Próbki testowe do optymalizacji mikroskopii superrozdzielczej STORM

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, jak uzyskać wysokiej jakości obrazy burzy w super rozdzielczości. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie znakowanej fluorescencyjnie próbki testowej. Drugim krokiem jest przygotowanie bufora przełączającego, a następnie napełnienie komory obrazowania buforem.

Następnie surowe dane są pozyskiwane na mikroskopie burzowym. Ostatnim krokiem jest rekonstrukcja obrazów w super rozdzielczości z surowych danych za pomocą oprogramowania do przetwarzania burzy deszczowej. Ostatecznie próbki testowe są wykorzystywane do pokazania, jak pozyskiwać wysokiej jakości surowe dane, które można następnie przetworzyć w celu wygenerowania obrazów o super rozdzielczości burzowej w komórkach o rozdzielczości od 30 do 50 nanometrów, co stanowi od pięciu do dziesięciu razy większą rozdzielczość w porównaniu z tradycyjnymi technikami mikroskopii fluorescencyjnej, w tym murawy i konfokalu.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy, ponieważ nie zdają sobie sprawy z tego, jak ważne jest zbieranie wielu wysokiej jakości rzadkich linków. Jest to znacznie łatwiejsze dzięki zastosowaniu barwnika Alexa 6 4 7 w odpowiednim buforze przełączającym. Wizualna demonstracja tej techniki jest niezbędna, ponieważ pozyskiwanie wysokiej jakości surowych danych ma kluczowe znaczenie w tworzeniu obrazów w rozdzielczości SPR.

Surowe sekwencje wideo tej techniki wyglądają zupełnie inaczej niż każda inna forma mikroskopii fluorescencyjnej. Aby rozpocząć procedurę powlekania szkła dekstryną fluorescencyjną w 200 mikrolitrach 0,01% roztworu polilizyny do każdej studzienki ośmiokomorowego szkła nakrywkowego i inkubować przez 10 minut. Po 10 minutach usuń roztwór polilizyny pipetą, aby upewnić się, że żaden płyn nie pozostał rozcieńczony.

0,25 mikrolitra dwóch miligramów na mililitr roztworu podstawowego dekstryny. Alexa 6 47 w 25 mikrolitrach wody dejonizowanej, aby utworzyć roztwór o stężeniu 20 mikrogramów na mililitr, aby stworzyć powłokę dekstryny o dużej gęstości. Rozwiązanie Alexa 6 47.

Rozcieńczyć 20 mikrolitrów roztworu o stężeniu 20 mikrogramów na mililitr w sumie 200 mikrolitrów wody dejonizowanej. Aby uzyskać roztwór o średniej gęstości, rozcieńczyć dwa mikrolitry w 200 mikrolitrach wody dejonizowanej. Aby uzyskać roztwór o małej gęstości, rozcieńczyć 0,2 mikrolitra.

W 200 mikrolitrach wody dejonizowanej dodaj 200 mikrolitrów rozcieńczonych roztworów dekstryny Alexis X 47 do każdej studzienki i inkubuj przez 10 minut. Można stosować dłuższe czasy inkubacji, co może skutkować gęstszą powłoką dekstryny. Na koniec usuń roztwory Dexter Xis X 47 i trzykrotnie umyj wodą.

Aby przygotować fluorescencyjne włókna aktynowe na szkle, najpierw dodaj 200 mikrolitrów 0,01% roztworu polilizyny do każdej studzienki ośmiokomorowej. Przykryj szklankę i inkubuj przez 10 minut. Usuń pipetą, aby upewnić się, że nie pozostał żaden płyn.

