Name: Metoda oznaczania powinowactwa do wiązań bez oczyszczania białek za pomocą termoforezy w mikroskali (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Poznaj metodę mikroskalowej termoforezy do oznaczania powinowactwa wiązań białko-ligand bez konieczności oczyszczania białek z lizatów komórkowych. Technika ta przyspiesza badania interakji białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Program Badań Wewnętrznych NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research; Umowa o współpracy badawczej między NCI i Calidris Therapeutics; Amerykańskie Towarzystwo Onkologiczne przyznało IRG 97-152-17 dla O.T; oraz fundusze federalne z National Cancer Institute, NIH, na podstawie umowy HHSN26120080001E.

1. Przygotowanie lizatu komórkowego
Ten protokół jest przeznaczony dla komórek adherentnych, które wyrażają dowolne białko skonfundowane przez GFP. Potrzebna liczba komórek może wahać się od 106 do nawet 20 x 106 komórek, w zależności od poziomu ekspresji białka. Na przykład lizat komórek HEK z nadekspresją GFP-STAT3 przygotowano przez potraktowanie komórek hodowanych w 10 kolbach T75 do prawie 70% konfluencji za pomocą 1 ml buforu do lizy. Jednak lizat ten musiał zostać rozcieńczony 150-krotnie, aby zapewnić optymalny poziom fluorescencji w eksperymencie MST. Protokół lizy komórek zależy w dużym stopniu od właściwości i lokalizacji wewnątrzkomórkowej badanego białka. Jeśli stosowanie detergentów jest niepożądane ze względu na niestabilność białka, najlepszym wyborem może być sonikacja opisana poniżej. Do buforu do lizy można dodawać różne dodatki, aby zapobiec reakcjom modyfikacji białek: EDTA zapobiega fosforylacji, wanadan sodu hamuje fosfatazy białkowe tyrozyny, fluorek sodu jest inhibitorem fosfataz Ser/Thr.
<ol>
	<li>Przygotować bufor do lizy. W przypadku łatwych do ekstrakcji białek cytoplazmatycznych dobrze sprawdza się następujący skład: 25 mM Tris HCl, pH 8,0 i koktajl inhibitorów proteazy rozcieńczony 100-krotnie (Sigma-Aldrich P2714, składający się z 2 mM AEBSF, 0,3 μM aprotyniny, 130 μM bestatyny, 1 mM EDTA, 14 μM E-64, 1 μM leupeptyny). Alternatywnie, w przypadku mniej rozpuszczalnych białek, można użyć komercyjnego buforu RIPA z inhibitorami proteazy, koktajlem i niedenaturującymi detergentami. Utrzymuj bufor na lodzie.</li>
	<li>Krótko przemyć komórki lodowatym PBS, używając 10 ml buforu na kolbę T75. Trzymać komórki na lodzie przez 5 minut lub do momentu, gdy komórki zaczną odłączać się od kolby. Zeskrob komórki za pomocą skrobaka do komórek, aby odłączyć w razie potrzeby.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 10 ml lodowatego PBS i przenieść do wstępnie schłodzonej 14 ml okrągłodennej probówki wirówkowej.</li>
	<li>Komórki osadu rozdrabniać przez odwirowanie w temperaturze 400-600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. W razie potrzeby połączyć komórki z kilku kolb.</li>
	<li>Usunąć supernatant PBS i ponownie zawiesić osad w 200 μl lodowatego buforu do lizy, przenosząc zawiesinę do wstępnie schłodzonej probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Utrzymuj komórki na lodzie, aby zminimalizować miejscowe przegrzanie. Lizuj komórki za pomocą 3 impulsów sonikacji po 10 sekund przy amplitudzie 30%, używając wstępnie schłodzonej końcówki o średnicy 2-3 mm. Trzymaj końcówkę pod powierzchnią, aby zminimalizować pienienie. Pomiń ten krok, jeśli używasz buforu zawierającego detergent i zamiast tego inkubuj na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>W razie potrzeby skorygować roztwór lizatu tak, aby zawierał fizjologiczne stężenie soli (100 mM NaCl), stosując 5 M NaCl.</li>
