Name: Protokół wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa przy użyciu rekombinowanych przynęt białkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Poznaj technikę wyświetlania fagów do identyfikacji interakcji białkowych z użyciem przynęt białkowych. Ten protokół umożliwia efektywną selekcję powinowactwa i odkrywanie nowych interaktorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został częściowo sfinansowany przez NSF IOS (0849230); Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), Grant Nasion USDA (2011-04375) oraz stypendium badawcze Sir Fredericka McMastera dla ABD.

<ol><li>Georgieva, Y., Konthur, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+screening+of+M13+phage+display+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Design and screening of M13 phage display cDNA libraries.</a> Molecules. 16, 1667-1681 (2011).</li>
<li>Beghetto, E., Gargano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda-display%3A+a+powerful+tool+for+antigen+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery.</a> Molecules. 16, 3089-3105 (2011).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORF+phage+display+to+identify+cellular+proteins+with+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">ORF phage display to identify cellular proteins with different functions.</a> Methods. 58, 2-9 (2012).</li>
<li>Willats, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display%3A+practicalities+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phage display: practicalities and prospects.</a> Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).</li>
<li>Konthur, Z., Crameri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+applications+of+phage+display+in+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Targets%22%5BJournal%5D)">High-throughput applications of phage display in proteomic analyses.</a> Targets. 2, 261-270 (2003).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+of+the+Arabidopsis+thaliana+protein+isoaspartyl+methyltransferase+1+identified+using+phage+display+and+biopanning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning.</a> J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).</li>
<li>Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+for+improved+protein+stability+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Selection for improved protein stability by phage display.</a> J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).</li>
<li>Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigmatic+LEA+proteins+and+other+hydrophilins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins.</a> Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).</li>
<li>Egli, D. B., Bruening, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source-sink+relationships%2C+seed+sucrose+levels+and+seed+growth+rates+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Botany%22%5BJournal%5D)">Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean.</a> Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).</li>
<li>Badotti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+the+mode+of+sucrose+utilization+by+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae.</a> Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).</li>
<li>Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Late+Embryogenesis+Abundant+%28LEA%29+Protein+Putative+Interactors+Using+Phage+Display%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display.</a> Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).</li>
<li>Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+expression+of+recombinant+proteins+in+the+cytoplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli.</a> Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).</li>
<li>Gasser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+and+conformational+stress+in+microbial+cells+producing+recombinant+proteins%3A+a+host+comparative+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview.</a> Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).</li>
<li>Daly, R., Hearn, M. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+heterologous+proteins+in+Pichia+pastoris%3A+a+useful+experimental+tool+in+protein+engineering+and+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production.</a> J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).</li>
<li>Davis, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+recombinant+protein+production+of+eight+insect+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).</li>
<li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).</li>
<li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).</li>
<li>Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+protein+microarrays+for+the+high-throughput+identification+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions.</a> Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).</li>
<li>Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cold-shock+response+in+cultured+mammalian+cells%3A+Harnessing+the+response+for+the+improvement+of+recombinant+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production.</a> Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).</li>
<li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przeprowadzając eksperyment w trzech zreplikowanych studzienkach, można odróżnić niezależnie nabyte fagi tego samego białka wiążące się z przynętą, nawet jeśli są to te same klony (tj. nie ma różnicy w sekwencji nukleotydów regionu CDS, który został nabyty, ale zostały one pobrane z niezależnych studzienek). W przeciwnym razie jedynym sposobem na odróżnienie fagów kodujących to samo białko wiążące się z przynętą jest to, że są to niezależnie odwrócone regiony transkrybowane, które różnią się w jakiejś części sek...

