Protokół wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa przy użyciu rekombinowanych przynęt białkowych

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie oddziaływań białkowych z unieruchomionymi cząsteczkami przynęty. Jest to osiągane poprzez uprzednie pozyskanie i unieruchomienie przynęty. Drugim krokiem jest wprowadzenie biblioteki fagowej do przesiewania do przynęty w warunkach sprzyjających wiązaniu.

Następnie nieprzypisane fagi są usuwane poprzez rygorystyczne płukanie. Fagi związane są wykorzystywane do zakażenia bakterii, a następnie odzyskiwane. Ostatnim krokiem jest amplifikacja związanych fagów w celu przeprowadzenia kolejnej iteracji selekcji powinowactwa.

Ostatecznie, gdy miano fagów osiągnie plateau, wyselekcjonowano i zsekwencjonowano pojedyncze plaques, aby wykazać, które białka wykazują najwyższe powinowactwo do unieruchomionego białka opóźniającego w warunkach wiązania zastosowanych w eksperymencie. Proces ten może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące oddziaływań białko-białko. Procedura ta rozpoczyna się od umieszczenia oczyszczonego białka rekombinowanego na dnie płytek mikrotitracyjnych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Kolejnym krokiem jest zaszczepienie 50 ml pożywki Luria burani z dodatkiem 100 µg/ml ampicyliny w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml pojedynczą kolonią, wyhodowaną wcześniej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Próbkę należy inkubować w temperaturze 37 °C przy 200 RPM w wytrząsarce poziomej, monitorując gęstość komórek za pomocą spektrofotometru aż do uzyskania gęstości optycznej przy 600 nm na poziomie 0,5 do 0,6. Następnie komórki należy przelać do probówki Falcon 50 ml lub podobnego naczynia i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia; komórki zazwyczaj pozostają żywe przez około jeden tydzień. W pierwszym dniu należy przygotować się do selekcji powinowactwa zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a w dniu drugim rano przystąpić do procedury.

Umieść dziewięć wysterylizowanych w autoklawie, pustych kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml w uchwytach inkubatora z wytrząsarką. Zaszczep 500 ml pożywki LAL Burani za pomocą 500 µL jednej z kultur komórek BLT 5 4 0 3 zainfekowanych fagiem, przygotowanych w nocy poprzedzającej eksperyment. Po umieszczeniu kolby w inkubatorze włącz spektrofotometr i ustaw go na pomiar absorbancji przy 600 nm. W międzyczasie wyjmij płytkę mikrotitracyjną z temperatury 4 °C i usuń folię plastikową. Usuń z płytki wszelkie niezwiązane białka, myjąc ją 10 razy za pomocą 200 µL na dołek 1X soli buforowej Tris (TBS) o pH 7,5, odwracając płytkę do góry dnem i uderzając nią o ręcznik papierowy pomiędzy kolejnymi płukaniami.

Blokuj, dodając 200 µL 5% odczynnika blokującego w TBS do każdego dołka przez jedną godzinę. Mając płytkę owiniętą folią spożywczą, wypłucz roztwór blokujący 10 razy, używając 200 µL 1X TBS-T, uderzając płytką odwróconą do dołu o cztery warstwy ręcznika papierowego pomiędzy kolejnymi płukaniami.

Od tego momentu należy używać końcówek z filtrem, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej fagami. Do białek nalać 100 µL biblioteki fagowej. Ponownie szczelnie zapakować płytkę folią spożywczą i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Po upływie jednej godziny zdjąć folię z płytki i natychmiast wypłukać, wylewając fagi do pojemnika na odpady biologiczne. Następnie za pomocą wielokanałowej pipety szybko dodać 200 µL 1X-T-B-S-T do każdej studzienki. Ustawić timer na jedną minutę.

Po jednej minucie wylej bufor do pojemnika na odpady biologiczne, uderz płytką do góry dnem o ręcznik papierowy i połóż ją z powrotem na blacie. Powtórz etapy płukania 10 razy. Po dziesiątym płukaniu pobierz 200 µL komórek BLT 5 4 0 3 z probówki typu Falcon o pojemności 50 mL w temperaturze 4 °C i przenieś je na dno każdej z dziewięciu studni, z których usunięto ostatnią porcję płukanki.

Owiń płytki folią spożywczą i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 20 minut, aby fagi wciąż przytwierdzone do przynęty mogły zainfekować bakterie po upływie 20 minut. Zdejmij folię z płytek. Następnie pobierz 10 µL bakterii z dołka z BSA w temperaturze 25 °C z powtórzenia jeden i przenieś je do 990 µL pożywki oznaczonej jako jeden.

Powtórz ten proces jeszcze dwukrotnie dla danej studzienki, aby uzyskać trzy powtórzenia rozcieńczenia 1:100 faga z tej studzienki; stanowi to pierwszą replikację BSA pobraną trzykrotnie. Rozcieńczenia te zostaną wykorzystane do oszacowania średniego miana wraz z błędem standardowym średniej dla tej replikacji BSA. Postąp analogicznie w przypadku drugiej i trzeciej replikacji BSA, a także dla trzech zreplikowanych studzienek z zatrutym białkiem przynęcią oraz dla zestawu białka przynęci. Odstaw te 27 probówek EOR. Jeśli gęstość optyczna bakterii w kolbie wynosi od 0,6 do 1,0, przelej 50 ml komórek z kolby Erlenmeyera do każdej z 9 kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml.