	<li>Zbierać lizaty przez odwirowanie w temperaturze około 26 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Określić optymalne rozcieńczenie lizatu (zgodnie z opisem w sekcji 3 poniżej) i ilość lizatu potrzebną do jednego miareczkowania (zwykle około 300 μl wstępnie rozcieńczonego lizatu).</li>
	<li>Podwielokrotnić lizat i przechowywać w temperaturze odpowiedniej dla badanego białka (w większości przypadków -80 °C).</li>
</ol>
2. Wybór i przygotowanie bufora MST
<ol>
	<li>Ponieważ oddziaływania białko-ligand są zależne od warunków buforowych, skład bufora MST dobierany jest na podstawie właściwości konkretnego układu. Ogólnie rzecz biorąc, korzystne jest przetestowanie co najmniej dwóch różnych.</li>
	<li>Przygotuj 2 MST po 5x. Mieliśmy dobre doświadczenia z tymi dwoma kompozycjami: HEPES (250 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl2; 500 mM NaCl; 0,25% NP-40) i Tris HCl (250 mM Tris HCl, pH 7,4; 750 mM NaCl; 50 mM MgCl2; 0,05% Tween-20). Dodatek BSA (5% w końcowej mieszaninie wiążącej) może pomóc w zapobieganiu przywieraniu białek do plastikowych probówek i szklanych naczyń włosowatych. NaN3 (0,5 mM) może być również włączony, aby zapobiec rozwojowi mikroorganizmów.</li>
</ol>
3. Określenie optymalnego rozcieńczenia lizatu
<ol>
	<li>Wybierz źródło wzbudzenia LED o długości fali λ = 470 nm na przyrządzie MST.</li>
	<li>Załaduj naczynia włosowate ekstraktem komórkowym rozcieńczonym 2 i 10x buforem MST.</li>
	<li>Wykonaj operację "Znajdź kapilary" w oprogramowaniu sterującym przyrządu MST. Optymalny zakres fluorescencji w rozcieńczonym lizacie wynosi od 400 do 1 500 jednostek fluorescencyjnych.</li>
</ol>
4. Określenie optymalnego zakresu stężenia ligandów
<ol>
	<li>Najwyższe stężenie liganda powinno być co najmniej 20 razy wyższe niż oczekiwana stała dysocjacji.</li>
	<li>Najniższe stężenie liganda powinno być niższe niż stężenie molowe białka fluorescencyjnego.</li>
</ol>
Zapoznaj się z narzędziem NanoTemper Technologies Concentration Finder, aby oszacować zakres stężenia ligandów.
5. Przygotowanie lizatu komórkowego i rozcieńczeń ligandów
<ol>
	<li>Umieść stojak na probówki z wymaganą liczbą (zwykle 10-16) probówek wirówkowych LoBind o pojemności 0,5 ml na lodzie. Odpipetować 25 μl buforu MST na dno każdej probówki. Dodać 25 μl roztworu podstawowego liganda do pierwszej probówki (#1, najwyższe stężenie liganda) i przeprowadzić seryjne dwukrotne rozcieńczenie liganda przy użyciu pozostałych probówek. Stojak z próbkami ligandów należy przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Rozmrażaj komórki powoli na lodzie.</li>
	<li>Rozcieńczyć lizat komórkowy buforem MST, aby zapewnić optymalny poziom docelowego białka fluorescencyjnego w reakcjach wiązania. Końcowe stężenie białka powinno być bliskie oczekiwanemu KD lub niższe. Należy go dostosować, aby uzyskać niezbędną liczbę fluorescencji w roztworze końcowym. W celu określenia stężenia GFP-STAT3 w lizacie przyrząd został skalibrowany za pomocą fluoresceiny. Stężenie molowe GFP w lizacie oznaczono za pomocą stosunku wydajności kwantowej fluoresceiny i EGFP, odpowiednio 0,85 i 0,61. 15</li>
</ol>
6. Badania wiązania termoforezy w mikroskali
<ol>
	<li>Wybierz źródło wzbudzenia LED o λ = 470 nm na przyrządzie MST.</li>
	<li>Umieścić probówki LoBind o pojemności 0,5 ml w stojaku na probówki naprzeciwko probówek z próbkami do seryjnego rozcieńczania ligandów. Ostrożnie dodaj 15 μl lizatu komórkowego na dno każdej probówki. Staraj się nie dotykać ścianek rurki, aby uniknąć utraty próbki.</li>