Dlaczego używać wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa zamiast niezliczonych innych dostępnych technik do odkrywania i badania interakcji białek z innymi cząsteczkami? Wyświetlanie fagów może mieć pewne unikalne zalety w porównaniu z innymi metodami wykrywania interakcji białko-ligand1-3, w tym:
Bardzo szeroki repertuar cząsteczek przynęty
Głównym powodem jest różnorodność molekuł zdolnych do działania jako przynęta w selekcji powinowactwa 4. Wyświetlanie fagów jest bardzo skutecznym sposobem izolowania fragmentów białek, które oddziałują z innymi białkami, nukleotydami, węglowodanami itp.5 Zasadniczo, jeśli polimer/cząsteczka może być przyłączona do odzyskiwalnego nośnika, można ją przebadać pod kątem powinowactwa do białek wyświetlanych w fagach. Dodatkowo można uzyskać dostęp do cząsteczki przynęty w celu określenia, czy zachowuje ona aktywność biologiczną po unieruchomieniu6, czy warunki stosowane w celu zmniejszenia/wyeliminowania jej aktywności są skuteczne6 lub w celu wprowadzenia modyfikacji potranslacyjnych do przynęty przed selekcją powinowactwa.
Odporność fagów na czynniki zewnętrzne
Drugim powodem korzystania z wyświetlania fagów jest to, że możliwe jest, że niektóre przynęty mogą wymagać stresu środowiskowego (ciepło, wysokie stężenia osmolitów, specyficzne kofaktory, itp.), aby uchwycić ich oddziałujące białka, lub białka wyświetlane na fagach mogą wymagać jakoś zmiany przed selekcją powinowactwa. Podstawowym badanym czynnikiem jest interakcja między przynętą a białkiem, a nie stan, który pozwala na wystąpienie interakcji lub czy jest ona śmiertelna dla badanego organizmu. T7 szczególnie dobrze nadaje się do takich badań, ponieważ może wytrzymać trudne warunki eksperymentalne, zarówno nienaruszony, jak i żywotny (np. opublikowane maksimum termiczne dla żywotności T7 wynosi ~60 °C 7). Jako przykład zmiany białek wyświetlanych przez fagi, podczas badania proteomu nasion Arabidopsis thaliana pod kątem substratów białkowych enzymu naprawczego, Protein Isoaspartyl Methyl Transferease (PIMT), wirus użyty w tych badaniach był "leżakowany" przez tydzień, przed każdą rundą selekcji powinowactwa, aby zachęcić do wprowadzenia reszt izoasparaginianu (isoAsp) do podatnych białek6 co nie jest możliwe w organizmach, które potrafią rozpoznawać i naprawiać/metabolizować takie nieprawidłowości.
Metabolicznie obojętny
Ponadto, fagi są zazwyczaj odporne na trucizny metaboliczne i zakłócające małe cząsteczki, które co najmniej skutkowałyby plejotropowymi efektami na metabolicznie aktywnych organizmach testowych. Po rygorystycznym myciu trucizna jest usuwana przed wprowadzeniem dużej ilości bakterii do infekcji, więc trucizna jest rozcieńczana do zakresu nieszkodliwego dla bakterii lub późniejszej replikacji fagów. Podczas badania celów białkowych enzymu naprawczego PIMT, S-adenozylometionina (AdoMet) została użyta do aktywacji enzymu unieruchomionego mikro-mianowo-płytkowego, aby umożliwić wychwytywanie docelowego białka, polegając jednocześnie na S-adenozylohomocysteinie (AdoHcy) w celu inaktywacji enzymu i zapewnienia użytecznej kontroli ujemnej, mając pewność, że wirus nie będzie miał negatywnego wpływu ani AdoMet, ani AdoHcy6. Ponadto wiadomo, że członkowie niektórych rodzin białek Late Embryogenesis Abundant (LEA), badanych w tym laboratorium, zmieniają swój kształt w obecności dodatków, takich jak sacharoza8, która może osiągnąć stężenie nawet 200 mM w nasionach soi w momencie dojrzałości fizjologicznej9. Nie przewiduje się, aby dodanie 200 mM sacharozy w każdej rundzie selekcji powinowactwa miało wpływ na wirusa, co może być konieczne w przypadku niektórych interakcji białkowych LEA-klient, co nie ma miejsca w przypadku autonomicznie zdolnych do życia organizmów testowych10.
To laboratorium skupiło się na odkrywaniu interakcji białko-białko w dojrzałych, odwodnionych lub kiełkujących nasionach, które leżą u podstaw mechanizmu ochrony przechowywanego proteomu podczas odwodnienia11 lub naprawy składników przechowywanego proteomu, które są podatne na tworzenie isoAsp po wchłonięciunasion 6. W związku z tym produkcja i oczyszczanie rekombinowanych białek wymaganych jako przynęta w stanie aktywnym oraz zapewnienie, że pozostaną one takie przed i po unieruchomieniu, choć często trudne, jest kamieniem węgielnym naszej pracy. Ponieważ jednak każdy scenariusz produkcji białek rekombinowanych jest inny, optymalizacja warunków produkcji białek rekombinowanych nie będzie tutaj omawiana. Zachęca się użytkowników, aby w miarę możliwości podjęli próbę ustalenia, czy unieruchomione białko jest nadal funkcjonalne (np. jeśli jest to enzym, należy przeprowadzić test enzymatyczny w dołkach płytki do mikromiareczkowania). Da to pewną pewność, że przynęta jest biologicznie aktywna, a zatem, że wszelkie odkryte interakcje z większym prawdopodobieństwem będą miały znaczenie biologiczne.