Pozostałe 170 µL bakterii BLT 5 4 0 3 zainfekowanych fagiem z dołka replikacji BSA one przenieś do 50 ml komórek oznaczonych jako BSA rep.One. Powtórz tę czynność dla wszystkich dziewięciu dołków przed wstrząsaniem kolbami w inkubatorze w temperaturze 37 °C. W międzyczasie wykonaj rozcieńczenia z początkowych 27 rozcieńczeń, pobierając 100 µL LB z bakteriami z probówki Einor 1 i dodając je do 900 µL LB w probówce einor.

W przypadku rozcieńczenia 10⁻³ należy wyrzucić końcówkę z filtrem i użyć nowej przed pobraniem 100 µL pożywki LB z bakteriami z probówki numer cztery i dodaniem jej do 900 µL pożywki LB w probówce eph. W przypadku rozcieńczenia 10⁻⁴ należy kontynuować proces rozcieńczania dla wszystkich powtórzeń technicznych, wszystkich replikacji oraz wszystkich białek i wariantów traktowania. Po lizie komórek powinno powstać łącznie 135 probówek.

Dostosuj stężenie chlorku sodu w kulturze do 0,5 M, dodając pięć mililitrów z roztworu zapasowego chlorku sodu o stężeniu 5 M, a następnie przenieś próbkę do oznakowanej butelki do wirowania i wiruj przy 8 000 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zlej supernatant zawierający wirusa do czystej, sterylnej probówki Falcon o pojemności 50 ml. Do zlewanego supernatantu w probówce Falcon dodaj kilka kropli chloroformu.

Nadpływ można przechowywać w temperaturze 4°C do kolejnej rundy selekcji powinowactwa; trzeciego dnia pipetujemy 250 µL komórek VLT 5 4 0 3 z temperatury 4°C do każdej z wcześniej przygotowanych ponumerowanych probówek borokrzemowych. Następnie pipetujemy 100 µL z rozcieńczenia w probówce einor jeden do 250 µL komórek w probówce borokrzemowej jeden. Krótko podgrzewamy pierwsze pięć cali pipety nad płomieniem i zanurzamy ją w stopionym top aros.

Pobierz trzy mililitry i szybko wprowadź do probówki, na powierzchnię komórek i fagów. Wymieszaj, delikatnie stukując palcem o ściankę probówki, trzymając ją w drugiej ręce, a następnie wylej zawartość na płytkę. Przechyl płytkę i za pomocą probówki usuń pęcherzyki powietrza oraz suche miejsca, aż cała powierzchnia płytki zostanie pokryta górną warstwą agarozy.

Odstaw probówkę w pozycji pionowej na blacie w celu schłodzenia. Wyrzuć probówkę borokrzemową. Usuń końcówkę z barierą filtracyjną, pobierz nową i kontynuuj procedurę, aż wszystkie rozcieńczenia zostaną naniesione na płytki.

Wyjmij przygotowane płytki z inkubatora w miarę ich zużycia, jednak nie więcej niż sześć jednocześnie, aby zapobiec ich ochłodzeniu i zbyt szybkiemu zastygnięciu górnej warstwy agarozy; sprawdź powstałe na płytkach plakki i odrzuć te z lizą konfluencyjną. Określ, które z pozostałych rozcieńczeń seryjnych przyniosły wystarczająco małą liczbę plakków, aby umożliwić dokładne przeliczenie. Zapisz liczbę plakków z tych płytek i przejdź do obliczenia miana zgodnie z opisem w protokole tekstowym na końcu selekcji powinowactwa. W czwartej rundzie wybierz 18 pojedynczych, wyraźnie zdefiniowanych kolonii plakków, używając sterylnego żółtego końcówki do pipety.

Nawilż wnętrze końcówki roztworem tris chlorowodorku pH 8.5 w probówce typu einor. Następnie pobierz rdzenie tych placków z płytek mianowania, przebijając końcówką dobrze odizolowany placzek bezpośrednio do plastikowej szalki Petriego znajdującej się poniżej i aspirując rdzeń, a następnie wydmuchaj rdzeń do 100 µL tris chlorowodorku pH 8.5 w odpowiedniej probówce przed wymieszaniem w wortexie. Krótko nagrzewaj 20 µL z tej objętości w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie przeprowadź PCR i sekwencjonowanie zgodnie z opisem w protokole tekstowym; przedstawione tutaj są typowe wyniki mianowania uzyskane poprzez wielokrotne pobieranie próbek. Końcowe szacunki liczbowe są mniej podatne na błędy pipetowania, co pozwala na dokładniejszą ocenę rzeczywistego miana oraz związanej z nim zmienności.

Szacunki dla poszczególnych studzienek wykazują wzrost miana fagów, preferencyjnie w przypadku przynęty niezatrutej, wraz ze zwiększaniem liczby rund selekcji powinowactwa. Potwierdza to również prawidłowe działanie zastosowanej techniki. Utrzymanie rosnącego odsetka fagów zawierających insert w studzienkach z przynętą niezatrutą, w miarę zwiększania liczby selekcji powinowactwa, jest równie obiecujące po zaawansowanych rundach selekcji powinowactwa.

Wzrost liczby niezależnie wyizolowanych fagów zawierających insert w stosunku do pierwszej rundy oraz skupienie tych amplikonów w kilku pasmach o tej samej wielkości jest dobrym wskaźnikiem tego, że w wyniku zastosowania tej procedury selekcji powinowactwa wyselekcjonowane są konkretne klony. W celu walidacji oddziaływań odkrytych za pomocą prezentacji fagowej można zastosować inne metody, takie jak system dwuhybrydowy drożdżowy.