	<li>Dodać 15 μl próbki liganda o najwyższym stężeniu (#1) do odpowiedniej probówki #1 z lizatem komórkowym. Dobrze wymieszaj i zmień końcówkę pipety. Powtórz ten krok z resztą probówek, z wyjątkiem ostatniej, która nie powinna zawierać liganda.</li>
	<li>Dodać 15 μl buforu MST do ostatniej probówki i dobrze wymieszać.</li>
	<li>Napełnij około 2/3 pierwszej kapilary mieszaniną wiążącą z probówki #1, przechyl ją, aby przesunąć roztwór w kierunku środka i umieść kapilatę na tacce kapilarnej w pozycji #1 (najbliższa pozycja otworu tacy). Powtórz ten krok z pozostałymi naczyniami włosowatymi. Końce kapilarne można zatkać woskiem w celu przeprowadzenia dłuższych eksperymentów.</li>
	<li>Umieść tacę wewnątrz instrumentu MST i zamknij drzwiczki instrumentu.</li>
	<li>Wykonaj polecenie "Znajdź kapilary", aby umożliwić instrumentowi znalezienie dokładnych pozycji naczyń włosowatych i zmierzenie fluorescencji próbek.</li>
	<li>W zależności od intensywności sygnału fluorescencji dostosuj moc diody LED (od 10-100%), aby ustawić ją w odstępie 400-1,500 jednostek.</li>
	<li>Kliknij przycisk "Start", aby przeprowadzić eksperyment termoforezy. Do eksperymentu można wybrać więcej niż jedną moc lasera IR, aby znaleźć optymalny gradient temperatury dla danego systemu. Zbierz dane z 2-3 przebiegów dla tego samego zestawu kapilarek, aby zapewnić powtarzalność pomiarów. Uruchomienie jednego zestawu 16 naczynek zajmuje 10-12 minut.</li>
</ol>
7. Analiza danych termoforezy w mikroskali
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy.</li>
	<li>Załaduj folder projektu. W wyświetlonej przeglądarce Information Run Viewer należy wybrać zebrane przy określonej mocy lasera IR krzywe termoforetyczne. Istnieje możliwość otwarcia wszystkich śladów termoforetycznych pobranych w różnych warunkach, takich jak moc lasera IR, moc diody LED, temperatura, stężenie itp. od razu, a następnie wybierając dowolne krzywe do analizy, włączając je i wyłączając (kliknij na nazwę eksperymentu).</li>
	<li>W oknie wykresu Punkty oceny wybierz termoforezę lub termoforezę za pomocą T-jump. Upewnij się, że niebieskie i czerwone linie są prawidłowo ustawione. Aby uzyskać uśrednione punkty z odchyleniami standardowymi, wybierz "Użyj średniej" lub "Rozróżnij przebiegi" dla oddzielnych przebiegów.</li>
	<li>Aby wykreślić dopasowanie stałej dysocjacji, wybierz "Użyj średniej", wprowadź i ustal oznaczoną wartość stężenia cząsteczki (sprawdź kwadrat "stężenie" w menu okna dopasowania) i dopasuj krzywą. Wartość K D wraz z odchyleniem standardowym pojawia się w osobnym wyskakującym oknie informacyjnym. Aby wykreślić pasowanie za pomocą metody Hill, wybierz "Średnia", metodę Hill, a następnie dopasuj krzywą. W tym przypadku pokazana jest wartość powinowactwa EC50 wraz z jego odchyleniem standardowym. Cecha "granicy" KD lub Hilla może być również wykorzystana, gdy nie zostanie osiągnięte nasycenie w stanie związanym.</li>
	<li>Zapisz dane średniego dopasowania w pliku tekstowym i przenieś je do programu Excel.</li>
	<li>Wykres normy F (fluorescencja znormalizowana),norma ΔF (różnica w znormalizowanej fluorescencji, jeśli porównuje się różne eksperymenty) lub frakcja związana (patrz wzór poniżej) w funkcji stężenia cząsteczki nieznakowanej (miareczkowanej).</li>
</ol>
Frakcja związana (frakcja cząsteczek w kompleksie) = (Therm(C)-niezwiązana)/(związana-niezwiązana), gdzie Therm(C) to termoforeza mierzona dla stężenia C, niezwiązana to termoforeza dla stanu niezwiązanego (gdy cząsteczki nie są w kompleksie), a związana to termoforeza dla stanu całkowicie związanego.

