Wysokoprzepustowa mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia i bezpośredniej stochastycznej rekonstrukcji optycznej z wykorzystaniem chipa fotonicznego
16 listopada 2019
Mikroskopia optyczna oparta na chipach jest nowatorskim podejściem do mikroskopii fluorescencyjnej i oferuje korzyści w zakresie efektywności kosztowej i przepustowości. W tym miejscu przedstawiono protokoły przygotowania i obrazowania chipów dla mikroskopii TIRF i mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji.
Głównym celem tego manuskryptu jest przedstawienie procedury obrazowania nowo opracowanej mikroskopii TIRF opartej na chipach fotonicznych i mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek, takiej jak dSTORM. Głównym elementem jest tutaj chip fotoniczny, który jest wykonany z szeregu falowodów optycznych. Światło wewnątrz falowodu optycznego jest kierowane w oparciu o całkowite odbicie wewnętrzne.
Część światła jest obecna na powierzchni w postaci ulotnych fal. Te ulotne fale rozpadają się wykładniczo od powierzchni, a ich głębokość penetracji wynosi kilkaset nanometrów. Dzięki temu nadają się do oświetlenia TIRF.
Oświetlenie TIRF za pomocą falowodu optycznego jest dostępne na bardzo dużym obszarze, który jest zdefiniowany przez geometrię falowodu, dzięki czemu idealnie nadaje się do obrazowania o wysokiej przepustowości. Kluczowa różnica między tradycyjną konfiguracją TIRF i dSTORM w porównaniu z naszym podejściem polega na tym, że używamy chipa fotonicznego do oświetlenia próbki, zamiast wysyłać światło przez soczewkę obiektywu obrazującego. Nasze podejście oddziela oświetlenie od części świetlnej kolekcji, otwierając nowe możliwości obrazowania.
Umieść chip na szklanej szalce Petriego za pomocą pęsety waflowej i całkowicie przykryj 1% roztworem Hellmanex. Umieść szalkę Petriego na płycie grzejnej w temperaturze 70 stopni na 10 minut. Będąc jeszcze na płycie grzejnej, przetrzyj powierzchnię wacikiem do tkanek do pomieszczeń czystych.
Usuń wiór z szalki Petriego. Spłucz co najmniej 100 mililitrami wody dejonowej. Spłucz co najmniej 100 mililitrami izopropanolu, uważając, aby rozpuszczalnik nie wyschł na powierzchni, aby zapobiec plamom z parowania.
Spłucz co najmniej 100 mililitrami wody dejonowej. Wydmuchaj wiór do sucha za pomocą pistoletu do azotu. Przygotuj późniejszy PDMS o wielkości 150 mikrometrów, obracając go na szalce Petriego.
Użyj skalpela, aby wyciąć ramkę o wymiarach około 1,5 na 1,5 centymetra z warstwy PDMS. Podnieś ramkę z szalki Petriego za pomocą pęsety. Umieść go płasko na czystym i wypolerowanym chipie.
Próbka jest teraz gotowa do wysiewu komórek. Po wysianiu komórek usuń chip z podłoża. Użyj pipety, aby usunąć nadmiar płynu spoza komory PDMS.
Usuń bieżący płyn z wnętrza komory PDMS za pomocą pipety, dodając jednocześnie około 60 mikrolitrów czystego PBS. Zastąp PBS czystym PBS o pojemności 60 mikrolitrów i pozwól mu inkubować przez minutę. Powtórz poprzedni krok, tym razem pozwalając mu inkubować przez pięć minut.
Usuń PBS i zastąp go 60 mikrolitrami roztworu barwnika. Pozostawić próbkę do inkubacji na około 15 minut, osłaniając ją przed światłem. Przemyć próbkę PBS, stosując poprzednio opisaną procedurę.
