td>Nicotiana excelsiana</td><td>Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td><td>LSBC EBA 042304.02</td><td>Infiltracja</td></tr><tr><td>Płoza próżniowa</td><td>Abbas, Ashland, MA</td><td>Wykonana na zamówienie</td><td>infiltracja roślin</td></tr><tr><td>Rockwool</td><td>Grodan Inc., Ontario, Kanada</td><td>AO 50/40</td><td>Pożywka hydroponiczna do uprawy roślin</td></tr><tr><td>Kwas 2-(N-Morfolino) etanosulfonowy</td><td>Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ</td><td>172595000</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>Murashige & Sól Skoog (sól MS)</td><td>Laboratorium fitotechnologii</td><td>M524</td><td>Pożywki do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D134406-5G</td><td>Indukcja Agrobacterium</td></tr><tr><td>Membrana transferowa Immobilon-P</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>IPVH00010</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>I-block</td><td>Applied Biosystems, Foster City, CA</td><td>T2015</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Surowica przeciw poliklonalnej surowicy anty-GFP królika&nbsp;</td><td>Washington Biotechnology, Baltimore, MD</td><td></td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Mouse anti&ndash; przeciwciało monoklonalne poli-histydyny</td><td>Qiagen GmbH, Hilden</td><td>34670</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-królicze sprzężone z peroksydazą chrzanową&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>111-035-003</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie sprzężone z peroksydazą chrzanową</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115-035-003</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>SuperSignal&reg; Podłoże chemiluminescencyjne West Pico</td><td>Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td><td>34078</td><td>Porosty zachodnie</td></tr> (<tr><td>1-3: 1-4-beta-D-glukan)</td><td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Irlandia</td><td>P-LICHN</td><td>Aktywność porchazy</td></tr><tr><td>Kongo Czerwony&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>C6277</td><td>Barwienie żelem</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy&nbsp;</td><td>Olympus, Center Valley, PA</td><td>C-8080</td><td>Obrazowanie chemiluminescencyjne</td></tr><tr><td>GeneGnome</td><td>Syngene, Frederick, MD</td><td></td><td>Obrazowanie chemiluminescencyjne&nbsp;</td></tr><tr><td>Norma GFP&nbsp;</td><td>Wykonane we własnym zakresie</td><td></td><td>obrazowanie chemiluminescencyjne&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór nawozu do roślin</td><td>Griffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE</td><td>67-23-20</td><td>Uprawa roślin</td></tr><tr><td>Lichenaza Standard</td><td>Oczyszczony we własnym zakresie</td><td></td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>MicroPulser</td><td>Electroporator BioRad, Hercules, CA</td><td>165-2100</td><td>Transformacja Agrobacterium&nbsp;</td></tr></tbody></table>

optymalizacja i wykorzystanie produkcji białek przejściowych za pośrednictwem agrobacterium w nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Produkcja białek przejściowych w roślinach za pośrednictwem Agrobacterium jest obiecującym podejściem do produkcji antygenów szczepionkowych i białek terapeutycznych w krótkim czasie. Jednak technologia ta dopiero zaczyna być stosowana w produkcji na dużą skalę, ponieważ obecnie pokonuje się wiele przeszkód technologicznych związanych z zwiększaniem skali. W tym miejscu demonstrujemy prostą i powtarzalną metodę produkcji białek przejściowych na skalę przemysłową opartą na infiltracji próżniowej roślin Nicotiana za pomocą agrobakterii przenoszących wektory startowe. Optymalizacja hodowli Agrobacterium w pożywce AB pozwala na bezpośrednie rozcieńczenie kultury bakteryjnej w wodzie Milli-Q, upraszczając proces infiltracji. Spośród trzech badanych gatunków Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) została wybrana jako najbardziej obiecujący żywiciel ze względu na łatwość infiltracji, wysoki poziom produkcji białka reporterowego i około dwukrotnie wyższą produkcję biomasy w kontrolowanych warunkach środowiskowych. Indukcja Agrobacterium zawierającego pBID4-GFP (oparty na wirusie mozaiki tytoniu) przy użyciu substancji chemicznych, takich jak acetosyringon i monosacharyd, nie miała wpływu na poziom produkcji białka. Infiltracja rośliny pod ciśnieniem od 50 do 100 mbar przez 30 lub 60 sekund spowodowała około 95% infiltracji tkanek liści roślin. Infiltracja laboratoryjnym szczepem Agrobacterium GV3101 wykazała najwyższą produkcję białka w porównaniu z laboratoryjnymi szczepami Agrobacteria LBA4404 i C58C1 oraz szczepami Agrobacteria typu dzikiego w at6, at10, at77 i A4. Jednoczesna ekspresja wirusowego supresora wyciszającego RNA, p23 lub p19, u N. benthamiana skutkowała wcześniejszą akumulacją i zwiększoną produkcją (15-25%) białka docelowego (hemaglutyniny wirusa grypy).