<ol><li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li>
<li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li>
<li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+binding+assays+at+equilibrium%3A+validation+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li>
<li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li>
<li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-protein+binding%3A+a+critical+review+of+analytical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li>
<li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science%3A+a+tutorial+review%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li>
<li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li>
<li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein%3A+nucleic+acid+interactions+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100(2010).</li>
<li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK-STAT+pathway+at+twenty%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li>
<li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li>
<li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li>
<li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li>
<li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li>
<li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Treść tej publikacji niekoniecznie odzwierciedla poglądy lub politykę Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej, a wzmianki o nazwach handlowych, produktach komercyjnych lub organizacjach nie oznaczają poparcia ze strony rządu Stanów Zjednoczonych.

Ekspresja i oczyszczanie białek jest pracochłonnym i kosztownym etapem, który jest jednak niezbędny do określenia KD oddziaływań za pomocą większości obecnie stosowanych metod. Zastosowanie MST pozwala uniknąć oczyszczania białek, co znacznie upraszcza i przyspiesza ilościową charakterystykę oddziaływań. Ma ona szczególnie istotne zalety w przypadku białek trudnych do ekspresji i oczyszczenia, takich jak białka błonowe i czynniki transkrypcyjne.
Głównym ograniczeniem i wymogiem MST ...

Ilościowa charakterystyka powinowactwa oddziaływań międzycząsteczkowych jest ważna w wielu dziedzinach badań biomedycznych. Stała dysocjacji wiązania (KD) jest niezbędna nie tylko w odkrywaniu leków, ale jest również ważnym parametrem w charakterystyce każdej interakcji binarnej w dowolnym systemie biologicznym. Metody biochemiczne stosowane do wykrywania oddziaływań białko-białko, takie jak immunoprecypitacja i badania przesiewowe drożdży dwuhybrydowych, nie informują nas o tym, jak ścisłe są te interakcje, podczas gdy powinowactwo określa, czy ten konkretny kompleks istnieje w danych warunkach in vivo. W procesie odkrywania leków, opracowanie testu wiązania jest jednym z niezbędnych i często najbardziej czasochłonnych kroków. Do najczęściej stosowanych metod oznaczania KD należą: polaryzacja fluorescencyjna,1 technologia powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR),2 wiązanie radioligandów,3 izotermiczna kalorymetria miareczkowa,4 dializa równowagowa (ED),5 ultrafiltracja (UF),5 i ultrawirowanie (UC). 6 Wszystkie z nich wymagają znacznych ilości oczyszczonego białka docelowego. Termoforeza w mikroskali (MST) to szybko rozwijająca się metoda, która wykrywa ukierunkowany ruch cząsteczek w mikroskopijnym gradiencie temperatury. Wszelkie zmiany powłoki hydratacyjnej biomolekuł powodują względną zmianę ruchu wzdłuż gradientu temperatury. 7 MST służy do określania powinowactwa wiązania i jest stosowany do badania wiązania ligandów z białkami znakowanymi fluorescencyjnie lub ligandów fluorescencyjnych z białkiem docelowym. 8, 9 MST umożliwia pomiar oddziaływań bezpośrednio w roztworze bez konieczności unieruchamiania na powierzchni (technologia bez unieruchomienia). Praktycznie każdemu powiązaniu towarzyszy zmiana sygnału MST, chociaż wielkość zmiany różni się znacznie w zależności od systemu. Aby wykryć ruch cząsteczek przez MST, muszą być one fluorescencyjne. To poważne ograniczenie metody można przekuć w zaletę. Jeśli białko ulega ekspresji jako fuzja GFP w dowolnym systemie, będzie to jedyna cząsteczka fluorescencyjna, a zatem może być badane bez izolacji od lizatu komórkowego lub bezkomórkowego systemu ekspresji. Głównym wyzwaniem jest generowanie lizatów komórkowych, które pozwalają na warunki wiązania przy minimalnej ilości artefaktów. Tutaj opisujemy protokół przygotowania lizatu komórkowego i eksperymentu MST, który można zastosować do wielu białek rozpuszczalnych i błonowych.
Białka STAT są utajonymi cytoplazmatycznymi czynnikami transkrypcyjnymi aktywowanymi przez fosforylację tyrozyny w odpowiedzi na sygnały zewnątrzkomórkowe i biorą udział w wielu procesach biologicznych, w tym w odporności, hematopoezie, zapaleniu i rozwoju. 10 U ssaków rodzina STAT składa się z STAT 1, 2, 3, 4, 5A, 5B i 6. Wiadomo, że wszystkie aktywowane STAT wiążą się z tą samą sekwencją DNA, tak zwanym motywem GAS, sekwencją aktywowaną IFN-gamma. Jednak efekty transkrypcyjne różnych STAT są bardzo różne. 11 Pomimo udziału w wielu procesach patologicznych i szeroko zakrojonych badań zaowocowanych ponad 17 000 publikacji, KD interakcji STAT z różnymi sekwencjami DNA nie zostało określone. Scharakteryzowano jedynie względne powinowactwo różnych STAT do wariantów motywu GAS. 11 Trudności w ekspresji i oczyszczaniu białek są głównymi przeszkodami w charakterystyce selektywności wiązania DNA STAT. Chociaż większość badań koncentrowała się na roli "aktywowanych" STAT, które stały się synonimem czynnika transkrypcyjnego fosforylowanego Tyra, rola niefosforylowanych STAT (U-STATs) w regulacji transkrypcji szybko się pojawia. 12 Mechanizmy te są jednak słabo poznane i nie było jasne, czy U-STAT faktycznie wiążą się z DNA, czy też działają poprzez interakcje z innymi czynnikami transkrypcyjnymi. Niedawno wykazaliśmy, że U-STAT3 może wiązać się z sekwencjami DNA różniącymi się od motywów GAS z jeszcze większym powinowactwem. 13 Odkrycie to ma istotne implikacje dla naszego zrozumienia biologicznych funkcji tego ważnego białka. Zastosowaliśmy termoforezę w mikroskali w celu określenia względnego powinowactwa STAT3 do GAS i oligonukleotydu bogatego w AT S + 100 (ryc. 4). Prawie identyczny protokół został użyty do oznaczania KD w celu wiązania innego liganda STAT3, inhibitora lipopeptydu. 14 Nie wykryto wiązania z pokrewnym czynnikiem transkrypcyjnym, GFP-STAT1, który był używany jako kontrola ujemna, potwierdzając w ten sposób selektywność interakcji. 14

