Metoda oznaczania powinowactwa do wiązań bez oczyszczania białek za pomocą termoforezy w mikroskali
15 sierpnia 2013
Termoforeza w mikroskali (MST) może być szeroko stosowana do określania powinowactwa do wiązania bez oczyszczania docelowego białka z lizatów komórkowych. Protokół obejmuje nadekspresję białka połączonego z GFP, lizę komórek w warunkach niedenaturujących oraz wykrywanie sygnału MST w obecności różnych stężeń liganda.
Ogólnym celem tej procedury jest określenie powinowactwa wiązania interakcji liganda białkowego bez oczyszczania białka z lizatu komórkowego. Osiąga się to poprzez pierwszą ekspresję białka skondensowanego GFP w dowolnej przylegającej linii komórkowej. Po przygotowaniu lizatu komórkowego i rozcieńczenia ligandów, mieszaniny ligandów lizatu komórkowego są przygotowywane i ładowane do naczyń włosowatych.
Następnie mierzy się termorezę białka skondensowanego GFP w obecności różnych stężeń ligandów. Ostatnim krokiem jest analiza danych z pomiarów termosfery w mikroskali lub MST. Ostatecznie termoreza w mikroskali jest wykorzystywana do określania powinowactwa do wiązania interakcji między białkami połączonymi z GFP a różnymi ligandami.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak miareczkowanie, kalorymetria lub mono osocza powierzchniowego, jest to, że pozwala uniknąć oczyszczania białek, co znacznie upraszcza i przyspiesza ilościową charakterystykę oddziaływań binarnych. Metoda ta ma znaczące zalety podczas pracy z białkami, które są trudne do ekspresji i oczyszczenia, takimi jak białka błonowe i czynniki transkrypcyjne. Jedną z największych zalet termosfery w mikroskali jest to, że działa w różnych i toleruje obecność detergentów i moich komórek w systemie Zademonstruje tę technikę Karen Stefka, biolog z mojego laboratorium Aby rozpocząć krótkie płukanie komórek lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS przy użyciu 10 mililitrów buforu na kolbę T 75.
Trzymać komórki na lodzie przez pięć minut lub do momentu, gdy zaczną odłączać się od kolby. Zeskrob komórki za pomocą skrobaka do komórek, aby w razie potrzeby odłączyć. Ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach lodowatego PBS i przenieść do wstępnie schłodzonej 14-mililitrowej probówki wirówkowej z okrągłym dnem.
Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze od 400 do 600 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy. Przenieść zawiesinę do wstępnie schłodzonej 1,5-mililitrowej probówki einor w celu ekstrakcji białek cytozolowych.
Umieść komórki na lodzie, aby zminimalizować miejscowe przegrzanie i poddaj komórki trzykrotnymi dziesięciosekundowymi impulsami sonikacji przy amplitudzie 30%. Używając dwu- lub trzymilimetrowej końcówki do wstępnego schładzania, trzymaj końcówkę pod powierzchnią, aby zminimalizować pienienie. Pomiń ten krok, jeśli używasz buforu zawierającego detergent i inkubuj na lodzie przez 30 minut.
Zamiast tego należy skorygować roztwór lizatu tak, aby zawierał fizjologiczne stężenie soli 100 milimolowego chlorku sodu, jeśli to konieczne, z roztworu podstawowego pięciomolowego chlorku sodu. Na koniec zbierz lizaty przez odwirowanie w temperaturze około 25 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Wybierz diodę elektroluminescencyjną lub źródło wzbudzenia LED o długości fali równej 470 nanometrów na instrumencie MST.
Załaduj naczynia włosowate ekstraktem komórkowym rozcieńczonym dwa i 10 razy buforem MST i umieść je w przyrządzie MST. Wykonaj operację znajdowania kapilar w oprogramowaniu sterującym przyrządu MST. Optymalny zakres fluorescencji w rozcieńczonym lizacie wynosi od 400 do 1500 jednostek fluorescencyjnych.
