Name: Próbki testowe do optymalizacji mikroskopii superrozdzielczej STORM (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 52 s
Description: Naucz się przygotowywać fluorescencyjne próbki testowe do optymalizacji mikroskopii STORM. Poznaj metody akwizycji danych i rekonstrukcji obrazów superrozdzielczych z rozdzielczością 30-50 nm.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Potwierdzamy finansowanie z programu Metrologii Chemicznej i Biologicznej brytyjskiego Narodowego Urzędu Miar. Dziękujemy Sebastianowi van de Linde, Miklosowi Erdelyi i Ericowi Reesowi za porady i sugestie techniczne. Dziękujemy Miklosowi Erdelyi, Ericowi Reesowi i Maxowi Ryadnovowi za pomocne komentarze i dyskusje na temat tego manuskryptu.

Uwaga: W całym tym protokole, wskazówki i sugestie znajdują się po wykonaniu pewnych kroków. Notacja "*1" wskazuje, że uwaga 1 jest istotna dla tego konkretnego kroku i tak dalej.
1. Fluorescencyjna powłoka dekstranowa szkła
<ol>
	<li>Dodać 200 μl 0,01% roztworu poli-L-lizyny do każdego dołka 8-komorowego szkła nakrywkowego i inkubować przez 10 minut. Usunąć pipetą, aby upewnić się, że nie pozostał płyn.</li>
	<li>Rozpuść dextran-Alexa 647*1 zgodnie z instrukcjami producenta, aby utworzyć roztwór podstawowy o stężeniu 2 mg/ml. Na tej podstawie rozcieńczyć 0,25 μl w 25 μl wody dejonizowanej, aby uzyskać roztwór o stężeniu 20 μg/ml.</li>
	<li>Aby utworzyć powłokę o dużej gęstości z roztworu dextran-Alexa 647, rozcieńczyć 20 μl roztworu 20 μg/ml w sumie 200 μl wody dejonizowanej. W przypadku roztworu o średniej gęstości rozcieńczyć 2 μl w 200 μl wody dejonizowanej (rozcieńczenie 1:10 000 od oryginalnego roztworu podstawowego). W przypadku roztworu o małej gęstości rozcieńczyć 0,2 μl w 200 μl wody dejonizowanej (rozcieńczenie 1:100 000 od oryginalnego roztworu podstawowego).</li>
	<li>Dodać 200 μl rozcieńczonych roztworów dekstranu-Alexa 647 do każdego dołka i inkubować przez 10 minut. Można zastosować dłuższy czas inkubacji, co może skutkować gęstszą powłoką dekstranu. Wyjmij i umyj trzykrotnieH2O*2</li>
</ol>
Uwaga 1: Można używać innych koniugatów dektran-barwnik. Niesprzężony dekstran może być również sprzężony z barwnikami, jeśli pożądane kombinacje nie są dostępne na rynku.
Uwaga 2: Te same komory dekstranowe mogą być ponownie zobrazowane w ciągu kilku tygodni, chociaż jednorodność fluorescencji może się zmniejszyć. Zaleca się przechowywanie w temperaturze 4 °C przy braku bufora.
2. Fluorescencyjne filamenty aktynowe na szkle
<ol>
	<li>Dodać 200 μl 0,01% roztworu poli-L-lizyny do każdego dołka komory i inkubować przez 10 minut*3. Usuń pipetą, aby upewnić się, że nie pozostał żaden płyn.</li>
	<li>Do każdej komory dodać 90 μl ogólnego buforu aktynowego (rozpuszczonego zgodnie z instrukcjami producenta). Dodać 10 μl 10 μM wstępnie uformowanego roztworu filamentu aktynowego i 1 μl falloidyny-Alexa 647 (0,2 jednostki, po rozpuszczeniu w 1,5 ml metanolu zgodnie z instrukcjami producenta) i delikatnie pipetować w górę iw dół, aby wymieszać. Inkubować przez 30 minut*4.</li>
</ol>
Uwaga 3: Zwiększenie objętości roztworu filamentu w komorze powoduje zmniejszenie liczby włókien wiążących się ze szkłem pokrytym poli-L-lizyną.
Uwaga 4: Czas inkubacji do 48 godzin w temperaturze 4 °C został przetestowany z dobrymi wynikami. Jakość obrazu filamentu aktynowego pogarsza się, gdy komora została wystawiona na działanie bufora przełączającego, dlatego nie zaleca się używania tej samej próbki dłużej niż jeden dzień.
3. Mikrosferyczne koraliki fluorescencyjne jako znaczniki referencyjne
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 1 μl kulek TetraSpeck w 200 μl PBS i wymieszać.</li>
	<li>Dodaj rozcieńczone kulki do komory obrazowania i odczekaj 15 minut*5. Usunąć roztwór i przemyć 3 razy PBS przed obrazowaniem.</li>
</ol>
Uwaga 5 - czas rozcieńczania i inkubacji można dostosować do różnych gęstości koralików. Protokół ten zwykle daje od 3 do 10 kulek na pole widzenia 20,5 μm x 20,5 μm.
4. Barwienie komórek naskórkowego czynnika wzrostu
<ol>
	<li>Hodowla komórek HeLa w komorach obrazowania do około 80% zbiegu w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem penicyliny i streptomycyny.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć PBS. Następnie dodać 500 μl 4% roztworu formaldehydu (4 ml 10% roztworu formaldehydu, 1 ml 10X PBS, 5 ml wody) przez 10 min. Usuń formaldehyd i przemyj 3 razy PBS. Nie pozwól, aby komórki pozostały suche i zawsze używaj roztworów buforowanych PBS, aby uniknąć stresu hipotonicznego.</li>
</ol>
UWAGA - formaldehyd jest niezwykle toksyczny. Upewnij się, że noszone są odpowiednie rękawice, okulary ochronne i fartuchy laboratoryjne. Zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi usuwania formaldehydu.
<ol start="3">
	<li>Rozpuść EGF-Alexa 647 zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 μg/ml. Dodać 2 μl tego roztworu podstawowego do 200 μl 0,1% roztworu BSA (w PBS). Usunąć PBS z komórek, dodać roztwór EGF i inkubować przez 30 minut.</li>
	<li>Usunąć roztwór i przemyć 3 razy PBS przed dodaniem roztworu blokującego 0,1% BSA (w PBS) przez 15 minut. Usunąć go i przemyć kolejne 3 razy PBS przed obrazowaniem.</li>
</ol>
5. Przygotowanie bufora przełączającego
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy enzymu (A) z 10 μl katalazy (20 μg/ml), 20 μl 1 M chlorowodorku fosfiny Tris (2-karboksyeltylu) (4 mM), 2,5 ml gliceryny (50%), 125 μl 1 M KCl (25 mM), 100 μl 1 M pH 7,5 Tris-HCl (20 mM), 5 mg oksydazy glukozowej (1 mg / ml) i uzupełnić do 5 ml objętości diH20. Jest to wystarczające do wytworzenia 100 x 50 μl podwielokrotności, które mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C i używane przez okres do 1 roku.</li>
	<li>) Przygotować podstawowy roztwór glukozy (B) z 4 g glukozy (100 mg/ml), 4 ml gliceryny (10%) i 36 ml diH20. Jest to wystarczające do wytworzenia 100 x 400 μl podwielokrotności, które mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C i używane przez okres do 1 roku.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy środka redukującego (C) ze 113,6 mg MEA-HCl (1M) i 1 ml diH20. Użyć świeżych lub przygotować 10 porcji po 100 μl, które można przechowywać w temperaturze -20 °C i używać przez okres do 1 miesiąca (nie zamrażać ponownie porcji).</li>
	<li>Tuż przed obrazowaniem należy zmieszać roztwory podstawowe enzymu (A), glukozy (B) i środka redukującego (C) w proporcjach 50 μl, 400 μl, 100 μl i uzupełnić do 1 ml PBS*6. Ten bufor będzie teraz pochłaniał tlen i będzie miał środowisko redukujące (100 mM MEA-HCl)*7. Końcowe pH powinno mieścić się w zakresie 6,0 - 8,5 (regulacja zwykle nie jest konieczna)*8.</li>
</ol>
Uwaga 6 - ten bufor jest odpowiedni do stosowania z barwnikami na bazie karbocyjaniny, takimi jak Cy5 i Alexa 647.
Uwaga 7 - końcowe stężenia enzymów wynoszą 50 μg/ml (5 jednostek/ml) oksydazy glukozowej i 1 μg/ml (40-60 jednostek/ml) katalazy. Aktywność enzymatyczna (jednostki) jest podawana przez dostawców i może się różnić. Obliczenia dla katalazy zakładają, że 1 μg/ml stężenia końcowego po kroku 5.4 będzie zawierało 50 jednostek enzymu. Różne kompozycje, w tym podobne składniki pochłaniające tlen, można znaleźć 21,30,40. Podsumowanie kombinacji i barwników znajduje się w piśmiennictwie 28,29. Gliceryna i TCEP są wymagane do długotrwałego przechowywania w temperaturze -20 °C.
Uwaga 8 - jeśli obrazujesz filamenty aktynowe, dodaj 2 mM MgCl2 i 0,2 mM ATP, aby pomóc ustabilizować filamenty.
6. Akwizycja danych STORM pod mikroskopem (przy użyciu barwnika Alexa 647)
<ol>
	<li>Włączyć mikroskop STORM/PALM, najlepiej co najmniej 3 godziny przed obrazowaniem, aby umożliwić osiągnięcie równowagi termicznej. Obrazowanie przed tym ma zwiększoną szansę na dryf.</li>
	<li>Włóż komorę obrazowania do uchwytu na próbkę stolika mikroskopu. Upewnij się, że próbka jest mocno osadzona w uchwycie i jest płaska.</li>
	<li>Wyjmij PBS z komory obrazowania, a następnie napełnij do góry buforem przełączającym. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na górze komory, upewniając się, że w ogóle nie ma pęcherzyków i że cała komora jest przykryta. Uzupełnij dodatkowym buforem lub PBS, jeśli widoczne są jakiekolwiek bąbelki, w przeciwnym razie wydajność bufora może się pogorszyć.</li>
</ol>
UWAGA - aby zminimalizować ryzyko poprzecznego i osiowego dryfu próbki w stosunku do soczewki obiektywu, zaleca się, aby próbka i bufor były pozostawione do zrównoważenia do temperatury pokojowej przez co najmniej 15 minut przed obrazowaniem.
<ol start="4">
	<li>Zlokalizuj interesującą nas strukturę fluorescencyjną, która ma zostać zobrazowana. Wybierz żądany kąt oświetlenia, w tym przypadku zalecany jest TIRF lub kąt bardzo nachylony, ponieważ poprawia to stosunek sygnału do szumu poprzez zminimalizowanie nieostrego światła, co jest szczególnie korzystne w przypadku próbek komórek. Wykonaj referencyjny obraz struktury z ograniczoną dyfrakcją przed obrazowaniem STORM.</li>
	<li>Zwiększ laser wzbudzający (o odpowiedniej długości fali wzbudzenia około 640 nm) do dużej mocy, odpowiadającej około 2 kW/cm2 podczas obrazowania przy ustawieniach kamery 10 ms ekspozycji i czasie cyklu około 50 Hz (klatek na sekundę). Gdy fluorofory przejdą w rzadki wzór mrugania (prawdopodobnie w ciągu 10 sekund w przypadku większości próbek), zbierz 10 000 klatek*9.</li>
</ol>
Uwaga: 9 - 10 000 ramek jest odpowiednie dla opisywanych tutaj próbek, ale może być konieczne zwiększenie liczby ramek do 50 000 lub więcej dla innych próbek.
7. Rekonstrukcja obrazów o wysokiej rozdzielczości z surowych danych (przy użyciu rainSTORM)
<ol>
	<li>Otwórz plik rainSTORM.m z poziomu programu MATLAB i uruchom (Rysunek 1A).</li>
	<li>W oknie rainSTORM (Rysunek 1B) wybierz plik obrazu do analizy za pomocą przycisku przeglądania. Powinien to być plik .tif (ImageJ może być używany do konwersji innych typów plików na format tif). Zmień szerokość pikseli, aby dopasować ją do nieprzetworzonych danych systemu mikroskopowego użytego do uzyskania danych*10. Pozostaw inne wartości domyślne.</li>
</ol>
Uwaga 10 - Typowa kamera EMCCD ma rozmiar piksela 16 μm, więc w systemie z obiektywem 100X rozmiar piksela na obrazie będzie wynosił 160 nm. W systemach komercyjnych rozmiar piksela jest zwykle wyświetlany w oprogramowaniu. Rozmiary pikseli wahają się od 100 nm do 160 nm dla większości mikroskopów lokalizacyjnych.
<ol start="3">
	<li>Naciśnij przycisk "Przetwarzaj obrazy" i poczekaj, aż pojawi się wstępny obraz. Czas trwania przetwarzania będzie zależał od rozmiaru pliku, specyfikacji komputera i liczby kandydujących mrugnięć w surowych danych*11.</li>
</ol>
Uwaga: 11 - 10 000 sekwencji klatek danych aktyny i EGF zajęło odpowiednio 23 sekundy i 25 sekund na komputerze z procesorem Intel Xeon E5420. Korzystając z tego samego komputera bez zestawu narzędzi do przetwarzania równoległego w programie MATLAB lub z komputerem bez przetwarzania wielordzeniowego, czasy wynosiły odpowiednio 66 s i 81 s.
<ol start="4">
	<li>Aby wygenerować zaktualizowany obraz w super rozdzielczości, naciśnij przycisk "Otwórz recenzenta", a pojawi się drugie okno (Rysunek 1C). Naciśnij przycisk "Dostosuj kontrast", aby zmienić sposób wyświetlania obrazu zgodnie z potrzebami (Rysunek 1D). W niektórych przypadkach, gdy obraz jest bardzo ciemny, wartość maksymalna powinna zostać zmniejszona.</li>
