Name: Interactome-Seq: Protokół do budowania, walidacji i wyboru bibliotek domenomowych poprzez wyświetlanie fagów i sekwencjonowanie nowej generacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Poznaj metodę budowy i walidacji bibliotek domenomowych z wykorzystaniem wyświetlania fagów i sekwencjonowania nowej generacji. To podejście umożliwia bezstronną, wysokoprzepustową analizę interakcji białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant z włoskiego Ministerstwa Edukacji i Szkolnictwa (2010P3S8BR_002 dla CP).

<ol><li>Loman, N. J., Pallen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty+years+of+bacterial+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Twenty years of bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).</li>
<li>Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+annotation+error+rate+of+curated+GO+database+sequence+annotations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations.</a> BMC Bioinformatics. 8 (1), 170(2007).</li>
<li>Andorf, C., Dobbs, D., Honavar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+inconsistencies+in+genome-wide+protein+function+annotations%3A+a+machine+learning+approach%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Exploring inconsistencies in genome-wide protein function annotations: a machine learning approach.</a> BMC Bioinformatics. 8 (1), 284(2007).</li>
<li>Wong, W. -C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+Than+1%2C001+Problems+with+Protein+Domain+Databases%3A+Transmembrane+Regions%2C+Signal+Peptides+and+the+Issue+of+Sequence+Homology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology.</a> PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867(2010).</li>
<li>Bioinformatics, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+correction+of+abnormal%2C+incomplete+and+mispredicted+proteins+in+public+databases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases.</a> BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).</li>
<li>Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+analysis+on+a+proteomic+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein analysis on a proteomic scale.</a> Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).</li>
<li>DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scaleable+and+integrated+crystallization+pipeline+applied+to+mining+the+Thermotoga+maritima+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome.</a> J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).</li>
<li>Nordlund, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18235434">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+open+reading+frames+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li>
<li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+interactome+profiling+by+massive+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid interactome profiling by massive sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 38 (9), e110(2010).</li>
<li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+soluble%2Ffoldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering%3A+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).</li>
<li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtering+%26%2334%3Bgenic%26%2334%3B+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Filtering &#34;genic&#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5(2011).</li>
<li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+A+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).</li>
<li>Heger, A., Holm, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12706730">Exhaustive enumeration of protein domain families.</a> J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).</li>
<li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+open+reading+frames+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li>
<li>Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+of+cDNA+libraries%3A+Enrichment+of+cDNA+expression+using+open+reading+frame+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection.</a> Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).</li>
<li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+%CE%B1-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+%28RIDome%29%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li>
<li>Collins, M. O., Choudhary, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+multiprotein+complexes+by+affinity+purification+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).</li>
<li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).</li>
<li>Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+Drosophila+gene+coding+for+a+protein+containing+a+novel+phosphatidylserine-binding+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif.</a> J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).</li>
<li>Deng, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+antibody+single-chain+variable+fragments+with+improved+carbohydrate+binding+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display.</a> J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).</li>
<li>Danner, S., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+phage+display%3A+A+novel+genetic+selection+system+for+cloning+RNA-binding+proteins+from+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).</li>
<li>Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+chain+antibodies+specific+for+fatty+acids+derived+from+a+semi-synthetic+phage+display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+-+Gen+Subj%22%5BJournal%5D)">Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library.</a> Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).</li>
<li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+%CE%B1-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+%28RIDome%29%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li>
<li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mrd.1080010210/abstract">Current Protocols in Molecular Biology.</a> Mol Biol. 1 (2), 146(2003).</li>
<li>Sblattero, D., Bradbury, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+recombination+in+single+bacteria+to+make+large+phage+antibody+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries.</a> Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10(2011).</li>
<li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2803857/">BLAST+: architecture and applications.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 421(2009).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+The+Swiss-Army+tool+for+genome+feature+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinforma%22%5BJournal%5D)">BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis.</a> Curr Protoc Bioinforma. , (2014).</li>
<li>Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JBrowse%3A+A+next-generation+genome+browser%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">JBrowse: A next-generation genome browser.</a> Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).</li>
<li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+soluble%2Ffoldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering%3A+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).</li>
<li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtering+%26%2334%3Bgenic%26%2334%3B+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Filtering &#34;genic&#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5(2011).</li>
<li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+monoclonal+antibody+epitopes+by+filtered+gene+fragment+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display.</a> Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).</li>
<li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Stworzenie wysokiej jakości, wysoce zróżnicowanej, filtrowanej biblioteki ORF jest pierwszym krytycznym krokiem w całej procedurze, ponieważ będzie miało wpływ na wszystkie kolejne kroki potoku.
Ważną zaletą naszej metody jest to, że każde źródło (beztronowego) DNA (cDNA, genomowe DNA, DNA pochodzące z PCR lub syntetyczne DNA) nadaje się do budowy biblioteki. Pierwszym parametrem, który należy wziąć pod uwagę, jest to, że długość fragmentów DNA sklonowanych do wektora pFILTER powinna zapewniać...