Produkcja białka przejściowego w roślinach Nicotiana oparta na infiltracji próżniowej za pomocą agrobakterii przenoszących wektory startowe (oparte na wirusie mozaiki tytoniu) jest szybkim i ekonomicznym podejściem do produkcji antygenów szczepionkowych i białek terapeutycznych. Uprościliśmy procedurę i poprawiliśmy akumulację celu, optymalizując warunki hodowli bakterii, dobierając gatunki gospodarzy i współwprowadzając supresory wyciszające RNA.

Optymalizacja i wykorzystanie produkcji białek przejściowych za pośrednictwem Agrobacterium w Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie prostej, wydajnej i skalowalnej metody przejściowej produkcji białek rekombinowanych w systemie roślinnym z wykorzystaniem techniki agroinfiltracji. Zostanie to osiągnięte poprzez optymalizację warunków wzrostu roślin w pierwszej kolejności. Drugim krokiem jest transformacja agrobakterii wektorami startowymi, które łączą komponenty wirusów roślinnych i plazmidów binarnych, a następnie hodowla przekształconej agrobakterii do wykorzystania w eksperymentach agro.Podczas infiltracji agrobakteriami rośliny odwraca się do góry nogami, a ich części nadziemne zanurza w zawiesinie agrobakterii. Następnie przykłada się podciśnienie, co powoduje usunięcie powietrza z przestrzeni międzykomórkowych w tkankach liści. Gwałtowne ponowne zwiększenie ciśnienia po zwolnieniu próżni skutkuje wtłoczeniem zawiesiny agrobakterii do wnętrza liści.W końcowej fazie zastosowano immunoblotting oraz analizy fluorescencyjne, aby wykazać produkcję białka rekombinowanego w roślinach poddanych infiltracji. Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak infiltracja ręczna, jest możliwość przeskalowania metody infiltracji próżniowej na potrzeby przemysłowej produkcji białek rekombinowanych, w tym szczepionek i białek terapeutycznych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biotechnologii roślin oraz w dalszym usprawnieniu wykorzystania roślin jako alternatywnej platformy do komercyjnej produkcji białek rekombinowanych.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy, że skalowanie procesu agrofiltracji w roślinach hodowanych w glebie jest problematyczne. Z kilku powodów gleba zawiera zanieczyszczenia, takie jak wirusy, bakterie i nicienie, a ponadto skład gleby oraz woda do nawadniania różnią się między partiami i sezonami, a gleba ulega starzeniu podczas przechowywania. Co więcej, odwracanie roślin hodowanych w glebie prowadziłoby do niepożądanego ściekania ziemi do kultury agrobakterii podczas infiltracji.Procedurę tę zaprezentują Rebecca Snow, starsza asystentka badawcza z laboratorium biologii roślin i inżynierii, oraz Emma Gut Robin Lobe. Ona, wraz z Adamem Trevorem, są asystentami badawczymi w moim laboratorium. W badaniu tym wykorzystano hydroponiczne podłoże do wzrostu roślin oraz roztwór odżywczy, aby zapewnić jednolitość wzrostu roślin i wyeliminować komplikacje związane z wykorzystaniem gleby w uprawie roślin.Aby rozpocząć tę procedurę, należy namoczyć płyty z wełny mineralnej w roztworze nawozu dla roślin przez pięć minut, a następnie ręcznie wysiać nasiona na powierzchni wełny mineralnej nasączonej składnikami odżywczymi. W badaniu tym zostaną ocenione trzy gatunki Nico Oceana z serii Cedar: dwa gatunki typu dzikiego, Nico Oceana, Benham Ana i Nico Oceana Excelsior, oraz hybryda Benhama, Any i Excelsior o nazwie Nico Oceana Excela. Rośliny z nasion należy hodować w warunkach kontrolowanych i przy długim fotoperiodzie w kaskadowym systemie hydroponicznym.Nico Oceana, Bentham Miana i Nico Oceana Excela przez cztery do pięciu