<table><tbody><tr><td>Bufor RIPA</td><td>Millipore</td><td>20-188</td><td>innych producentów również działają</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Monolith NT.115</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>G008</td><td></td></tr><tr><td>Monolith NT.115 Taca kapilarna</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>T001</td><td></td></tr><tr><td>Monolith NT.115 Traktowany standardowo Kapilary</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>K002</td><td></td></tr><tr><td>NT Oprogramowanie sterujące</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>2.0.2.29</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie analityczne NT</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>1.4.27</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Inne wirówki z chłodzeniem z mikroprobówkami dostarczające </td></tr><tr><td>probówkę Protein LoBind 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431064</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda oznaczania powinowactwa do wiązań bez oczyszczania białek za pomocą termoforezy w mikroskali

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Ilościowa charakterystyka interakcji białek jest niezbędna praktycznie w każdej dziedzinie nauk przyrodniczych, szczególnie w odkrywaniu leków. Większość obecnie dostępnych metod oznaczaniaKD wymaga dostępu do oczyszczonego białka będącego przedmiotem zainteresowania, którego wytwarzanie może być czasochłonne i kosztowne. Opracowaliśmy protokół, który pozwala na określenie powinowactwa wiązania za pomocą termoforezy w mikroskali (MST) bez oczyszczania białka docelowego z lizatów komórkowych. Metoda polega na nadekspresji białka połączonego z GFP i lizie komórek w warunkach niedenaturujących. Zastosowanie metody do STAT3-GFP ulegającego przejściowej ekspresji w komórkach HEK293 pozwoliło po raz pierwszy określić powinowactwo dobrze przebadanego czynnika transkrypcyjnego do oligonukleotydów o różnych sekwencjach. Protokół jest prosty i może mieć wiele zastosowań do badania interakcji białek z małymi cząsteczkami, peptydami, DNA, RNA i białkami.

Pomiar powinowactwa wiązania niefosforylowanego białka STAT3 do oligonukleotydów.
Komórki HEK293 wykazujące ekspresję STAT3-GFP zostały wykorzystane jako źródło znakowanego fluorescencyjnie białka STAT3 do analizy wiązania z DNA. Lizaty komórkowe przygotowano z użyciem buforu RIPA (20x106komórek/ml). Do badań wiązania lizaty rozcieńczono 150-krotnie w buforze wiążącym DNA do MST, aby zapewnić optymalny poziom białka fluorescencyjnego w reakcji wiązania (około 20 nM). N...

Termoforeza w mikroskali (MST) może być szeroko stosowana do określania powinowactwa do wiązania bez oczyszczania docelowego białka z lizatów komórkowych. Protokół obejmuje nadekspresję białka połączonego z GFP, lizę komórek w warunkach niedenaturujących oraz wykrywanie sygnału MST w obecności różnych stężeń liganda.

