Metoda oznaczania powinowactwa do wiązań bez oczyszczania białek za pomocą termoforezy w mikroskali

Ogólnym celem tej procedury jest określenie powinowactwa wiązania interakcji liganda białkowego bez oczyszczania białka z lizatu komórkowego. Osiąga się to poprzez pierwszą ekspresję białka skondensowanego GFP w dowolnej przylegającej linii komórkowej. Po przygotowaniu lizatu komórkowego i rozcieńczenia ligandów, mieszaniny ligandów lizatu komórkowego są przygotowywane i ładowane do naczyń włosowatych.

Następnie mierzy się termorezę białka skondensowanego GFP w obecności różnych stężeń ligandów. Ostatnim krokiem jest analiza danych z pomiarów termosfery w mikroskali lub MST. Ostatecznie termoreza w mikroskali jest wykorzystywana do określania powinowactwa do wiązania interakcji między białkami połączonymi z GFP a różnymi ligandami.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak miareczkowanie, kalorymetria lub mono osocza powierzchniowego, jest to, że pozwala uniknąć oczyszczania białek, co znacznie upraszcza i przyspiesza ilościową charakterystykę oddziaływań binarnych. Metoda ta ma znaczące zalety podczas pracy z białkami, które są trudne do ekspresji i oczyszczenia, takimi jak białka błonowe i czynniki transkrypcyjne. Jedną z największych zalet termosfery w mikroskali jest to, że działa w różnych i toleruje obecność detergentów i moich komórek w systemie Zademonstruje tę technikę Karen Stefka, biolog z mojego laboratorium Aby rozpocząć krótkie płukanie komórek lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS przy użyciu 10 mililitrów buforu na kolbę T 75.

Trzymać komórki na lodzie przez pięć minut lub do momentu, gdy zaczną odłączać się od kolby. Zeskrob komórki za pomocą skrobaka do komórek, aby w razie potrzeby odłączyć. Ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach lodowatego PBS i przenieść do wstępnie schłodzonej 14-mililitrowej probówki wirówkowej z okrągłym dnem.

Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze od 400 do 600 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy. Przenieść zawiesinę do wstępnie schłodzonej 1,5-mililitrowej probówki einor w celu ekstrakcji białek cytozolowych.

Umieść komórki na lodzie, aby zminimalizować miejscowe przegrzanie i poddaj komórki trzykrotnymi dziesięciosekundowymi impulsami sonikacji przy amplitudzie 30%. Używając dwu- lub trzymilimetrowej końcówki do wstępnego schładzania, trzymaj końcówkę pod powierzchnią, aby zminimalizować pienienie. Pomiń ten krok, jeśli używasz buforu zawierającego detergent i inkubuj na lodzie przez 30 minut.

Zamiast tego należy skorygować roztwór lizatu tak, aby zawierał fizjologiczne stężenie soli 100 milimolowego chlorku sodu, jeśli to konieczne, z roztworu podstawowego pięciomolowego chlorku sodu. Na koniec zbierz lizaty przez odwirowanie w temperaturze około 25 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Wybierz diodę elektroluminescencyjną lub źródło wzbudzenia LED o długości fali równej 470 nanometrów na instrumencie MST.

Załaduj naczynia włosowate ekstraktem komórkowym rozcieńczonym dwa i 10 razy buforem MST i umieść je w przyrządzie MST. Wykonaj operację znajdowania kapilar w oprogramowaniu sterującym przyrządu MST. Optymalny zakres fluorescencji w rozcieńczonym lizacie wynosi od 400 do 1500 jednostek fluorescencyjnych.

Przystąp do określenia optymalnego zakresu stężenia ligandów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieścić stojak na probówki z niezbędną liczbą 0,5 mililitra probówek wirówkowych o niskim poziomie wiązania na lodu, pipetować 25 mikrolitrów buforu MST na dnie każdej probówki przy 25 mikrolitrach roztworu podstawowego liganda do pierwszej probówki i wykonać seryjne dwukrotne rozcieńczenie liganda przy użyciu pozostałych probówek. Stojak z próbkami ligandów należy przechowywać na lodzie.

Obliczyć rozcieńczenie lizatu komórkowego, aby uzyskać optymalny poziom docelowego białka fluorescencyjnego w reakcjach wiązania. Końcowe stężenie białka powinno być bliskie oczekiwanej stałej dysocjacji wiązania lub niższe i powinno być dostosowane w celu uzyskania niezbędnej liczby fluorescencji. W końcowym roztworze przystąp do rozcieńczania lizatu komórkowego za pomocą buforu MST.

Umieść 0,5 mililitra probówek o niskim poziomie wiązania w stojaku na probówki naprzeciwko probówek z próbkami do seryjnego rozcieńczania ligandów. Ostrożnie dodaj 15 mikrolitrów lizatu komórkowego na dno każdej probówki. Staraj się nie dotykać ścianek rurki, aby uniknąć utraty próbki.

