Metoda oznaczania powinowactwa do wiązań bez oczyszczania białek za pomocą termoforezy w mikroskali

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie powinowactwa wiązania w oddziaływaniu białko-ligand bez konieczności oczyszczania białka z lizatu komórkowego. Osiąga się to poprzez ekspresję białka docelowego połączonego z GFP w dowolnej linii komórek adherentnych. Po przygotowaniu lizatu komórkowego i rozcieńczeń ligandu sporządza się mieszaniny lizatu komórkowego z ligandem, które następnie nanosi się do kapilar.

Następnie pomiarowi poddawana jest termoforeza białka z fuzją GFP w obecności różnych stężeń liganda. Ostatnim etapem jest analiza danych z pomiarów termoforezy mikroskalowej, czyli MST. W końcowym rozrachunku termoforeza mikroskalowa służy do określenia powinowactwa wiązania w oddziaływaniach między białkami z fuzją GFP a różnymi ligandami.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak miareczkowanie, kalorymetria czy powierzchniowy rezonans plazmonowy, jest fakt, że nie wymaga ona oczyszczania białek, co znacząco upraszcza i przyspiesza ilościową charakterystykę oddziaływań binarnych. Metoda ta oferuje istotne korzyści podczas pracy z białkami trudnymi do ekspresji i oczyszczania, takimi jak białka błonowe i czynniki transkrypcyjne. Jedną z największych zalet mikrotermoforezy jest to, że działa ona w różnych buforach i toleruje obecność detergentów oraz całych komórek w układzie. Technikę tę zaprezentuje Karen Stefka, biolog z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, należy krótko przemyć komórki lodowatym solą fizjologiczną buforowanym fosforanem (PBS), używając 10 mL buforu na jedną kolbę T 75.

Przechowywać komórki w lodzie przez pięć minut lub do momentu, gdy zaczną odrywać się od kolby. W razie potrzeby zdrapać komórki za pomocą skrobaka do komórek, aby je odseparować. Resuspendować komórki w 10 ml schłodzonego PBS i przenieść do uprzednio schłodzonej, okrągłodنnej probówki wirówkowej o pojemności 14 ml.

Odwirować komórki przy 400 do 600 Gs w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut w celu uzyskania osadu. Usunąć nadsącz i zawiesić osad w 200 µL lodowatego buforu do lizy. Przenieść zawiesinę do schłodzonej probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 ml w celu ekstrakcji białek cytozolowych.

Umieścić komórki w lodzie, aby zminimalizować lokalne przegrzanie, a następnie poddać je lizie za pomocą trzech dziesięciosekundowych impulsów sonikacji przy amplitudzie 30%. Używając schłodzonej wcześniej końcówki o średnicy od dwóch do trzech milimetrów, należy utrzymać ją poniżej powierzchni cieczy, aby zminimalizować pienienie. Pominąć ten krok w przypadku stosowania buforu zawierającego detergent i inkubować w lodzie przez 30 minut.

Zamiast tego, w razie potrzeby skoryguj stężenie soli w roztworze lizatu do fizjologicznego poziomu 100 millimolar chlorku sodu, wykorzystując roztwór stokowy pięciu molar chlorku sodu. Na koniec zbierz lizaty poprzez wirowanie przy przyspieszeniu około 25 000 Gs i temperaturze czterech stopni Celsius za 10 minut. Na urządzeniu MST wybierz źródło wzbudzenia w postaci diody emitującej światło (LED) o długości fali równej 470 nanometrów.

Napełnić kapilary ekstraktem komórkowym rozcieńczonym dwukrotnie i 10-krotnie buforem MST, a następnie umieścić je w urządzeniu MST. Wykonać operację wyszukiwania kapilar (find capillaries) w oprogramowaniu sterującym urządzenia MST. Optymalny zakres fluorescencji w rozcieńczonym lizacie wynosi od 400 do 1500 jednostek fluorescencji.

Należy przystąpić do wyznaczenia optymalnego zakresu stężeń ligandu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieścić na lodzie statyw z odpowiednią liczbą probówek wirówkowych o pojemności 0,5 ml typu low bind, do każdej z nich pipetować 25 µL buforu MST, a do pierwszej probówki 25 µL roztworu zapasu ligandu, następnie wykonać dwukrotne rozcieńczenia szeregowe ligandu w pozostałych probówkach. Statyw z próbkami ligandu należy przechowywać na lodzie.

Oblicz rozcieńczenie lizatu komórkowego, aby uzyskać optymalny poziom fluorescencyjnego białka docelowego w reakcjach wiązania. Końcowe stężenie białka powinno być bliskie oczekiwanej stałej dysocjacji wiązania lub niższe i powinno zostać dostosowane w celu uzyskania wymaganego poziomu liczników fluorescencji. W końcowym roztworze należy rozcieńczyć lizat komórkowy za pomocą buforu MST.

Umieść probówki low bind o pojemności 0,5 ml w statywie, naprzeciwko probówek z próbkami seryjnych rozcieńczeń ligandu. Ostrożnie dodaj 15 µL lizatu komórkowego na dno każdej probówki. Staraj się nie dotykać ścianek probówek, aby uniknąć utraty próbki.