	<li>Użyj okna recenzenta (Rysunek 1C), aby wygenerować przydatne wskaźniki jakości obrazu i jeszcze bardziej udoskonalić obraz w super rozdzielczości. Ustaw pierwsze trzy parametry kontroli jakości na wartości odpowiednio 4 000, 0,1 i 0,8-2,0*12. Zaktualizuj liczbę na wartość fotonu, która powinna być oparta na pomiarze kalibracji fotonów lub przy użyciu wartości krzywej kalibracji krzywej fotonowej określonych przez producenta kamery dla określonego ustawienia wzmocnienia EM. Ma to kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnej precyzji i rozdzielczości pomiarów*13.</li>
</ol>
Uwaga 12 - Signal Counts odrzuca mrugnięcia na podstawie kryteriów jasności. Im wyższa wartość, tym jaśniejsze musi być mrugnięcie, aby zostało zaakceptowane jako lokalizacja na końcowym obrazie. Może to wymagać zmiany w zależności od ilości fotonów wytwarzanych przez barwnik oraz czasu ekspozycji i czułości aparatu. Tolerancja odrzuca mrugnięcia, jeśli występuje znaczny błąd kwadratowy między sygnałem a dopasowanym gaussowskim, tj. podwójne szczyty. Zakres PSF Sigma odrzuca mrugnięcia, jeśli dopasowana szerokość PSF wykracza poza ten zakres, tj. węższy zakres może być używany do odrzucania sygnałów nieostrych i dużych zagregowanych plam o stałej fluorescencji. Użycie szerszego zakresu może spowodować pojawienie się artefaktów błędnej lokalizacji na końcowym obrazie. W praktyce zaleca się przeprowadzenie wstępnej kontroli jakości za pomocą parametru odcięcia precyzji lokalizacji.
Uwaga 13 - więcej informacji na temat wskaźników rozdzielczości znajduje się w odnośnikach 23,27. Krótko mówiąc, znając liczbę fotonów wytwarzanych przez każde mrugnięcie, można obliczyć precyzję lokalizacji każdej lokalizacji, a w konsekwencji uzyskać ogólne oszacowania średniej precyzji dla całego obrazu. Używając Andor iXON DU-897E z ustawieniem wzmocnienia 200, wartość zliczeń na foton wynosi 9,04.
<ol start="6">
	<li>Zmień granicę precyzji lokalizacji (Rysunek 1C), aby dokonać kompromisu między optymalizacją średniej precyzji lokalizacji w stosunku do liczby lokalizacji na końcowym obrazie. Zalecane są wartości 30-50 nm w zależności od jakości danych i próbki. Zarówno histogramy, jak i pliki info.txt mogą być wykorzystane do podjęcia tej decyzji (rysunki 1F i 1G).</li>
	<li>Domyślny współczynnik skali rekonstrukcji (rysunek 1C) wynosi 5, co spowoduje wygenerowanie pikseli o wysokiej rozdzielczości 32 nm, przy założeniu, że szerokość pikseli na oryginalnych obrazach wynosi 160 nm. Jeśli obrazy RAW mają rozmiar piksela 100 nm, uzyska to obrazy o wysokiej rozdzielczości z pikselami 20 nm. Zwiększ współczynnik skali, aby uzyskać mniejsze piksele o wysokiej rozdzielczości na końcowym obrazie*14.</li>
</ol>
Uwaga 14- Rozdzielczość mikroskopii lokalizacyjnej zależy od wygładzenia wymaganego do wizualizacji (tj. rozmiaru piksela prostej rekonstrukcji histogramu), jak również od precyzji lokalizacji. W praktyce rozmiar piksela rekonstrukcji powinien być na ogół mniejszy niż precyzja lokalizacji (patrz metryka Szacowana średnia precyzja w pliku tekstowym informacji - kroki 6.11 i 6.12). W tym przypadku utrata rozdzielczości spowodowana rekonstrukcją rozmiaru piksela będzie niewielka 23,27. Na przykład średnia precyzja oszacowania w kierunku wiersza i kolumny na rysunku 4E wynoszą 16,1 nm i 16,2 nm. Do wizualizacji tych danych wykorzystano rozmiar piksela 16 nm (współczynnik skali rekonstrukcji 10 przy oryginalnej szerokości piksela 160 nm).
<ol start="8">
	<li>Zmodyfikuj limit zakresu ramek (Rysunek 1C), aby ograniczyć rekonstrukcję do podzbiorów danych pierwotnych, na przykład [2001-inf] wykluczy początkowe 2000 klatek danych pierwotnych.</li>
	<li>Naciśnij przycisk "Uruchom przeglądarkę" (Rysunek 1C), aby wygenerować zaktualizowany obraz w super rozdzielczości (Rysunek 1E).</li>
	<li>Naciśnij przycisk "Wyświetl histogramy" (Rysunek 1C), aby wyświetlić wskaźniki jakości obrazu (Rysunek 1F)*15.</li>
</ol>
Uwaga 15 - Wykres w prawym górnym rogu przedstawiający liczbę akceptowanych lokalizacji w stosunku do numeru klatki kamery oraz histogram Precyzji Lokalizacji Thompsona w prawym dolnym rogu (Rysunek 1F) może być użyty do informacji o opcji przeglądu precyzji lokalizacji. Na przykład użycie odcięcia 50 nm wykluczyłoby wszystkie lokalizacje o gorszej precyzji z uwzględnienia w końcowym obrazie o wysokiej rozdzielczości.
<ol start="11">
	<li>Naciśnij przycisk "Zapisz obraz" w recenzentze (Rysunek 1C), aby zapisać wszystkie te dane*16.</li>
</ol>
Uwaga 16 - Można zapisać od 3 do 5 plików w zależności od wybranych opcji (suma obrazów, STORMdataImage, STORMprocessed, info & hists), patrz Rysunek 1G. Obraz przetworzony przez STORM jest wyświetlany ze zmodyfikowanymi mapami kontrastu i kolorów. STORMdataImage to obraz w skali szarości, w którym poziom szarości każdego piksela jest równy liczbie lokalizacji, które zostały w nim zidentyfikowane.
<ol start="12">
	<li>Po przeanalizowaniu danych (np. pliku Info.txt i histogramów) wróć do kroku 7.6 i w razie potrzeby powtórz kolejne kroki z innymi parametrami recenzenta. Naciśnięcie przycisku "Zapisz obraz" w kroku 7.11 spowoduje nadpisanie wcześniej zapisanych danych.</li>
</ol>
8. Śledzenie pudełek i korekta dryfu (przy użyciu rainSTORM)
<ol>
	<li>Wykonaj kroki 7.1 - 7.9, aby wygenerować obraz w normalny sposób.</li>
	<li>Naciśnij przycisk "Śledzenie pudełka" w recenzencie (Rysunek 1C), a następnie kliknij i przeciągnij pole na znacznik odniesienia lub strukturę będącą przedmiotem zainteresowania na recenzowanym obrazie.</li>
	<li>Poczekaj, aż pojawi się nowy obraz, na którym zostaną wyświetlone "Pozycje w ramce" (patrz rysunki 6B, 6C i 6F dla przykładów). Zapisz ten obraz, jeśli chcesz.</li>
	<li>Jeśli obiekt zainteresowania jest znacznikiem odniesienia, korektę dryfu można wykonać, klikając przycisk "Ustaw kotwicę", a następnie przycisk "Odejmij dryf". Na koniec ponownie kliknij "Uruchom recenzenta", aby wygenerować nowy obraz STORM, który będzie teraz miał wszystkie lokalizacje poprawione zgodnie z pozycjami znaczników odniesienia. Pozycje ściegów są usuwane z końcowego recenzowanego obrazu.</li>
	<li>Jeśli na końcowym obrazie z korekcją dryfu znajdują się inne znaczniki odniesienia, można je usunąć, naciskając "Śledzenie pola", "Usuń pudełkowe", a następnie "Uruchom recenzenta" tyle razy, ile chcesz.</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Pokazujemy, że za pomocą kilku prostych próbek testowych i ogólnodostępnego oprogramowania do przetwarzania rainSTORM możliwa jest optymalizacja obrazowania w superrozdzielczości STORM. Te narzędzia i metody zapewnią użyteczne punkty wyjścia dla nowych użytkowników oraz sposoby dla doświadczonych użytkowników na zwiększenie zaufania do swoich mikroskopów i ich wykorzystania do badania struktur biologicznych i komórkowych z niespotykaną dotąd szczegółowością. Wykorzystując kombinację próbek o znanych lub dobrze poznanych strukturach oraz algorytm, który może wygenerować szereg użytecznych wskaźników jakości obrazu, takich jak oszacowania średniej precyzji, liczba lokalizacji i histogramy, można poprawić jakość obrazu i mieć większe zaufanie do procesu obrazowania STORM. Nie ma jednego uniwersalnego podejścia do pozyskiwania danych, ponieważ istnieje wiele różnych komercyjnych i samodzielnie zbudowanych konfiguracji mikroskopów, których można użyć. Co więcej, istnieje wiele etapów przygotowania próbki i akwizycji obrazu, które mogą mieć wpływ na ostateczny obraz, dlatego posiadanie narzędzi programowych i próbek testowych ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia i optymalizacji jakości obrazu STORM.
Ponadto protokoły te mogą zapewnić przydatne i mniej niejednoznaczne sposoby rozwiązywania wszelkich problemów, które mogą się pojawić. Na przykład próbka dekstranu jest bardzo przydatnym sposobem określenia, czy występuje niewspółosiowość wiązki laserowej lub nierównomierne oświetlenie próbki. Jeśli istnieją obawy, że bufor przełączający może nie działać, pomocny będzie bardzo prosty test wizualny, aby sprawdzić, czy jest jakieś "mruganie". Filamenty aktynowe są użytecznym sposobem pomiaru rozdzielczości za pomocą porównań FWHM, a także podkreślania artefaktów dryfu i błędnej lokalizacji. Należy jednak zauważyć, że ponieważ metody superrozdzielczości oparte na lokalizacji mogą być wrażliwe na gęstość fluoroforu, niezależnie od innych czynników, takich jak czasy ekspozycji, liczba klatek na sekundę, moc lasera i sposób przetwarzania obrazu, niemożliwe jest przypisanie rozdzielczości do konkretnego mikroskopu i założenie, że wszystkie obrazy będą miały tę rozdzielczość. Możliwe jest jednak zmierzenie różnych aspektów rozdzielczości, takich jak średnia precyzja lokalizacji, liczba lokalizacji i dryf 27. Nawet jeśli markery odniesienia nie mogą być włączone do każdego eksperymentu, można je przynajmniej wykorzystać do scharakteryzowania systemu mikroskopowego, jego środowiska i lepszego zrozumienia kwestii operacyjnych, takich jak czas potrzebny do osiągnięcia równowagi termicznej po uruchomieniu. Oprócz korekcji dryfu bocznego, markery odniesienia mogą być używane do charakteryzowania i korygowania dryfu osiowego, chociaż wymaga to użycia soczewki astygmatycznej i mechanizmu sprzężenia zwrotnego w celu skorygowania pozycji próbki podczas pozyskiwania obrazów 43. Komercyjne systemy super-resolution zwykle zawierają jakiś rodzaj kontroli stabilności lub mechanizmu blokady ostrości, który może być bardziej praktycznym rozwiązaniem do korekcji dryfu ostrości.
Istnieją alternatywy dla niespecyficznego powlekania szkła dekstranem, takie jak bezpośrednie stosowanie barwników lub innych sprzężonych cząsteczek, takich jak przeciwciała drugorzędowe. Ograniczeniem tych podejść jest to, że liczba cząsteczek związanych ze szkłem nie jest znana. Alternatywne struktury nitkowate, które zostały użyte, obejmują mikrotubule 28 i DNA21. Jednak połączenie bardzo małych rozmiarów i wygodnych dostępnych na rynku odczynników sprawia, że aktyna jest atrakcyjną alternatywą, zwłaszcza że odległość separacji rozbieżnych lub rozgałęzionych włókien może być również użytecznym pomiarem wydajności systemu 27.
Jest miejsce na dalszy rozwój próbek testowych, pomimo ostatnich postępów w tej dziedzinie 28,29,46,47. W szczególności obrazowanie wielokolorowe wiąże się z szeregiem wyzwań we wszystkich 3 głównych aspektach obrazowania, etykietowaniu próbek, pozyskiwaniu obrazu (sprzęt) i oprogramowaniu (przetwarzanie i wyrównywanie obrazu). Powstało wiele publikacji poświęconych tym aspektom 4-6 i dlatego jasne jest, że odpowiednie próbki testowe i metodologie mają kluczowe znaczenie dla generowania i wiarygodnej interpretacji tego typu obrazów. Rzeczywiście, niedawno wykazano, że dSTORM może być używany do wykonania dwóch kolorowych obrazów i rozdzielczości wysoce symetrycznej natury kompleksu porów jądrowych, a autorzy zasugerowali, że byłby to idealny sposób oceny wydajności korekcji aberracji chromatycznej 45. Innym interesującym podejściem jest wykorzystanie origami DNA do stworzenia nanolinijki, która stwarza możliwość pozycjonowania fluoroforów w określonych odległościach od siebie pod dyfrakcją 46. Zapewnia to sposób oceny rozdzielczości i wykonywania pomiarów odległości. Jednak ostatecznym celem jest zastosowanie tych technik superrozdzielczości do niewyidealizowanych próbek, takich jak komórki, które są złożonymi strukturami trójwymiarowymi. W takim przypadku połączenie dokładniejszego zrozumienia techniki w połączeniu z narzędziami programowymi, które pomagają użytkownikowi w pozyskiwaniu danych, przetwarzaniu ich w odpowiedni sposób i dostarczaniu metryk obrazu, prawdopodobnie będzie ostateczną odpowiedzią. 28,29,47,48

