Mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał

Moje badania koncentrują się na błonie komórek T i mają na celu ujawnienie nowych nanoskalowych spostrzeżeń istotnych dla celów terapeutycznych. Istniejące metody obrazowania zazwyczaj nie wizualizują bezpośrednio interakcji przeciwciał z epitopem na skali nanoskalowej w komórkach. Protokół ten przezwycięża to ograniczenie, umożliwiając bezpośrednią obserwację w środowisku komórkowym.

Po zamontowaniu próbki na mikroskopie i naniesieniu złotych koloidów na powierzchnię, użyj oświetlenia jasnego pola, aby zweryfikować, czy wystarczająca liczba koloidów została zdeponowana w interesującym obszarze. Przed dalszym działaniem należy potwierdzić, że idealna gęstość 5 do 10 złotych koloidów znajduje się w interesującym obszarze. Aby uzyskać optyczną konfigurację fluoroforu sondy przeciwciała, otwórz oprogramowanie obrazujące i uzyskaj dostęp do ustawień konfiguracji optycznej.

Wybierz odpowiednie lustro dichroiczne i ustaw długość fali wzbudzenia lasera oraz gęstość mocy. Dostosuj czas integracji aparatu i wybierz filtr emisji. Następnie ustaw binning pikseli kamery na rozmiar piksela od 150 do 160 nanometrów.

Teraz stwórz konfigurację optyczną dla etapu wybielania zdjęć, wybierając tryb wybielania zdjęć w oprogramowaniu obrazującym. Ustaw moc lasera na 100% i dostosuj czas integracji kamery na jedną sekundę. Ustaw parametry obrazowania w oprogramowaniu do akwizycji obrazu, definiując interwał nieiluminacyjny, liczbę klatek oraz częstotliwość procesu wybielania zdjęć.

Następnie przygotuj bufor obrazowy, rozcieńczając przeciwciało CD81 do stężenia 1 mikrogram na mililitr w 200 mikrolitrach 5% BSA wyprodukowanych w DPBS. Ostateczne zalecane stężenie przeciwciał to 0,5 nanomola dla komórek Jurkat T, lub 2 nanomolary dla komórek U-2 OS. Dodaj przygotowany bufor obrazowania do studni zawierającej komórki i rozpocznij akwizycję obrazu w oprogramowaniu, aby rozpocząć zbieranie danych.

Użyj funkcji podglądu na żywo w oprogramowaniu obrazującym skonfigurowanym do oznaczania pojedynczych przeciwciał błonowych, aby monitorować wiązanie przeciwciał w czasie rzeczywistym. Konfiguruj parametry obrazowania w oprogramowaniu do akwizycji obrazu, aby uzyskać co najmniej 10 klatek i ustaw interwał nieoświetlający na pięć sekund. Rozpocznij akwizycję i oceń rzadkość lokalizacji pojedynczych cząsteczek w nagranym filmie.

Jeśli po dodaniu buforu obrazowego zaobserwuje się wiele nakładających się na siebie zdarzeń wiązania przeciwciał lub jeśli lokalizacje pojedynczych cząsteczek kumulują się w czasie, przerwij akwizycję. Zmniejsz stężenie przeciwciał dwukrotnie i powtórz pobieranie na nowej próbce. Kontynuuj dwukrotne zmniejszanie stężenia przeciwciał i ponowną ocenę liczby zdarzeń na jednostkę powierzchni, aż osiągniesz pożądaną gęstość lokalizacji pojedynczej cząsteczki.

Jeśli gęstość zdarzeń jest rzadka, zwiększ stężenie przeciwciał w buforze obrazowym dwukrotnie. Powtórz pobieranie na nowej próbce i kontynuuj dwukrotne zwiększenie stężenia przeciwciał, jednocześnie ponownie oceniając liczbę zdarzeń wiązania na jednostkę powierzchni, aż osiągniesz pożądaną gęstość lokalizacji pojedynczej cząsteczki. Dla optymalizacji interwałów nieiluminujących skonfiguruj parametry obrazowania w oprogramowaniu do akwizycji obrazu, aby uzyskać akwizycję 50 klatek.

Po dodaniu przeciwciał i rozpoczęciu akwizycji oceń gęstość i rzadkość lokalizacji pojedynczych cząsteczek w nagranym filmie. Określ najniższy przedział nieoświetlający, który daje optymalną gęstość zdarzeń pojedynczych cząsteczek. Na koniec, jeśli podczas akwizycji pojawią się przestrzennie nakładające się zdarzenia wiązania, wprowadź etap wybielania zdjęć w regularnych odstępach czasu.

Dostosuj częstotliwość fotowybielania tak, aby fluorescencja z powiązanych przeciwciał została usunięta przed nagromadzeniem się nakładających się zdarzeń. Ustaw ścieżkę pliku w oprogramowaniu MATLAB na folder, który zawiera zrekonstruowany plik wartości rozdzielonych przecinkami komórek M. Uruchom kod, klikając Uruchom w pasku narzędzi MATLAB.

Po zapytaniu wybierz plik CSV komórki M i kliknij Otwórz, aby załadować go do programu. Przeprowadź analizę, korzystając z wcześniej zdefiniowanych danych wejściowych jako punktu wyjścia. Ocena wykresu rozrzutowego zawierającego dane lokalizacji nieskupionej.

Wybierz minimalną wartość punktową wyższą niż liczba lokalizacji szumów, ale mniejszą niż liczba lokalizacji na komórce. Oceń okno przedstawiające zgrupowane dane. Potwierdź, że skupiska pozostają na komórce o oczekiwanym fenotypie, podczas gdy lokalizacje poza komórką są minimalizowane.

Jeśli parametry klastrowania są zbyt restrykcyjne, zmniejsz minimalną wartość punktów i zwiększ epsilon. Jeśli parametry klastrowania są zbyt obszerne, zwiększ minimalną wartość punktów i zmniejsz epsilon. Na koniec, po dostosowaniu minimalnej wartości punktów i epsilonu, ponownie uruchom kod, aby uzyskać optymalne klastry.

Komórki Jurkat T zostały unieruchomione z odpowiednimi odstępami, aby zachować integralność błony i umożliwić dostęp przeciwciał do epitopów błonowych. Złote koloidy były wizualizowane i wykorzystywane jako znaczniki fiducial do korekcji dryfu bocznego podczas pozyskiwania obrazu komórek M. Optymalizacja interwału nieiluminacyjnego wykazała, że pięciosekundowy odstęp powoduje zdarzenia wiązania przeciwciał z minimalnym nakładaniem się przestrzennym w porównaniu do krótszych lub dłuższych interwałów przy stężeniu jednego nanomolowego przeciwciała.

Zastosowanie korekcji dryfu poprawiło zrekonstruowany obraz komórki M w porównaniu do nieskorygowanej rekonstrukcji. Klasteryzacja lokalizacji komórek M oparta na gęstości ograniczyła interakcje tła o niskiej gęstości i uwidoczniła zdarzenia wiązania CD81 w klastrasach. Możemy obserwować przeciwciała oddziałujące z ich błonowymi epitopami w środowisku komórkowym, dostarczając wglądu istotnego do przeciwciał terapeutycznych.

Stężenie przeciwciał, interwał bez oświetlenia oraz etapy fotobielenia są kluczowe dla optymalizacji. Parametry suboptymalne mogą wpłynąć na wyniki. Znakowanie pojedynczych przeciwciał może być rozszerzone o jednoczesną ocenę wiązania błony białkowej przez wiele przeciwciał w tym samym środowisku komórkowym.