<table><tbody><tr><td>Trypton</td><td>, Becton, Dickinson Co.</td><td></td><td></td>211705</tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td> Research <td>Products International</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>69064</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-212</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BLT5403</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>BLT5403</td><td>Genotyp: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)</td></tr><tr><td>Ampicylina, Sól sodowa</td><td>Research Products International</td><td>A40040</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP102-1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>A-9647</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne Penta-HIS</td><td>Qiagen Inc.</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>Kozia koniugat fosfatyzacji alkalicznej przeciwko myszom</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>A-5153</td><td></td></tr><tr><td>para-Nitrofenylofosforan</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>N-7653</td><td></td></tr><tr><td>Podkład T7-UP</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td></td><td>5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-DOWN</td></tr> <tr><td>podkład</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td></td><td>5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick</td></tr> <tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>Qiagen Inc.</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu Qiaquick </td><td>Qiagen Inc.</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do sekwencjonowania cykli Big Dye Terminator v3.1</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>4336917</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)</td><td>18780</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>Costar 3590</td><td></td></tr><tr><td>Piec do inkubatora izotempowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>516D</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura, 5 i #190; w</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Transformiluminator ChromaView</td><td>UVP Inc.</td><td>TS-15</td><td></td></tr><tr><td>UV Shield</td><td>Oberon</td><td>071AF</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice, nitryl</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-170-010C</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki 1,5 ml</td><td>USA Scientific Inc</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipety borokrzemianowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-25E</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do hodowli borokrzemianów</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-27</td><td></td></tr><tr><td>Uniskan I, czytnik płytek ELISA</td><td>Labsystem i Flow Laboratories, Helsinki, Finlandia</td><td>Typ 362</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa przy użyciu rekombinowanych przynęt białkowych

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Wykorzystanie rekombinowanego faga jako rusztowania do prezentacji różnych porcji białek kodowanych przez kierunkowo sklonowaną bibliotekę cDNA do unieruchomionych cząsteczek przynęty jest skutecznym sposobem na odkrywanie interakcji. Technika ta została w dużej mierze wykorzystana do odkrycia interakcji białko-białko, ale cząsteczka przynęty, która ma zostać poddana próbie, nie musi ograniczać się do białek. Przedstawiony tutaj protokół został zoptymalizowany, aby umożliwić badanie przesiewowe niewielkiej liczby przynęt w powtórzeniach, aby zmaksymalizować identyfikację niezależnych klonów prezentujących to samo białko. Pozwala to na uzyskanie większej pewności, że zidentyfikowane oddziałujące białka są legalnymi interaktorami cząsteczki przynęty. Monitorowanie miana faga po każdej rundzie selekcji powinowactwa dostarcza informacji o postępie selekcji powinowactwa, a także o skuteczności kontroli ujemnych. Przedstawiono jeden ze sposobów mianowania faga oraz to, jak i co przygotować z wyprzedzeniem, aby proces ten przebiegał jak najefektywniej. Podkreślono atrybuty amplikonów pobranych po wyizolowaniu niezależnej płytki, które można wykorzystać do ustalenia, jak dobrze postępuje selekcja powinowactwa. Wyjaśniono techniki rozwiązywania problemów w celu zminimalizowania wyników fałszywie dodatnich lub ominięcia trwale odzyskiwanych fagów. Omówiono sposoby ograniczania zaostrzeń zakażeń wirusowych.