Usuń PBS i zastąp go jednocześnie 40 mikrolitrami buforu do obrazowania. Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu, zapobiegając tworzeniu się pęcherzyków powietrza pod spodem. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do komory obrazowania, aby usunąć nadmiar nośnika.
Za pomocą pipety usunąć nadmiar podłoża poza szkiełko nakrywkowe. Oczyść obszar na zewnątrz szkiełka nakrywkowego wilgotnym wacikiem, aby uniknąć kryształów utworzonych przez wysuszone pozostałości mediów zanurzeniowych. Ta wersja konfiguracji składa się z trzech głównych komponentów.
Mikroskop z uchwytem filtra, źródłem światła białego, kamerą i rewolwerem obiektywowym. Stopień sprzęgający, który jest trójosiowym stopniem piezoelektrycznym, z laserem sprzężonym z światłowodem i soczewką sprzęgającą. Stolik na próbki, który jest jednoosiowym stolikiem ręcznym, z końcówką i pochyleniem, z uchwytem próżniowym.
Zarówno sprzęgło, jak i stolik na próbkę są zamontowane na dwuosiowym stoliku z napędem do translacji próbki. Umieść wiór na wózku próżniowym, stroną sprzęgającą skierowaną w stronę celu sprzęgania. Upewnij się, że chip znajduje się w odległości około jednej ogniskowej od obiektywu sprzęgającego.
Włącz pompę próżniową. Włącz laser na jeden miliwat. Z grubsza dostosuj wysokość wióra tak, aby belka uderzała w jego krawędź.
Wyłącz laser. Włącz źródło białego światła. Wybierz obiektyw o małym powiększeniu, na przykład 10x.
Ustaw ostrość mikroskopu na falowodzie. Przesuń mikroskop wzdłuż falowodu, aby sprawdzić, czy jest dobrze wyrównany ze ścieżką optyczną. Przysunąć mikroskop do krawędzi sprzęgającej.
Włącz laser o mocy jednego miliwata lub mniejszej. Przesuń mikroskop wzdłuż krawędzi sprzęgającej, aby znaleźć światło lasera. Skoncentruj wiązkę na krawędzi wióra.
Wyreguluj stopień sprzężenia wzdłuż ścieżki optycznej w kierunku, który zmniejsza rozmiar plamki wiązki laserowej, aż zniknie. Belka znajduje się teraz nad lub pod powierzchnią wióra. Dostosuj wysokość stopnia sprzęgania, aż punkt wiązki pojawi się ponownie i zostanie zmaksymalizowany.
Powtarzaj dwa poprzednie kroki, aż laser utworzy skupiony punkt. Przesuń zogniskowany punkt na interesujący Cię falowód. Przesuń mikroskop na niewielką odległość od krawędzi, tak aby skupiona plamka wiązki nie była już widoczna.
Wyłącz białe światło. Dostosuj kontrast. Jeśli falowód jest prowadzony, światło rozproszone wzdłuż falowodu powinno być wyraźnie widoczne.
Dostosuj oś stopnia sprzęgającego, aby zmaksymalizować intensywność rozproszonego światła. Wyłącz laser. Włącz białe światło.
W razie potrzeby dostosuj kontrast. Przejdź do regionu obrazowania. Skoncentruj się na żądanym celu wyobrażenia.
Wyłącz białe światło. Włóż filtr fluorescencyjny i zmniejsz moc lasera do jednego miliwata. Ustaw czas ekspozycji aparatu na około 100 milisekund.
Dostosuj kontrast zgodnie z potrzebami. Upewnij się, że sprzęgło jest nadal zoptymalizowane. Zlokalizuj obszar zainteresowania do obrazowania.
Włącz pętlę piezoelektrycznego stage, aby uśrednić węzły. Zrób co najmniej 300 zdjęć. Załaduj przechwycony stos obrazów na Fidżi za pomocą wirtualnego stosu.
