Wykrywanie i charakterystyka samoorganizacji białek in vivo za pomocą cytometrii przepływowej

Zrozumienie fizycznych podstaw samoorganizacji białek w komórkach jest ograniczone przez brak odpowiednich narzędzi. Obecne metody charakteryzują się niską czułością, pośrednimi odczytami, ograniczoną przepustowością i/lub rozdzielczością na poziomie populacji. W przeciwieństwie do tego, nasz test wykrywa i określa ilościowo skłonność białka do samoorganizacji in vivo z czułym, jednokomórkowym odczytem o wysokiej przepustowości, niezależnie od lokalizacji białka lub rozpuszczalności.

Przy pierwszej próbie testu, uzyskanie prawidłowej konwersji zdjęcia może wymagać pewnych testów empirycznych w celu uzyskania optymalnych warunków do uzyskania dobrego odczytu na całej płycie. Czułość testu może być również zagrożona, jeśli cytometr nie ma oddzielnych filtrów detekcyjnych dla sygnałów FRET i akceptorowych. Procedurę zademonstruje mi Andrew Box, kierownik laboratorium cytometrii.

Aby przygotować kulturę drożdży dla DAmFRET, dla każdego białka zapytania, należy zaszczepić przekształcone kolonie drożdży w trzech egzemplarzach w 200 mikrolitrach odpowiedniej, nieindukującej pożywki wzrostowej w indywidualnych studzienkach 96-dołkowej płytki hodowlanej z okrągłym dnem. Inkubuj komórki drożdży przez wytrząsanie z orbitą 1,5 milimetra z prędkością 1 200 obrotów na minutę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Pod koniec inkubacji osadzać komórki drożdży przez odwirowanie i usuwać supernatanty przez wymuszoną inwersję.

Dodać 200 mikrolitrów odpowiedniej pożywki indukcyjnej i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze do wytrząsania na kolejne 12 godzin. Pod koniec inkubacji osadnić komórki drożdży przez odwirowanie i wymuszoną inwersję, a następnie dodać 200 mikrolitrów świeżej pożywki indukcyjnej. Następnie inkubuj komórki, potrząsając przez dodatkowe cztery godziny, aby zmniejszyć autofluorescencję.

Aby dokonać fotokonwersji próbek, umieść płytkę bez pokrywy pod lampą ultrafioletową wyposażoną w filtr o długości od 320 do 500 nanometrów i kolimator wiązki umieszczony 45 centymetrów nad płytką. Włącz lampę, aby przekonwertować zdjęcia komórek przez 25 minut z potrząsaniem. W celu zebrania danych DAmFRET załaduj przekonwertowane na zdjęcia komórki do obrazowego cytometru przepływowego za pomocą niewspółliniowych laserów 488 i 561 nanometrów i zabramuj cztery pojedyncze niezawiązkowe komórki przez wysoką okrągłość i mały obszar komórki.

Następnie zbierz dane dla dwóch do pięciu razy 10 do czterech pojedynczych komórek na próbkę w bramce fluorescencyjnie dodatniej. Pod koniec analizy użyj próbki mEos3.1 bez konwersji fotograficznej dla czystego sygnału donorowego i monomerycznego DsRed dwa dla czystego sygnału akceptora, aby ustawić kompensację. Aby uzyskać większą czułość, upewnij się, że kanał detektora FRET jest również uwzględniany jako cel rozlania się w programie do analizy.

Oblicz parametr AmFRET jako stosunek całkowitego sygnału FRET do całkowitego sygnału akceptora FRET. Profile AmFRET komórek drożdży wykazujących ekspresję samego białka fluorescencyjnego wykazują znikomą AmFRET, podczas gdy komórki drożdży ulegające ekspresji jako stabilny homooligomer połączony z białkiem fluorescencyjnym wykazują jednolite dodatnie wartości AmFRET. Obrazy komórek uzyskane za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej ujawniają rozproszoną fluorescencję we wszystkich kanałach.

Mikroskopia konfokalna stosów Z dla wielu pól komórek pokazuje równomierny rozkład fluorescencji w cytozolu każdej komórki bez wykrywalnego punktu. Komórki drożdży wykazujące ekspresję samego fluoroforu lub fluoroforu plus zmutowana forma ludzkiego białka inflamasomu wykazują znikomy AmFRET w całym zakresie stężeń, co wskazuje na niezdolność do samointerakcji. W przeciwieństwie do tego, białko inflamasomu typu dzikiego wykazuje profil DAmFRET z jedną znikomą populacją AmFRET i jedną wysoką populacją AmFRET.

Należy zauważyć, że białko inflamasomu typu dzikiego jest odporne na samoorganizację nawet w wysokich stężeniach, a białko przechodzi do formy samoorganizującej się tylko we frakcji komórek. Jest to wyraźna wskazówka na istnienie bariery zarodkowania dla samoorganizacji. Jak potwierdzono za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, populacje te reprezentują komórki, które zawierają odpowiednio albo tylko rozpuszczalne białko, albo w większości białka samoorganizujące się.

Rzeczywiście, DAmFRET potwierdza wcześniejsze dane strukturalne, że mutant punktowy w inflamasomie zakłóca zarodkowanie w stężeniach osiągalnych przez ten system ekspresji. Należy zauważyć, że profile ekspresji białek w komórkach ssaków, które nie mają ekspresji kaspazy-1, przypominają te obserwowane w komórkach drożdży. Najważniejszym krokiem do zapamiętania jest konwersja zdjęć.

Inne kluczowe kroki obejmują zebranie wystarczającej liczby zdarzeń, które nie są nasycone dla sygnału fluorescencji i uzyskanie prawidłowej kompensacji. Kontynuacja testu za pomocą odpowiedniej biochemii, racjonalnej mutagenezy i podejścia biologii strukturalnej mogą pomóc w pełnym wyjaśnieniu mechanizmu samoorganizacji.