Przystąp do określenia optymalnego zakresu stężenia ligandów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieścić stojak na probówki z niezbędną liczbą 0,5 mililitra probówek wirówkowych o niskim poziomie wiązania na lodu, pipetować 25 mikrolitrów buforu MST na dnie każdej probówki przy 25 mikrolitrach roztworu podstawowego liganda do pierwszej probówki i wykonać seryjne dwukrotne rozcieńczenie liganda przy użyciu pozostałych probówek. Stojak z próbkami ligandów należy przechowywać na lodzie.
Obliczyć rozcieńczenie lizatu komórkowego, aby uzyskać optymalny poziom docelowego białka fluorescencyjnego w reakcjach wiązania. Końcowe stężenie białka powinno być bliskie oczekiwanej stałej dysocjacji wiązania lub niższe i powinno być dostosowane w celu uzyskania niezbędnej liczby fluorescencji. W końcowym roztworze przystąp do rozcieńczania lizatu komórkowego za pomocą buforu MST.
Umieść 0,5 mililitra probówek o niskim poziomie wiązania w stojaku na probówki naprzeciwko probówek z próbkami do seryjnego rozcieńczania ligandów. Ostrożnie dodaj 15 mikrolitrów lizatu komórkowego na dno każdej probówki. Staraj się nie dotykać ścianek rurki, aby uniknąć utraty próbki.
Dodać 15 mikrolitrów próbki liganda o najwyższym stężeniu do odpowiedniej probówki. Po pierwsze, z lizatem komórkowym. Dobrze wymieszaj i zmień końcówkę pipety.
Powtórz ten krok z resztą probówek, z wyjątkiem ostatniej, która nie powinna zawierać liganda. Dodaj 15 mikrolitrów buforu MST do ostatniej probówki i wymieszaj. Dobrze wypełnij około dwóch trzecich pierwszej kapilary mieszaniną wiążącą z probówki numer jeden.
Przechyl go, aby przesunąć roztwór w kierunku środka i umieść kapilę na tacce kapilarnej w tej pozycji. Po pierwsze, powtórz ten krok z resztą naczyń włosowatych. Końce kapilarne można zatkać woskiem w celu przeprowadzenia dłuższych eksperymentów.
Umieść tacę wewnątrz instrumentu MST i zamknij drzwiczki instrumentu. Następnie wybierz źródło wzbudzenia LED o długości fali równej 470 nanometrów. W przyrządzie MST wykonaj polecenie znajdź kapilary, aby umożliwić instrumentowi znalezienie dokładnych pozycji naczyń włosowatych i zmierzenie fluorescencji próbek w oparciu o intensywność sygnału fluorescencyjnego.
Dostosuj moc diody LED, aby wprowadzić ją w przedział od 400 do 1500 jednostek. Kliknij przycisk Start, aby przeprowadzić eksperyment Thermo Resis. Do eksperymentu można wybrać więcej niż jedną moc lasera na podczerwień.
Aby znaleźć optymalny gradient temperatury dla danego systemu, uruchomienie jednego zestawu 16 naczyń włosowatych zajmuje od 10 do 12 minut. Zbierz dane z dwóch lub trzech przebiegów dla tego samego zestawu kapilarn, aby zapewnić odtwarzalność pomiarów. Aby rozpocząć analizę danych, otwórz oprogramowanie analityczne i załaduj folder projektu.
W wyświetlonych informacjach uruchom przeglądarkę wybierz zebrane przy określonej mocy lasera IR krzywe termoretyczne. Istniała możliwość otwarcia wszystkich śladów termoretycznych pobranych w różnych warunkach jednocześnie, a następnie wybrania dowolnych krzywych do analizy poprzez ich włączanie i wyłączanie. W oknie wykresu punktów oceny wybierz termorezę lub ferezę termiczną z niebieskimi i czerwonymi liniami T jump.
Zdefiniuj dwa obszary krzywych eksperymentalnych, które są wybierane ręcznie do analizy przez oprogramowanie. Upewnij się, że niebieskie i czerwone linie są prawidłowo ustawione, aby zapewnić maksymalną zmianę w Thermo Resis. Aby uzyskać uśrednione punkty z odchyleniami standardowymi, wybierz opcję Użyj średniej lub Rozróżnij przebiegi dla oddzielnych przebiegów.
Aby wykreślić dopasowanie stałej dysocjacji, wybierz opcję Użyj średniej, wprowadź i ustal wartość stężenia cząsteczki oznaczonej i dopasuj krzywą. Stała dysocjacji powiązania lub wartość KD wraz z jej odchyleniem standardowym pojawia się w osobnym wyskakującym oknie informacyjnym. Zapisz dane średniego dopasowania w pliku tekstowym i przenieś je do programu Excel.Heck.
2 9 3 komórki eksprymujące STAT 3G FP wykorzystano jako źródło fluorescencyjnie znakowanego statu trzeciego. W przypadku testu wiązania DNA wiązanie silnie naładowanych oligonukleotydów spowodowało znaczące zmiany w ruchliwości STAT 3. W gradiencie temperatury.
Sygnał termoretyczny jest wykreślany jako funkcja stężenia oligonukleotydów. Każdy punkt danych reprezentuje średnią z trzech pomiarów. Oprogramowanie do analizy nanoczasowej zostało wykorzystane do dopasowania i wyznaczenia pozornych wartości KD.
Pozorne stałe dysocjacji wynosiły 37,9 plus minus 1,0 mikromola dla wiązania z motywem gazowym i 23,3 plus minus 0,6 mikromola dla wiązania z bogatym oligonukleotydem s plus 100. Co zaskakujące, sekwencje s plus 100 wykazały nieco ściślejsze wiązanie niż gaz. W trzech powtórzeniach pomiaru, podstawienie A do G spowodowało dramatyczny spadek powinowactwa zmutowanego s plus 100
.Podczas gdy zmutowany s plus 100 dwa nie wykazywał wykrywalnego wiązania, potwierdzając w ten sposób sekwencyjne selektywne wiązanie STAT trzy z s plus 100 Po opanowaniu technikę tę można wykonać w mniej niż dwie godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że optymalne warunki ekstrakcji białek błonowych będą różne dla różnych białek i zwykle wymagają optymalizacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić powinowactwo wiązania białka do elegancji bez oczyszczania białka z komórki. Lizat.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje zastosowanie mikroskalowej termoforezy (MST) do określenia powinowactwa wiązania interakcji białko-ligand bezpośrednio z lizatów komórkowych. Metoda polega na ekspresji białka związanego z GFP, przygotowaniu lizatów komórkowych i pomiarze sygnałów MST przy różnych stężeniach ligandu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Interakcje białko-ligand
- Techniki termoforezy
Tło
- Mikroskalowa termoforeza to technika pomiaru powinowactwa wiązania.
- Zezwala na analizę bez konieczności oczyszczania białka.
- Zastosowanie białek związanych z GFP ułatwia wykrywanie.
- Lizaty komórkowe zapewniają bardziej fizjologiczne środowisko dla interakcji.
Cel badania
- Określenie powinowactwa wiązania interakcji białko-ligand.
- Wykorzystanie lizatów komórkowych dla bardziej dokładnych pomiarów.
- Uproszczenie procesu poprzez uniknięcie oczyszczania białka.
Stosowane metody
- Nadekspresja białek związanych z GFP w liniach komórkowych adhezywnych.
- Przygotowanie lizatów komórkowych w warunkach niedenaturujących.
- Przygotowanie rozcieńczeń ligandu do analizy MST.
- Pomiar sygnałów MST w odpowiedzi na różne stężenia ligandu.
Główne wyniki
- Skuteczna determinacja powinowactwa wiązania za pomocą MST.