tygodni, a Nico Oceana Excelsior przez pięć do sześciu tygodni. Szczepy Agrobacterium tumor Fasion użyte w tym eksperymencie zostały przekształcone odpowiednimi wektorami startowymi, zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. Na potrzeby niniejszej demonstracji wykorzystano pięć przekształconych szczepów agrobacterium.Szczepy Agrobacterium GV 3 1 0 1 zawierające gen reporterowy zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) GV 3 1 0 1, zawierające gen wirusowego supresora wyciszania P 19 wirusa pomidorowego stunt virus oraz GV 3 1 0 1 A four i T 10 zawierające gen białka nośnikowego zmodyfikowanej liazy lub lick KM, hodowano przez noc w pożywce LB uzupełnionej o 50 mg/L kanamycyny w temperaturze 28 °C przy wstrząsaniu z prędkością od 200 do 250 RPM. Następnego dnia przygotowano zawiesiny Agrobacterium do planowanych eksperymentów. Aby zbadać możliwość wykorzystania wielu szczepów Agrobacterium do przejściowej produkcji białek, rozcieńczono szczep laboratoryjny oraz dwa szczepy dzikie zawierające wektor PBI four lick km w wodzie milli Q do gęstości optycznej 0,5 przy 600 nm.Aby zbadać konieczność indukowania genów wirulencji agrobacterium przed infiltracją, najpierw należy odwirować kultury agrobacterium niosące wektor P bid 4G FP, hodowane w medium LB, przy 4 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Następnie resuspender je w medium indukcyjnym MMA do gęstości optycznej przy 600 nm wynoszącej 0,5 i mieszać w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Aby sprawdzić, czy acetyl kon enhances przejściową produkcję białka, należy odwirować kulturę agrobacterium niosącą wektor PBI 4G FP, hodowaną przez noc w medium LB, a następnie resuspender ją w buforze do infiltracji zawierającym 1× soli ms, 10 mM MES i 2% glukozy.Podziel zawiesinę komórkową do czterech pojemników. Do każdej z zawiesin Agrobacterium dodaj aceto cone w innym stężeniu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Aby przetestować wpływ ko-infiltracji supresora wyciszania wirusowego na przejściową produkcję białka GFP, wymieszaj.Kulturę agrobacterium niosącą gen GFP oraz kulturę niosącą viralny supresor wyciszania P19 rozcieńczono wodą Milli-Q i zmieszano w stosunku cztery do jednego przed przeprowadzeniem infiltracji próżniowej roślin, co zostanie zademonstrowane. Następnie, aby przeprowadzić infiltrację próżniową roślin, kluczowe jest kontrolowanie ciśnienia próżni oraz czasu trwania infiltracji. W pierwszej kolejności należy przenieść przygotowaną zawiesinę agrobacterium do pojemnika znajdującego się wewnątrz komory próżniowej.Następnie odwróć roślinę do góry nogami w rozcieńczonej zawiesinie agrobakterii i zastosuj próżnię od 50 do 400 mbar przez 30 lub 60 sekund. Optymalną infiltrację rutynowo przeprowadza się przy 50 do 100 mbar przez 60 sekund. Po przerwaniu próżni wyjmij rośliny z komory próżniowej, opłucz w wodzie i hoduj przez pięć do siedmiu dni w tych samych warunkach wzrostu, które stosowano przed filtracją.Aby przygotować próbki do analizy Western, najpierw należy pobrać losowe próbki liści z roślin Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior lub Nico Oceana Excela od czterech do siedmiu dni po infiltracji (DPI), a następnie sproszkować próbki liści w ciekłym azocie do postaci drobnego proszku. Do każdej próbki należy dodać trzy objętości buforu 1x PBS zawierającego 0,5% Triton X 100 i przenieść próbkę do probówki typu Eppendorf. Próbki poddać delikatnemu wstrząsaniu lub rotacji przez 15 minut w temperaturze 4 °C.Odwirować ekstrakt przez pięć minut i zebrać całkowite białka rozpuszczalne do