Ostatnio rozwinięto szereg technik mikroskopii optycznej, zwykle określanych jako mikroskopia superrozdzielcza lub nanoskopia, które mogą ominąć limit dyfrakcji i generować obrazy o rozdzielczości 100 nm lub lepszej 1,2 . Od czasu ogłoszenia w 2008 r. mikroskopii superrozdzielczej jako metody roku w Nature Methods, nastąpił znaczny rozwój mikroskopów opartych na lokalizacji. Na przykład istnieją aplikacje wielokolorowe 3-6 , implementacje 3D 7-12, a nawet aplikacje na żywo komórkowe 5,13-17 . Co więcej, w związku z tym, że systemy te są komercjalizowane i obecnie wychodzą z laboratoriów optycznych w ręce biologów komórkowych, prawdopodobnie nastąpi dalszy wzrost ich wykorzystania i zastosowania w kwestiach biomedycznych.
Jedną z gałęzi tej rodziny są metody oparte na lokalizacji, które działają poprzez budowanie obrazu cząsteczka po cząsteczce. W tym celu większość cząsteczek fluorescencyjnych w próbce musi zostać wyłączona, tak aby w danym momencie aktywnych było tylko kilka przestrzennie oddzielonych cząsteczek. Cząsteczki te są następnie szybko włączane i wyłączane, a następnie wykonywanych jest wiele obrazów, dzięki czemu znaczna część populacji jest obrazowana w celu odzwierciedlenia podstawowej struktury z precyzją subdyfrakcyjną. Opublikowano szereg podejść, w tym GSDIM 18, PALM 19, fPALM 20, STORM 21 i RESOLFT 22. Algorytmy, które mierzą pozycję wykrywania pojedynczej cząsteczki, mogą być następnie wykorzystane do zlokalizowania rzeczywistej pozycji cząsteczki z precyzją lepszą niż 20 nm przy użyciu dopasowania Gaussa23, na przykład rapidSTORM 24,25, QuickPALM 26, palm3d 12 i rainSTORM27. Podczas obrazowania komórek lub innych próbek biologicznych, które mają dużą gęstość cząsteczek, konieczne jest zatem pobranie wielu tysięcy klatek tego, przestrzennie oddzielonego sygnału w celu zobrazowania znacznej części znakowanych cząsteczek.
Stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM) oraz wysoce powiązane metody dSTORM i GSDIM są metodami super-rozdzielczości opartymi na lokalizacji, które okazały się działać z dostępnymi na rynku barwnikami organicznymi 21. Od tego czasu wykazano, że mają one zastosowanie do wielu różnych barwników 28-30, co czyni tę metodologię szczególnie atrakcyjną ze względu na specyficzność i względną wygodę dobrze ugruntowanych podejść do znakowania immunologicznego w celu przeprowadzenia mikroskopii fluorescencyjnej. W związku z tym istnieje łatwy dostęp do szeregu koniugatów barwnik-przeciwciało i barwnik-biomolekuła, które mogą być potencjalnie wykorzystane w obrazowaniu superrozdzielczym opartym na lokalizacji. Podczas gdy ogólne zasady STORM i podobne podejścia są stosunkowo proste, a sprzęt i przygotowanie próbek na pierwszy rzut oka wydają się stosunkowo proste, istnieje wiele etapów w procesie, które mają kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości, wolnych od artefaktów obrazów w superrozdzielczości.
Podobnie jak w przypadku wszystkich technik mikroskopowych, proces ten można podzielić na 3 główne etapy: po pierwsze, przygotowanie próbki, po drugie, akwizycja obrazu, a po trzecie, przetwarzanie obrazu i/lub analiza i interpretacja obrazu. Dodatkowa zdolność rozdzielcza i metoda generowania obrazów o wysokiej rozdzielczości przy użyciu podejścia opartego na lokalizacji wprowadza pewne nowe problemy i rozważania 31-33. Począwszy od przygotowania próbki, podczas wykonywania znakowania immunologicznego, w szczególności immunofluorescencji pośredniej, w której stosuje się kombinację przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, należy zauważyć, że barwnik fluorescencyjny może znajdować się w odległości do 20 nm od cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania. W przypadku mikrotubul daje to średnice 35-50 nm w porównaniu z oczekiwaną średnicą mikrotubul 25 nm 28,30 . Ponadto gęstość etykietowania powinna spełniać kryteria Nyquista, aby uzyskać obraz wysokiej jakości 14. Na przykład, aby uzyskać przewidywaną rozdzielczość obrazu 20 nm wzdłuż struktury nitkowatej, cząsteczka barwnika powinna znajdować się co najmniej co 10 nm 27. Chociaż opublikowano wiele barwników, które działają w podejściach opartych na lokalizacji, ogólna wydajność barwnika jest mieszanką co najmniej czterech ważnych kryteriów, a mianowicie wykrytych fotonów na zdarzenie przełączające (jasność każdego mrugnięcia - im jaśniejsza jest lepsza), cykl pracy równowagi on-off (współczynnik kontrastu barwników w stanie wyłączonym i włączonym - więcej wyłączonego jest generalnie lepsze), frakcja przeżycia (niski wskaźnik bielenia jest lepszy) i liczba cykli przełączania (liczba mrugnięć na fluorofor - więcej jest lepsze dla wysokiej rozdzielczości, chociaż 1 mrugnięcie na fluorofor może być zaletą do celów liczenia cząsteczek). Sytuację dodatkowo komplikuje fakt, że właściwości te dla danego barwnika mogą się różnić w różnych warunkach buforowych i przy mocy lasera 28,29 . Ponadto, oprócz tych unikalnych rozważań STORM, jakość obrazu można poprawić, optymalizując przygotowanie próbki w taki sam sposób, jak w przypadku bardziej tradycyjnych technik mikroskopii fluorescencyjnej, na przykład minimalizując autofluorescencję poprzez modyfikację warunków utrwalania i stosowanie odczynników hartujących. Ważne jest również zminimalizowanie niespecyficznie związanych fluoroforów, co można osiągnąć poprzez dostosowanie stężeń etykiety, czasu inkubacji oraz etapów blokowania i mycia.
Drugi krok pozyskiwania obrazów jest również krytyczny. Optymalne ustawienia mikroskopu będą zależeć od barwnika, warunków buforowania, gęstości etykietowania i rodzaju próbki, np. monowarstwy na szkle, komórkach lub próbkach tkanek. Główne czynniki to czas naświetlania aparatu, liczba klatek, kąt oświetlenia (TIRF, HILO, Epi) i moc lasera. Celem jest jak najszybsze zebranie jak największej liczby jasnych, przestrzennie oddzielonych od siebie mrugnięć. Jeśli tło jest bardzo wysokie lub mrugnięcia nie są zbyt jasne, innymi słowy, stosunek sygnału do szumu jest słaby, algorytm rekonstrukcji nie będzie w stanie zlokalizować pozycji tak dokładnie. Oprócz maksymalizacji precyzji lokalizacji, tj. można zmierzyć dokładność pomiaru każdej cząsteczki, jakość obrazu zależy również od dużej liczby lokalizacji. Jeśli zobrazowana zostanie niewystarczająca liczba interesujących nas cząsteczek, czy to z powodu słabej skuteczności znakowania, nadmiernego fotowybielania, czy nieodpowiedniej liczby klatek, wówczas wynikowy obraz o wysokiej rozdzielczości będzie punktowy i nieciągły, ponieważ kryteria Nyquista nie zostaną spełnione 14,27.
I na koniec, trzeci krok, przetwarzanie obrazu, jest szczególnie ważny w porównaniu ze standardowymi technikami mikroskopii fluorescencyjnej. Istnieje szereg swobodnie i komercyjnie dostępnych algorytmów, co jest zarówno zaletą, jeśli chodzi o wybór, jak i wadą, ponieważ ustalenie, który z nich jest najbardziej odpowiedni do użycia, może być mylące. Jeśli na przykład surowe dane mają dobrze rozmieszczone, przestrzennie odrębne mrugnięcia, algorytm dopasowania pojedynczej cząsteczki może być bardzo dokładny i wydajny, na przykład dzięki algorytmom rzadkiego dopasowania dostępnym w oprogramowaniu rainSTORM 27, rapidSTORM 24,25, palm3d 12 i QuickPALM 26. Jeśli surowe dane zawierają wiele nakładających się na siebie sygnałów, algorytmy, które mogą być bardziej odpowiednie, obejmują DAOSTORM 34, 3B 35 i deconSTORM 36. Co więcej, algorytmy te zawierają progi dla różnych kryteriów, takich jak liczba sygnałów lub fotony na mignięcie, a także różne opcje wyświetlania obrazu, takie jak wizualizacja z wygładzonymi funkcjami Gaussa lub jako histogramy z siatkami pikseli, gdzie rozmiar piksela o superrozdzielczości może być wybrany przez użytkownika. Wszystkie te opcje zmieniają wygląd końcowego obrazu i mają wpływ na interpretację i analizę obrazu.
Dlatego prezentujemy 3 próbki testowe, które zapewnią nowemu użytkownikowi punkt wyjścia do eksperymentów z lokalizacją opartą na barwnikach, które dla jasności będziemy nazywać STORM, a bardziej doświadczonym użytkownikom możliwość dalszej optymalizacji swoich eksperymentów. Po pierwsze, możliwe jest pokrycie powierzchni szkła fluorescencyjną warstwą sprzężonego dekstranu i barwnika. Zapewnia to szybki i prosty sposób na ustalenie, czy mikroskop, barwnik i bufor działają w celu wygenerowania sygnału fluorescencyjnego. Metodę tę można następnie rozszerzyć, porównując średnią precyzję lokalizacji i wskaźniki liczbowe generowane przez rainSTORM w celu optymalizacji warunków buforowania, ustawień akwizycji obrazu i testowania różnych barwników. Po drugie, przedstawiamy prosty protokół przygotowania filamentów aktynowych na szkle, które można łatwo znakować za pomocą koniugatów falloidyna-barwnik. Zapewniają one idealne struktury do wykonywania pomiarów rozdzielczości 27 i zazwyczaj pełna szerokość połowy maksimum (FWHM) żarnika jest podawana jako empiryczne oszacowanie rozdzielczości 37. Należy zauważyć, że rozdzielczość różni się między próbkami i między obrazami w tej samej próbce, ponieważ rozdzielczość w mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji jest funkcją jasności fluoroforu, szumu tła i gęstości lokalizacji 27 i niekoniecznie są one stałe w całej próbce. Filamenty aktynowe są używane do demonstrowania potencjalnych artefaktów, takich jak błędne lokalizacje i dryf, oraz sposobu ich identyfikacji za pomocą funkcji oprogramowania w rainSTORM. Ponadto opisujemy zastosowanie fluorescencyjnych markerów odniesienia zarówno do pomiaru, jak i korygowania dryfu. Po trzecie, opisano barwienie komórek koniugatami naskórkowego czynnika wzrostu (EGF)-barwnik. EGF stanowi użyteczny wskaźnik wydajności obrazu o wysokiej rozdzielczości, ponieważ część receptora na powierzchni komórki ulega endocytozie za pośrednictwem pęcherzyków, które są strukturami o rozmiarach subdyfrakcyjnych o średnicy około 50-150 nm 27,38,39 .

