Próbki testowe do optymalizacji mikroskopii superrozdzielczej STORM

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie sposobu uzyskiwania wysokiej jakości obrazów o superrozdzielczości STORM. W tym celu w pierwszej kolejności przygotowywana jest fluorescencyjnie znakowana próbka testowa. Drugim krokiem jest przygotowanie buforu przełączającego, a następnie wypełnienie nim komory obrazowania.

Następnie surowe dane są pozyskiwane przy użyciu mikroskopu STORM. Ostatnim krokiem jest rekonstrukcja obrazów o superrozdzielczości z surowych danych przy użyciu oprogramowania przetwarzającego RainStorm. Ostatecznie próbki testowe służą do pokazania sposobu pozyskiwania wysokiej jakości surowych danych, które można następnie przetworzyć w celu wygenerowania obrazów superrozdzielczości STORM w komórkach, o rozdzielczości od 30 do 50 nanometrów, co stanowi pięcio- do dziesięciokrotne zwiększenie rozdzielczości w porównaniu z tradycyjnymi technikami mikroskopii fluorescencyjnej, w tym TIRF i konfokalną.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ nie zdają sobie sprawy z wagi gromadzenia dużej liczby wysokiej jakości rzadkich połączeń. Proces ten jest znacznie ułatwiony dzięki zastosowaniu barwnika Alexa 647 w odpowiednim buforze przełączającym. Wizualna demonstracja tej techniki jest niezbędna, ponieważ pozyskanie wysokiej jakości danych surowych ma kluczowe znaczenie dla uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości SPR.

Surowe sekwencje wideo uzyskane tą techniką wyglądają zupełnie inaczej niż w jakiejkolwiek innej formie mikroskopii fluorescencyjnej. Aby rozpocząć procedurę powlekania szkła fluorescencyjną dekstryną, do każdej studni ośmiokomorowego szkiełka podstawowego należy nanieść 200 µL 0,01% roztworu polilizyny i inkubować przez 10 minut. Po 10 minutach usunąć roztwór polilizyny za pomocą pipety, aby upewnić się, że nie pozostała żadna ciecz.

0,25 µL roztworu stokowego dekstryny Alexa 647 o stężeniu 2 mg/mL dodano do 25 µL wody dejonizowanej, aby przygotować roztwór o stężeniu 20 µg/mL w celu stworzenia powłoki o wysokiej gęstości z roztworu dekstryny Alexa 647.

Przenieś 20 µL roztworu o stężeniu 20 µg/mL do łącznie 200 µL wody dejonizowanej. W celu przygotowania roztworu o średnim stężeniu rozcieńcz 2 µL w 200 µL wody dejonizowanej. W celu przygotowania roztworu o niskim stężeniu rozcieńcz 0,2 µL.

Do 200 µL wody dejonizowanej dodaj 200 µL rozcieńczonych roztworów dekstryny Alexis X 47 do każdego dołka i inkubuj przez 10 minut. Można zastosować dłuższy czas inkubacji, co może doprowadzić do uzyskania gęstszej powłoki dekstrynowej. Na koniec usuń roztwory Dexter Xis X 47 i przemyj wodą trzy razy.

Aby przygotować fluorescencyjne filamenty aktynowe na szkle, należy najpierw dodać 200 µL 0,01% roztworu polilizyny do każdej studni komory ośmiodzielnej. Przykryć szkło i inkubować przez 10 minut. Odessać ciecz za pomocą pipety, upewniając się, że nie pozostały żadne resztki płynu.

Do każdej komory dodaj 90 µL ogólnego buforu do aktyny, uprzednio przygotowanego zgodnie z instrukcją producenta. Następnie dodaj 10 µL 10 µM roztworu prefabrykowanych filamentów aktynowych oraz 1 µL foid i Alexa 6 47, a następnie delikatnie wymieszaj za pomocą pipety, zasysając i wypuszczając ciecz. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby przygotować fluorescencyjne kuleczki mikrosferowe jako markery powiernicze. Rozcieńcz 1 µL kuleczek tepec w 200 µL PBS i wymieszaj. Dodaj rozcieńczone kuleczki do komory obrazowania i odczekaj 15 minut.