Do odpowiedniej probówki dodaj 15 µL próbki ligandu o najwyższym stężeniu. Probówka numer jeden zawiera lizat komórkowy. Wymieszaj dokładnie i zmień końcówkę pipety.

Powtórz ten krok dla pozostałych probówek z wyjątkiem ostatniej, która nie powinna zawierać liganda. Do ostatniej probówki dodaj 15 µL buforu MST i wymieszaj. Wypełnij dokładnie około dwóch trzecich pierwszej kapilary mieszaniną wiążącą z probówki numer jeden.

Przechyl naczynie, aby przesunąć roztwór w stronę środka, a następnie umieść kapilarę na tacy do kapilar w pozycji numer jeden; powtórz ten krok z pozostałymi kapilarami. W przypadku dłuższych eksperymentów końce kapilar można zapieczętować woskiem.

Umieść tackę wewnątrz urządzenia MST i zamknij drzwiczki instrumentu. Następnie wybierz źródło wzbudzenia LED o długości fali równej 470 nanometrów. W urządzeniu MST wykonaj polecenie wyszukiwania kapilar (find capillaries), aby instrument mógł zlokalizować dokładne położenia kapilar i zmierzyć fluorescencję próbek na podstawie natężenia sygnału fluorescencyjnego.

Dostosuj moc diody LED tak, aby mieściła się w przedziale od 400 do 1500 jednostek. Kliknij przycisk start, aby przeprowadzić eksperyment Thermo Resis. Do eksperymentu można wybrać więcej niż jedną wartość mocy lasera podczerwonego.

Aby znaleźć optymalny gradient temperatury dla konkretnego układu, przeprowadzenie jednego zestawu 16 kapilar zajmuje od 10 do 12 minut. Należy zebrać dane z dwóch do trzech pomiarów dla tego samego zestawu kapilar, aby zapewnić powtarzalność wyników. Aby rozpocząć analizę danych, należy uruchomić oprogramowanie analityczne i wczytać folder projektu.

W wyświetlonym oknie przeglądaru danych uruchom krzywe termoretyczne zebrane przy określonej mocy lasera IR. Istniała możliwość jednoczesnego otwarcia wszystkich śladów termoretycznych zebranych w różnych warunkach, a następnie wybrania dowolnych krzywych do analizy poprzez ich włączanie i wyłączanie. W oknie wykresu punktów oceny wybierz termorezystancję lub termoferezę z niebieskimi i czerwonymi liniami skoku T.

Zdefiniuj dwa obszary krzywych eksperymentalnych, które zostaną wybrane ręcznie do analizy przez oprogramowanie. Upewnij się, że niebieskie i czerwone linie są ustawione prawidłowo, aby uzyskać maksymalną zmianę Thermo Resis. Aby otrzymać punkty uśrednione z odchyleniami standardowymi, wybierz opcję use average lub distinguish runs dla oddzielnych serii pomiarowych.

Aby wykreślić dopasowanie stałej dysocjacji, należy wybrać opcję użycia średniej, wprowadzić i ustalić wartość stężenia znakowanej cząsteczki, a następnie dopasować krzywą. Stała dysocjacji wiązania lub wartość KD wraz z odchyleniem standardowym pojawi się w oddzielnym wyskakującym oknie informacyjnym. Zapisz dane z dopasowania średniej w pliku tekstowym i przenieś je do programu Excel.

Do uzyskania fluorescencyjnie znakowanego białka STAT3 wykorzystano komórki 2 9 3 wykazujące ekspresję STAT 3G FP. W przypadku testu wiązania z DNA, wiązanie silnie naładowanych oligonukleotydów spowodowało istotne zmiany w mobilności STAT3 w gradiencie temperatury.

Sygnał termoretyczny przedstawiono jako funkcję stężenia oligonukleotydów. Każdy punkt danych reprezentuje średnią z trzech pomiarów. Oprogramowanie Nano temporal analysis zostało wykorzystane do dopasowania krzywych i wyznaczenia pozornych wartości KD.

Pozorne stałe dysocjacji wynosiły 37,9 ± 1,0 µM dla wiązania z motywem gas oraz 23,3 ± 0,6 µM dla wiązania z bogatym w AT oligonukleotydem s+100. Co zaskakujące, sekwencje s+100 wykazały nieco silniejsze wiązanie niż gas. W trzech powtórzeniach pomiarowych substytucja A na G doprowadziła do drastycznego spadku powinowactwa mutanta s+100.

Podczas gdy mutant s plus 100 dwa nie wykazał wykrywalnego wiązania, co potwierdziło sekwencyjną selektywność wiązania STAT three do s plus 100. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w czasie krótszym niż dwie godziny, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać, że optymalne warunki ekstrakcji białek błonowych będą się różnić w zależności od białka i zazwyczaj wymagają optymalizacji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak określić powinowactwo wiązania białka do ligandu bez konieczności oczyszczania białka z lizatu komórkowego.