<table><tbody><tr><td>Szkło komorowe Labtek Imaging</td><td>Fisher</td><td>CBR-166-390E</td><td>Przygotowanie próbki</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony </td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>* Poniżej znajdują się alternatywy</td></tr><tr><td>Obiektyw 100 X TIRF</td><td>Olympus</td><td>UAPON 100XOTIRF</td><td>* Poniżej znajdują się alternatywy</td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>ior</td><td>iXon 897</td><td>* Poniżej znajdują się alternatywy</td></tr><tr><td>Laser</td> <td>640 nmToptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td>*150 mW - do obrazowania barwników Alexa 647 lub Cy5</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>*Oprogramowanie akwizycyjne (sprzęt sterujący)</td></tr><tr><td>PC </td><td>Dell</td><td></td><td>Windows XP (64 bit), procesor Intel Xeon E5420, 16 GB RAM *Sterowanie instrumentem i przetwarzanie obrazu</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Analiza i przetwarzanie obrazu <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td></tr><tr><td>rainSTORM</td><td>Laser Analytics Group (Cambridge) software</td><td></td><td><a href="http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources" target="_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources</a></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Running rainSTORM</td><td></td><td><a href="http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/" target="_blank">http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/</a></td></tr><tr><td>*Przykład samodzielnie zbudowanych mikroskopów</td><td></td><td></td> STORM/PALM <td>Zobacz także odnośnik 29 <a href="http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope" target="_blank">http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope</ a></td></tr><tr><td>*Komercyjne mikroskopy</td><td></td><td></td> superrozdzielcze STORM/PALM <td>Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (lokalizacja Monet) Alternatywy dla samodzielnie zbudowanych mikroskopów</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1. Materiały i Sprzęt </td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Fisher</td><td>VX70013065</td><td>1; 2; 3; 4</td></tr><tr><td>Poli-L-Lizyna</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td>1.1; 2.1</td></tr><tr><td>Dextran-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>D-22914</td><td>1.2</td></tr><tr><td>Ogólny bufor aktynowy</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>BSA01</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Filamenty wstępnie uformowane aktyny</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>AKF99</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Phallodin-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Mikrosfery TetraSpeck (0,1 mikrona)</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Komórki HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>4.1</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher</td><td>VX31966021</td><td>4.1</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher</td><td>VX10500064</td><td>4.1</td></tr><tr><td>Pióro/Krok</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td>4.1</td></tr><tr><td>Naczynia plastikowe</td><td>Invitrogen</td><td>734-0006</td><td>4.1</td></tr><tr><td>EGF - Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>E35351</td><td>4.3</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>4.3, 4.4</td></tr><tr><td>Formaldehyd - 10 % roztwór klasy EM</td><td>Polysciences</td><td>04018-1</td><td>4.2</td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma</td><td>C100</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>5.1</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>5.1</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>C4706</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>93352</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>C7528</td><td>5.2</td></tr><tr><td>MEA-HCl</td><td>Sigma</td><td>M6500</td><td>5.3</td></tr><tr><td>Gliceryna</td><td>Sigma</td><td>G2289</td><td>5.1; 5.2</td></tr><tr><td colspan="4">Odczynniki Tabela 2.</td></tr></tbody></table>