Tutaj opisujemy wysokoprzepustową metodę budowy i wyboru bibliotek złożonych i rozpuszczalnych domen białkowych z dowolnego źródła początkowego genicznego/genomowego. Podejście to łączy w sobie trzy różne technologie: wyświetlanie fagów, wykorzystanie składanego reportera i sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) ze specjalnym narzędziem internetowym do analizy danych. Metody te mogą być stosowane w wielu różnych kontekstach badań opartych na białkach, do identyfikacji i adnotacji nowych białek/domen białkowych, charakterystyki właściwości strukturalnych i funkcjonalnych znanych białek, a także definiowania sieci interakcji białkowych.
Wiele otwartych pytań jest nadal obecnych w badaniach opartych na białkach, a rozwój metod optymalnej produkcji białka jest ważną potrzebą dla kilku dziedzin badań. Na przykład, pomimo dostępności tysięcy genomów prokariotycznych i eukariotycznych1, dla zdecydowanej większości organizmów nadal brakuje odpowiedniej mapy względnych proteomów z bezpośrednią adnotacją kodowanych białek i peptydów. Katalog kompletnych proteomów jawi się jako ambitny cel, wymagający ogromnego wysiłku pod względem czasu i zasobów. Złotym standardem w adnotacji eksperymentalnej pozostaje klonowanie wszystkich otwartych ramek odczytu (ORF) genomu, budując tak zwany "ORFeome". Zazwyczaj funkcja genu jest przypisywana na podstawie homologii do pokrewnych genów o znanej aktywności, ale to podejście jest słabo dokładne ze względu na obecność wielu nieprawidłowych adnotacji w referencyjnych bazach danych2,3,4,5. Co więcej, nawet w przypadku białek, które zostały zidentyfikowane i oznaczone, wymagane są dodatkowe badania, aby uzyskać charakterystykę pod względem liczebności, wzorców ekspresji w różnych kontekstach, w tym właściwości strukturalnych i funkcjonalnych, a także sieci interakcji.
Ponadto, ponieważ białka składają się z różnych domen, z których każda wykazuje specyficzne cechy i inaczej przyczynia się do funkcji białek, badanie i dokładna definicja tych domen może pozwolić na uzyskanie bardziej wszechstronnego obrazu, zarówno na poziomie pojedynczego genu, jak i na poziomie pełnego genomu. Wszystkie te niezbędne informacje sprawiają, że badania oparte na białkach są szeroką i wymagającą dziedziną.
Z tego punktu widzenia, ważnym wkładem mogłyby być bezstronne i wysokoprzepustowe metody produkcji białka. Jednak powodzenie takich podejść, oprócz wymaganych znacznych inwestycji, zależy od zdolności do produkcji rozpuszczalnych/stabilnych konstruktów białkowych. Jest to główny czynnik ograniczający, ponieważ szacuje się, że tylko około 30% białek może być z powodzeniem wyrażanych i wytwarzanych na wystarczających poziomach, aby były eksperymentalnie użyteczne6,7,8. Podejście mające na celu przezwyciężenie tego ograniczenia opiera się na wykorzystaniu losowo pofragmentowanego DNA do produkcji różnych polipeptydów, które razem zapewniają nakładającą się reprezentację fragmentów poszczególnych genów. Tylko niewielki procent losowo wygenerowanych fragmentów DNA to funkcjonalne ORF, podczas gdy zdecydowana większość z nich jest niefunkcjonalna (ze względu na obecność kodonów stop w ich sekwencjach) lub koduje nienaturalne (ORF w ramce innej niż oryginalna) polipeptydy bez znaczenia biologicznego.
Aby rozwiązać wszystkie te problemy, nasza grupa opracowała wysokoprzepustową platformę do analizy ekspresji i interakcji białek, która może być używana w skali genomicznej9,10,11,12. Platforma ta integruje następujące techniki: 1) metodę selekcji zbiorów prawidłowo sfałdowanych domen białkowych z kodującej części DNA z dowolnego organizmu; 2) technologia wyświetlania fagów do wyboru partnerów interakcji; 3) NGS w celu pełnego scharakteryzowania całego badanego interaktomii i zidentyfikowania klonów będących przedmiotem zainteresowania; oraz 4) narzędzie internetowe do analizy danych dla użytkowników bez żadnych umiejętności bioinformatycznych lub programistycznych, aby przeprowadzić analizę Interactome-Seq w łatwy i przyjazny dla użytkownika sposób.
Korzystanie z tej platformy oferuje ważne korzyści w porównaniu z alternatywnymi strategiami badawczymi; przede wszystkim metoda jest całkowicie bezstronna, wysokoprzepustowa i modułowa do badań od pojedynczego genu do całego genomu. Pierwszym krokiem jest stworzenie biblioteki z losowo pofragmentowanego badanego DNA, które jest następnie głęboko charakteryzowane przez NGS. Biblioteka ta jest generowana przy użyciu zmodyfikowanego wektora, w którym geny/fragmenty będące przedmiotem zainteresowania są klonowane między sekwencją sygnałową do wydzielania białka do przestrzeni peryplazmatycznej (tj. liderem Sec) a genem TEM1 β-laktamazy. Białko fuzyjne zapewni oporność na ampicylinę i zdolność do przetrwania pod ciśnieniem ampicyliny tylko wtedy, gdy sklonowane fragmenty znajdują się w ramce z obydwoma tymi elementami, a powstałe białko fuzyjne jest prawidłowo złożone10,13,14. Wszystkie klony uratowane po selekcji antybiotykowej, tak zwane "przefiltrowane klony", są ORFami i zdecydowana większość z nich (ponad 80%) pochodzi z prawdziwych genów9. Co więcej, siła tej strategii polega na odkryciach, że wszystkie klony przefiltrowane przez ORF kodują prawidłowo złożone/rozpuszczalne białka/domeny15. Ponieważ wiele klonów, obecnych w bibliotece i mapujących w tym samym regionie/domenie, ma różne punkty początkowe i końcowe, pozwala to na bezstronną, jednoetapową identyfikację minimalnych fragmentów, które mogą skutkować rozpuszczalnymi produktami.