Możliwość upośledzenia zdolności przynęty do oddziaływania z białkami eksponowanymi na fagach (metaboliczne zatrucie przynęty) stanowi skuteczną kontrolę negatywną dla tej techniki. Zaleca się również sprawdzenie, czy przynęta po związaniu z dołkiem płytki mikrotitru zachowuje swoją funkcję. Obie te weryfikacje zwiększą pewność, że białka eksponowane na fagach, które oddziałują i są odzyskiwane za pomocą niezatrutej przynęty, są wiarygodnymi interaktorami.
Pobranie trzech powtórzeń z każdej st...

Wyświetlanie fagów to potężna technika do wychwytywania białek lub ugrupowań białkowych, które oddziałują z unieruchomioną cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. Po podjęciu decyzji o rodzaju biblioteki cDNA fagów, którą należy utworzyć i przebadać, opisany tutaj protokół pozwala na skuteczną selekcję powinowactwa prowadzącą do identyfikacji interaktorów.

Protokół wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa przy użyciu rekombinowanych przynęt białkowych

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie oddziaływań białkowych z unieruchomionymi cząsteczkami przynęty. Jest to osiągane poprzez uprzednie pozyskanie i unieruchomienie przynęty. Drugim krokiem jest wprowadzenie biblioteki fagowej do przesiewania do przynęty w warunkach sprzyjających wiązaniu.Następnie nieprzypisane fagi są usuwane poprzez rygorystyczne płukanie. Fagi związane są wykorzystywane do zakażenia bakterii, a następnie odzyskiwane. Ostatnim krokiem jest amplifikacja związanych fagów w celu przeprowadzenia kolejnej iteracji selekcji powinowactwa.Ostatecznie, gdy miano fagów osiągnie plateau, wyselekcjonowano i zsekwencjonowano pojedyncze plaques, aby wykazać, które białka wykazują najwyższe powinowactwo do unieruchomionego białka opóźniającego w warunkach wiązania zastosowanych w eksperymencie. Proces ten może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące oddziaływań białko-białko. Procedura ta rozpoczyna się od umieszczenia oczyszczonego białka rekombinowanego na dnie płytek mikrotitracyjnych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Kolejnym krokiem jest zaszczepienie 50 ml pożywki Luria burani z dodatkiem 100 µg/ml ampicyliny w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml pojedynczą kolonią, wyhodowaną wcześniej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Próbkę należy inkubować w temperaturze 37 °C przy 200 RPM w wytrząsarce poziomej, monitorując gęstość komórek za pomocą spektrofotometru aż do uzyskania gęstości optycznej przy 600 nm na poziomie 0,5 do 0,6. Następnie komórki należy przelać do probówki Falcon 50 ml lub podobnego naczynia i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia; komórki zazwyczaj pozostają żywe przez około jeden tydzień. W pierwszym dniu należy przygotować się do selekcji powinowactwa zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a w dniu drugim rano przystąpić do procedury.Umieść dziewięć wysterylizowanych w autoklawie, pustych kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml w uchwytach inkubatora z wytrząsarką. Zaszczep 500 ml pożywki LAL Burani za pomocą 500 µL jednej z kultur komórek BLT 5 4 0 3 zainfekowanych fagiem, przygotowanych w nocy poprzedzającej eksperyment. Po umieszczeniu kolby w inkubatorze włącz spektrofotometr i ustaw go na pomiar absorbancji przy 600 nm. W międzyczasie wyjmij płytkę mikrotitracyjną z temperatury 4 °C i usuń folię plastikową. Usuń z płytki wszelkie niezwiązane białka, myjąc ją 10 razy za pomocą 200 µL na dołek 1X soli buforowej Tris (TBS) o pH 7,5, odwracając płytkę do góry dnem i uderzając nią o ręcznik papierowy pomiędzy kolejnymi płukaniami.Blokuj, dodając 200 µL 5% odczynnika blokującego w TBS do każdego dołka przez jedną godzinę. Mając płytkę owiniętą folią spożywczą, wypłucz roztwór blokujący 10 razy, używając 200 µL 1X TBS-T, uderzając płytką odwróconą do dołu o cztery warstwy ręcznika papierowego pomiędzy kolejnymi płukaniami.Od tego momentu należy używać końcówek z filtrem, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej fagami. Do białek nalać 100 µL biblioteki fagowej. Ponownie szczelnie zapakować płytkę folią spożywczą i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Po upływie jednej godziny zdjąć folię z płytki i natychmiast wypłukać, wylewając fagi do pojemnika na odpady biologiczne. Następnie za pomocą wielokanałowej pipety szybko dodać 200 µL 1X-T-B-S-T do każdej studzienki. Ustawić timer na jedną minutę.Po jednej minucie wylej bufor do pojemnika na odpady biologiczne, uderz płytką do góry dnem o ręcznik papierowy i połóż ją z powrotem na blacie. Powtórz etapy płukania 10 razy. Po dziesiątym płukaniu pobierz 200 µL komórek BLT 5 4 0 3 z probówki typu Falcon o pojemności 50 mL w temperaturze 4 °C i przenieś je na dno każdej z dziewięciu studni, z których usunięto ostatnią porcję płukanki.Owiń płytki folią spożywczą i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 20 minut, aby fagi wciąż przytwierdzone do przynęty mogły zainfekować bakterie po upływie 20 minut. Zdejmij folię z płytek. Następnie pobierz 10 µL bakterii z dołka z BSA w temperaturze 25 °C z powtórzenia jeden i przenieś je do 990 µL pożywki oznaczonej jako jeden.Powtórz ten proces jeszcze dwukrotnie dla danej studzienki, aby uzyskać trzy powtórzenia rozcieńczenia 1:100 faga z tej studzienki; stanowi to pierwszą replikację BSA pobraną trzykrotnie. Rozcieńczenia te zostaną wykorzystane do oszacowania średniego miana wraz z błędem standardowym średniej dla tej replikacji BSA. Postąp analogicznie w przypadku drugiej i trzeciej replikacji BSA, a także dla trzech zreplikowanych studzienek z zatrutym białkiem przynęcią oraz dla zestawu białka przynęci. Odstaw te 27 probówek EOR. Jeśli gęstość optyczna bakterii w kolbie wynosi od 0,6 do 1,0, przelej 50 ml komórek z kolby Erlenmeyera do każdej z 9 kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml.Pozostałe 170 µL bakterii BLT 5 4 0 3 zainfekowanych fagiem z dołka replikacji BSA one przenieś do 50 ml komórek oznaczonych jako BSA rep.One. Powtórz tę czynność dla wszystkich dziewięciu dołków przed wstrząsaniem kolbami w inkubatorze w temperaturze 37 °C. W międzyczasie wykonaj rozcieńczenia z początkowych 27 rozcieńczeń, pobierając 100 µL LB z bakteriami z probówki Einor 1 i dodając je do 900 µL LB w probówce einor.W przypadku rozcieńczenia 10⁻³ należy wyrzucić końcówkę z filtrem i użyć nowej przed pobraniem 100 µL pożywki LB z bakteriami z probówki numer cztery i dodaniem jej do 900 µL pożywki LB w probówce eph. W przypadku rozcieńczenia 10⁻⁴ należy kontynuować proces rozcieńczania dla wszystkich powtórzeń technicznych, wszystkich replikacji oraz wszystkich białek i wariantów traktowania. Po lizie komórek powinno powstać łącznie 135 probówek.Dostosuj stężenie chlorku sodu w kulturze do 0,5 M, dodając pięć mililitrów z roztworu zapasowego chlorku sodu o stężeniu 5 M, a następnie przenieś próbkę do oznakowanej butelki do wirowania i wiruj przy 8 000 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zlej supernatant zawierający wirusa do