próbki testowe do optymalizacji mikroskopii superrozdzielczej storm

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM to niedawno opracowana technika mikroskopii superrozdzielczej o rozdzielczości do 10 razy lepszej niż standardowe techniki mikroskopii fluorescencyjnej. Ponieważ jednak obraz jest pozyskiwany w zupełnie inny sposób niż normalnie, poprzez budowanie obrazu cząsteczka po cząsteczce, istnieją pewne poważne wyzwania dla użytkowników w próbie optymalizacji pozyskiwania obrazu. Aby wspomóc ten proces i uzyskać lepszy wgląd w działanie STORM, przedstawiamy przygotowanie 3 próbek testowych oraz metodykę pozyskiwania i przetwarzania obrazów STORM w superrozdzielczości o typowych rozdzielczościach w zakresie 30-50 nm. Łącząc próbki testowe z wykorzystaniem ogólnodostępnego oprogramowania do przetwarzania rainSTORM, możliwe jest uzyskanie wielu informacji na temat jakości i rozdzielczości obrazu. Korzystając z tych wskaźników, można zoptymalizować procedurę obrazowania, począwszy od optyki, poprzez przygotowanie próbki, wybór barwnika, warunki buforowania, aż po ustawienia akwizycji obrazu. Pokazujemy również przykłady niektórych typowych problemów, które skutkują niską jakością obrazu, takich jak dryf boczny, w którym próbka porusza się podczas akwizycji obrazu, oraz problemy związane z gęstością powodujące zjawisko "błędnej lokalizacji".