czystej probówki typu eppendorf. Rozcieńczyć ekstrakty do odpowiedniego stężenia w buforze ekstrakcyjnym 1X PBS, a następnie dodać bufor do próbek 5X do końcowego stężenia 1X. Gotować próbki przez pięć minut przed rozdzieleniem białek metodą SDS-PAGE.Po przeniesieniu białek na nieruchomą membranę transferową P należy wykryć GFP, stosując królicze poliklonalne antiserum anty-GFP w rozcieńczeniu 1:5 000 w roztworze blokującym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę przy delikatnym kołysaniu, po uprzednim trzykrotnym przemyciu membran roztworem 1X PBST 20. Następnie inkubować przez jedną godzinę z przeciwciałem anty-króliczym sprzężonym z peroksydazą chrzanową w rozcieńczeniu 1:5 000 w celu detekcji GFP.Następnie analizuje się wyniki western blotu oraz intensywność prążków odpowiadających białkom zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. Wizualną detekcję fluorescencji GFP w całych roślinach poddanych transformacji przejściowej przeprowadza się przy użyciu ręcznej lampy UV o długiej fali; do fotografowania roślin poddanych transformacji przejściowej przez żółty filtr ES 52 należy użyć aparatu cyfrowego z czasem naświetlania wynoszącym 15 sekund. Obrazy z analiz western blot uzyskuje się przy użyciu oprogramowania Gene Snap na komputerze.Ilościowo określ wyniki za pomocą oprogramowania gene tool, wykorzystując krzywą kalibracyjną opartą na oczyszczonym standardzie GFP. Nick Oceana Bentham Miana hodowano na płytkach Rockwool nasączonych dostępnymi w handlu nawozami, aby określić optymalne warunki wzrostu roślin i akumulacji biomasy. Obecność fosforu jest krytyczna dla uzyskania kiełkowania i wzrostu nasion NICO Oceana. Bentham, co obrazują te sześciotygodniowe rośliny rosnące albo w roztworze nawozu zawierającym 4,8% fosforu, albo w roztworze nawozu zawierającym 0% fosforu.Wpływ pożywek do wzrostu i infiltracji agrobacterium na zdrowie roślin oraz produkcję białek zbadano poprzez porównanie produkcji GFP w roślinach Nicotiana hamana, które poddano infiltracji próżniowej kulturami agrobacterium PBI 4G FP hodowanymi w trzech różnych pożywkach. Kultury YEB, AB i LB hodowane przez noc w pożywkach YEB lub LB wirowano z niską prędkością i resuspenderowano w pożywce indukcyjnej MMA, lub hodowano przez noc w pożywkach YEB, LB lub AB i rozcieńczano bezpośrednio w stosunku 1:5 lub 1:10 wodą Milli Q. Jak pokazano na tym wyniku western blot, rośliny infiltrowane kulturami agrobacterium hodowanymi w pożywkach YEB, LB lub AB i rozcieńczanymi wodą Milli Q nie wykazały istotnych różnic w średniej produkcji GFP w porównaniu z kulturami wirowanymi i resuspenderowanymi w MMA.W związku z tym do rozcieńczania kultur agrobacterium w celu infiltracji roślin zaleca się stosowanie wody milli Q, która była rutynowo używana w kolejnych eksperymentach do uzyskania gęstości optycznej przy 600 nanometrach wynoszącej 0,5. Następnie zbadano wpływ gęstości zawiesiny komórek agrobacterium oraz czasu przebiegu na ekspresję docelową. Oceńiono cztery różne gęstości zawiesiny komórek agrobacterium niosących PBI 4G FP, a próbki liści pobrano w czwartym, siódmym i dziesiątym dniu po infiltracji (DPI) w celu przeprowadzenia analizy western blot. W czwartym dniu DPI zaobserwowano wyraźne różnice w fluorescencji GFP wśród roślin infiltrowanych zawiesinami komórek agrobacterium o różnej gęstości; przy gęstości 600 wynoszącej 0,05 nie stwierdzono ekspresji GFP w siódmym dniu DPI GFP.Fluorescencja była podobna w roślinach infiltrowanych zawiesiną komórkową o gęstościach 1,0, 0,5 i 0,1, natomiast była niższa w roślinach infiltrowanych przy A 600 