czystej, sterylnej probówki Falcon o pojemności 50 ml. Do zlewanego supernatantu w probówce Falcon dodaj kilka kropli chloroformu.Nadpływ można przechowywać w temperaturze 4°C do kolejnej rundy selekcji powinowactwa; trzeciego dnia pipetujemy 250 µL komórek VLT 5 4 0 3 z temperatury 4°C do każdej z wcześniej przygotowanych ponumerowanych probówek borokrzemowych. Następnie pipetujemy 100 µL z rozcieńczenia w probówce einor jeden do 250 µL komórek w probówce borokrzemowej jeden. Krótko podgrzewamy pierwsze pięć cali pipety nad płomieniem i zanurzamy ją w stopionym top aros.Pobierz trzy mililitry i szybko wprowadź do probówki, na powierzchnię komórek i fagów. Wymieszaj, delikatnie stukując palcem o ściankę probówki, trzymając ją w drugiej ręce, a następnie wylej zawartość na płytkę. Przechyl płytkę i za pomocą probówki usuń pęcherzyki powietrza oraz suche miejsca, aż cała powierzchnia płytki zostanie pokryta górną warstwą agarozy.Odstaw probówkę w pozycji pionowej na blacie w celu schłodzenia. Wyrzuć probówkę borokrzemową. Usuń końcówkę z barierą filtracyjną, pobierz nową i kontynuuj procedurę, aż wszystkie rozcieńczenia zostaną naniesione na płytki.Wyjmij przygotowane płytki z inkubatora w miarę ich zużycia, jednak nie więcej niż sześć jednocześnie, aby zapobiec ich ochłodzeniu i zbyt szybkiemu zastygnięciu górnej warstwy agarozy; sprawdź powstałe na płytkach plakki i odrzuć te z lizą konfluencyjną. Określ, które z pozostałych rozcieńczeń seryjnych przyniosły wystarczająco małą liczbę plakków, aby umożliwić dokładne przeliczenie. Zapisz liczbę plakków z tych płytek i przejdź do obliczenia miana zgodnie z opisem w protokole tekstowym na końcu selekcji powinowactwa. W czwartej rundzie wybierz 18 pojedynczych, wyraźnie zdefiniowanych kolonii plakków, używając sterylnego żółtego końcówki do pipety.Nawilż wnętrze końcówki roztworem tris chlorowodorku pH 8.5 w probówce typu einor. Następnie pobierz rdzenie tych placków z płytek mianowania, przebijając końcówką dobrze odizolowany placzek bezpośrednio do plastikowej szalki Petriego znajdującej się poniżej i aspirując rdzeń, a następnie wydmuchaj rdzeń do 100 µL tris chlorowodorku pH 8.5 w odpowiedniej probówce przed wymieszaniem w wortexie. Krótko nagrzewaj 20 µL z tej objętości w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie przeprowadź PCR i sekwencjonowanie zgodnie z opisem w protokole tekstowym; przedstawione tutaj są typowe wyniki mianowania uzyskane poprzez wielokrotne pobieranie próbek. Końcowe szacunki liczbowe są mniej podatne na błędy pipetowania, co pozwala na dokładniejszą ocenę rzeczywistego miana oraz związanej z nim zmienności.Szacunki dla poszczególnych studzienek wykazują wzrost miana fagów, preferencyjnie w przypadku przynęty niezatrutej, wraz ze zwiększaniem liczby rund selekcji powinowactwa. Potwierdza to również prawidłowe działanie zastosowanej techniki. Utrzymanie rosnącego odsetka fagów zawierających insert w studzienkach z przynętą niezatrutą, w miarę zwiększania liczby selekcji powinowactwa, jest równie obiecujące po zaawansowanych rundach selekcji powinowactwa.Wzrost liczby niezależnie wyizolowanych fagów zawierających insert w stosunku do pierwszej rundy oraz skupienie tych amplikonów w kilku pasmach o tej samej wielkości jest dobrym wskaźnikiem tego, że w wyniku zastosowania tej procedury selekcji powinowactwa wyselekcjonowane są konkretne klony. W celu walidacji oddziaływań odkrytych za pomocą prezentacji fagowej można zastosować inne metody, takie jak system dwuhybrydowy drożdżowy.