Po 15 minutach usunąć roztwór i trzykrotnie przemyć PBS przed obrazowaniem. W tym doświadczeniu wykorzystuje się komórki hodowane do konfluencji na poziomie około 80%. Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć PBS. Następnie dodać 500 µL 4% roztworu formaldehydu na 10 minut.

Usunąć formaldehyd i wypłukać trzy razy PBS. Nie dopuszczać do wyschnięcia komórek i zawsze stosować roztwory buforowane PBS. Aby uniknąć stresu hipotonicznego, dodać 2 µL roztworu EGF Alexa 647 o stężeniu 50 µg/mL do 200 µL 0,1% roztworu BSA, a następnie dodać ten roztwór do komórek HeLa.

Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór i przemyć trzykrotnie buforem PBS. Dodać roztwór blokujący zawierający 0,1% BSA i pozostawić na 15 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie usunąć roztwór blokujący i przemyć próbkę jeszcze trzy razy PBS przed obrazowaniem. Bezpośrednio przed obrazowaniem przygotować bufor przełączający, mieszając roztwory stokowe enzymu, glukozy i czynnika redukującego w proporcjach 50 µL, 400 µL i 100 µL, a następnie dodać PBS do uzyskania objętości końcowej 1 mL. Usunąć PBS z komory obrazowania, a następnie wypełnić ją do pełna buforem przełączającym.

Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkę na górze komory, upewniając się, że nie ma w niej żadnych pęcherzyków powietrza i że cała komora jest przykryta. Jeśli zauważysz pęcherzyki, dolej dodatkowy bufor lub PBS. W przeciwnym razie wydajność buforu może spaść.

Gromadzenie wysokiej jakości, rzadkich danych wiążących jest niezbędne dla sukcesu tej procedury, dlatego należy upewnić się, że mikroskopy są właściwie ustawione, a zastosowano odpowiednie parametry akwizycji. Zlokalizuj fluorescencyjną strukturę, która ma zostać zobrazowana. Wybierz pożądany kąt oświetlenia.

W tym przypadku zaleca się zastosowanie obiektywu typu turf lub ustawienie pod dużym kątem nachylenia, ponieważ poprawia to stosunek sygnału do szumu poprzez minimalizację światła poza ogniskiem, co jest szczególnie korzystne w przypadku próbek komórkowych. Wykonaj obraz referencyjny struktury z ograniczoną liczbą klatek przed obrazowaniem STORM. Zwiększ moc lasera wzbudzającego do wysokiej wartości odpowiadającej około 2 kW/cm², obrazując przy ustawieniach kamery: czas ekspozycji 10 ms oraz czas cyklu około 50 Hz lub klatek na sekundę.

Gdy flora fours przejdą w tryb rzadkiego migotania, należy zebrać 10 000 klatek. Aby rozpocząć rekonstrukcję, otwórz plik RAINSTORM M w programie MATLAB i uruchom go w oknie rainstorm.

Wybierz plik obrazu do analizy, korzystając z przycisku przeglądaj. Plik ten powinien być w formacie TIF. Zmień szerokość piksela tak, aby odpowiadała surowym danym z systemu mikroskopowego użytego do pozyskania danych.

Pozostałe wartości pozostaw bez zmian. Kliknij przycisk przetwarzania obrazów i poczekaj, aż pojawi się obraz wstępny. Czas przetwarzania będzie zależał od rozmiaru pliku, specyfikacji komputera oraz liczby potencjalnych połączeń w surowych danych.

Aby wygenerować zaktualizowany obraz o wysokiej rozdzielczości (super resolution), należy nacisnąć przycisk „open reviewer”, po czym pojawi się drugie okno. Naciśnij przycisk „adjust contrast”, aby zmienić wyświetlanie obrazu zgodnie z potrzebami. W przypadkach, gdy obraz jest bardzo ciemny, należy zmniejszyć wartość maksymalną.