wynoszącym 0,05, co zaobserwowano w 10 DPI. Nie odnotowano różnic w produkcji GFP pomiędzy roślinami infiltrowanymi czterema różnymi gęstościami zawiesiny komórkowej, co pozwala na zwiększenie różnorodności szczepów agrobacterium dostępnych do przejściowej produkcji białek.Rośliny Nicotiana benthamiana poddano infiltracji próżniowej siedmioma różnymi szczepami bakterii agrobacteria zawierającymi wektor KBI four lick km. Infiltrowane liście zebrano w siódmym dniu po inkubacji (7 DPI), a poziom ekspresji kinazy określono metodą Western blot. Jak pokazano na tym wykresie, najwyższy poziom produkcji liazy uzyskano przy użyciu szczepów GV 3 1 10, 1 A four oraz LBA 4 4 0 4, z niewielkimi różnicami.Podczas gdy najniższy poziom ekspresji odnotowano dla C58 C1, średnią produkcję liaz uzyskano w szczepach AT77, AT06 i AT10. Aktywność enzymatyczna liaz została wykazana przy użyciu testu XMO Graham. Oczyszczone bakteryjne białko liazy posłużyło jako kontrola pozytywna aktywności enzymu. Warto zauważyć, że rośliny Nicotiana benthamiana zainfiltrowane szczepami Agrobacterium typu dzikiego A4 i AT77 wykazywały objawy patologiczne, takie jak zahamowanie wzrostu, wydłużenie ogonków liściowych oraz zwijanie się liści w 7. dniu po inokulacji (DPI).Objawy były łagodne u roślin nicotiana benham infiltrowanych szczepem T 10 typu dzikiego. Nie zaobserwowano żadnych objawów u roślin Nico Oceana Benham infiltrowanych szczepem laboratoryjnym GV 3 1 0 1. Porównanie produkcji biomasy roślin u gatunków typu dzikiego wykazało, że w tych samych warunkach wzrostu, maksymalna biomasa liści, jaką można uzyskać z Nico Oceana Excela, jest około dwukrotnie wyższa w porównaniu z Nico Oceana.Produkcję białka Benham badano w odmianach Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior oraz Nico Oceana Excela zainfiltrowanych szczepem agrobacterium GV 3 1 0 1 zawierającym PBI 4G F-P-G-F-P. Akumulację oceniano w 7. dniu po inokulacji (DPI) w całych zainfiltrowanych liściach. Wizualna ocena ekspresji GFP w świetle UV wykazała równomierne rozmieszczenie GFP w Nico Oceana Hamana i Nico Oceana Excela oraz nierównomierne rozmieszczenie w Nico Oceana Excelsior, co wynikało z trudności w infiltracji całej powierzchni liścia Nico Oceana Excelsior. Analiza Western blot akumulacji GFP w tych zainfiltrowanych liściach w 7. dniu DPI wykazała, że poziom GFP był wyższy w Nico Oceana Hamana niż w Nico Oceana Excela i Nico Oceana Excelsior, co wskazuje na niski poziom produkcji białka w Nico Oceana.Zjawisko to wynika z nierównomiernej infiltracji oraz nierównomiernego rozkładu nagromadzonego GFP w pobranym liściu. Aby przetestować wpływ ciśnienia próżniowego na liście, rośliny Nico Oceana Benham poddano infiltracji szczepem agrobacterium GV 3 1 0 1 zawierającym PBI 4G FP przy ciśnieniach próżniowych 400, 200, 100 lub 50 milibar, przy czasie utrzymywania próżni wynoszącym 30 lub 60 sekund. Nie zaobserwowano różnic w produkcji GFP oraz odnotowano niewielki lub żaden negatywny wpływ na zdrowie roślin przy zastosowaniu ciśnień próżniowych 5, 100 i 200 milibar przez 30 lub 60 sekund.Wpływ czasu trwania próżni na ekspresję docelową oceniono poprzez infiltrowanie jednej kuwety roślin Nico Oceana Benham co godzinę przez osiem godzin, używając GV 3 1 0 1 zawierającego PBI 4G FP o wartości A 600 wynoszącej 0,5. W tej samej kulturze agrobacterium, jak pokazano w tym reprezentatywnym wyniku, poziom produkcji GFP był podobny we wszystkich punktach czasowych do ośmiu godzin, co sugeruje, że w tym okresie agrobacterium zachowuje zdolność do wprowadzania jednoniciowego DNA. Ponieważ zgłoszono, że wiele substancji chemicznych i monosacharydów zwiększa przejściową produkcję białek u różnych gatunków roślin.W niniejszym badaniu oceniono również wpływ różnych stężeń aceto- syringonu i glukozy na przejściową produkcję białka GFP w liściach Nicotiana benthamiana zainfiltracjach szczepem agrobacterium GV3101 zawierającym plazmid PBI4G FP. Agrobakterie hodowano przez noc w pożywce YEB, następnie wirowano i resuspendowano do wartości OD₆₀₀ wynoszącej 0,5 albo w pożywce MMA zawierającej 2% glukozy z aceto-syringonem w określonych stężeniach, albo w pożywce MMA zawierającej 200 µM aceto-syringonu z glukozą w określonych stężeniach. Jak pokazano tutaj, żadne z przetestowanych stężeń tych związków nie wywołało istotnego wzrostu produkcji białka GFP w porównaniu z kontrolą, w której pożywka indukcyjna nie zawierała aceto-syringonu ani glukozy.Następnie zbadano wpływ współinfiltracji supresora wyciszania na przejściową ekspresję genów GFP oraz HAC one w liściach Nico Oceana. Benham. Przed infiltracją kultury Agrobacterium GV 3101 zawierające PBI 4G FP oraz wirusowy supresor wyciszania P 19 wirusa pomarszczonych liści pomidora (tomato bushy stunt virus) zmieszano odpowiednio w stosunkach 1:1, 2:1, 3:1 i 4:1. Jak wskazują wyniki analizy Western blot w 7. dniu po inokulacji (DPI), obecność P 19 nie zwiększyła ani nie zmniejszyła produkcji GFP w nicotiana Benham Miana przy żadnym stosunku obu zawiesin Agrobacterium.Dodatkowo zbadano wpływ dwóch viralnych supresorów wyciszania genów, P 23 i P 19, na zapobieganie posttranskrypcyjnemu wyciszaniu genów dla HAC one. Odmiany agrobacterium zawierające wektor startowy PBI four HAC one oraz jeden z dwóch plazmidów supresorów wyciszania viralnego zmieszano w stosunku odpowiednio cztery do jednego i ko-infiltrowano do Nicotiana Bentham Miana. Próbki infiltrowanych liści pobrano od trzech do ośmiu DPI.Wykres ten przedstawia średnie poziomy ekspresji HAC one z trzech eksperymentów, określone za pomocą analizy Western blot. Ko-infiltracja Nico Oceana Benham z P 23 lub P 19 doprowadziła do zwiększenia produkcji HAC one w porównaniu z brakiem stosowania supresora wyciszania w 60 pi. Sugeruje to, że P 23 i P 19 są efektywne w tym systemie.Zaobserwowano również, że zarówno w obecności, jak i w przypadku braku supresora wyciszania, poziom produkcji białka HAC one zaczął spadać w siódmej dobie po inokulacji (DPI). Wskazuje to na to, że czas spadku przejściowej produkcji białka w roślinach Nicotiana benthamiana infiltrowanych wektorem startowym jest specyficzny dla danego celu. Na koniec, stabilność banku komórek Agrobacterium jest oceniana co roku poprzez infiltrowanie roślin Nicotiana benthamiana tą samą partią banku komórek Agrobacterium w celu oceny akumulacji białka.Te reprezentatywne wyniki wskazują, że produkcja białka HA one jest bardzo stabilna od ponad trzech lat. Średnia produkcja HAC one w roślinach Nicotiana benam wynosi 651 ± 49,4 mg/kg. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat zastosowania techniki agroinfiltracji w produkcji białek rekombinowanych na dużą skalę, która może być wykorzystywana do wytwarzania szczepionek podjednostkowych, przeciwciał przeciwko białkom oraz antygenów diagnostycznych.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby kontrolować krzyżowanie roślin hydroponicznie, używać żywotnych bakterii agro, kontrolować ciśnienie i czas próżni oraz monitorować nośnik ekspresji białka. Po opanowaniu techniki, filtracja agro może zostać przeprowadzona w ciągu 24 godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo w kontrolowanych warunkach.