Opisujemy przygotowanie trzech próbek testowych i jak można je wykorzystać do optymalizacji i oceny wydajności mikroskopów STORM. Na tych przykładach pokazujemy, jak pozyskiwać surowe dane, a następnie przetwarzać je w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości w komórkach o rozdzielczości około 30-50 nm.

Próbki testowe do optymalizacji mikroskopii superrozdzielczej STORM

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie sposobu uzyskiwania wysokiej jakości obrazów o superrozdzielczości STORM. W tym celu w pierwszej kolejności przygotowywana jest fluorescencyjnie znakowana próbka testowa. Drugim krokiem jest przygotowanie buforu przełączającego, a następnie wypełnienie nim komory obrazowania.Następnie surowe dane są pozyskiwane przy użyciu mikroskopu STORM. Ostatnim krokiem jest rekonstrukcja obrazów o superrozdzielczości z surowych danych przy użyciu oprogramowania przetwarzającego RainStorm. Ostatecznie próbki testowe służą do pokazania sposobu pozyskiwania wysokiej jakości surowych danych, które można następnie przetworzyć w celu wygenerowania obrazów superrozdzielczości STORM w komórkach, o rozdzielczości od 30 do 50 nanometrów, co stanowi pięcio- do dziesięciokrotne zwiększenie rozdzielczości w porównaniu z tradycyjnymi technikami mikroskopii fluorescencyjnej, w tym TIRF i konfokalną.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ nie zdają sobie sprawy z wagi gromadzenia dużej liczby wysokiej jakości rzadkich połączeń. Proces ten jest znacznie ułatwiony dzięki zastosowaniu barwnika Alexa 647 w odpowiednim buforze przełączającym. Wizualna demonstracja tej techniki jest niezbędna, ponieważ pozyskanie wysokiej jakości danych surowych ma kluczowe znaczenie dla uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości SPR.Surowe sekwencje wideo uzyskane tą techniką wyglądają zupełnie inaczej niż w jakiejkolwiek innej formie mikroskopii fluorescencyjnej. Aby rozpocząć procedurę powlekania szkła fluorescencyjną dekstryną, do każdej studni ośmiokomorowego szkiełka podstawowego należy nanieść 200 µL 0,01% roztworu polilizyny i inkubować przez 10 minut. Po 10 minutach usunąć roztwór polilizyny za pomocą pipety, aby upewnić się, że nie pozostała żadna ciecz.0,25 µL roztworu stokowego dekstryny Alexa 647 o stężeniu 2 mg/mL dodano do 25 µL wody dejonizowanej, aby przygotować roztwór o stężeniu 20 µg/mL w celu stworzenia powłoki o wysokiej gęstości z roztworu dekstryny Alexa 647.Przenieś 20 µL roztworu o stężeniu 20 µg/mL do łącznie 200 µL wody dejonizowanej. W celu przygotowania roztworu o średnim stężeniu rozcieńcz 2 µL w 200 µL wody dejonizowanej. W celu przygotowania roztworu o niskim stężeniu rozcieńcz 0,2 µL.Do 200 µL wody dejonizowanej dodaj 200 µL rozcieńczonych roztworów dekstryny Alexis X 47 do każdego dołka i inkubuj przez 10 minut. Można zastosować dłuższy czas inkubacji, co może doprowadzić do uzyskania gęstszej powłoki dekstrynowej. Na koniec usuń roztwory Dexter Xis X 47 i przemyj wodą trzy razy.Aby przygotować fluorescencyjne filamenty aktynowe na szkle, należy najpierw dodać 200 µL 0,01% roztworu polilizyny do każdej studni komory ośmiodzielnej. Przykryć szkło i inkubować przez 10 minut. Odessać ciecz za pomocą pipety, upewniając się, że nie pozostały żadne resztki płynu.Do każdej komory dodaj 90 µL ogólnego buforu do aktyny, uprzednio przygotowanego zgodnie z instrukcją producenta. Następnie dodaj 10 µL 10 µM roztworu prefabrykowanych filamentów aktynowych oraz 1 µL foid i Alexa 6 47, a następnie delikatnie wymieszaj za pomocą pipety, zasysając i wypuszczając ciecz. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby przygotować fluorescencyjne kuleczki mikrosferowe jako markery powiernicze. Rozcieńcz 1 µL kuleczek tepec w 200 µL PBS i wymieszaj. Dodaj rozcieńczone kuleczki do komory obrazowania i odczekaj 15 minut.Po 15 minutach usunąć roztwór i trzykrotnie przemyć PBS przed obrazowaniem. W tym doświadczeniu wykorzystuje się komórki hodowane do konfluencji na poziomie około 80%. Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć PBS. Następnie dodać 500 µL 4% roztworu formaldehydu na 10 minut.Usunąć formaldehyd i wypłukać trzy razy PBS. Nie dopuszczać do wyschnięcia komórek i zawsze stosować roztwory buforowane PBS. Aby uniknąć stresu hipotonicznego, dodać 2 µL roztworu EGF Alexa 647 o stężeniu 50 µg/mL do 200 µL 0,1% roztworu BSA, a następnie dodać ten roztwór do komórek HeLa.Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór i przemyć trzykrotnie buforem PBS. Dodać roztwór blokujący zawierający 0,1% BSA i pozostawić na 15 minut w temperaturze pokojowej.Następnie usunąć roztwór blokujący i przemyć próbkę jeszcze trzy razy PBS przed obrazowaniem. Bezpośrednio przed obrazowaniem przygotować bufor przełączający, mieszając roztwory stokowe enzymu, glukozy i czynnika redukującego w proporcjach 50 µL, 400 µL i 100 µL, a następnie dodać PBS do uzyskania objętości końcowej 1 mL. Usunąć PBS z komory obrazowania, a następnie wypełnić ją do pełna buforem przełączającym.Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkę na górze komory, upewniając się, że nie ma w niej żadnych pęcherzyków powietrza i że cała komora jest przykryta. Jeśli zauważysz pęcherzyki, dolej dodatkowy bufor lub PBS. W przeciwnym razie wydajność buforu może spaść.Gromadzenie wysokiej jakości, rzadkich danych wiążących jest niezbędne dla sukcesu tej procedury, dlatego należy upewnić się, że mikroskopy są właściwie ustawione, a zastosowano odpowiednie parametry akwizycji. Zlokalizuj fluorescencyjną strukturę, która ma zostać zobrazowana. Wybierz pożądany kąt oświetlenia.W tym przypadku zaleca się zastosowanie obiektywu typu turf lub ustawienie pod dużym kątem nachylenia, ponieważ poprawia to stosunek sygnału do szumu poprzez minimalizację światła poza ogniskiem, co jest szczególnie korzystne w przypadku próbek komórkowych. Wykonaj obraz referencyjny struktury z ograniczoną liczbą klatek przed obrazowaniem STORM. Zwiększ moc lasera wzbudzającego do wysokiej wartości odpowiadającej około 2 kW/cm², obrazując przy ustawieniach kamery: czas ekspozycji 10 ms oraz czas cyklu około 50 Hz lub klatek na sekundę.Gdy flora fours przejdą w tryb rzadkiego migotania, należy zebrać 10 000 klatek. Aby rozpocząć rekonstrukcję, otwórz plik RAINSTORM M w programie MATLAB i uruchom go w oknie rainstorm.Wybierz plik obrazu do analizy, korzystając z przycisku przeglądaj. Plik ten powinien być w formacie TIF. Zmień szerokość piksela tak, aby odpowiadała surowym danym z systemu mikroskopowego użytego do pozyskania danych.Pozostałe wartości pozostaw bez zmian. Kliknij przycisk przetwarzania obrazów i poczekaj, aż pojawi się obraz wstępny. Czas przetwarzania będzie zależał od rozmiaru pliku, specyfikacji komputera oraz liczby potencjalnych połączeń w surowych danych.Aby wygenerować zaktualizowany obraz o wysokiej rozdzielczości (super resolution), należy nacisnąć przycisk „open reviewer”, po czym pojawi się drugie okno. Naciśnij przycisk „adjust contrast”, aby zmienić wyświetlanie obrazu zgodnie z potrzebami. W przypadkach, gdy obraz jest bardzo ciemny, należy zmniejszyć wartość maksymalną.Użyj okna przeglądarki, aby wygenerować przydatne wskaźniki jakości obrazu i dalej udoskonalać obraz o super rozdzielczości. Pozostaw pierwsze trzy parametry kontroli jakości na wartościach domyślnych odpowiednio 5 000, 0,1 oraz od 0,8 do 3,5. Zaktualizuj wartość liczby zliczeń na foton.Zmień wartość progu precyzji lokalizacji, aby zrównoważyć optymalizację średniej lokalizacji i precyzji względem liczby lokalizacji. W obrazie końcowym zaleca się wartości od 30 do 50 nanometrów, w zależności od jakości danych i próbki. Domyślny współczynnik skali rekonstrukcji wynosi pięć, co pozwoli na wygenerowanie pikseli superrozdzielczych o rozmiarze 32 nanometrów, przy założeniu, że piksel w obrazach oryginalnych ma 160 nanometrów.Jeśli surowe obrazy mają rozmiar piksela wynoszący 100 nanometrów, pozwoli to na uzyskanie obrazów o superrozdzielczości z pikselami o rozmiarze 20 nanometrów. Zwiększ współczynnik skalowania, aby uzyskać mniejsze piksele w obrazach o superrozdzielczości. W końcowym obrazie naciśnij przycisk run reviewer, aby wygenerować zaktualizowany obraz o superrozdzielczości.Naciśnij przycisk view histograms, aby wyświetlić parametry jakości obrazu. Na koniec naciśnij przycisk save image w podglądzie, aby zapisać wszystkie te dane. Rozpocznij tę procedurę od wygenerowania obrazu w ten sam sposób, co pokazano wcześniej.Naciśnij przycisk śledzenia obszaru (box tracking) w podglądzie, a następnie kliknij i przeciągnij ramkę