CometChip: wysokowydajna, 96-dołkowa platforma do pomiaru uszkodzeń DNA w mikromacierzowanych komórkach ludzkich

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie sposobu wykorzystania chipa COMET do wysokoprzepustowych pomiarów uszkodzeń DNA w komórkach ssaków. Jest to realizowane poprzez wstępne załadowanie komórek ssaków do chipa COMET. Drugim krokiem jest poddanie komórek działaniu substancji chemicznych, o których wiadomo, że wywołują uszkodzenia DNA.

Następnie komórki poddaje się lizie i elektroforezie zgodnie z tradycyjnymi protokołami testu COMET. Ostatnim etapem jest obrazowanie fluorescencyjne komórkowego DNA w celu wizualizacji migracji uszkodzonego DNA. Ostatecznie wykorzystuje się oprogramowanie do analizy obrazu, aby określić stopień uszkodzenia DNA.

Metoda kometowa jest znana od bardzo dawna i stanowi niezwykle użyteczne narzędzie do analizy wielu różnych rodzajów uszkodzeń DNA. Problemem było jednak to, że charakteryzuje się ona niską przepustowością oraz brakiem czułości. W związku z tym stworzyliśmy chip COMET, który w zasadzie jest wersją testu kometowego o bardzo wysokiej przepustowości, co umożliwia prowadzenie wysokoprzepustowych badań, na przykład w ramach screeningu leków czy w badaniach epidemiologicznych.

Procedurę zaprezentuje Jing GA, student studiów magisterskich w moim laboratorium. Chip coma to żel z matrycą mikrootworów, wytworzony za pomocą mikrofabrykowanej stempla z mikrosłupkami o średnicach tak małych, jak pojedyncza komórka; na początek należy go umieścić w jednodobowej płytce prostokątnej, stroną z błoną wiążącą żel skierowaną w dół. Po dwukrotnym przemyciu żelu w 25 ml 1x PBS, należy położyć chip coma na szklanej płytce, a następnie odpowiednio oznakować orientację żelu.

Teraz delikatnie dociśnij odwróconą płytkę 96-dołkową bez dna do żelu, upewniając się, że wszystkie 96 dołków znajduje się w obrębie żelu. Następnie przymocuj oba boki płytki 96-dołkowej do szklanej płytki za pomocą zacisków biurowych 1,5 cala. Na koniec odessaj nadmiar PBS z każdego dołka.

Należy zebrać komórki w zawiesinie lub przylegające zgodnie ze standardowymi procedurami i rozcieńczyć je w medium do końcowego stężenia od 100 000 do 1 miliona komórek na mililitr. W razie potrzeby należy przepuścić komórki przez filtr komórkowy, aby uzyskać jednoprzestrzenną zawiesinę komórek. Do każdej studzienki 96-dołkowej płytki comet chip należy pipetować 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej.

Przykryj płytkę folią wiążącą żel, aby zapobiec parowaniu, a następnie umieść ją w inkubatorze ustawionym na 37 °C na 30 minut po wyjęciu płytki z inkubatora. Po upływie 30 minut odessaj medium z każdej studni, a następnie zdejmij klamry i bezdenną płytkę 96-dołkową. Trzymając chip do elektroforezy kometowej z płytką szklaną pod kątem, delikatnie wypłucz go za pomocą 1x PBS, aby usunąć nadmiar komórek z powierzchni agarozy. Następnie obejrzyj płytkę przez obiektyw 4x w mikroskopie w polu jasnym, aby sprawdzić, czy załadunek komórek jest optymalny. Po załadowaniu odpowiedniej liczby komórek umieść chip na płaskiej powierzchni i nałóż warstwę 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia, uprzednio podgrzanej do 37 °C.

Pozostaw warstwę do stężenia w temperaturze pokojowej przez trzy minuty, a następnie umieść ją w temperaturze 4 °C na pięć minut w celu pełnej polimeryzacji przed podaniem komórkom wybranych substancji chemicznych. Najpierw ostrożnie wyrównaj dołki chipa kometowego z dołkami nowej płytki 96-dołkowej bez dna i dociśnij. Przymocuj płytkę 96-dołkową do szklanej płytki za pomocą żabek biurowych, tak jak wcześniej.

Następnie należy umieścić płytkę na lodzie i dodać do każdej studni 100 µL badanego związku w pożądanej dawce. Po pozostawieniu badanego związku na komórkach przez określony czas od podania, należy odessać roztwór związku z każdej studni i w razie potrzeby przepłukać one raz XPBS. Żel należy pociąć na oddzielne fragmenty. Następnie, aby zbadać kinetykę naprawy, do studni dodaje się pożywkę hodowlaną, inkubuje i przystępuje do lizy komórek w określonych punktach czasowych w celu przygotowania lizowanych komórek do alkalicznego testu kometowego.

Przygotuj około 25 mililitrów roboczego buforu do lizy alkalicznej dla każdego chipu, dodając 1% Triton X 100 do roztworu zapasowego buforu do lizy alkalicznej. Następnie schłodź go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przelej bufor do lizy alkalicznej do pojemnika nieco większego niż chip do elektroforezy kometowej.