Dalsze ulepszenie technologii jest możliwe dzięki zastosowaniu NGS do scharakteryzowania biblioteki. Połączenie tej platformy i specjalnego narzędzia internetowego do analizy danych dostarcza ważnych, bezstronnych informacji na temat dokładnych sekwencji nukleotydów oraz lokalizacji wybranych ORF na badanym referencyjnym DNA bez konieczności dalszych obszernych analiz lub wysiłków eksperymentalnych.
Biblioteki domenomowe mogą być przeniesione do kontekstu wyboru i używane jako uniwersalne narzędzie do przeprowadzania badań funkcjonalnych. Wysokoprzepustowa platforma do analizy ekspresji i interakcji białek, którą zintegrowaliśmy i którą nazwaliśmy Interactome-Seq, wykorzystuje technologię wyświetlania fagów, przenosząc przefiltrowany ORF do wektora fagowego i tworząc bibliotekę fagów-ORF. Po ponownym sklonowaniu do kontekstu wyświetlania faga, domeny białkowe są wyświetlane na powierzchni cząstek M13; W ten sposób biblioteki domenomowe mogą być bezpośrednio selekcjonowane pod kątem fragmentów genów kodujących domeny o określonych aktywnościach enzymatycznych lub właściwościach wiązania, co pozwala na profilowanie sieci interaktomowych. Podejście to zostało początkowo opisane przez Zacchi i wsp.16 i później używane w kilku innych kontekstach13,17,18.
W porównaniu z innymi technologiami używanymi do badania interakcji białko-białko (w tym drożdże dwa hybrydowe systemy i spektrometria masowa19,20), jedną z głównych zalet jest wzmocnienie partnera wiążącego, które występuje podczas wielu rund selekcji fagów. Zwiększa to czułość selekcyjną, umożliwiając w ten sposób identyfikację domen białek wiążących o niskiej obfitości obecnych w bibliotece. Efektywność selekcji przeprowadzanej za pomocą biblioteki filtrowanej przez ORF jest dodatkowo zwiększona ze względu na brak niefunkcjonalnych klonów. Wreszcie, technologia pozwala na przeprowadzenie selekcji zarówno w odniesieniu do przynęt białkowych, jak i niebiałkowych21,22,23,24,25.
Selekcja fagów przy użyciu biblioteki domainome-phage może być przeprowadzona przy użyciu przeciwciał pochodzących z surowic pacjentów z różnymi stanami patologicznymi, np. chorobami autoimmunologicznymi13, rak lub choroby infekcyjne jako przynęta. Podejście to służy do uzyskania tzw. "sygnatury przeciwciał" badanej choroby, co pozwala na masową identyfikację i charakterystykę antygenów/epitopów specyficznie rozpoznawanych przez przeciwciała pacjentów w tym samym czasie. W porównaniu z innymi metodami, zastosowanie wyświetlania fagów pozwala na identyfikację zarówno liniowych, jak i konformacyjnych epitopów antygenowych. Identyfikacja konkretnej sygnatury może potencjalnie mieć istotny wpływ na zrozumienie patogenezy, projektowania nowych szczepionek, identyfikacji nowych celów terapeutycznych oraz opracowania nowych i specyficznych narzędzi diagnostycznych i prognostycznych. Co więcej, gdy badanie koncentruje się na chorobach zakaźnych, główną zaletą jest to, że odkrycie białek immunogennych jest niezależne od hodowli patogenów.
Nasze podejście potwierdza, że składane reportery mogą być używane na skali genomowej do wyboru "domenomu": zbioru poprawnie złożonych, dobrze wyrażonych, rozpuszczalnych domen białkowych z kodującej części DNA i/lub cDNA z dowolnego organizmu. Po wyizolowaniu fragmenty białka są przydatne do wielu celów, dostarczając niezbędnych informacji eksperymentalnych do adnotacji genów, a także do badań strukturalnych, mapowania epitopów przeciwciał, identyfikacji antygenów itp. Kompletność danych o wysokiej przepustowości dostarczanych przez NGS umożliwia analizę bardzo złożonych próbek, takich jak biblioteki wyświetlania fagów, i ma potencjał do obejścia tradycyjnego pracochłonnego wybierania i testowania pojedynczych klonów uratowanych przez fagi.
Jednocześnie, dzięki cechom filtrowanej biblioteki oraz ekstremalnej czułości i mocy analizy NGS, możliwe jest zidentyfikowanie domeny białkowej odpowiedzialnej za każdą interakcję bezpośrednio w początkowym ekranie, bez potrzeby tworzenia dodatkowych bibliotek dla każdego związanego białka. NGS pozwala na uzyskanie kompleksowej definicji całego domomu dowolnego źródła wyjściowego genów/genomu, a narzędzie internetowe do analizy danych umożliwia uzyskanie wysoce specyficznej charakterystyki zarówno z jakościowego, jak i ilościowego punktu widzenia domen białek interaktomowych.