Z menu obrazu na Fidżi wybierz Stosy i Projekt Z. Oblicz obraz TIRF, wybierając Typ projekcji, Średnia intensywność. Włącz laser na jeden miliwat i ustaw czas ekspozycji aparatu na 30 milisekund.
Dostosuj kontrast i ostrość. Zwiększaj moc lasera, aż do momentu zaobserwowania mrugania. Powiększ mały obszar próbki.
Dostosuj kontrast. Zrób kilka zdjęć, aby sprawdzić, czy mrugnięcia są dobrze oddzielone. Dostosuj czas ekspozycji aparatu, aby uzyskać optymalne.
Włącz piezoelektryczny stage zapętlenie. Nagraj stos obrazów składający się z co najmniej 30 000 klatek, w zależności od gęstości. Otwórz Fidżi i załaduj stos dSTORM jako obrazy wirtualne.
W razie potrzeby dostosuj kontrast. Użyj narzędzia prostokąt, aby zaznaczyć obszar, który chcesz zrekonstruować. Otwórz Uruchom analizę we wtyczce ThunderSTORM na Fidżi.
Ustaw podstawowe ustawienia kamery w ThunderSTORM, odpowiadające Twojemu urządzeniu. Pozostałe parametry domyślne są zazwyczaj zadowalające. Rozpocznij odbudowę.
Lista lokalizacji dostarczana przez oprogramowanie do rekonstrukcji jest filtrowana w celu usunięcia nieokreślonych lokalizacji. W razie potrzeby stosowana jest dodatkowa korekta dryftu. Główna różnica między obrazowaniem opartym na chipach a tradycyjnym obrazowaniem polega na oprzyrządowaniu i pozyskiwaniu danych.
Jakość zrekonstruowanych obrazów można zatem ocenić w taki sam sposób, jak obraz z komercyjnego mikroskopu superrozdzielczego. Ponieważ stosowane są falowody wielomodowe, uzyskany obraz może jednak wykazywać niejednorodne wzbudzenie, jeśli zbierze się zbyt mało obrazów. Jest to pokazane w panelu a.
Zwiększenie ilości wzorców wzbudzenia powinno skutkować niejednorodnym wzbudzeniem, jak pokazano w panelu b. Tutaj zobrazowaliśmy sinusoidalną komórkę śródbłonka wątroby z fluorescencyjnie znakowaną błoną plazmatyczną. Panele a i b są obrazami ograniczonymi dyfrakcją.
Panel c pokazuje ograniczony dyfrakcją obraz wstawki w panelu b. Panel d pokazuje obraz dSTORM tego samego obszaru. Sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby mają w błonie plazmatycznej nano-rozmiarowe otwory, które są wyraźnie widoczne na obrazie o wysokiej rozdzielczości w panelu d.
Jedną z głównych zalet obrazowania superrozdzielczego opartego na chipach jest duże pole widzenia, które jest osiągalne. Panel A przedstawia obraz dSTORM o wymiarach 500 mikronów na 500 mikronów sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby z mikrotubuliną znakowaną fluorescencyjnie. Panel b przedstawia wstawkę w kolorze magenta z panelu a, z obrazami o ograniczonej dyfrakcji i o wysokiej rozdzielczości dla porównania.
Panel c pokazuje zieloną wstawkę z panelu a. Rozdzielczość przechwyconego obrazu wynosi 77 nanometrów. W tym filmie przeprowadziliśmy obrazowanie TIRF i dSTORM w dużym polu widzenia sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby przy użyciu chipa fotonicznego do oświetlenia.
Nasza metoda jest mniej złożona, bardziej kompaktowa i bardziej elastyczna niż konwencjonalny sposób wykonywania TIRF przy użyciu obiektywu mikroskopowego o z góry określonej aperturze numerycznej i niskim polu widzenia. Mikroskopia lokalizacyjna, taka jak dSTORM, jest jedną z kilku technik obrazowania o wysokiej rozdzielczości, które badaliśmy przy użyciu chipa fotonicznego. Na przykład światło może być znacznie ściślej zamknięte w materiale falowodu optycznego o wysokim współczynniku załamania światła, niż jest to możliwe przy użyciu soczewki obiektywu do obrazowania.
