Name: Mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-20T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Poznaj mikroskopię lokalizacyjną pojedynczych cząsteczek do wizualizacji interakcji przeciwciał z białkami błonowymi w komórkach T. Ta metoda umożliwia obserwację nanoskalowych oddziaływań w natywnym środowisku komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tej publikacji zostały wsparte przez National Institute of General Medical Sciences przy National Institutes of Health w ramach Nagrody numer R35GM146786 oraz College of Liberal Arts and Sciences na University of Illinois Chicago. Treść jest wyłącznie odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne poglądy Narodowych Instytutów Zdrowia.

Wszyscy autorzy deklarują, że nie mają konfliktów interesów do ujawnienia.

Organizacja białek błony plazmatycznej odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcjonowania komórek. Konwencjonalne techniki mikroskopii fluorescencyjnej są ograniczone przez granicę dyfrakcyjną światła, co maskuje ich organizację na poziomie nano. SMLM przezwycięża to ograniczenie, osiągając rozdzielczość przestrzenną 10-20 nm47, co umożliwia charakteryzację ich zespołów w skali nanoskalowej: 10,48,49. Artef...

Błona plazmatyczna zawiera różnorodne białka regulujące mobilność komórek, adhezję, wykrywanie oraz komunikację międzykomórkową. Zrozumienie nanoskalowego rozkładu białek błony plazmatycznej jest ważne, ponieważ funkcja białek często zależy nie tylko od poziomu ekspresji, ale także od ich przestrzennej organizacji na błonie 1,2. Co istotne, wiele przeciwciał terapeutycznych celuje w białka błonowe 3,4, co czyni badania na skalę nanobiologiczną niezbędną dla zrozumienia, jak interakcje przeciwciał są wpływane przez lokalną organizację białek błonowych. Jednak precyzyjne mapowanie rozkładu białek błonowych, profilowanie ich liczebności na pojedynczych cząsteczkach oraz monitorowanie w czasie rzeczywistym ich dynamicznych interakcji z partnerami wiążącymi pozostają wyzwaniem.
Szeroko stosowane techniki mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczych cząsteczek (SMLM), takie jak bezpośrednia stochastyczna mikroskopia optyczna rekonstrukcyjna (dSTORM)5,6 oraz akumulacja punktów oparta na DNA do obrazowania w topografii nanoskalowej (DNA-PAINT)7, wykorzystują barwienie immunofluorescencyjne (IF) do oznaczania próbek. Osiągają rozdzielczość boczną ~ 10 nm i dostarczyły szerokich informacji na temat organizacji nanoskalowej celów terapeutycznych błon, w tym ludzkiego receptora czynnika wzrostu naskórnego 2 (HER2)8,9, CD2010, receptorów limfocytów T11,12,13, ligandu zaprogramowanej śmierci 114, receptorów komórek B15, 16, 17 oraz CD1917, 18. Na przykład badania dSTORM z użyciem terapeutycznego przeciwciała monoklonalnego Trastuzumab do bezpośredniego wykrywania HER2, kluczowego receptora powiązanego z rakiem piersi, wykazały wyraźne stany klasteryzacji u pacjentów z HER2 pozytywnymi8, podczas gdy różne przeciwciała terapeutyczne modulowały klasteryzację HER29. DNA-PAINT w połączeniu z mikroskopią lattice light sheet wyjaśniło stany oligomeryczne i profile interakcji CD20 w komórkach B z terapeutycznymi przeciwciałami monoklonalnymi: rytuksymabem, ofatumumab i obinutuzumab10. Chociaż konwencjonalna SMLM dostarcza cennych informacji na temat organizacji w skali nano, jej pełny potencjał jest ograniczony przez tradycyjne metody barwienia IF. Jakość obrazu SMLM zależy od barwienia IF, które z kolei zależy od specyficzności i powinowactwa przeciwciała znakującego. Tradycyjne SMLM wykorzystuje przeciwciała o wysokiej afinitecie, które zazwyczaj osiągają lepsze barwienie IF i jakość obrazu. Jednak większość terapeutycznych przeciwciał oddziałuje z receptorami błonowymi komórek żywych o umiarkowanym powinowactwie, aby zminimalizować skutki uboczne poza celem19. Na przykład bispecyficzne aktywatory komórek T (TCE) wykazują niższą afinitet do CD3, co zapobiega internalizacji TCR 20,21,22. Takich interakcji nie da się dokładnie uchwycić konwencjonalnymi technikami IF.
Wcześniej opracowaliśmy strategię bezpośrednio wykorzystującą interakcje pojedyncząsteczkowych przeciwciał z epitopem, zwaną znakowaniem pojedynczego przeciwciała (SAL). SAL umożliwia mapowanie interakcji przeciwciało-epitop w dużej gęstości, zachowując jednocześnie natywne równowagi wiązania23. Chociaż wcześniej zgłaszaliśmy protokół dlawewnątrzkomórkowych białek cytoszkieletowych i mitochondrialnych, SAL na białkach błonowych nie został jeszcze potwierdzony. W tym protokole przedstawiamy krok po kroku workflow aplikacji SAL do białek błonowych, wykazany poprzez znakowanie tetraspaniny CD81, zgłoszonej terapeutycznej kandydatki docelowej 25,26,27,28, zarówno w komórkach zawiesiny, jak i adherentnych. Wykorzystując fluorescencyjnie znakowane przeciwciała anty-CD81 do bezpośredniego badania przestrzennego rozkładu CD81 na komórkach U2OS i Jurkat T, demonstrujemy zastosowanie badań nanoskalowych białek błonowych SAL. Strategię tę nazwaliśmy błonowym SAL (mSAL). Na koniec opisujemy strategię opartą na klasteryzacji, mającą na celu zmniejszenie izolowanych wykryć pojedynczych cząsteczek poza komórką.
W istocie SAL wykorzystuje poklatkowe oznaczanie pojedynczej cząsteczki do rejestrowania indywidualnych interakcji przeciwciało-epitop, a późniejsza dekonwolucja pojedynczego emitera daje obraz superrozdzielczy oparty na SMLM. Poprzez regulację stężenia przeciwciał i wybór odpowiedniego interwału nieiluminującego (NII) pomiędzy kolejnymi klatkami obrazu, SAL dopasowuje szybkość włączania przeciwciał do szybkości wykrywania pojedynczej cząsteczki, umożliwiając lokalizację pojedynczych cząsteczek. SAL wymaga dłuższych NII ze względu na inherentnie wolną kinetykę wiązania przeciwciał, która wydłuża czas akwizycji obrazu (~3-17 h). SAL najlepiej sprawdza się w zastosowaniach wymagających precyzyjnego mapowania epitopów na skalę nanoskalową oraz oceny dynamiki interakcji pojedynczego przeciwciało z epitopem. Pomimo niższej przepustowości, SAL oferuje unikalny wgląd w organizację epitopów i zaangażowanie przeciwciał w warunkach bliskich fizjologii, co czyni go szczególnie cennym do charakteryzowania terapeutycznych przeciwciał in situ.