<table><tbody><tr><td>Homogenizator ultradźwiękowy Sonopuls</td><td>Bandelin</td><td>HD2070</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0321</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0311</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Biologia molekularna</td><td>Agaroza BioRad</td><td>161-3102</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Green Gel Plus</td><td>Fisher Molecular Biology</td><td>FS-GEL01</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>6x barwnik ładujący DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>zestaw do szybkiego stępiania</td><td>New England Biolabs</td><td>E1201S</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>Kulki magnetyczne streptawidyny</td><td>New England Biolabs</td><td>S1420S</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195L</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza antarktyczna</td><td>New England Biolabs</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu 3M pH5.2</td><td>ogólny dostawca</td><td></td><td></td>laboratoryjny</tr><tr><td>Etanol do biologii molekularnej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Komórki bakteryjne DH5aF Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml probówki</td><td>ogólny dostawca</td><td></td> <td>laboratoryjny</td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml Ogólny</td><td>dostawca</td><td></td><td></td>laboratoryjny</tr><tr><td>Kuwety do elektroporacji 0,1 cm</td><td>Biosigma</td><td>4905020</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x YT medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1003</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA Polimeraza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EP0702</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina roztworów deoksynukleotydów (dNTP) New</td><td>England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy termocykler (z podgrzewaną pokrywą)</td><td>Ogólny dostawca</td><td></td><td></td>laboratoryjny</tr><tr><td>Płytki 150 mm</td><td>Ogólny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>laboratoryjny Płytki 100 mm Ogólny</td><td>dostawca</td> <td>laboratoryjny</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>BssHII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0199L</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131L</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>M13KO7 Helper Phage</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-1524-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny ze Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy (PEG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5413</td><td></td></tr><tr><td>Kloryd sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Ogólny dostawca</td><td></td><td></td>laboratoryjny</tr><tr><td>Dynabeads Białko G do immunoprecypitacji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>MagnaRack Magnetic Separation Rack</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15000</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Beztłuszczowe mleko w proszku</td><td>EuroClone</td><td>EMR180500</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems, Fisher Scientific</td><td>7958935001</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki AMPure XP</td><td>Agencourt, Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT podwójne podkłady</td><td>indeksowe Illumina</td><td>FC-131-2001 lub FC-131-2002 lub FC-131-2003 lub FC-131-2004</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq lub Hiseq2500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomer</td><td>Nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent Bioanalizator lub TapeStation</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forward PCR starter</td><td>dla ogólnego dostawcy</td><td></td><td>laboratoryjnego 5' TACCTATTGCCTACGGCA GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3'</td></tr><tr><td>Starter do odwróconego PCR</td><td>ogólny dostawca</td><td></td> laboratoryjny <td>5 ' TGGTGATGGTGAGTACTA TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3'</td></tr><tr><td>Podkład do przodu dla</td><td>ogólnego dostawcy</td><td></td> laboratoryjnego NGS <td>5' TCGTCGGCAGCGTCAGAGA TGTGTATAAGAGACAGGCA GCAAGCGGCGCCCATGC 3';</td></tr><tr><td>Odwrócony podkład dla</td><td>ogólnego dostawcy</td><td></td> laboratoryjnego NGS <td>5' GTCTCGTGGGCTCGGAGA TGTGTATAAGAGACAGGGG ATTGGTTTGCCGCTAGC 3';</td></tr></tbody></table>