Metoda oznaczania powinowactwa do wiązań bez oczyszczania białek za pomocą termoforezy w mikroskali

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie powinowactwa wiązania w oddziaływaniu białko-ligand bez konieczności oczyszczania białka z lizatu komórkowego. Osiąga się to poprzez ekspresję białka docelowego połączonego z GFP w dowolnej linii komórek adherentnych. Po przygotowaniu lizatu komórkowego i rozcieńczeń ligandu sporządza się mieszaniny lizatu komórkowego z ligandem, które następnie nanosi się do kapilar.Następnie pomiarowi poddawana jest termoforeza białka z fuzją GFP w obecności różnych stężeń liganda. Ostatnim etapem jest analiza danych z pomiarów termoforezy mikroskalowej, czyli MST. W końcowym rozrachunku termoforeza mikroskalowa służy do określenia powinowactwa wiązania w oddziaływaniach między białkami z fuzją GFP a różnymi ligandami.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak miareczkowanie, kalorymetria czy powierzchniowy rezonans plazmonowy, jest fakt, że nie wymaga ona oczyszczania białek, co znacząco upraszcza i przyspiesza ilościową charakterystykę oddziaływań binarnych. Metoda ta oferuje istotne korzyści podczas pracy z białkami trudnymi do ekspresji i oczyszczania, takimi jak białka błonowe i czynniki transkrypcyjne. Jedną z największych zalet mikrotermoforezy jest to, że działa ona w różnych buforach i toleruje obecność detergentów oraz całych komórek w układzie. Technikę tę zaprezentuje Karen Stefka, biolog z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, należy krótko przemyć komórki lodowatym solą fizjologiczną buforowanym fosforanem (PBS), używając 10 mL buforu na jedną kolbę T 75.Przechowywać komórki w lodzie przez pięć minut lub do momentu, gdy zaczną odrywać się od kolby. W razie potrzeby zdrapać komórki za pomocą skrobaka do komórek, aby je odseparować. Resuspendować komórki w 10 ml schłodzonego PBS i przenieść do uprzednio schłodzonej, okrągłodنnej probówki wirówkowej o pojemności 14 ml.Odwirować komórki przy 400 do 600 Gs w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut w celu uzyskania osadu. Usunąć nadsącz i zawiesić osad w 200 µL lodowatego buforu do lizy. Przenieść zawiesinę do schłodzonej probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 ml w celu ekstrakcji białek cytozolowych.Umieścić komórki w lodzie, aby zminimalizować lokalne przegrzanie, a następnie poddać je lizie za pomocą trzech dziesięciosekundowych impulsów sonikacji przy amplitudzie 30%. Używając schłodzonej wcześniej końcówki o średnicy od dwóch do trzech milimetrów, należy utrzymać ją poniżej powierzchni cieczy, aby zminimalizować pienienie. Pominąć ten krok w przypadku stosowania buforu zawierającego detergent i inkubować w lodzie przez 30 minut.Zamiast tego, w razie potrzeby skoryguj stężenie soli w roztworze lizatu do fizjologicznego poziomu 100 millimolar chlorku sodu, wykorzystując roztwór stokowy pięciu molar chlorku sodu. Na koniec zbierz lizaty poprzez wirowanie przy przyspieszeniu około 25 000 Gs i temperaturze czterech stopni Celsius za 10 minut. Na urządzeniu MST wybierz źródło wzbudzenia w postaci diody emitującej światło (LED) o długości fali równej 470 nanometrów.Napełnić kapilary ekstraktem komórkowym rozcieńczonym dwukrotnie i 10-krotnie buforem MST, a następnie umieścić je w urządzeniu MST. Wykonać operację wyszukiwania kapilar (find capillaries) w oprogramowaniu sterującym urządzenia MST. Optymalny zakres fluorescencji w rozcieńczonym lizacie wynosi od 400 do 1500 jednostek fluorescencji.Należy przystąpić do wyznaczenia optymalnego zakresu stężeń ligandu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieścić na lodzie statyw z odpowiednią liczbą probówek wirówkowych o pojemności 0,5 ml typu low bind, do każdej z nich pipetować 25 µL buforu MST, a do pierwszej probówki 25 µL roztworu zapasu ligandu, następnie wykonać dwukrotne rozcieńczenia szeregowe ligandu w pozostałych probówkach. Statyw z próbkami ligandu należy przechowywać na lodzie.Oblicz rozcieńczenie lizatu komórkowego, aby uzyskać optymalny poziom fluorescencyjnego białka docelowego w reakcjach wiązania. Końcowe stężenie białka powinno być bliskie oczekiwanej stałej dysocjacji wiązania lub niższe i powinno zostać dostosowane w celu uzyskania wymaganego poziomu liczników fluorescencji. W końcowym roztworze należy rozcieńczyć lizat komórkowy za pomocą buforu MST.Umieść probówki low bind o pojemności 0,5 ml w statywie, naprzeciwko