Protokół wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa przy użyciu rekombinowanych przynęt białkowych

Ogólnym celem tej procedury jest odkrycie interakcji białek z unieruchomionymi cząsteczkami przynęty. Osiąga się to poprzez uprzednie zdobycie i unieruchomienie przynęty. Drugim krokiem jest wprowadzenie biblioteki fagów, która ma być przesiewana do przynęty w warunkach sprzyjających wiązaniu.

Następnie niezwiązany jest usuwany przez rygorystyczne mycie. Podczas gdy związane fagi są używane do infekowania bakterii przed ich odzyskaniem. Ostatnim krokiem jest amplifikacja związanego faga do następnej iteracji selekcji powinowactwa.

Ostatecznie, gdy miano faga osiąga plateau, pojedyncze blaszki są wybierane i sekwencjonowane, aby pokazać, które białka mają największe powinowactwo do unieruchomionego opóźnienia w eksperymentalnych warunkach wiązania. Proces ten może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące interakcji białek białkowych. Procedura ta rozpoczyna się od umieszczenia oczyszczonego białka rekombinowanego na dnie płytek do mikromiareczkowania, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnym krokiem jest zaszczepienie 50 mililitrów pożywki Luria burani 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny w 250-mililitrowej kolbie Erlenmeyera z pojedynczą kolonią, która została wcześniej wyhodowana zgodnie z opisem w protokole tekstowym, inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 200 obr./min w wytrząsarce poziomej i używać spektrofotometru do monitorowania gęstości komórek, aż do uzyskania gęstości optycznej przy 600 nanometrach od 0,5 do 0,6. Następnie wlej komórki do 50-mililitrowej probówki Falcon lub podobnej i utrzymuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż komórki użytkowe zwykle pozostaną żywotne przez około tydzień pierwszego dnia. Przygotuj się do wyboru powinowactwa zgodnie z opisem w protokole tekstowym rano drugiego dnia.

Umieść dziewięć pustych autoklawów, 250-mililitrowych kolb Erlenmeyera w zaciskach wytrząsarki inkubacyjnej, zaszczepij 500 mililitrów lal burani 500 mikrolitrami z jednej z nocnych kultur zakażonych fagami BLT 5 4 0 3 komórek rozpoczętych poprzedniej nocy po umieszczeniu kolby w inkubatorze, włącz spektrofotometr i ustaw go na odczyt absorbancji na poziomie 600 nanometrów. W międzyczasie wyjmij płytkę do mikromiareczkowania z czterech stopni Celsjusza i zdejmij plastikową folię. Usuń wszelkie niezwiązane białko z płytki, przemywając 10 razy 200 mikrolitrami na studzienkę jednego buforowanego roztworu soli fizjologicznej X tris lub TBS pH 7,5 i uderzając płytką do góry nogami w ręcznik papierowy między praniami.

Blokuj 200 mikrolitrami na studzienkę 5% odczynnika blokującego w TBS przez jedną godzinę. Z talerzem owiniętym w folię spożywczą, zmyj roztwór blokujący 10 razy za pomocą 200 mikrolitrów jednego X-T-B-S-T, uderzając płytką do góry nogami o cztery warstwy papieru. Ręcznik między praniami.

Stąd użyj końcówek bariery filtracyjnej, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego fagów. Odpipetować 100 mikrolitrów z biblioteki fagów razem z białkami. Ponownie zamknąć płytkę folią spożywczą i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Po upływie jednej godziny zdejmij plastikową folię z płytki i natychmiast umyj, wytrząsając faga do odpadów niebezpiecznych biologicznie. Następnie użyj pipetera wielopipetowego, aby szybko dodać 200 mikrolitrów jednego X-T-B-S-T do każdego. Dobrze ustaw minutnik na jedną minutę.

Po minucie wytrząśnij bufor z odpadami niebezpiecznymi biologicznie, uderz talerzem do góry nogami w ręcznik papierowy i połóż go z powrotem na ławce. Powtórz kroki prania 10 razy po 10. praniu. Weź 200 mikrolitrów komórek BLT 5 4 0 3 z 50-mililitrowej rurki sokoła o temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieś na dno każdej z dziewięciu studzienek, z których usunięto ostatnie płukanie.

Zawiń płytki w folię spożywczą i umieść ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut, aby, który nadal przykleił się do przynęty, zainfekował bakterie pod koniec 20 minut. Rozwiń talerze. Następnie usuń 10 mikrolitrów bakterii z BSA w temperaturze 25 stopni Celsjusza, replikując jeden dołek i przenieś do 990 mikrolitrów oznaczonej pożywki.

Powtórz ten proces jeszcze dwa razy dla tej studni, co daje trzy triplelaty od jednego do 100 dilu faga z tego dołka, jest to replikacja BSA, jedna próbka pobrana trzy razy. Rozcieńczenie to zostanie wykorzystane do oszacowania średniego miana plus lub minus błąd standardowy średniej dla tej replikacji BSA, zrób to samo dla replikacji drugiej i trzeciej BSA dla trzech replikowanych studzienek zatrutego białka przynęty, a dla białka przynęty odłóż na bok te 27 probówek EOR. Jeśli bakterie w kolbie mają gęstość optyczną od 0,6 do 1,0, należy zdekantować 50 mililitrów komórek z kolby paproci do każdej z 9 kolb Erlenmeyera o pojemności 250 mililitrów.