Następnie zanurzyć chip alkaliczny w schłodzonym roboczym buforze do lizy alkalicznej, umieścić go w lodówce i pozwolić na przebieg lizy przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia wyjąć chip do komet z buforu do lizy i szybko przepłukać go roztworem XPBS. Następnie umieścić chip w komorze elektroforetycznej stroną z folią żelową skierowaną w dół i przymocować go za pomocą dwustronnej taśmy klejącej.

Przenieść komorę do chłodni w temperaturze 4 °C i wypełnić ją zimnym zasadowym buforem do elektroforezy do poziomu, który ledwo zakryje żel. Następnie pozostawić chip w temperaturze 4 °C na 40 minut, aby umożliwić zasadowe rozplatanie. Na koniec prowadzić elektroforezę przy napięciu 1 V/cm i natężeniu 300 mA przez 30 minut.

W chłodni należy dostosować objętość buforu do elektroforezy w komorze, aby uzyskać pożądany prąd prowadzenia. W przypadku neutralnego testu komet, należy przygotować roboczy neutralny bufor lizujący poprzez dodanie 1% Triton X 100 i 10% DMSO do roztworu zapasowego neutralnego buforu lizującego. Ponownie, przygotowując około 25 mililitrów roboczego buforu lizującego dla każdego chipa.

Umieścić roboczy neutralny bufor lizujący w inkubatorze ustawionym na 43 °C w celu wstępnego ogrzania. Po ogrzaniu neutralnego buforu lizującego, zanurzyć chip przecinkowy (comma chip) w neutralnym buforze lizującym i pozostawić w inkubatorze w temperaturze 40 °C przez noc. Następnego dnia usunąć neutralny bufor lizujący, a następnie dwukrotnie przepłukać chip neutralnym buforem elektroforetycznym przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Za każdym razem należy zamocować chip w komorze elektroforetycznej i przenieść go do pomieszczenia chłodniczego.

Podobnie jak poprzednio, należy napełnić komorę elektroforetyczną zimnym neutralnym buforem do elektroforezy do poziomu, który ledwo pokrywa żel, a następnie pozostawić żel w pomieszczeniu chłodniczym na 60 minut; elektroforezę należy prowadzić przy napięciu 0,6 V/cm i natężeniu 6 mA przez 60 minut w pomieszczeniu chłodniczym. Ponownie, w razie potrzeby, należy dostosować objętość buforu do elektroforezy w komorze, aby uzyskać pożądane natężenie prądu. Po wyjęciu chipa COM z pomieszczenia chłodniczego, żele należy zneutralizować, płucząc je dwa razy buforem neutralizującym przez 15 minut każdego płukania w temperaturze 4 °C.

Barwienie w obrębie chipa wykonuje się przy użyciu fluorescencyjnego barwnika DNA, takiego jak cyberg gold lub bromek irydu, zgodnie z instrukcjami producenta. Na górnym panelu tego schematu przedstawiono obrazy reprezentatywnych komet z mikrootworów uzyskane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej dla niepoddanych działaniu czynników limfoblastów TK six. Na panelu środkowym przedstawiono komórki TK six wystawione na działanie 50 micromolar nadtlenku wodoru, a na panelu dolnym na działanie 100 micromolar nadtlenku wodoru.

Wszystkie ekspozycje trwały 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ten wykres liniowy przedstawia odpowiedź na dawkę nadtlenku wodoru w komórkach TK six. Każdy punkt danych stanowi średnią z trzech niezależnych eksperymentów, w których w każdym przypadku wyznaczono medianę procentowej zawartości DNA w ogonie dla co najmniej 50 poszczególnych komet.

Wykres ten przedstawia zmienność między próbkami w teście comma chip dla komórek TK6 poddanych działaniu nadtlenku wodoru; zaprezentowano tutaj dane dotyczące procentowej zawartości DNA w ogonie dla każdej studzienki. Każde pole reprezentuje medianę z co najmniej 50 pojedynczych komet z każdej studzienki. Średnia z 12 studni wynosi 77,53%, odchylenie standardowe to 3,99%, a współczynnik zmienności wynosi 5,2%. Wykres ten obrazuje zmienność między eksperymentami.

Tę samą ekspozycję na nadtlenek wodoru powtórzono sześciokrotnie, a dane z każdego powtórzenia przedstawiono w postaci szarych słupków. Każde pole reprezentuje medianowy procent DNA w ogonie dla co najmniej 100 pojedynczych komet z każdego powtórzenia. Średnia z sześciu powtórzeń wynosi 49,57%, co przedstawiono tutaj w postaci czarnego słupka.

Odchylenie standardowe z sześciu powtórzeń wynosi 4,99%, a błąd standardowy średniej wynosi 2,04%, co zostało przedstawione jako słupek błędu na rysunku, podobnie jak w tradycyjnym, powszechnym teście. Badacze mogą wprowadzać modyfikacje do tej procedury lub stosować inne metody, na przykład poprzez dołączenie oczyszczonych enzymów specyficznych dla uszkodzeń, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące rodzaju uszkodzeń DNA powstałych w komórkach. Technika comet chip utorowała drogę do badań nad komórkami ssaków w celu poznania mechanizmów uszkadzania i naprawy DNA.

Dzięki wysokiej przepustowości możliwe jest przeprowadzanie badań klinicznych i epidemiologicznych, które wcześniej były nieosiągalne ze względu na liczbę próbek.