nad marker fiducjalny na analizowanym obrazie. Odczekaj, aż pojawi się nowy obraz z zaznaczonymi pozycjami w ramkach. Jeśli obiektem zainteresowania jest marker fiducjalny, można zapisać ten obraz.Podobnie jak w tym przypadku, należy przeprowadzić korekcję dryfu, klikając przycisk ustawienia punktu zakotwiczenia (set anchor), a następnie przycisk odejmowania dryfu (subtract drift). Na koniec należy ponownie kliknąć przycisk uruchomienia przeglądarki (run reviewer), aby wygenerować nowy obraz STORM. Prawidłowe pokrycie dekstryną powinno przynieść fluorescencyjną monowarstwę; typowe dane dla dekstryny przedstawiono na tej rycinie.Obrazy o rozdzielczości ograniczonej dyfrakcją przedstawiają różne stężenia dekstryny przed obrazowaniem STORM. Rekonstrukcje w superrozdzielczości mają rozmiar piksela wynoszący 25 nanometrów. Zebrano 10 000 obrazów o rozmiarze klatki 128 na 128 pikseli, a poszczególne klatki z tej sekwencji zostały przedstawione poniżej.Przy wysokim stężeniu dekstryny fluorescencyjna monowarstwa powinna wydawać się stosunkowo jednolita, co przedstawiono na tych obrazach oraz w tym fragmencie wideo. Przy niższych stężeniach błyski będą rzadsze i bardziej wyraźne.Przy braku wyraźnego tła podczas tej fazy akwizycji obrazu przy stałym naświetlaniu laserem, liczba błysków będzie maleć w czasie, co zilustrowano poprzez porównanie klatki 2000 i klatki 8 000 w próbce o wysokiej gęstości. Główną różnicą między obrazami o superrozdzielczości dla wysokich, średnich i niskich stężeń dekstryny jest malejąca liczba lokalizacji. Wykres ten przedstawia średnią z trzech sekwencji po 10 000 klatek dla każdego stężenia dekstryny, gdzie słupki błędów wskazują odchylenie standardowe.Niemniej jednak ta proporcjonalna zależność między stężeniem cząsteczek fluorescencyjnych, liczbą błysków w surowych danych a liczbą lokalizacji nie jest prostą zależnością liniową, co zilustrowano na tym wykresie liczby zaakceptowanych lokalizacji na klatkę. Przy zastosowaniu średniej kroczącej z 100 klatek i bardzo wysokiej gęstości cząsteczek, oprogramowanie nie jest w stanie skutecznie lokalizować cząsteczek podczas obrazowania jakiejkolwiek próbki. Powszechnym problemem może być obecność jasnej, ale niewyraźnej mgiełki fluorescencyjnej na całym obrazie, spowodowanej dyfuzją fluoroforu przez ośrodek.Można zapobiegać obecności tych odseparowanych cząsteczek fluorescencyjnych lub je usuwać poprzez zwiększenie liczby etapów płukania roztworem PBS przed dodaniem buforu przełączającego lub poprzez dodanie świeżego buforu przełączającego do komory; przetwarzanie i porównywanie danych z każdej sekwencji obrazów prowadzi do uzyskania bardzo różnych obrazów o superrozdzielczości. Panele C i D przedstawiają konstrukcje obrazów o superrozdzielczości odpowiadające danym zgromadzonym odpowiednio w panelach A i B. Wykres ten przedstawia liczbę zaakceptowanych lokalizacji na klatkę przy użyciu ruchomej średniej z 100 klatek.Czerwona linia odpowiada sekwencjom storm A i C, w których występuje wysokie tło, natomiast niebieska linia odpowiada sekwencjom B i D, w których tło jest niskie. Zaakceptowana liczba lokalizacji dla obrazów odpowiadających danym z wysokim i niskim tłem została przedstawiona na drugim wykresie. Te trzy obrazy ograniczone dyfrakcyjnie pokazują typowe dane dla wstępnie utworzonych filamentów aktyny przytwierdzonych do powierzchni szkła przed dodaniem buforu przełączającego i obrazowaniem storm.Można zaobserwować włókna o zmiennej długości. Bardzo jasne włókna to często kilka splątanych ze sobą włókien. Wybieranie pojedynczych, stosunkowo jasnych włókien zamiast obszarów splątanych pozwala uzyskać obrazy lepszej jakości podczas fazy akwizycji.Wzdłuż długości filamentu powinny być widoczne jasne, punktowe błyski. Rzadkie błyski powinny być widoczne podczas fazy akwizycji, a następnie w przetworzonych danych. Powinien być widoczny cienki, ciągły filament, a liczba lokalizacji w klatce powinna wykazywać stopniowy spadek.Zazwyczaj szerokość połówkowa maksymalnej wartości (FWHM) filamentu jest podawana jako empiryczna ocena rozdzielczości, uzyskana poprzez wykreślenie linii prostej przez powiększony obszar filamentu aktynowego przy użyciu funkcji profilu wykresu w programie ImageJ, a następnie wykonanie dopasowania gaussowskiego. Wartość FWHM wynosi 43,2 nanometrów. Problem błędnej lokalizacji może wystąpić w sytuacjach, gdy szereg filamentów aktynowych rozgałęzia się lub przecina, co analizuje się poprzez przetwarzanie podzbiorów klatek i porównywanie pierwszych oraz ostatnich 5 000 klatek.Zastosowanie pierwszych 5 000 klatek do uzyskania obrazu o superrozdzielczości pozwala otrzymać inny obraz. W środkowej części obrazu widocznych jest wiele lokalizacji. Jednak przy wykorzystaniu ostatnich 5 000 klatek tylko nieliczne lokalizacje są widoczne i pozostają jedynie filamenty, choć w pewnym stopniu nieciągłe ze względu na niską liczbę lokalizacji na obrazie.Jeśli podejrzewa się zbyt wysoką gęstość migotania, porównanie obrazów z danymi dotyczącymi lokalizacji w każdej klatce może silnie sugerować, że problem ten występuje podczas pierwszej serii klatek. Średnia liczba lokalizacji na klatkę wynosi wówczas ponad 10, w porównaniu z ostatnią serią klatek, gdzie wynosi ona około czterech. Innym potencjalnym problemem w mikroskopii STORM jest dryft, który występuje, gdy próbka przesuwa się względem obiektywu podczas fazy akwizycji danych; choć dryft jest bardzo trudny do wykrycia w trakcie pozyskiwania obrazów, można go zidentyfikować na obrazach superrozdzielczych znanych struktur, takich jak filamenty aktynowe.Pierwszą oznaką, że mógł wystąpić dryft boczny, jest fakt, że struktura jest większa niż oczekiwano. Na przykład, gdy szerokość połówkowa (FWHM) jest stosunkowo duża w porównaniu z danymi granicy precyzji z rainstorm, w tym przypadku 90 nanometrów w porównaniu z 67 nanometrami. Lepszym sposobem na wykrycie dryftu jest porównanie lokalizacji w funkcji czasu, czyli sprawdzenie, czy lokalizacje w późniejszych klatkach są przesunięte w stosunku do tych w klatkach wczesnych.Można to wyraźnie zaobserwować w przypadku filamentów aktynowych przy zastosowaniu kodowania kolorystycznego. Dzięki funkcji śledzenia obszarów (box tracking) w programie rainstorm, jak pokazano na panelach B i C, lokalizacje są wyświetlane w kolorze odpowiadającym numerowi klatki, w której zostały zarejestrowane. Przykładowo, lokalizacje z początku sekwencji akwizycji są koloru niebieskiego, natomiast lokalizacje z końcowego etapu sekwencji akwizycji są koloru czerwonego.Przesunięte kolory wskazują, że wystąpił dryf, który należy zmierzyć i skorygować. W celu pomiaru dryfu jako markerów referencyjnych można zastosować kuleczki fluorescencyjne o średnicy 100 nanometrów; numery od jeden do cztery pokazują przycięte i powiększone pojedyncze kuleczki. W przykładzie, w którym wystąpił stosunkowo silny dryf wynoszący około 100 nanometrów w ciągu trzech minut i 10 sekund fazy akwizycji, tę samą funkcję śledzenia ramki można wykorzystać do oznaczenia kolorami i potwierdzenia wystąpienia dryfu. Ponieważ wszystkie cztery kuleczki w tym przykładzie wykazują niemal identyczny dryf, można wybrać jedną z nich – w tym przypadku kuleczkę nr 2 – jako punkt odniesienia i odjąć wartość dryfu od pozostałych kuleczek.Porównanie z panelem E pokazuje, że dryft boczny został skorygowany. Wreszcie, komórki HeLa barwione na obecność czynnika wzrostu naskórka mogą posłużyć jako realistyczny przykład rozdzielczości obrazu. W przypadku komórek, panel A przedstawia obraz części komórki HeLa ograniczony dyfrakcyjnie, z ogniskowaniem na podstawnej powierzchni komórki, gdzie żółte ramki wskazują powiększone obszary zainteresowania pokazane w panelach B i C, w przeciwieństwie do niewyraźnych powiększonych obszarów zainteresowania w obrazie ograniczonym dyfrakcyjnie.Obrazy o superrozdzielczości powinny przedstawiać mieszaninę klastrów i sporadycznie występujących pojedynczych, izolowanych pikseli. Klastry będą miały średnicę około 100 nanometrów i prawdopodobnie odpowiadają tworzącym się wgłębieniom oraz pęcherzykom. Ścieżka, którą EGF jest głównie wyciszane i endocytozowane, a także dane dotyczące lokalizacji na klatkę z Panelu D, przedstawiono na wykresie G. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować proste próbki testowe, pozyskać dane i zrekonstruować wysokiej jakości obrazy o superrozdzielczości STORM.Metody te pomogą uniknąć niektórych powszechnych problemów z dopasowaniem, takich jak dryft, oraz pomogą zoptymalizować proces STORM. Zobacz eksperymenty dotyczące rozdzielczości.