- Demonstracja przydatności metody dla różnych ligandów.
- Walidacja wyników poprzez analizę danych pomiarów MST.
- Potencjał dla szerszych zastosowań w badaniach interakcji białkowych.
Wnioski
- MST jest skuteczną metodą do badania interakcji białko-ligand.
- Protokół pozwala na analizę bezpośrednio z lizatów komórkowych.
- To podejście może poprawić zrozumienie interakcji biochemicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Determining binding affinity directly from cell lysates eliminates the bottleneck of protein purification, accelerating early-stage target validation and lead identification. This approach enables rapid assessment of protein-ligand interactions in a near-physiological context, improving predictive confidence for downstream screening campaigns. By reducing time and resource investment in protein production, the method supports higher-throughput screening of difficult targets such as transcription factors and membrane proteins.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring binding affinities of GFP-tagged proteins to oligonucleotides, peptides, or small molecules directly from lysates.
- Operational Value: Avoids protein purification steps, reducing timelines and costs associated with expressing and isolating difficult targets like STAT3.
- Predictive Value: Provides quantitative KD measurements that support target prioritization and go/no-go decisions in early discovery.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates reproducible, quantitative binding data from lysate-based systems suitable for hit confirmation and SAR exploration.
- Scalability: Compatible with serial ligand dilution formats and capillary-based MST platforms, enabling medium-throughput affinity profiling.
- Contextual Relevance: Maintains physiological buffer conditions and tolerates detergents, preserving native protein states for more translatable interaction data.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports mechanistic de-risking by validating target engagement in lysate systems that reflect cellular complexity.
- Biomarker Alignment: Enables assessment of how mutations or post-translational modifications affect binding, informing structure-function relationships relevant to disease variants.
- Risk-Adjusted Advancement: Affinity data from native-like environments improves confidence in selecting leads with favorable target interaction profiles.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a lysate-compatible alternative to purified-protein assays for affinity measurement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying binding of GFP-fused transcription factors to DNA or protein ligands without purification.
- Screening: Enables assay readiness through standardized lysate preparation and ligand titration, yielding reproducible MST thermophoresis curves for affinity ranking.
- Analytics: Generates KD values with standard deviations from averaged MST thermophoresis traces, providing statistical outputs for comparing ligand potency and selectivity.
- Translational Research: Connects early binding data to preclinical relevance by using lysates from disease-relevant cell models (e.g., HEK293 expressing STAT3-GFP) to assess target behavior in near-native conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable lysate-based MST workflow applicable across multiple targets and ligand classes, reducing dependency on protein purification bottlenecks.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence through quantitative affinity measurements that reduce mechanistic ambiguity in target-ligand interactions.
- Operational Value: Increases standardization and reproducibility by eliminating variability introduced during protein purification and enabling direct comparison across lysate preparations.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by accelerating hit validation and reducing late-stage attrition due to poor target engagement predictions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on lysate-derived affinity data, supporting better resource allocation in early discovery portfolios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent protein tagging, cell culture, and lysate preparation under non-denaturing conditions.
- Dependent on access to an MST instrument with appropriate LED excitation (e.g., 470 nm for GFP) and capillary loading capabilities.
- Necessitates standardization of lysate dilution and ligand titration protocols to maintain fluorescence within the optimal 400–1500 unit range.
- Requires optimization for different protein classes (e.g., membrane proteins may need detergent-containing buffers) and ligand solubility considerations.
- Limited by the need for detectable fluorescence changes upon binding; may require validation for ligands that induce minimal thermophoresis shifts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:43
Preparation of Cell Lysate
4:02
Microscale Thermophoresis Binding Studies
7:05
Microscale Thermophoresis Data Analysis
8:25
Results: Measuring the Affinity of Non-phosphorylated STAT3 Protein Binding to Oligonucleotides
9:40
Conclusion
3:20
Determination of Optimal Lysate Dilution