Do każdej komory dodać 90 mikrolitrów ogólnego buforu aktynowego uprzednio rozpuszczonego zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 10 mikromolowych wstępnie uformowanych roztworów filamentu aktynowego i jeden mikrolitr foid i Alexa 6 47 i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać, inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby przygotować mikrosferyczne kulki fluorescencyjne jako markery odniesienia do rozcieńczenia jednego mikrolitra kulek tepec do 200 mikrolitrów PBS i wymieszać. Dodaj rozcieńczone kulki do komory obrazowania i odczekaj 15 minut.

Po 15 minutach usuń roztwór i przemyj trzykrotnie PBS przed obrazowaniem w tym eksperymencie wykorzystuje się komórki hodowane do około 80% płynności CO. Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć PBS. Następnie dodaj 500 mikrolitrów 4% roztworu formaldehydu na 10 minut.

Usuń formaldehyd i umyj trzykrotnie PBS. Nie pozwól, aby komórki pozostały suche i zawsze używaj roztworów buforowanych PBS. Aby uniknąć stresu hipotonicznego, dodaj dwa mikrolitry 50 mikrogramów na mililitr roztworu podstawowego EGF Alexa, 6 47 do 200 mikrolitrów 0,1% roztworu BSA, a następnie dodaj ten roztwór do komórek hela.

Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór i przemyć trzykrotnie PBS. Dodaj roztwór blokujący 0,1% BSA i pozostaw na 15 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń roztwór blokujący i przemyj kolejne trzy razy PBS przed obrazowaniem. Tuż przed obrazowaniem należy przygotować bufor przełączający, mieszając razem roztwory podstawowe enzymu glukozy i środka redukującego W proporcji 50 mikrolitrów, 400 mikrolitrów i 100 mikrolitrów dodać PBS, aby uzupełnić końcową objętość do jednego mililitra. Wyjmij PBS z komory obrazowania, a następnie napełnij do góry buforem przełączającym.

Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na górze komory, upewniając się, że w ogóle nie ma pęcherzyków powietrza, a cała komora jest zakryta. Jeśli widoczne są bąbelki, uzupełnij dodatkowym buforem lub PBS. W przeciwnym razie wydajność bufora może się pogorszyć.

Gromadzenie wysokiej jakości, rzadkich danych łączących ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia tej procedury, dlatego należy upewnić się, że mikroskopy są odpowiednio ustawione i używane są właściwe ustawienia akwizycji. Zlokalizuj interesującą nas strukturę fluorescencyjną, która ma zostać zobrazowana. Wybierz żądany kąt oświetlenia.

W takim przypadku zalecany jest kąt murawy lub dużego nachylenia, ponieważ poprawia to stosunek sygnału do szumu poprzez zminimalizowanie nieostrego światła, co jest szczególnie korzystne w przypadku próbek komórek. Odnieś się do ograniczonego ułamkowo obrazu struktury przed obrazowaniem burzy. Zwiększ laser wzbudzający do dużej mocy odpowiadającej około dwóm kilowatom na centymetr kwadratowy podczas obrazowania z ustawieniami kamery 10 milisekund ekspozycji i czasem cyklu około 50 Hz lub klatek na sekundę.

Gdy czwórki flory zmienią się w rzadki wzór, zbierz 10 000 klatek. Aby rozpocząć tę odbudowę. Otwórz plik RAINSTORM M z poziomu programu MATLAB i uruchom go w oknie burzy deszczowej.

Wybierz plik obrazu do analizy za pomocą przycisku przeglądania. Powinien to być plik TIF. Zmień szerokość piksela, aby dopasować ją do nieprzetworzonych danych systemu mikroskopowego użytego do uzyskania danych.

Pozostaw inne wartości domyślne. Naciśnij przycisk przetwarzania obrazów i poczekaj, aż pojawi się wstępny obraz. Czas trwania przetwarzania będzie zależał od rozmiaru pliku, specyfikacji komputera i liczby potencjalnych linków w surowych danych.