test-samples-for-optimizing-storm-super-resolution-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Próbki testowe do optymalizacji mikroskopi superrozdzielczej STORM

Demonstrujemy metodę obrazowania wielu cząsteczek w heterogenicznych nanostrukturach z dokładnością do pojedynczej cząsteczki, wykorzystując sekwencyjne wiązanie i elucję fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał.

Wysoce multipleksowane obrazowanie limfocytów T w superrozdzielczości przy użyciu madSTORM

Ten protokół opisuje niezbędne kroki do uzyskania wyników lokalizacji białek subkomórkowych na siatkówce danio pręgowanego poprzez korelację obrazów z superrozdzielczej mikroskopii świetlnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna superrozdzielczość i mikroskopia elektronowa w celu ustalenia lokalizacji białek w siatkówce danio pręgowanego

Ogólnym celem tej metodologii jest zapewnienie optymalnych warunków eksperymentalnych od przygotowania próbki do akwizycji i rekonstrukcji obrazu, aby umożliwić wykonanie dwukolorowych obrazów 2D dSTORM mikrotubul i pośrednich włókien w stałych komórkach...

Obrazowanie pośrednich włókien i mikrotubul za pomocą 2-wymiarowej bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej

Tutaj opisujemy metodę fotowybielania w celu zmniejszenia autofluorescencji sinic. Po fotowybielaniu stosuje się stochastyczną mikroskopię rekonstrukcji optycznej w celu uzyskania trójwymiarowych obrazów pierścienia FtsZ cyjanobakterii o wysokiej rozdzielczości.

Fotowybielanie umożliwia obrazowanie pierścienia FtsZ w Cyanobacterium prochlorococcus w superrozdzielczości

Mikroskopia optyczna oparta na chipach jest nowatorskim podejściem do mikroskopii fluorescencyjnej i oferuje korzyści w zakresie efektywności kosztowej i przepustowości. W tym miejscu przedstawiono protokoły przygotowania i obrazowania chipów dla mikroskopii TIRF i mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji.

Wysokoprzepustowa mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia i bezpośredniej stochastycznej rekonstrukcji optycznej z wykorzystaniem chipa fotonicznego

Ten artykuł zawiera prosty i przejrzysty protokół oznaczania efektorów wydzielanych przez Salmonellę za pomocą rozszerzenia kodu genetycznego (GCE) specyficznie dla miejsca i obrazowania subkomórkowej lokalizacji wydzielanych białek w komórkach HeLa za pomocą bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (dSTORM)...

Obrazowanie w superrozdzielczości białek wydzielanych przez bakterie za pomocą ekspansji kodu genetycznego

Protokół ten opisuje znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) w celu rozwiązywania nanoskalowej organizacji przestrzennej białek błony plazmatycznej. Wykorzystując skumulowane interakcje przeciwciał-epitop na poziomie pojedynczych cząsteczek, błonowy SAL (mSAL) mapuje lokalne rozkłady epitopów, jednocześnie rejestrując zachowanie wiązania przeciwciał w natywnym środowisku komórkowym.

Mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał

Ten protokół przedstawia wydajny proces pracy dla mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek obrazowania izolowanych jąder Arabidopsis, wykorzystując zoptymalizowane izolację, fiksację i etykietowanie, aby osiągnąć niezawodną wizualizację w skali nanometrów chromatyny i RNA Polimerazy II. To podejście można łatwo dostosować do innych białek związanych z chromatyną lub modyfikacji histonów dla wysokiej rozdzielczości obrazowania.

Stworzenie ujednoliconego protokołu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w jądrach Arabidopsis

Opisujemy metodę obrazowania w super-rozdzielczości, aby zbadać strukturalną organizację bakteryjnego pierścienia FtsZ, niezbędnego aparatu do podziału komórek.  Metoda ta opiera się na analizach ilościowych obrazów z mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) i może być stosowana do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu.

Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Dołączanie wirionów do powierzchni jest wymogiem do obrazowania pojedynczego wirionu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości lub mikroskopii sił atomowych (AFM). W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania próbki do kontrolowanej adhezji wirionów do powierzchni szklanych, odpowiednią do stosowania w obrazowaniu AFM i fluorescencji o wysokiej rozdzielczości.

Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości

Naucz się przygotowywać fluorescencyjne próbki testowe do optymalizacji mikroskopii STORM. Poznaj metody akwizycji danych i rekonstrukcji obrazów superrozdzielczych z rozdzielczością 30-50 nm.

Próbki testowe do optymalizacji mikroskopii superrozdzielczej STORM

Przeglądaj więcej filmów