Dodać 15 mikrolitrów próbki liganda o najwyższym stężeniu do odpowiedniej probówki. Po pierwsze, z lizatem komórkowym. Dobrze wymieszaj i zmień końcówkę pipety.

Powtórz ten krok z resztą probówek, z wyjątkiem ostatniej, która nie powinna zawierać liganda. Dodaj 15 mikrolitrów buforu MST do ostatniej probówki i wymieszaj. Dobrze wypełnij około dwóch trzecich pierwszej kapilary mieszaniną wiążącą z probówki numer jeden.

Przechyl go, aby przesunąć roztwór w kierunku środka i umieść kapilę na tacce kapilarnej w tej pozycji. Po pierwsze, powtórz ten krok z resztą naczyń włosowatych. Końce kapilarne można zatkać woskiem w celu przeprowadzenia dłuższych eksperymentów.

Umieść tacę wewnątrz instrumentu MST i zamknij drzwiczki instrumentu. Następnie wybierz źródło wzbudzenia LED o długości fali równej 470 nanometrów. W przyrządzie MST wykonaj polecenie znajdź kapilary, aby umożliwić instrumentowi znalezienie dokładnych pozycji naczyń włosowatych i zmierzenie fluorescencji próbek w oparciu o intensywność sygnału fluorescencyjnego.

Dostosuj moc diody LED, aby wprowadzić ją w przedział od 400 do 1500 jednostek. Kliknij przycisk Start, aby przeprowadzić eksperyment Thermo Resis. Do eksperymentu można wybrać więcej niż jedną moc lasera na podczerwień.

Aby znaleźć optymalny gradient temperatury dla danego systemu, uruchomienie jednego zestawu 16 naczyń włosowatych zajmuje od 10 do 12 minut. Zbierz dane z dwóch lub trzech przebiegów dla tego samego zestawu kapilarn, aby zapewnić odtwarzalność pomiarów. Aby rozpocząć analizę danych, otwórz oprogramowanie analityczne i załaduj folder projektu.

W wyświetlonych informacjach uruchom przeglądarkę wybierz zebrane przy określonej mocy lasera IR krzywe termoretyczne. Istniała możliwość otwarcia wszystkich śladów termoretycznych pobranych w różnych warunkach jednocześnie, a następnie wybrania dowolnych krzywych do analizy poprzez ich włączanie i wyłączanie. W oknie wykresu punktów oceny wybierz termorezę lub ferezę termiczną z niebieskimi i czerwonymi liniami T jump.

Zdefiniuj dwa obszary krzywych eksperymentalnych, które są wybierane ręcznie do analizy przez oprogramowanie. Upewnij się, że niebieskie i czerwone linie są prawidłowo ustawione, aby zapewnić maksymalną zmianę w Thermo Resis. Aby uzyskać uśrednione punkty z odchyleniami standardowymi, wybierz opcję Użyj średniej lub Rozróżnij przebiegi dla oddzielnych przebiegów.

Aby wykreślić dopasowanie stałej dysocjacji, wybierz opcję Użyj średniej, wprowadź i ustal wartość stężenia cząsteczki oznaczonej i dopasuj krzywą. Stała dysocjacji powiązania lub wartość KD wraz z jej odchyleniem standardowym pojawia się w osobnym wyskakującym oknie informacyjnym. Zapisz dane średniego dopasowania w pliku tekstowym i przenieś je do programu Excel.Heck.

2 9 3 komórki eksprymujące STAT 3G FP wykorzystano jako źródło fluorescencyjnie znakowanego statu trzeciego. W przypadku testu wiązania DNA wiązanie silnie naładowanych oligonukleotydów spowodowało znaczące zmiany w ruchliwości STAT 3. W gradiencie temperatury.

Sygnał termoretyczny jest wykreślany jako funkcja stężenia oligonukleotydów. Każdy punkt danych reprezentuje średnią z trzech pomiarów. Oprogramowanie do analizy nanoczasowej zostało wykorzystane do dopasowania i wyznaczenia pozornych wartości KD.

Pozorne stałe dysocjacji wynosiły 37,9 plus minus 1,0 mikromola dla wiązania z motywem gazowym i 23,3 plus minus 0,6 mikromola dla wiązania z bogatym oligonukleotydem s plus 100. Co zaskakujące, sekwencje s plus 100 wykazały nieco ściślejsze wiązanie niż gaz. W trzech powtórzeniach pomiaru, podstawienie A do G spowodowało dramatyczny spadek powinowactwa zmutowanego s plus 100

Podczas gdy zmutowany s plus 100 dwa nie wykazywał wykrywalnego wiązania, potwierdzając w ten sposób sekwencyjne selektywne wiązanie STAT trzy z s plus 100 Po opanowaniu technikę tę można wykonać w mniej niż dwie godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że optymalne warunki ekstrakcji białek błonowych będą różne dla różnych białek i zwykle wymagają optymalizacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić powinowactwo wiązania białka do elegancji bez oczyszczania białka z komórki. Lizat.