Aby wygenerować zaktualizowany obraz w super rozdzielczości, naciśnij przycisk otwierania recenzenta, a pojawi się drugie okno. Naciśnij przycisk regulacji kontrastu, aby zmienić sposób wyświetlania obrazu zgodnie z potrzebami. W niektórych przypadkach, gdy obraz jest bardzo ciemny, wartość maksymalna powinna zostać zmniejszona.

Użyj okna recenzenta, aby wygenerować przydatne wskaźniki jakości obrazu i jeszcze bardziej udoskonalić obraz w super rozdzielczości. Pozostaw pierwsze trzy parametry kontroli jakości na wartości domyślne wynoszące odpowiednio 5 000, 0,1 i 0,8 do 3,5. Zaktualizuj liczbę liczb na foton.

Zmień granicę precyzji lokalizacji, aby dokonać kompromisu między optymalizacją średniej lokalizacji, precyzją względem liczby lokalizacji. W przypadku obrazu końcowego zalecane są wartości od 30 do 50 nanometrów w zależności od jakości danych i próbki. Domyślny współczynnik skali rekonstrukcji wynosi pięć, co spowoduje wygenerowanie pikseli o wysokiej rozdzielczości 32 nanometrów, przy założeniu, że piksel w oryginalnych obrazach ma 160 nanometrów.

Jeśli surowe obrazy mają rozmiar piksela 100 nanometrów, spowoduje to uzyskanie obrazów o super rozdzielczości z pikselami 20 nanometrów. Zwiększ współczynnik skali, aby uzyskać mniejsze piksele o wysokiej rozdzielczości. Na ostatnim obrazie naciśnij przycisk uruchamiania recenzenta, aby wygenerować zaktualizowany obraz w super rozdzielczości.

Naciśnij przycisk wyświetl histogramy, aby wyświetlić metryki jakości obrazu. Na koniec naciśnij przycisk zapisywania obrazu w recenzencie, aby zapisać wszystkie te dane. Rozpocznij tę procedurę od wygenerowania obrazu w taki sam sposób, jak pokazano wcześniej.

Naciśnij przycisk śledzenia pola w recenzencie, a następnie kliknij i przeciągnij pole na znacznik odniesienia na recenzowanym obrazie. Poczekaj, aż pojawi się nowy obraz, który wyświetli pozycje w ramkach. Zapisz ten obraz w razie potrzeby, jeśli interesujący go obiekt jest znacznikiem odniesienia.

Tak jak w tym przypadku, wykonaj korekcję dryfu, klikając przycisk ustaw kotwicę, a następnie przycisk odejmij dryf. Na koniec ponownie kliknij przycisk uruchom recenzenta, aby wygenerować nowy obraz burzy. Udane powlekanie dekstryną powinno wytworzyć monowarstwę fluorescencyjną, a typowe dane dekstryny przedstawiono na tym rysunku.

Obrazy o ograniczonej dyfrakcji pokazują różne stężenia dekstryny przed obrazowaniem burzy. Rekonstrukcje w super rozdzielczości mają rozmiar piksela 25 nanometrów. Zebrano 10 000 obrazów o rozmiarze klatki 1 28 na 1 28 pikseli, a poszczególne klatki są wyświetlane z tej sekwencji.

Przy wysokim stężeniu dekstryny. Monowarstwa fluorescencyjna powinna wydawać się względnie jednolita, jak pokazano na tych zdjęciach i w tym segmencie wideo. Przy niższych stężeniach mrugnięcia będą wydawać się rzadsze i ostre.

Przy braku wyraźnego tła podczas tej fazy akwizycji obrazu przy stałym oświetleniu laserowym, liczba mrugnięć będzie się zmniejszać z czasem, jak pokazano w porównaniu między klatką 2000 a klatką 8 000 w próbce o wysokiej gęstości. Główną różnicą między obrazami o super rozdzielczości wysokiego, średniego i niskiego stężenia dekstryny jest zmniejszająca się liczba lokalizacji. Ten wykres przedstawia średnią z trzech sekwencji klatek po 10 000 dla każdego stężenia dekstryny, gdzie słupki błędów wskazują odchylenie standardowe.