Weź pozostałe 170 mikrolitrów bakterii zakażonych fagami BLT 5 4 0 3 w jednym dołku replikacji BSA i dodaj je do 50 mililitrów komórek oznaczonych BSA rep. Jeden. Zrób to dla wszystkich dziewięciu studzienek przed wytrząśnięciem kolb w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. W międzyczasie wykonaj rozcieńczenia z początkowych 27 rozcieńczeń, pobierając 100 mikrolitrów LB z bakteriami z pierwszej probówki Einor i dodając je do 900 mikrolitrów LB w probówce einor.

Cztery dla 10 do minus trzeciego rozcieńczenia, wyrzuć końcówkę bariery filtra na nową, zanim uzyskasz 100 mikrolitrów LB z bakteriami z rurki einor cztery i dodaj ją do 900 mikrolitrów LB w probówce eph. Siedem dla rozcieńczenia od 10 do minus czwartego, kontynuować rozcieńczanie dla wszystkich trzykrotności wszystkich replikacji wszystkich białek i traktowania. Po ułożeniu komórek powinno być w sumie 135 probówek.

Doprowadź kulturę do 0,5 molowego chlorku sodu, dodając pięć mililitrów z pięciomolowego wywaru chlorku sodu i przenosząc próbkę do oznakowanej wirówki butelkowej wirówki o temperaturze 8 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zdekantować supernatant zawierający wirusa do czystej, sterylnej probówki sokoła o pojemności 50 mililitrów. Dodać kilka kropli chloroformu do zdekantowanego supernatantu w probówce Falcona.

Supernatant może być przechowywany w temperaturze czterech stopni Celsjusza do następnej rundy selekcji powinowactwa w trzecim dniu, odpipetować 250 mikrolitrów komórek VLT 5 4 0 3 z czterech stopni Celsjusza do każdej z wcześniej przygotowanych ponumerowanych probówek krzemianowych. Następnie odpipetować 100 mikrolitrów z rozcieńczenia w probówce einor do 250 mikrolitrów komórek w probówce z krzemianu. Jeden. Krótko podgrzej pierwsze pięć cali pipety nad płomieniem i zanurz ją w stopionym górnym aros.

Wyciągnij trzy mililitry i szybko dostarcz do probówki na wierzchu komórek i faga. Wymieszaj, przesuwając palcem trzymając tubkę drugą ręką, a następnie wylej zawartość na talerz. Przechyl płytkę i użyj probówki, aby gonić bąbelki i suche miejsca, aż cała płytka zostanie pokryta górnym agrosem.

Odłóż go pionowo na ławce, aby ostygł. Wyrzuć rurkę z krzemianem boros. Wysuń końcówkę bariery filtra i weź nową, a następnie kontynuuj, aż całe rozcieńczenie zostanie pokryte.

Wyjmij przygotowane płytki z inkubatora, gdy są wyczerpane, ale nie więcej niż sześć na raz lub ostygną, a górny agros zbyt szybko zastygnie, zbadaj płytkę nazębną utworzoną na płytkach i wyrzuć te z konfluencyjną lizą. Określ, które z pozostałych rozcieńczeń seryjnych wytworzyły wystarczająco mało blaszek, aby umożliwić dokładne Cali Zapisz liczbę blaszek z tych płytek i przystąp do obliczania miana zgodnie z opisem w protokole tekstowym na końcu wyboru powinowactwa. W czwartej rundzie wybierz 18 pojedynczych, dobrze zdefiniowanych kolonii płytki nazębnej za pomocą sterylnej żółtej końcówki pipety.

Zwilż wnętrze końcówki chlorowodorkiem tris o pH 8,5 w probówce einor. Następnie wydrąż te płytki z płytek do titteringu, przepychając końcówkę przez dobrze odizolowaną płytkę bezpośrednio do plastikowej szalki Petriego poniżej i odsysając rdzeń, wyrzuć rdzeń do 100 mikrolitrów chlorowodorku tris o pH 8,5 w odpowiedniej probówce przed wirowaniem. Krótko mówiąc, podgrzej 20 mikrolitrów z tej objętości w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut i kontynuuj PCR i sekwencjonowanie zgodnie z opisem w przedstawionym tutaj protokole tekstowym, są typowymi wynikami miana poprzez kilkakrotne pobieranie próbek ostateczne szacunkowe wyniki nie są tak podatne na błędy pipetowania i dokładniejsze oszacowanie rzeczywistego miana i zmian wokół niego.

Szacuje się, że uzyskuje się od dobrego do dobrego wzrostu miana faga preferencyjnie dla niezatrutej przynęty wraz ze wzrostem liczby rund selekcji powinowactwa. Daje również pewność, że technika działa. Zatrzymywanie rosnącego procentu wstawki zawierającej fagi w niezatrutych studzienkach na przynęty wraz ze wzrostem liczby selekcji powinowactwa jest również pomyślne po zaawansowanych rundach selekcji powinowactwa.

Wzrost liczby niezależnie odzyskanych fagów, które mają insercję w stosunku do pierwszej rundy i osiadanie tych amplikonów na kilku pasmach o identycznej wielkości, jest dobrą wskazówką, że określone klony są wybierane w selekcji powinowactwa zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak Ease Two Hybrid, można wykonać w celu walidacji interakcji wykrytych przez wyświetlanie fagów.