Użyj okna przeglądarki, aby wygenerować przydatne wskaźniki jakości obrazu i dalej udoskonalać obraz o super rozdzielczości. Pozostaw pierwsze trzy parametry kontroli jakości na wartościach domyślnych odpowiednio 5 000, 0,1 oraz od 0,8 do 3,5. Zaktualizuj wartość liczby zliczeń na foton.

Zmień wartość progu precyzji lokalizacji, aby zrównoważyć optymalizację średniej lokalizacji i precyzji względem liczby lokalizacji. W obrazie końcowym zaleca się wartości od 30 do 50 nanometrów, w zależności od jakości danych i próbki. Domyślny współczynnik skali rekonstrukcji wynosi pięć, co pozwoli na wygenerowanie pikseli superrozdzielczych o rozmiarze 32 nanometrów, przy założeniu, że piksel w obrazach oryginalnych ma 160 nanometrów.

Jeśli surowe obrazy mają rozmiar piksela wynoszący 100 nanometrów, pozwoli to na uzyskanie obrazów o superrozdzielczości z pikselami o rozmiarze 20 nanometrów. Zwiększ współczynnik skalowania, aby uzyskać mniejsze piksele w obrazach o superrozdzielczości. W końcowym obrazie naciśnij przycisk run reviewer, aby wygenerować zaktualizowany obraz o superrozdzielczości.

Naciśnij przycisk view histograms, aby wyświetlić parametry jakości obrazu. Na koniec naciśnij przycisk save image w podglądzie, aby zapisać wszystkie te dane. Rozpocznij tę procedurę od wygenerowania obrazu w ten sam sposób, co pokazano wcześniej.

Naciśnij przycisk śledzenia obszaru (box tracking) w podglądzie, a następnie kliknij i przeciągnij ramkę nad marker fiducjalny na analizowanym obrazie. Odczekaj, aż pojawi się nowy obraz z zaznaczonymi pozycjami w ramkach. Jeśli obiektem zainteresowania jest marker fiducjalny, można zapisać ten obraz.

Podobnie jak w tym przypadku, należy przeprowadzić korekcję dryfu, klikając przycisk ustawienia punktu zakotwiczenia (set anchor), a następnie przycisk odejmowania dryfu (subtract drift). Na koniec należy ponownie kliknąć przycisk uruchomienia przeglądarki (run reviewer), aby wygenerować nowy obraz STORM. Prawidłowe pokrycie dekstryną powinno przynieść fluorescencyjną monowarstwę; typowe dane dla dekstryny przedstawiono na tej rycinie.

Obrazy o rozdzielczości ograniczonej dyfrakcją przedstawiają różne stężenia dekstryny przed obrazowaniem STORM. Rekonstrukcje w superrozdzielczości mają rozmiar piksela wynoszący 25 nanometrów. Zebrano 10 000 obrazów o rozmiarze klatki 128 na 128 pikseli, a poszczególne klatki z tej sekwencji zostały przedstawione poniżej.

Przy wysokim stężeniu dekstryny fluorescencyjna monowarstwa powinna wydawać się stosunkowo jednolita, co przedstawiono na tych obrazach oraz w tym fragmencie wideo. Przy niższych stężeniach błyski będą rzadsze i bardziej wyraźne.

Przy braku wyraźnego tła podczas tej fazy akwizycji obrazu przy stałym naświetlaniu laserem, liczba błysków będzie maleć w czasie, co zilustrowano poprzez porównanie klatki 2000 i klatki 8 000 w próbce o wysokiej gęstości. Główną różnicą między obrazami o superrozdzielczości dla wysokich, średnich i niskich stężeń dekstryny jest malejąca liczba lokalizacji. Wykres ten przedstawia średnią z trzech sekwencji po 10 000 klatek dla każdego stężenia dekstryny, gdzie słupki błędów wskazują odchylenie standardowe.