probówek z próbkami seryjnych rozcieńczeń ligandu. Ostrożnie dodaj 15 µL lizatu komórkowego na dno każdej probówki. Staraj się nie dotykać ścianek probówek, aby uniknąć utraty próbki.Do odpowiedniej probówki dodaj 15 µL próbki ligandu o najwyższym stężeniu. Probówka numer jeden zawiera lizat komórkowy. Wymieszaj dokładnie i zmień końcówkę pipety.Powtórz ten krok dla pozostałych probówek z wyjątkiem ostatniej, która nie powinna zawierać liganda. Do ostatniej probówki dodaj 15 µL buforu MST i wymieszaj. Wypełnij dokładnie około dwóch trzecich pierwszej kapilary mieszaniną wiążącą z probówki numer jeden.Przechyl naczynie, aby przesunąć roztwór w stronę środka, a następnie umieść kapilarę na tacy do kapilar w pozycji numer jeden; powtórz ten krok z pozostałymi kapilarami. W przypadku dłuższych eksperymentów końce kapilar można zapieczętować woskiem.Umieść tackę wewnątrz urządzenia MST i zamknij drzwiczki instrumentu. Następnie wybierz źródło wzbudzenia LED o długości fali równej 470 nanometrów. W urządzeniu MST wykonaj polecenie wyszukiwania kapilar (find capillaries), aby instrument mógł zlokalizować dokładne położenia kapilar i zmierzyć fluorescencję próbek na podstawie natężenia sygnału fluorescencyjnego.Dostosuj moc diody LED tak, aby mieściła się w przedziale od 400 do 1500 jednostek. Kliknij przycisk start, aby przeprowadzić eksperyment Thermo Resis. Do eksperymentu można wybrać więcej niż jedną wartość mocy lasera podczerwonego.Aby znaleźć optymalny gradient temperatury dla konkretnego układu, przeprowadzenie jednego zestawu 16 kapilar zajmuje od 10 do 12 minut. Należy zebrać dane z dwóch do trzech pomiarów dla tego samego zestawu kapilar, aby zapewnić powtarzalność wyników. Aby rozpocząć analizę danych, należy uruchomić oprogramowanie analityczne i wczytać folder projektu.W wyświetlonym oknie przeglądaru danych uruchom krzywe termoretyczne zebrane przy określonej mocy lasera IR. Istniała możliwość jednoczesnego otwarcia wszystkich śladów termoretycznych zebranych w różnych warunkach, a następnie wybrania dowolnych krzywych do analizy poprzez ich włączanie i wyłączanie. W oknie wykresu punktów oceny wybierz termorezystancję lub termoferezę z niebieskimi i czerwonymi liniami skoku T.Zdefiniuj dwa obszary krzywych eksperymentalnych, które zostaną wybrane ręcznie do analizy przez oprogramowanie. Upewnij się, że niebieskie i czerwone linie są ustawione prawidłowo, aby uzyskać maksymalną zmianę Thermo Resis. Aby otrzymać punkty uśrednione z odchyleniami standardowymi, wybierz opcję use average lub distinguish runs dla oddzielnych serii pomiarowych.Aby wykreślić dopasowanie stałej dysocjacji, należy wybrać opcję użycia średniej, wprowadzić i ustalić wartość stężenia znakowanej cząsteczki, a następnie dopasować krzywą. Stała dysocjacji wiązania lub wartość KD wraz z odchyleniem standardowym pojawi się w oddzielnym wyskakującym oknie informacyjnym. Zapisz dane z dopasowania średniej w pliku tekstowym i przenieś je do programu Excel.Do uzyskania fluorescencyjnie znakowanego białka STAT3 wykorzystano komórki 2 9 3 wykazujące ekspresję STAT 3G FP. W przypadku testu wiązania z DNA, wiązanie silnie naładowanych oligonukleotydów spowodowało istotne zmiany w mobilności STAT3 w gradiencie temperatury.Sygnał termoretyczny przedstawiono jako funkcję stężenia oligonukleotydów. Każdy punkt danych reprezentuje średnią z trzech pomiarów. Oprogramowanie Nano temporal analysis zostało wykorzystane do dopasowania krzywych i wyznaczenia pozornych wartości KD.Pozorne stałe dysocjacji wynosiły 37,9 ± 1,0 µM dla wiązania z motywem gas oraz 23,3 ± 0,6 µM dla wiązania z bogatym w AT oligonukleotydem s+100. Co zaskakujące, sekwencje s+100 wykazały nieco silniejsze wiązanie niż gas. W trzech powtórzeniach pomiarowych substytucja A na G doprowadziła do drastycznego spadku powinowactwa mutanta s+100.Podczas gdy mutant s plus 100 dwa nie wykazał wykrywalnego wiązania, co potwierdziło sekwencyjną selektywność wiązania STAT three do s plus 100. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w czasie krótszym niż dwie godziny, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać, że optymalne warunki ekstrakcji białek błonowych będą się różnić w zależności od białka i zazwyczaj wymagają optymalizacji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak określić powinowactwo wiązania białka do ligandu bez konieczności oczyszczania białka z lizatu komórkowego.