Ta właściwość oświetlenia chipowego znalazła zastosowanie w zwiększaniu rozdzielczości metody mikroskopii optycznej opartej na fluktuacjach intensywności i mikroskopii oświetlenia strukturalnego. Ponadto chipy fotoniczne korzystają również z miniaturyzacji, opłacalności i prostej konfiguracji optycznej. Bycie zintegrowaną technologią sprawia, że jest kompatybilna z innymi wbudowanymi funkcjami optycznymi.
Łącznie umożliwia to doposażenie w konwencjonalne mikroskopy z ograniczoną dyfrakcją, co pozwala na uzyskanie superrozdzielczości przy niskich kosztach.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia nowatorską technikę nadrozdzielczej mikroskopii optycznej w układzie na chipie, koncentrując się na mikroskopii TIRF oraz mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek. Szczegółowo opisano protokoły przygotowania chipa oraz obrazowania, podkreślając zalety tego podejścia w zakresie efektywności kosztowej i wydajności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia fluorescencyjna
- Obrazowanie o superrozdzielczości
- Technologia chipów fotonicznych
Wstęp
- Tradycyjna mikroskopia TIRF opiera się na oświetleniu za pomocą obiektywu.
- Chipu fotoniczne wykorzystują falowody optyczne do prowadzenia światła.
- Fale ewanescentne umożliwiają obrazowanie o wysokiej rozdzielczości na poziomie powierzchni.
- Metoda ta zwiększa obszar obrazowania oraz przepustowość.
Cel badania
- Zaprezentowanie nowej procedury obrazowania z wykorzystaniem mikroskopii TIRF opartej na chipach fotonicznych.
- Porównanie tradycyjnych metod z podejściem opartym na chipach.
- Przedstawienie szczegółowych protokołów przygotowania chipów oraz obrazowania.
Zastosowane metody
- Przygotowanie chipów fotonicznych z wykorzystaniem falowodów optycznych.
- Protokoły wysiewania i inkubacji komórek w celu przygotowania próbek.
- Układ obrazowania obejmujący mikroskop, laser i kamerę.
- Akwizycja i przetwarzanie obrazów przy użyciu oprogramowania Fiji.
Główne wyniki
- Skuteczna demonstracja możliwości obrazowania wysokoprzepustowego.
- Wyraźna widoczność światła rozproszonego wzdłuż falowodu.
- Efektywna lokalizacja pojedynczych cząsteczek przy użyciu nowego układu.
- Poprawiona rozdzielczość obrazowania w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
Wnioski
- Podejście oparte na chipach oferuje znaczące zalety w mikroskopii fluorescencyjnej.
- Rozdzielenie oświetlenia i zbierania sygnału zwiększa możliwości obrazowania.
- Metoda ta toruje drogę do przyszłych osiągnięć w mikroskopii superrozdzielczej.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Nanoskopia oparta na chipach rozdziela ścieżki wzbudzenia i detekcji, co umożliwia obrazowanie TIRF z dużym polem widzenia przy zastosowaniu optyki o niskim powiększeniu. Podejście to wspiera wysokoprzepustowe obrazowanie o superrozdzielczości przy zachowaniu rozdzielczości porównywalnej z metodami tradycyjnymi, eliminując wąskie gardła na etapie odkrywania w walidacji celów oraz screeningu fenotypowym. Technika ta zwiększa pewność prognostyczną, dostarczając ilościowych i powtarzalnych danych obrazowania subkomórkowego w skalowalnych obszarach próbek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie struktur podkomórkowych, takich jak fenestracje komórek śródbłonka zatok wątrobowych oraz organizacja błony plazmatycznej, z rozdzielczością 76 nm.