Niemniej jednak ta proporcjonalna zależność między stężeniem cząsteczek fluorescencyjnych, liczbą błysków w surowych danych a liczbą lokalizacji nie jest prostą zależnością liniową, co zilustrowano na tym wykresie liczby zaakceptowanych lokalizacji na klatkę. Przy zastosowaniu średniej kroczącej z 100 klatek i bardzo wysokiej gęstości cząsteczek, oprogramowanie nie jest w stanie skutecznie lokalizować cząsteczek podczas obrazowania jakiejkolwiek próbki. Powszechnym problemem może być obecność jasnej, ale niewyraźnej mgiełki fluorescencyjnej na całym obrazie, spowodowanej dyfuzją fluoroforu przez ośrodek.

Można zapobiegać obecności tych odseparowanych cząsteczek fluorescencyjnych lub je usuwać poprzez zwiększenie liczby etapów płukania roztworem PBS przed dodaniem buforu przełączającego lub poprzez dodanie świeżego buforu przełączającego do komory; przetwarzanie i porównywanie danych z każdej sekwencji obrazów prowadzi do uzyskania bardzo różnych obrazów o superrozdzielczości. Panele C i D przedstawiają konstrukcje obrazów o superrozdzielczości odpowiadające danym zgromadzonym odpowiednio w panelach A i B. Wykres ten przedstawia liczbę zaakceptowanych lokalizacji na klatkę przy użyciu ruchomej średniej z 100 klatek.

Czerwona linia odpowiada sekwencjom storm A i C, w których występuje wysokie tło, natomiast niebieska linia odpowiada sekwencjom B i D, w których tło jest niskie. Zaakceptowana liczba lokalizacji dla obrazów odpowiadających danym z wysokim i niskim tłem została przedstawiona na drugim wykresie. Te trzy obrazy ograniczone dyfrakcyjnie pokazują typowe dane dla wstępnie utworzonych filamentów aktyny przytwierdzonych do powierzchni szkła przed dodaniem buforu przełączającego i obrazowaniem storm.

Można zaobserwować włókna o zmiennej długości. Bardzo jasne włókna to często kilka splątanych ze sobą włókien. Wybieranie pojedynczych, stosunkowo jasnych włókien zamiast obszarów splątanych pozwala uzyskać obrazy lepszej jakości podczas fazy akwizycji.

Wzdłuż długości filamentu powinny być widoczne jasne, punktowe błyski. Rzadkie błyski powinny być widoczne podczas fazy akwizycji, a następnie w przetworzonych danych. Powinien być widoczny cienki, ciągły filament, a liczba lokalizacji w klatce powinna wykazywać stopniowy spadek.

Zazwyczaj szerokość połówkowa maksymalnej wartości (FWHM) filamentu jest podawana jako empiryczna ocena rozdzielczości, uzyskana poprzez wykreślenie linii prostej przez powiększony obszar filamentu aktynowego przy użyciu funkcji profilu wykresu w programie ImageJ, a następnie wykonanie dopasowania gaussowskiego. Wartość FWHM wynosi 43,2 nanometrów. Problem błędnej lokalizacji może wystąpić w sytuacjach, gdy szereg filamentów aktynowych rozgałęzia się lub przecina, co analizuje się poprzez przetwarzanie podzbiorów klatek i porównywanie pierwszych oraz ostatnich 5 000 klatek.

Zastosowanie pierwszych 5 000 klatek do uzyskania obrazu o superrozdzielczości pozwala otrzymać inny obraz. W środkowej części obrazu widocznych jest wiele lokalizacji. Jednak przy wykorzystaniu ostatnich 5 000 klatek tylko nieliczne lokalizacje są widoczne i pozostają jedynie filamenty, choć w pewnym stopniu nieciągłe ze względu na niską liczbę lokalizacji na obrazie.