<table><tbody><tr><td>przeciwciało anty-CD81 Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-44132</td><td>Przeciwciała obrazowe</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydła</td><td>MilliporeSigma</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Komorowe szkło pokrywowe, 8-dołkowe</td><td>Cellvis</td><td>C8-1-N</td><td></td></tr><tr><td>Nośniki DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowa sól fizjologiczna Dulbecco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydła płodowa</td><td>MilliporeSigma</td><td>F0926-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd, 10%</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Złote koloidy, 100 nm</td><td>Ted Pella</td><td>15711 i minus; 20</td><td>Znacznik powierniczy</td></tr><tr><td>Olej immersyjny&nbsp;</td><td>Laboratoria Cargille</td><td>16245</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony&nbsp; wyposażony w moduł TIRF</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse Ti2-E</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Linia komórkowa Jurkat E6.1</td><td>MilliporeSigma</td><td>88042803-1VL</td><td>Komórki zawiesiny</td></tr><tr><td>Wystrzelenie laserowe, 6 linii</td><td>Oxxius</td><td>L6CC-CS8-1511</td><td>Laser wzbudzający</td></tr><tr><td>Lipofektamina 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Odczynnik transfekcyjny</td></tr><tr><td>Rurka mikrowirówkowa, 1,5 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego</td><td>Nikon Instruments</td><td>Zaawansowane badania NIS-Elements</td><td>Oprogramowanie do pozyskiwania obrazów</td></tr><tr><td>Cel, 100x/1,49 CFI APO TIRF&nbsp;</td><td>Nikon Instruments</td><td>MRD01991</td><td>Cel mikroskopowy</td></tr><tr><td>Paradehyd, 16%</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-Lizyny, 0,01%&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>P4707-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Aparat Prime 95B sCMOS</td><td>Teledyne Vision Solutions</td><td>01-PRIME-95B-R-M-16-C</td><td>Kamera</td></tr><tr><td>Nośniki RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td>Medium dla ogniw zawiesinowych</td></tr><tr><td>Azyd sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19038-1000</td><td></td></tr><tr><td>Borowodnikiem sodu</td><td>MilliporeSigma</td><td>213462-25G</td><td></td></tr><tr><td>Flaszki kultury T25</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>169900</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosfery TetraSpeck</td><td></td><td></td><td>Znacznik powierniczy</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkanek, 100 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>Komórki przylegające</td></tr></tbody></table>

mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał

Single-Molecule Localization Microscopy of Membrane Proteins using Single-Antibody Labeling

Błona plazmatyczna definiuje kształt komórki i pełni rolę interfejsu sterującego komunikacją międzykomórkową. Białka błonowe stanowią główną klasę celów terapeutycznych; Dlatego superrozdzielenie błony komórkowej poprzez białka konstytutywne niesie wielkie szanse na rozwój biologii komórkowej i terapii przeciwciałami. W tym kontekście mikroskopia lokalizacyjna pojedynczych cząsteczek (SMLM) umożliwia wizualizację organizacji białek na skali nanoskalowej na strukturach biologicznych. Pomimo swojego znaczenia, zastosowanie SMLM do białek błony plazmatycznej stawia przed sobą wyjątkowe wyzwania. W tym protokole przedstawiamy skuteczne podejście wykorzystujące znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) poklatkowe, zwane błonowym SAL (mSAL). Dostarczamy szczegółowe instrukcje krok po kroku, w tym optymalizację stężenia przeciwciał, gęstości mocy lasera, czasu trwania interwałów nieiluminacyjnych, rekonstrukcję obrazów oraz analizę klastrów opartą na gęstości, aby rozwiązywać rozkład białek błonowych nanoskalowych i morfologię błony. Używamy białka tetraspaniny CD81 jako modelowego białka błonowego, aby wykazać zdolność mSAL zarówno na komórek ssaków przylegających, jak i zawiesinowych. Oprócz superrozdzielczości błony komórkowej i rozkładu białek błonowych, nasza technika umożliwia badanie farmakodynamiki przeciwciał terapeutycznych oddziałujących z ich celami błonowymi w naturalnym środowisku błonowym.

Technika mSAL opisana w tym protokole umożliwia wizualizację zdarzeń wiązania pojedynczych przeciwciał z odpowiadającymi im celami białek błony plazmatycznej, tworząc superrozdzielczą mapę rozkładu białek błonowych. CD81 jest tutaj używany jako reprezentatywny przykład, choć podejście to jest łatwo adaptowalne do innych białek błonowych.
Unieruchomienie komórek Jurkat T przy odpowiedniej odległości między komórkami zapewnia dostęp membranowych epitopów przez przeciwciała i szklaną powierzchnię...

Protokół ten opisuje znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) w celu rozwiązywania nanoskalowej organizacji przestrzennej białek błony plazmatycznej. Wykorzystując skumulowane interakcje przeciwciał-epitop na poziomie pojedynczych cząsteczek, błonowy SAL (mSAL) mapuje lokalne rozkłady epitopów, jednocześnie rejestrując zachowanie wiązania przeciwciał w natywnym środowisku komórkowym.

Mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał

The plasma membrane defines the cell shape and serves as the interface that governs intercellular communication. Membrane proteins constitute a major ...