interactome-seq: protokół do budowania, walidacji i wyboru bibliotek domenomowych poprzez wyświetlanie fagów i sekwencjonowanie nowej generacji

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Składane reportery to białka o łatwych do zidentyfikowania fenotypach, takich jak oporność na antybiotyki, których fałdowanie i funkcja są zagrożone, gdy są połączone ze słabo fałdowanymi białkami lub losowymi otwartymi ramkami odczytu. Opracowaliśmy strategię, w której za pomocą TEM-1 β-laktamazy (enzymu nadającego oporność na ampicylinę) w skali genomowej, możemy wybrać zbiory prawidłowo sfałdowanych domen białkowych z kodującej części DNA dowolnego genomu beztronowego. Fragmenty białek uzyskane w ten sposób, tak zwane "domenom", będą dobrze wyrażone i rozpuszczalne, dzięki czemu będą odpowiednie do badań strukturalnych/funkcjonalnych.
Poprzez klonowanie i wyświetlanie "domenomu" bezpośrednio w systemie wyświetlania fagów, pokazaliśmy, że możliwe jest wybranie określonych domen białkowych o pożądanych właściwościach wiązania (np. z innymi białkami lub przeciwciałami), dostarczając w ten sposób niezbędnych informacji eksperymentalnych do adnotacji genów lub identyfikacji antygenu.
Identyfikacja najbardziej wzbogaconych klonów w wybranej populacji poliklonalnej może być osiągnięta dzięki zastosowaniu nowatorskich technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Z tych powodów wprowadzamy głęboką analizę sekwencjonowania samej biblioteki i wyników selekcji, aby dostarczyć pełnych informacji na temat różnorodności, obfitości i precyzyjnego odwzorowania każdego z wybranych fragmentów. Przedstawione tutaj protokoły pokazują kluczowe etapy budowy, charakterystyki i walidacji biblioteki.

Podejście do filtrowania przedstawiono schematycznie na Ryc. 1. Można zastosować każdy rodzaj DNA bez intronów. Na Ryc. 1A przedstawiono pierwszą część procesu filtrowania: po naniesieniu na żel agarozowy lub do bioanalizatora, prawidłowa fragmentacja badanego DNA objawia się jako smug fragmentów o rozkładzie długości w pożądanym zakresie 150-750 bp. Przedstawiono reprezentacyjny obraz wirtualnego żelu otrzymanego sfragmentowaneg...

Opisane protokoły pozwalają na budowę, charakterystykę i selekcję (w stosunku do wybranego celu) biblioteki "domenomowej" wykonanej z dowolnego źródła DNA. Jest to możliwe dzięki procesowi badawczemu, który łączy różne technologie: wyświetlanie fagów, składany reporter i sekwencjonowanie nowej generacji z narzędziem internetowym do analizy danych.