Jeśli podejrzewa się zbyt wysoką gęstość migotania, porównanie obrazów z danymi dotyczącymi lokalizacji w każdej klatce może silnie sugerować, że problem ten występuje podczas pierwszej serii klatek. Średnia liczba lokalizacji na klatkę wynosi wówczas ponad 10, w porównaniu z ostatnią serią klatek, gdzie wynosi ona około czterech. Innym potencjalnym problemem w mikroskopii STORM jest dryft, który występuje, gdy próbka przesuwa się względem obiektywu podczas fazy akwizycji danych; choć dryft jest bardzo trudny do wykrycia w trakcie pozyskiwania obrazów, można go zidentyfikować na obrazach superrozdzielczych znanych struktur, takich jak filamenty aktynowe.

Pierwszą oznaką, że mógł wystąpić dryft boczny, jest fakt, że struktura jest większa niż oczekiwano. Na przykład, gdy szerokość połówkowa (FWHM) jest stosunkowo duża w porównaniu z danymi granicy precyzji z rainstorm, w tym przypadku 90 nanometrów w porównaniu z 67 nanometrami. Lepszym sposobem na wykrycie dryftu jest porównanie lokalizacji w funkcji czasu, czyli sprawdzenie, czy lokalizacje w późniejszych klatkach są przesunięte w stosunku do tych w klatkach wczesnych.

Można to wyraźnie zaobserwować w przypadku filamentów aktynowych przy zastosowaniu kodowania kolorystycznego. Dzięki funkcji śledzenia obszarów (box tracking) w programie rainstorm, jak pokazano na panelach B i C, lokalizacje są wyświetlane w kolorze odpowiadającym numerowi klatki, w której zostały zarejestrowane. Przykładowo, lokalizacje z początku sekwencji akwizycji są koloru niebieskiego, natomiast lokalizacje z końcowego etapu sekwencji akwizycji są koloru czerwonego.

Przesunięte kolory wskazują, że wystąpił dryf, który należy zmierzyć i skorygować. W celu pomiaru dryfu jako markerów referencyjnych można zastosować kuleczki fluorescencyjne o średnicy 100 nanometrów; numery od jeden do cztery pokazują przycięte i powiększone pojedyncze kuleczki. W przykładzie, w którym wystąpił stosunkowo silny dryf wynoszący około 100 nanometrów w ciągu trzech minut i 10 sekund fazy akwizycji, tę samą funkcję śledzenia ramki można wykorzystać do oznaczenia kolorami i potwierdzenia wystąpienia dryfu. Ponieważ wszystkie cztery kuleczki w tym przykładzie wykazują niemal identyczny dryf, można wybrać jedną z nich – w tym przypadku kuleczkę nr 2 – jako punkt odniesienia i odjąć wartość dryfu od pozostałych kuleczek.

Porównanie z panelem E pokazuje, że dryft boczny został skorygowany. Wreszcie, komórki HeLa barwione na obecność czynnika wzrostu naskórka mogą posłużyć jako realistyczny przykład rozdzielczości obrazu. W przypadku komórek, panel A przedstawia obraz części komórki HeLa ograniczony dyfrakcyjnie, z ogniskowaniem na podstawnej powierzchni komórki, gdzie żółte ramki wskazują powiększone obszary zainteresowania pokazane w panelach B i C, w przeciwieństwie do niewyraźnych powiększonych obszarów zainteresowania w obrazie ograniczonym dyfrakcyjnie.

Obrazy o superrozdzielczości powinny przedstawiać mieszaninę klastrów i sporadycznie występujących pojedynczych, izolowanych pikseli. Klastry będą miały średnicę około 100 nanometrów i prawdopodobnie odpowiadają tworzącym się wgłębieniom oraz pęcherzykom. Ścieżka, którą EGF jest głównie wyciszane i endocytozowane, a także dane dotyczące lokalizacji na klatkę z Panelu D, przedstawiono na wykresie G. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować proste próbki testowe, pozyskać dane i zrekonstruować wysokiej jakości obrazy o superrozdzielczości STORM.

Metody te pomogą uniknąć niektórych powszechnych problemów z dopasowaniem, takich jak dryft, oraz pomogą zoptymalizować proces STORM. Zobacz eksperymenty dotyczące rozdzielczości.