protein-purification-free-method-binding-affinity-determination

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda bez czyszczenia białka w celu określenia powinowactwa wiązania za pomocą mikroskalowej termoforezy

ITC jest potężnym narzędziem do badania wiązania liganda z jego gospodarzem. Jednak w układach złożonych kilka modeli może równie dobrze dopasowywać się do danych. Metoda opisana w niniejszej pracy umożliwia wyjaśnienie odpowiedniego modelu wiązania dla układów złożonych oraz wyznaczenie odpowiadających im parametrów termodynamicznych.

Gromadzenie zbiorów danych izotermicznej kalorymetrii miareczkowej o zmiennym stężeniu w celu określenia mechanizmów wiązania

Przedstawiono ogólny protokół wykorzystania izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do monitorowania termodynamiki wiązania w układach biologicznych o umiarkowanym powinowactwie wiązania.

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa w pomiarach powinowactwa makrocząsteczek do ligandów

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii powinowactwa niklu do oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną z bakterii Clostridium difficile.

Oczyszczanie białek oparte na chromatografii powinowactwa niklu: technika oczyszczania rekombinowanych białek znakowanych polihistydyną z lizatu komórek bakteryjnych

Ten film demonstruje termoforezę w mikroskali do badania interakcji białko-lipid. Test wykrywa interakcję między cząsteczkami poprzez ilościowe określenie ruchu termoforetycznego białek znakowanych fluorescencyjnie w odpowiedzi na gradient temperatury. Cząsteczka fluorescencyjna jest mieszana z różnymi stężeniami niefluorescencyjnych cząsteczek lipidów, a mieszanina cząsteczek w roztworze jest ładowana do naczyń włosowatych. Do próbek w kapilarach stosuje się gradient temperatury, a ruch...

Termoforeza w mikroskali do badania interakcji białko-lipid w roztworze

Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.

Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Termoforeza w mikroskali (MST) to czuła technologia do charakteryzowania interakcji aptamer-cel. Niniejszy manuskrypt opisuje protokół MST do charakteryzowania oddziaływań aptamer-małe cząsteczki.

Mapowanie miejsca wiązania aptameru na ATP za pomocą termoforezy w mikroskali

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Przedstawiono procedurę ponownego fałdowania domeny wiążącej ligand peryplazmatyczny dCACHE chemoreceptora Campylobacter jejuni Tlp3 z ciał inkluzyjnych i oczyszczania w celu uzyskania miligramowych ilości białka.

Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i oczyszczania białek znakowanych stabilnymi izotopami, a następnie charakteryzację oddziaływań białko-białko za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i eksperymentów termoforezy w mikroskali (MST).

Pomiar oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i termoforezy w mikroskali (MST)

Termoforeza w mikroskali szybko uzyskuje stałe wiązania przy niskich kosztach materiałowych. Na rynku dostępna jest termoforeza w mikroskali znakowana lub bezetykietowa; Jednak termoforeza bezznacznikowa nie jest w stanie zapewnić różnorodności pomiarów interakcji, które można wykonać przy użyciu etykiet fluorescencyjnych. Udostępniamy protokół dla znakowanych pomiarów termoforezy.

Zastosowanie termoforezy w mikroskali do pomiaru interakcji białko-lipid

Adapter do płytek wielokolumnowych pozwala na połączenie kolumn chromatograficznych z wielodołkowymi płytkami do równoległego powinowactwa lub oczyszczania jonowymiennego, zapewniając ekonomiczną metodę oczyszczania białek o wysokiej przepustowości. Może być stosowany w warunkach grawitacji lub próżni, uzyskując miligramowe ilości białka za pomocą niedrogiego oprzyrządowania.

Ekonomiczny i wszechstronny wysokowydajny system oczyszczania białek za pomocą wielokolumnowego adaptera płytowego

Poznaj metodę mikroskalowej termoforezy do oznaczania powinowactwa wiązań białko-ligand bez konieczności oczyszczania białek z lizatów komórkowych. Technika ta przyspiesza badania interakji białkowych.

Metoda oznaczania powinowactwa do wiązań bez oczyszczania białek za pomocą termoforezy w mikroskali

Przeglądaj więcej filmów