Interactome-Seq: Protokół do budowania, walidacji i wyboru bibliotek domenomowych poprzez wyświetlanie fagów i sekwencjonowanie nowej generacji

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach opartych na białkach, takie jak adnotacja nowych białek lub domen białkowych, charakterystyka właściwości strukturalnych i funkcjonalnych znanych białek, definicja sieci interakcji białkowych lub sygnatury przeciwciał antygenowych w różnych warunkach. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona całkowicie bezstronna, wysokoprzepustowa i modułowa dla każdego rodzaju badań, od pojedynczego genu do całego genomu. Budowa biblioteki domainone jest bardzo przydatna do badań funkcjonalnych.Można go przenieść do kontekstu wyświetlania faga i wykorzystać do selekcji względem różnych celów, takich jak białka wiążące lub oczyszczone przeciwciała. Sprzężenie z NGS umożliwia niezwykle czułą i wydajną analizę. Jednocześnie specjalnie opracowane narzędzia internetowe dają precyzyjną charakterystykę całego domenie i interaktomii.Aby najpierw skonstruować bibliotekę ORF, należy poddać sonifikację DNA za pomocą 30-sekundowych impulsów o 100% mocy wyjściowej. Po sonikacji załaduj drabinę i sonikowane DNA na 1,5% żel agarozowy. Następnie uruchom jednostkę elektroforezy przy napięciu pięciu woltów na centymetr przez 15 minut.Elektroforeza w żelu agarozowym wykazuje obecność rozmazu DNA potwierdzającego sonikację. Jest to w porównaniu z solidnym prążkiem otrzymanym z DNA niepoddanego sonikacji. Następnie odetnij porcję żelu z rozmazem rozdrobnionego DNA i oczyść za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu na bazie kolumny.Zmierzyć stężenie oczyszczonego DNA w spektrofotometrze UV. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami producenta i potraktuj pięć mikrogramów wkładki jednym mikrolitrem szybko stępiającej mieszanki enzymów. Następnie dezaktywuj mieszankę enzymów w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut.Aby przygotować wektor filtrujący, najpierw należy przetrawić pięć mikrogramów oczyszczonego wektora klonowania za pomocą enzymu restrykcyjnego EcoRV. Następnie załaduj strawione i niestrawione wektory oraz marker molekularny na 1% żel agarozowy. Następnie podgrzej enzym restrykcyjny w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 20 minut.Następnie fosforyluj strawiony wektor pięcioma jednostkami enzymu fosfatazy i 1/10 objętości 10-krotnego buforu fosfatazy. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie dezaktywuj enzym fosfatazę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut.Następnie wyekstrahuj plazmid z żelu i oczyść DNA. Następnie zmierz stężenie DNA w spektrofotometrze UV. Aby przeprowadzić reakcję ligacji, dodaj 400 nanogramów fosforylowanych insertów do jednego mikrograma strawionego wektora, 10X buforu ligazy DNA T4 i ligazy DNA T4 do końcowej objętości 100 mikrolitrów.Następnie inkubuj reakcję ligacji w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia ciepło dezaktywuje ligazę w temperaturze 65 stopni Celsjusza na 10 minut. Następnie dodać 1/10 objętości trzech molowych octanu sodu o pH 5,2 i 2,5 objętości 100% etanolu, aby wytrącić produkt ligacji.Aby wytrącić DNA, wymieszaj odczynniki i zamrażaj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po 20 minutach wirować z najwyższą prędkością przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu usunąć supernatant.Do granulatu dodaj 500 mikrolitrów zimnego 70% etanolu i ponownie odwiruj. Odrzucić supernatant pod koniec wirowania. Po wysuszeniu osadu na powietrzu rozpuść wytrącone DNA w 10 mikrolitrach wody.Przed wykonaniem elektroporacji należy ustawić na lodzie odpowiednią liczbę probówek do mikrowirówek i kuwet do elektroporacji o średnicy 0,1 centymetra. Następnie dodaj jeden mikrolitr oczyszczonego produktu ligacji do 25 mikrolitrów komórek. Następnie odpipetuj DNA, mieszaninę komórek do zimnej kuwety do elektroporacji i przesuń probówkę.Następnie wytrzyj wodę z zewnętrznej części kuwety i umieść ją w jednostce do elektroporacji i uderz w impuls. Po zakończeniu elektroporacji szybko dodaj jeden mililitr płynnej pożywki 2X YT bez antybiotyku do komórek w kuwecie. Następnie przenieś mieszaninę komórkową do 10-mililitrowej probówki.Pozostaw rurkę na wytrząsarce z prędkością 220 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Rozcieńczenia biblioteki należy umieścić na 10-centymetrowych płytkach agarowych 2X YT uzupełnionych chloramfenikolem, ampicyliną i tylko chloramfenikolem. Ma to na celu uzyskanie pojedynczych kolonii do przetestowania metodą PCR i przeprowadzenia miareczkowania.Następnie połóż przekształcone kompetentne komórki na 15-centymetrowych płytkach agarowych 2X YT uzupełnionych chloramfenikolem i ampicyliną. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia policz kolonie, wybierając rozcieńczenie, w którym można je policzyć.Następnie oblicz rozmiar biblioteki. Rozmiar biblioteki oblicza się w następujący sposób: średnia liczba kolonii razy współczynnik rozcieńczenia razy całkowita objętość biblioteki. Rozmiar biblioteki powinien być rzędu 10 do potęgi sześciu klonów.Jeśli stężenie ampicyliny jest optymalne do przeprowadzenia większej filtracji, liczba klonów zmniejsza się do 1 do 20 w stosunku do liczby uzyskanej przy braku tego antybiotyku. Aby przetestować pozytywne kolonie, użyj końcówki, aby zebrać około 15 do 20 pojedynczych kolonii. Następnie rozcieńczyć kolonie 100 mikrolitrami pożywki 2X YT bez antybiotyków.Następnie PCR amplifikuje 0,5 mikrolitra kultury jako matrycę DNA za pomocą polimerazy DNA Taq. Podczas PCR należy przeprowadzić 25 cykli amplifikacji przy użyciu temperatury wyżarzania 55 stopni Celsjusza i czasu wydłużenia 40 sekund w temperaturze 72 stopni Celsjusza. Sprawdź, czy długość wkładki mieści się w oczekiwanym zakresie od 150 do 750 par zasad.I że różne kolonie mają różne wkładki o różnej wielkości. Świadczy to o dobrym przygotowaniu biblioteki pod względem zmienności. Następnie dodaj trzy mililitry świeżej pożywki 2X YT do 150-milimetrowych płytek, aby zebrać bakterie.Następnie zbierz bakterie za pomocą sterylnego skrobaka. Po dokładnym wymieszaniu dodaj 20% glicerolu i pozostaw w minus 80 stopniach Celsjusza w porcjach do wykorzystania w przyszłości. Do natychmiastowego użycia należy wykonać zestaw do ekstrakcji plazmidu oparty na kolumnie, aby oczyścić plazmidowe DNA z jednej z podwielokrotności biblioteki przed dodaniem glicerolu.Zmierz stężenie DNA w spektrofotometrze UV, a następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia. Użyj 2,5 mikrolitra biblioteki jako matrycy DNA do amplifikacji PCR. Ustaw warunki termocyklera i rozpocznij bieg.Następnie użyj zestawu do indeksowego PCR, aby wykonać indeksowy PCR. Spowoduje to sekwencjonowanie podwójnie indeksowanych bibliotek w multipleksowanych przebiegach Illumina. Następnie ustaw warunki termocyklera i rozpocznij bieg.Po oczyszczeniu za pomocą kulek AMPure XP, aby zweryfikować rozmiar, uruchom jeden mikrolitr rozcieńczenia od jednego do 10 końcowej biblioteki na bioanalizatorze. Następnie określ ilościowo, wybierając region końcowego śladu biblioteki. Te schematyczne przedstawienia pokazują, że po sklonowaniu do wektora filtra P, tylko kolonie odpowiadające ORF wytwarzają funkcjonalną beta-laktamazę w obecności antybiotyków.Po przefiltrowaniu oczekuje się 20-krotnego spadku liczby klonów. Z dobrymi folderami ORF rosnącymi przy wyższych stężeniach antybiotyków. Co więcej, fragmenty ORF można łatwo odzyskać z filtrowanej biblioteki.Biblioteka fagów ORF jest skonstruowana w celu przeprowadzenia selekcji wyświetlacza fagowego w stosunku do docelowych białek lub przeciwciał. Wszystkie biblioteki i uzyskane wyniki są następnie dogłębnie analizowane przez NGS. NGS dostarcza kompletnych informacji na temat różnorodności, zasobności i precyzyjnego odwzorowania każdego z wybranych fragmentów.Wreszcie, opracowane narzędzie internetowe do wyszukiwania interactome generuje surowe odczyty sekwencjonowania w zakresie do listy domniemanych domen z adnotacjami genomicznymi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonstruować i zweryfikować bibliotekę domenomową z pożądanego źródła DNA. A także przeprowadzenie wysokoprzepustowego badania przesiewowego biblioteki za pomocą sekwencjonowania nowej generacji.Zoptymalizowaliśmy sekwencjonowanie bibliotek filtrujących ORF za pomocą platform Illumina i opracowaliśmy narzędzie internetowe, które umożliwia analizę tego rodzaju danych bez konieczności posiadania umiejętności programistycznych.