- Wartość operacyjna: Rozdzielenie oświetlenia od detekcji pozwala na stosowanie obiektywów o niskim powiększeniu, co zwiększa pole widzenia w analizie zaangażowania celu na poziomie populacyjnym.
- Wartość prognostyczna: Obrazowanie dSTORM na dużych obszarach zapewnia statystyczną wiarygodność w lokalizacji celów oraz ocenie heterogeniczności.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Jednorodna ekscytacja falą ewanescentną w obszarach zdefiniowanych przez falowód umożliwia spójną lokalizację pojedynczych cząsteczek podczas odczytu wyników analizy.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność ze standardowymi mikroskopami oraz integracja na chipie wspierają standaryzację analiz i ich ponowne wykorzystanie w kampaniach badawczych.
- Skalowalność: Wykazany obszar obrazowania 500 µm x 500 µm umożliwia multipleksowe testowanie warunków w ramach jednej akwizycji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Obrazowanie LSEC w kontekście chorobowym potwierdza przydatność w modelach patofizjologii śródbłonka.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wizualizacja cech błonowych w nanoskali z superrozdzielczością pomaga w zrozumieniu przestrzennych zależności między lekiem a celem.
- Zgodność przedkliniczna: Rozdzielczość i wydajność wspierają badania lokalizacji biomarkerów w układach pierwotnych lub pochodzących z komórek macierzystych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w procesy od wczesnego etapu odkrywania po identyfikację wiodących związków, dostarczając odczyty o superrozdzielczości, które pozwalają ocenić pewność wyboru celu oraz powtarzalność testu przed rozpoczęciem przesiewu związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez bezpośrednią wizualizację lokalizacji i klastrowania celu w natywnych środowiskach błonowych.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki mierzalnym danym o lokalizacji o wysokiej gęstości z obszarów dużych próbek.
- Analityka: Generuje przefiltrowane listy lokalizacji oraz rekonstrukcje z korekcją dryftu w celu obiektywnego porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną poprzez obrazowanie ultrastruktury komórkowej istotnej dla przebiegu choroby w modelach pierwotnych komórek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Infrastruktura chipów fotonicznych może być zachowana w różnych projektach, co zmniejsza koszty ponownego doposażenia w obrazowanie o wysokiej rozdzielczości.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu dzięki rozdzielczości nanometrycznej organizacji i dynamiki białek błonowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzowany protokół przygotowania chipa i obrazowania zapewnia powtarzalność wyników pomiędzy użytkownikami i ośrodkami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub zaprzestaniu badań (go/no-go) w oparciu o dane o subkomórkowym rozkładzie celu, co redukuje liczbę niepowodzeń na późnych etapach wynikających z błędnego zrozumienia mechanizmów.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja celów z uwzględnieniem ryzyka, oparta na dowodach przestrzennych z obrazowania super-rozdzielczego w odpowiednich kontekstach komórkowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w obsłudze chipów fotonicznych, mikroskopii fluorescencyjnej oraz analizie lokalizacji pojedynczych cząsteczek.
- Instrumentacja obejmuje źródło laserowe, stół piezoelektryczny, uchwyt próżniowy oraz zestaw filtrów fluorescencyjnych kompatybilnych z TIRF i dSTORM.
- Kwestie standaryzacji międzyzespołowej obejmują procedury czyszczenia chipów, wytwarzanie komór PDMS oraz potoki analizy w programach Fiji/ThunderSTORM.
- Kwestie adaptacyjne obejmują optymalizację wzorców wzbudzenia w celu uzyskania homogennego oświetlenia dla różnych geometrii falowodów i typów próbek.
- Ograniczenia praktyczne obejmują możliwość wystąpienia niejednorodnego wzbudzenia przy niewystarczającym uśrednianiu wzorców oraz niewielki kompromis w zakresie rozdzielczości w porównaniu z TIRF z użyciem obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej (high-NA).