Moje badania koncentrują się na błonie komórek T i mają na celu ujawnienie nowych nanoskalowych spostrzeżeń istotnych dla celów terapeutycznych. Istniejące metody obrazowania zazwyczaj nie wizualizują bezpośrednio interakcji przeciwciał z epitopem na skali nanoskalowej w komórkach. Protokół ten przezwycięża to ograniczenie, umożliwiając bezpośrednią obserwację w środowisku komórkowym.Po zamontowaniu próbki na mikroskopie i naniesieniu złotych koloidów na powierzchnię, użyj oświetlenia jasnego pola, aby zweryfikować, czy wystarczająca liczba koloidów została zdeponowana w interesującym obszarze. Przed dalszym działaniem należy potwierdzić, że idealna gęstość 5 do 10 złotych koloidów znajduje się w interesującym obszarze. Aby uzyskać optyczną konfigurację fluoroforu sondy przeciwciała, otwórz oprogramowanie obrazujące i uzyskaj dostęp do ustawień konfiguracji optycznej.Wybierz odpowiednie lustro dichroiczne i ustaw długość fali wzbudzenia lasera oraz gęstość mocy. Dostosuj czas integracji aparatu i wybierz filtr emisji. Następnie ustaw binning pikseli kamery na rozmiar piksela od 150 do 160 nanometrów.Teraz stwórz konfigurację optyczną dla etapu wybielania zdjęć, wybierając tryb wybielania zdjęć w oprogramowaniu obrazującym. Ustaw moc lasera na 100% i dostosuj czas integracji kamery na jedną sekundę. Ustaw parametry obrazowania w oprogramowaniu do akwizycji obrazu, definiując interwał nieiluminacyjny, liczbę klatek oraz częstotliwość procesu wybielania zdjęć.Następnie przygotuj bufor obrazowy, rozcieńczając przeciwciało CD81 do stężenia 1 mikrogram na mililitr w 200 mikrolitrach 5% BSA wyprodukowanych w DPBS. Ostateczne zalecane stężenie przeciwciał to 0,5 nanomola dla komórek Jurkat T, lub 2 nanomolary dla komórek U-2 OS. Dodaj przygotowany bufor obrazowania do studni zawierającej komórki i rozpocznij akwizycję obrazu w oprogramowaniu, aby rozpocząć zbieranie danych.Użyj funkcji podglądu na żywo w oprogramowaniu obrazującym skonfigurowanym do oznaczania pojedynczych przeciwciał błonowych, aby monitorować wiązanie przeciwciał w czasie rzeczywistym. Konfiguruj parametry obrazowania w oprogramowaniu do akwizycji obrazu, aby uzyskać co najmniej 10 klatek i ustaw interwał nieoświetlający na pięć sekund. Rozpocznij akwizycję i oceń rzadkość lokalizacji pojedynczych cząsteczek w nagranym filmie.Jeśli po dodaniu buforu obrazowego zaobserwuje się wiele nakładających się na siebie zdarzeń wiązania przeciwciał lub jeśli lokalizacje pojedynczych cząsteczek kumulują się w czasie, przerwij akwizycję. Zmniejsz stężenie przeciwciał dwukrotnie i powtórz pobieranie na nowej próbce. Kontynuuj dwukrotne zmniejszanie stężenia przeciwciał i ponowną ocenę liczby zdarzeń na jednostkę powierzchni, aż osiągniesz pożądaną gęstość lokalizacji pojedynczej cząsteczki.Jeśli gęstość zdarzeń jest rzadka, zwiększ stężenie przeciwciał w buforze obrazowym dwukrotnie. Powtórz pobieranie na nowej próbce i kontynuuj dwukrotne zwiększenie stężenia przeciwciał, jednocześnie ponownie oceniając liczbę zdarzeń wiązania na jednostkę powierzchni, aż osiągniesz pożądaną gęstość lokalizacji pojedynczej cząsteczki. Dla optymalizacji interwałów nieiluminujących skonfiguruj parametry obrazowania w oprogramowaniu do akwizycji obrazu, aby uzyskać akwizycję 50 klatek.Po dodaniu przeciwciał i rozpoczęciu akwizycji oceń gęstość i rzadkość lokalizacji pojedynczych cząsteczek w nagranym filmie. Określ najniższy przedział nieoświetlający, który daje optymalną gęstość zdarzeń pojedynczych cząsteczek. Na koniec, jeśli podczas akwizycji pojawią się przestrzennie nakładające się zdarzenia wiązania, wprowadź etap wybielania zdjęć w regularnych odstępach czasu.Dostosuj częstotliwość fotowybielania tak, aby fluorescencja z powiązanych przeciwciał została usunięta przed nagromadzeniem się nakładających się zdarzeń. Ustaw ścieżkę pliku w oprogramowaniu MATLAB na folder, który zawiera zrekonstruowany plik wartości rozdzielonych przecinkami komórek M. Uruchom kod, klikając Uruchom w pasku narzędzi MATLAB.Po zapytaniu wybierz plik CSV komórki M i kliknij Otwórz, aby załadować go do programu. Przeprowadź analizę, korzystając z wcześniej zdefiniowanych danych wejściowych jako punktu wyjścia. Ocena wykresu rozrzutowego zawierającego dane lokalizacji nieskupionej.Wybierz minimalną wartość punktową wyższą niż liczba lokalizacji szumów, ale mniejszą niż liczba lokalizacji na komórce. Oceń okno przedstawiające zgrupowane dane. Potwierdź, że skupiska pozostają na komórce o oczekiwanym fenotypie, podczas gdy lokalizacje poza komórką są minimalizowane.Jeśli parametry klastrowania są zbyt restrykcyjne, zmniejsz minimalną wartość punktów i zwiększ epsilon. Jeśli parametry klastrowania są zbyt obszerne, zwiększ minimalną wartość punktów i zmniejsz epsilon. Na koniec, po dostosowaniu minimalnej wartości punktów i epsilonu, ponownie uruchom kod, aby uzyskać optymalne klastry.Komórki Jurkat T zostały unieruchomione z odpowiednimi odstępami, aby zachować integralność błony i umożliwić dostęp przeciwciał do epitopów błonowych. Złote koloidy były wizualizowane i wykorzystywane jako znaczniki fiducial do korekcji dryfu bocznego podczas pozyskiwania obrazu komórek M. Optymalizacja interwału nieiluminacyjnego wykazała, że pięciosekundowy odstęp powoduje zdarzenia wiązania przeciwciał z minimalnym nakładaniem się przestrzennym w porównaniu do krótszych lub dłuższych interwałów przy stężeniu jednego nanomolowego przeciwciała.Zastosowanie korekcji dryfu poprawiło zrekonstruowany obraz komórki M w porównaniu do nieskorygowanej rekonstrukcji. Klasteryzacja lokalizacji komórek M oparta na gęstości ograniczyła interakcje tła o niskiej gęstości i uwidoczniła zdarzenia wiązania CD81 w klastrasach. Możemy obserwować przeciwciała oddziałujące z ich błonowymi epitopami w środowisku komórkowym, dostarczając wglądu istotnego do przeciwciał terapeutycznych.Stężenie przeciwciał, interwał bez oświetlenia oraz etapy fotobielenia są kluczowe dla optymalizacji. Parametry suboptymalne mogą wpłynąć na wyniki. Znakowanie pojedynczych przeciwciał może być rozszerzone o jednoczesną ocenę wiązania błony białkowej przez wiele przeciwciał w tym samym środowisku komórkowym.