optimization-utilization-agrobacterium-mediated-transient-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Optymalizacja i wykorzystanie Agrobacterium-pośredniczonej przejściowej produkcji białka w Nicotiana

Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Agroinfiltracja i agroinfekcja PVX to rutynowe testy funkcjonalne dla przejściowej ektopowej ekspresji genów w roślinach. Metody te są skutecznymi testami w strategiach efektoromicznych (szybkie odkrywanie genów oporności i wirulencji) i mają kluczowe znaczenie dla nowoczesnych badań w zakresie molekularnej patologii roślin. Spełniają one zapotrzebowanie na solidną, wysokowydajną analizę funkcjonalną w zakładach.

Agroinfiltracja i agroinfekcja PVX u ziemniaka i Nicotiana benthamiana

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

W tym badaniu porównano ekspresję docelowego ludzkiego białka rekombinowanego na różnych platformach produkcyjnych. Skupiliśmy się na tradycyjnych kulturach fermentorowych i roślinach, opisując konfigurację każdego systemu i podkreślając, na podstawie zgłoszonych wyników, nieodłączne ograniczenia i zalety każdej platformy.

Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych

Połączenia międzykomórkowe roślin, plazmodesmaty (Pd), odgrywają kluczową rolę w fizjologii roślin i interakcjach między roślinami a wirusami. Kluczowe znaczenie dla transportu Pd mają sygnały sortujące, które kierują białka do Pd. Jednak nasza wiedza na temat tych sekwencji jest wciąż w powijakach. Opisujemy strategię identyfikacji sygnałów lokalizacji Pd w białkach docelowych Pd.

Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta

Ten manuskrypt opisuje łatwą i szybką procedurę eksperymentalną do określania interakcji białko-białko na podstawie pomiaru aktywności lucyferazy.

Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko

Przejściowa heterologiczna ekspresja enzymów biosyntetycznych w liściach Nicotiana benthamiana może przekierować endogenne dostawy 2,3-oksydoskwalenu na produkcję nowych produktów triterpenowych o wysokiej wartości. W niniejszym dokumencie opisano szczegółowy protokół szybkiej (5 dni) produkcji triterpenów i analogów na skalę preparatywną z wykorzystaniem tej potężnej platformy roślinnej.

Przejściowa ekspresja w liściach Nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej

Tutaj prezentujemy łatwe w użyciu protokoły produkcji i oczyszczania metabolitów diterpenoidowych poprzez kombinatoryczną ekspresję enzymów biosyntetycznych w Escherichia coli lub Nicotiana benthamiana, a następnie chromatograficzne oczyszczanie produktu. Otrzymane metabolity nadają się do różnych badań, w tym charakterystyki struktury molekularnej, badań funkcjonalnych enzymów i testów bioaktywności.

Indywidualne podejście do enzymatycznej produkcji i oczyszczania naturalnych produktów diterpenoidowych

Opisujemy tutaj prostą metodę ekspresji, ekstrakcji i oczyszczania rekombinowanej ludzkiej IgG połączonej z GFP u Nicotiana benthamiana. Protokół ten można rozszerzyć o oczyszczanie i wizualizację wielu białek, które wykorzystują chromatografię kolumnową. Co więcej, protokół można dostosować do osobistego i wirtualnego laboratorium dydaktycznego w college'u, zapewniając eksplorację opartą na projektach.

Wytwarzanie białek fuzyjnych IgG ulegających przejściowej ekspresji w Nicotiana benthamiana

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji tworzenia się kompleksu trójskładnikowego między trzema partnerami białkowymi za pomocą białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą testu FRET-FLIM opartego na BiFC. Metoda ta jest cenna w badaniu kompleksów interakcji białko-białko in vivo.

Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM

Transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) to technika obrazowania służąca do wykrywania interakcji białek w żywych komórkach. W tym miejscu przedstawiono protokół FRET w celu zbadania związku enzymów modyfikujących histony z czynnikami transkrypcyjnymi, które rekrutują je do docelowych promotorów w celu epigenetycznej regulacji ekspresji genów w tkankach roślinnych.

Badanie interakcji między enzymami modyfikującymi histony a czynnikami transkrypcyjnymi in vivo poprzez transfer energii rezonansu fluorescencyjnego

Poznaj metodę produkcji białek przejściowych w roślinach Nicotiana za pomocą agroinfiltracji próżniowej. Technika ta umożliwia skalowalną produkcję białek rekombinowanych, w tym szczepionek i białek terapeutycznych.

Optymalizacja i wykorzystanie produkcji białek przejściowych za pośrednictwem Agrobacterium w Nicotiana

Przeglądaj więcej filmów