Jednak ta proporcjonalna zależność między stężeniem cząsteczek fluorescencyjnych, liczbą mrugnięć w surowych danych a liczbą lokalizacji nie jest prosta liniowa, jak pokazano na tym wykresie liczby akceptowanych lokalizacji na klatkę. Korzystając ze średniej kroczącej 100 klatek przy bardzo dużej gęstości cząsteczek, oprogramowanie nie jest w stanie skutecznie zlokalizować cząsteczek podczas obrazowania dowolnej próbki. Częstym problemem może być obecność jasnej, ale nieostrej mgły fluorescencyjnej na obrazie spowodowanej siłą fluorescencyjną rozpraszającą się przez medium.

Tym oderwanym cząsteczkom fluorescencyjnym można zapobiec lub je usunąć, zwiększając liczbę etapów płukania za pomocą PBS przed dodaniem bufora przełączającego lub dodając nowy bufor przełączający do przetwarzania w komorze i porównując dane z każdej sekwencji obrazu, co daje bardzo różne obrazy o super rozdzielczości. Panele C i D są konstrukcjami zobrazowań o wysokiej rozdzielczości, odpowiadającymi danym zebranym odpowiednio w panelach A i B. Ten wykres przedstawia liczbę zaakceptowanych lokalizacji na klatkę przy użyciu średniej kroczącej 100 klatek.

Czerwona linia odpowiada sekwencji burzowej A i C, gdzie występuje wysokie tło, niebieska linia odpowiada B i D, gdzie tło jest niskie. Akceptowany numer lokalizacji dla obrazów odpowiadających danym o wysokim i niskim tle jest pokazany na drugim wykresie. Te trzy obrazy o ograniczonej dyfrakcji pokazują typowe dane wstępnie uformowanych włókien aktynowych przyklejonych do powierzchni szkła przed dodaniem bufora przełączającego i obrazowania burzy.

Widoczne są różne długości włókien. Bardzo jasne włókna to często kilka splątanych ze sobą włókien. Wybór pojedynczych, stosunkowo jasnych włókien, a nie splątanych obszarów, skutkuje lepszą jakością obrazów w fazie akwizycji.

Jasne ostre mrugnięcia powinny być widoczne wzdłuż długości żarnika. Rzadkie mruganie powinno być widoczne w fazie akwizycji, a następnie w danych procesowych. W lokalizacjach na klatkę powinien znajdować się cienki ciągły filament, który powinien wykazywać stopniowy spadek.

Zazwyczaj pełne z połową maksimum lub FWHM filamentu jest podawane jako empiryczne oszacowanie rozdzielczości poprzez narysowanie linii prostej przez powiększony obszar filamentu aktynowego za pomocą funkcji profilu wykresu na obrazie J, a następnie wykonanie dopasowania Gaussa. FWHM oblicza się jako 43,2 nanometra. Problem z lokalizacją mis może wystąpić, gdy pewna liczba filamentów aktynowych rozgałęzia się i/lub krzyżuje ze sobą, przetwarzając podzbiory ramek i porównując pierwsze i ostatnie 5 000 ramek.

Inny obraz jest tworzony w obrazie o wysokiej rozdzielczości przy użyciu pierwszych 5 000 klatek. W środku obrazu widocznych jest wiele lokalizacji. Jednak w przypadku korzystania z ostatnich 5 000 klatek, bardzo niewiele z tych lokalizacji jest widocznych i tylko włókna są pozostawione, choć nieco tak samo ciągłe ze względu na małą liczbę lokalizacji na obrazie.