a-protocol-for-phage-display-affinity-selection-using-recombinant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokół wyświetlania faga i selekcji powinowactwa z wykorzystaniem rekombinowanych białek przynętowych

AVEXIS to wysokoprzepustowy test interakcji białkowych opracowany w celu systematycznego przesiewania nowych zewnątrzkomórkowych par receptor-ligand zaangażowanych w procesy rozpoznawania komórkowego. Został on zaprojektowany specjalnie do wykrywania przejściowych interakcji białkowych, które są trudne do zidentyfikowania przy użyciu innych metod wysokoprzepustowych.

Przesiewowe badanie oddziaływań pozakomórkowych oparte na awidności (AVEXIS) w celu skalowalnej detekcji słabych oddziaływań między pozakomórkowymi receptorami a ligandami

W tym filmie demonstrujemy technikę wyświetlania fagów w celu wyizolowania wstępnie zaprojektowanych fagów wyrażających białka o wysokim powinowactwie do docelowego białka.

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do wyboru białek o wysokim powinowactwie do białka docelowego

Metoda jest opisana z wizualnym akompaniamentem do przeprowadzania skalowalnych, wysokoprzepustowych selekcji z kombinatorycznych bibliotek syntetycznych przeciwciał wyświetlanych przez fagi przeciwko setkom antygenów jednocześnie. Stosując to równoległe podejście, wyizolowaliśmy fragmenty przeciwciał, które wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla różnych antygenów, które są funkcjonalne w standardowych testach immunologicznych.

Skalowalny wybór przeciwciał syntetycznych o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego, solidna alternatywa dla przeciwciał. Półautomatyczna metoda sortowania usprawniła biopanoramowanie w celu zmniejszenia występowania wyników fałszywie dodatnich. Poniżej ilustrujemy proces myślowy i techniki stosowane w ocenie kandydatów i minimalizacji dalszej analizy.

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Opisane protokoły pozwalają na budowę, charakterystykę i selekcję (w stosunku do wybranego celu) biblioteki "domenomowej" wykonanej z dowolnego źródła DNA. Jest to możliwe dzięki procesowi badawczemu, który łączy różne technologie: wyświetlanie fagów, składany reporter i sekwencjonowanie nowej generacji z narzędziem internetowym do analizy danych.

Interactome-Seq: Protokół do budowania, walidacji i wyboru bibliotek domenomowych poprzez wyświetlanie fagów i sekwencjonowanie nowej generacji

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę budowy biblioteki syntetycznych przeciwciał wyświetlanych przez fagi z dostosowaną różnorodnością. Przeciwciała syntetyczne mają szerokie zastosowanie, od badań podstawowych po diagnostykę chorób i terapię.

Budowa biblioteki Fab Display z syntetycznymi fagami z dostosowaną różnorodnością

Tutaj prezentujemy metodę selekcji nowych wariantów ligazy białkowej biotyny E. coli BirA, która biotynyluje określony peptyd docelowy. Protokół opisuje budowę plazmidu do bakteryjnego wyświetlania docelowego peptydu, generowanie biblioteki BirA, selekcję i charakterystykę wariantów BirA.

Wyświetlacz peptydów bakteryjnych do wyboru nowych enzymów biotynylujących

Tworzenie chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek o pożądanym powinowactwie i specyficzności dla dowolnego ligandu małych cząsteczek miałoby wiele zastosowań w biologicznym wykrywaniu i uruchamianiu. W tym miejscu opisujemy wydajną, uogólnioną metodę inżynierii de novo chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji poprzez krokowy wybór kombinatorycznej biblioteki przeciwciał jednodomenowych wyświetlanej przez fagi.

Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię pomiaru izolewukleryn w tkankach metodą immunofluorescencji przy użyciu przeciwciała ScFv D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną. Modele nadciśnienia zarówno u myszy, jak i u ludzi są wykorzystywane do wyjaśnienia krok po kroku procedur i podstawowych zasad związanych z pomiarem izolewuklesyny w próbkach tkanek.

Bezpośrednie wykrywanie izolewuglandyn w tkankach przy użyciu białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej D11 scFv i immunofluorescencji

Ubikwitynacja jest krytyczną modyfikacją potranslacyjną białka, której dysregulacja jest przyczyną wielu chorób ludzkich. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób można wykorzystać wyświetlanie fagów do izolowania nowych wariantów ubikwityny, które mogą wiązać i modulować aktywność ligazów E3, które kontrolują specyficzność, wydajność i wzorce ubikwitynacji.

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do opracowania modulatorów wariantów ubikwityny dla ligaz E3

Poznaj technikę wyświetlania fagów do identyfikacji interakcji białkowych z użyciem przynęt białkowych. Ten protokół umożliwia efektywną selekcję powinowactwa i odkrywanie nowych interaktorów.

Protokół wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa przy użyciu rekombinowanych przynęt białkowych

Przeglądaj więcej filmów