single-molecule-localization-microscopy-membrane-proteins-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Demonstrujemy metodę obrazowania wielu cząsteczek w heterogenicznych nanostrukturach z dokładnością do pojedynczej cząsteczki, wykorzystując sekwencyjne wiązanie i elucję fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał.

Wysoce multipleksowane obrazowanie limfocytów T w superrozdzielczości przy użyciu madSTORM

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Przedstawiamy protokół do optycznego wykrywania pojedynczych, nieznakowanych białek w czasie rzeczywistym, gdy są wydzielane z żywych komórek. Opiera się to na mikroskopii rozpraszania interferometrycznego (iSCAT), która może być stosowana do wielu różnych systemów i konfiguracji biologicznych.

Bezznacznikowe obrazowanie pojedynczych białek wydzielanych z żywych komórek za pomocą mikroskopii iSCAT

Tutaj prezentujemy protokół do oceny jednorodności etykietowania dla każdego gatunku białka w złożonej próbce białka na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek 3D jest wykorzystywana do badania pozycji przestrzennych i trajektorii ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny i analizy danych określa dominujące zachowania dyfuzyjne białek cytozolowych w oparciu o zbiorcze trajektorie pojedynczych cząsteczek.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Ten protokół opisuje oparte na iSCAT przetwarzanie obrazów i śledzenie pojedynczych cząstek, które umożliwia jednoczesne badanie masy cząsteczkowej i dyfuzyjnego zachowania makrocząsteczek oddziałujących z błonami lipidowymi. Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki, konwersji masy na kontrast, akwizycji filmu i obróbki końcowej są dostępne wraz ze wskazówkami, aby zapobiec potencjalnym pułapkom.

Śledzenie cząstek czułych na masę w celu scharakteryzowania dynamiki makrocząsteczek związanych z błoną

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj mikroskopię lokalizacyjną pojedynczych cząsteczek do wizualizacji interakcji przeciwciał z białkami błonowymi w komórkach T. Ta metoda umożliwia obserwację nanoskalowych oddziaływań w natywnym środowisku komórkowym.

Mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał

Przeglądaj więcej filmów