Jeśli podejrzewa się zbyt dużą gęstość mrugania, porównanie obrazów z danymi dotyczącymi lokalizacji na klatkę może zdecydowanie sugerować, że ten problem występuje podczas pierwszego zestawu klatek. Średnia liczba lokalizacji na klatkę wynosi ponad 10 w porównaniu z ostatnim zestawem klatek, w którym wynosi ona około czterech. Innym potencjalnym problemem w mikroskopii burzowej jest dryf, który występuje, gdy próbka porusza się w stosunku do soczewki obiektywu W fazie akwizycji danych, chociaż bardzo trudna do wykrycia w fazie akwizycji obrazu, dryf można wykryć na obrazach o super rozdzielczości znanych struktur, takich jak filamenty aktynowe.

Pierwszą oznaką, że mógł wystąpić dryf boczny, jest to, że struktura jest większa niż oczekiwano. Na przykład ze stosunkowo dużym pełnym z połową maksimum w porównaniu z precyzyjnymi danymi granicznymi z ulewy, w tym przypadku 90 nanometrów w porównaniu z 67 nanometrami. Lepszym sposobem wykrywania dryfu jest porównanie lokalizacji w funkcji czasu IE, sprawdzenie, czy lokalizacje w późniejszych klatkach są przesunięte w porównaniu z tymi we wczesnych klatkach.

Widać to wyraźnie w przypadku filamentów aktynowych, gdy są one wyświetlane z kodem kolorystycznym. Korzystając z funkcji śledzenia pudełek podczas burzy deszczowej, jak pokazano na panelach, lokalizacje B i c są wyświetlane w kolorze odpowiadającym numerowi klatki, w którym zostały pobrane. Na przykład lokalizacje z początku sekwencji pozyskiwania są niebieskie, a lokalizacje z późnej sekwencji pozyskiwania są czerwone.

Przemieszczone kolory wskazują, że wystąpił dryf w celu zmierzenia i skorygowania. W przypadku dryfu koraliki fluorescencyjne o średnicy 100 nanometrów mogą być używane jako znaczniki odniesienia od jednego do czterech, pokazują indywidualnie przycięte i powiększone koraliki. W przykładzie, w którym występuje stosunkowo poważny dryft około 100 nanometrów w ciągu trzech minut, 10 sekund podczas fazy akwizycji, ta sama funkcja śledzenia pola może być użyta do oznaczenia kolorami i potwierdzenia, że dryft wystąpił, ponieważ wszystkie cztery koraliki w tym przykładzie pokazano prawie identyczny dryf, możliwe jest wybranie jednego z nich, w tym przypadku koralika dwa, aby użyć go jako odniesienia i odjąć dryf z innych koralików.

Porównanie z panelem E pokazuje, że dryft boczny został skorygowany. Wreszcie, komórki heela barwione naskórkowym czynnikiem wzrostu można wykorzystać, aby uzyskać realistyczny przykład rozdzielczości obrazu. W komórkach panel A pokazuje ograniczony dyfrakcją obraz części komórki hela skupiony na powierzchni komórki podstawnej, gdzie żółte pola wskazują powiększone obszary zainteresowania pokazane na panelach B i C, w przeciwieństwie do niewyraźnych powiększonych obszarów zainteresowania na obrazie z ograniczoną dyfrakcją.

Obrazy w super rozdzielczości powinny pokazywać mieszaninę klastrów, czasami izolowanych pojedynczych pikseli. Klastry będą miały średnicę około 100 nanometrów i prawdopodobnie będą odpowiadać tworzącym się wgłębieniom i pęcherzykom. Ścieżka, za pomocą której EGF jest głównie regulowany w dół i endocytozowany lokalizacje na klatkę dane z Panelu D przedstawiono na wykresie G. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać kilka prostych próbek testowych, pozyskać dane i zrekonstruować wysokiej jakości burzę, zobacz obrazy w rozdzielczości.

Te metody pomogą uniknąć niektórych typowych pułapek, takich jak dryf, i pomogą zoptymalizować burzę. Zobacz eksperymenty dotyczące rozdzielczości.