interactome-seq-protocol-for-domainome-library-construction

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje metodę badania interakcji białko-lek za pomocą biopanowania biblioteki peptydów wyświetlanych przez fagi T7 za pomocą biosensora QCM. Biopanowanie fagów wyświetlających określony peptyd na biosensorze QCM pozwala na specyficzną izolację peptydów o wysokim powinowactwie, a następnie sekwencjonowanie aminokwasów, co pomaga zidentyfikować określone miejsca interakcji na białku docelowym.

Biopanowanie oparte na biosensorach mikrowagi kwarcowej do badania interakcji białko-lek

Wyświetlanie fagów to potężna technika do wychwytywania białek lub ugrupowań białkowych, które oddziałują z unieruchomioną cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. Po podjęciu decyzji o rodzaju biblioteki cDNA fagów, którą należy utworzyć i przebadać, opisany tutaj protokół pozwala na skuteczną selekcję powinowactwa prowadzącą do identyfikacji interaktorów.

Protokół wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa przy użyciu rekombinowanych przynęt białkowych

Metoda jest opisana z wizualnym akompaniamentem do przeprowadzania skalowalnych, wysokoprzepustowych selekcji z kombinatorycznych bibliotek syntetycznych przeciwciał wyświetlanych przez fagi przeciwko setkom antygenów jednocześnie. Stosując to równoległe podejście, wyizolowaliśmy fragmenty przeciwciał, które wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla różnych antygenów, które są funkcjonalne w standardowych testach immunologicznych.

Skalowalny wybór przeciwciał syntetycznych o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi

Tutaj prezentujemy fenomiczne podejścia do funkcjonalnej charakterystyki domniemanych genów fagowych. Techniki obejmują opracowany test zdolny do monitorowania metabolizmu anabolicznego gospodarza, płytki do oznaczania wielu fenotypów (MAP), oprócz uznanej metody metabolomiki, zdolnej do pomiaru wpływu na metabolizm kataboliczny.

Fenomika fagów: fizjologiczne podejścia do charakterystyki nowych białek wirusowych

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego, solidna alternatywa dla przeciwciał. Półautomatyczna metoda sortowania usprawniła biopanoramowanie w celu zmniejszenia występowania wyników fałszywie dodatnich. Poniżej ilustrujemy proces myślowy i techniki stosowane w ocenie kandydatów i minimalizacji dalszej analizy.

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Głębokie sekwencjonowanie populacji drożdży wybranych do pozytywnych interakcji drożdży z hybrydami 2 potencjalnie dostarcza wielu informacji na temat oddziałujących białek partnerskich. W tym miejscu opisujemy działanie konkretnych narzędzi bioinformatycznych i dostosowanego zaktualizowanego oprogramowania do analizy danych sekwencyjnych z takich ekranów.

Analiza informacyjna danych sekwencyjnych z przesiewów drożdżowych 2-hybrydowych

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Tworzenie chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek o pożądanym powinowactwie i specyficzności dla dowolnego ligandu małych cząsteczek miałoby wiele zastosowań w biologicznym wykrywaniu i uruchamianiu. W tym miejscu opisujemy wydajną, uogólnioną metodę inżynierii de novo chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji poprzez krokowy wybór kombinatorycznej biblioteki przeciwciał jednodomenowych wyświetlanej przez fagi.

Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Ubikwitynacja jest krytyczną modyfikacją potranslacyjną białka, której dysregulacja jest przyczyną wielu chorób ludzkich. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób można wykorzystać wyświetlanie fagów do izolowania nowych wariantów ubikwityny, które mogą wiązać i modulować aktywność ligazów E3, które kontrolują specyficzność, wydajność i wzorce ubikwitynacji.

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do opracowania modulatorów wariantów ubikwityny dla ligaz E3

Poznaj metodę budowy i walidacji bibliotek domenomowych z wykorzystaniem wyświetlania fagów i sekwencjonowania nowej generacji. To podejście umożliwia bezstronną, wysokoprzepustową analizę interakcji białkowych.

Interactome-Seq: Protokół do budowania, walidacji i wyboru bibliotek domenomowych poprzez wyświetlanie fagów i sekwencjonowanie nowej generacji (Wideo) | JoVE Journal

Interactome-Seq: Protokół do budowania, walidacji i wyboru bibliotek domenomowych poprzez wyświetlanie fagów i sekwencjonowanie nowej generacji

Przeglądaj więcej filmów