Interactome-Seq: Protokół do budowania, walidacji i wyboru bibliotek domenomowych poprzez wyświetlanie fagów i sekwencjonowanie nowej generacji

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach opartych na białkach, takie jak adnotacja nowych białek lub domen białkowych, charakterystyka właściwości strukturalnych i funkcjonalnych znanych białek, definicja sieci interakcji białkowych lub sygnatury przeciwciał antygenowych w różnych warunkach. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona całkowicie bezstronna, wysokoprzepustowa i modułowa dla każdego rodzaju badań, od pojedynczego genu do całego genomu. Budowa biblioteki domainone jest bardzo przydatna do badań funkcjonalnych.

Można go przenieść do kontekstu wyświetlania faga i wykorzystać do selekcji względem różnych celów, takich jak białka wiążące lub oczyszczone przeciwciała. Sprzężenie z NGS umożliwia niezwykle czułą i wydajną analizę. Jednocześnie specjalnie opracowane narzędzia internetowe dają precyzyjną charakterystykę całego domenie i interaktomii.

Aby najpierw skonstruować bibliotekę ORF, należy poddać sonifikację DNA za pomocą 30-sekundowych impulsów o 100% mocy wyjściowej. Po sonikacji załaduj drabinę i sonikowane DNA na 1,5% żel agarozowy. Następnie uruchom jednostkę elektroforezy przy napięciu pięciu woltów na centymetr przez 15 minut.

Elektroforeza w żelu agarozowym wykazuje obecność rozmazu DNA potwierdzającego sonikację. Jest to w porównaniu z solidnym prążkiem otrzymanym z DNA niepoddanego sonikacji. Następnie odetnij porcję żelu z rozmazem rozdrobnionego DNA i oczyść za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu na bazie kolumny.

Zmierzyć stężenie oczyszczonego DNA w spektrofotometrze UV. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami producenta i potraktuj pięć mikrogramów wkładki jednym mikrolitrem szybko stępiającej mieszanki enzymów. Następnie dezaktywuj mieszankę enzymów w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Aby przygotować wektor filtrujący, najpierw należy przetrawić pięć mikrogramów oczyszczonego wektora klonowania za pomocą enzymu restrykcyjnego EcoRV. Następnie załaduj strawione i niestrawione wektory oraz marker molekularny na 1% żel agarozowy. Następnie podgrzej enzym restrykcyjny w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Następnie fosforyluj strawiony wektor pięcioma jednostkami enzymu fosfatazy i 1/10 objętości 10-krotnego buforu fosfatazy. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie dezaktywuj enzym fosfatazę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie wyekstrahuj plazmid z żelu i oczyść DNA. Następnie zmierz stężenie DNA w spektrofotometrze UV. Aby przeprowadzić reakcję ligacji, dodaj 400 nanogramów fosforylowanych insertów do jednego mikrograma strawionego wektora, 10X buforu ligazy DNA T4 i ligazy DNA T4 do końcowej objętości 100 mikrolitrów.

Następnie inkubuj reakcję ligacji w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia ciepło dezaktywuje ligazę w temperaturze 65 stopni Celsjusza na 10 minut. Następnie dodać 1/10 objętości trzech molowych octanu sodu o pH 5,2 i 2,5 objętości 100% etanolu, aby wytrącić produkt ligacji.

Aby wytrącić DNA, wymieszaj odczynniki i zamrażaj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po 20 minutach wirować z najwyższą prędkością przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu usunąć supernatant.

Do granulatu dodaj 500 mikrolitrów zimnego 70% etanolu i ponownie odwiruj. Odrzucić supernatant pod koniec wirowania. Po wysuszeniu osadu na powietrzu rozpuść wytrącone DNA w 10 mikrolitrach wody.

Przed wykonaniem elektroporacji należy ustawić na lodzie odpowiednią liczbę probówek do mikrowirówek i kuwet do elektroporacji o średnicy 0,1 centymetra. Następnie dodaj jeden mikrolitr oczyszczonego produktu ligacji do 25 mikrolitrów komórek. Następnie odpipetuj DNA, mieszaninę komórek do zimnej kuwety do elektroporacji i przesuń probówkę.

Następnie wytrzyj wodę z zewnętrznej części kuwety i umieść ją w jednostce do elektroporacji i uderz w impuls. Po zakończeniu elektroporacji szybko dodaj jeden mililitr płynnej pożywki 2X YT bez antybiotyku do komórek w kuwecie. Następnie przenieś mieszaninę komórkową do 10-mililitrowej probówki.

Pozostaw rurkę na wytrząsarce z prędkością 220 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Rozcieńczenia biblioteki należy umieścić na 10-centymetrowych płytkach agarowych 2X YT uzupełnionych chloramfenikolem, ampicyliną i tylko chloramfenikolem. Ma to na celu uzyskanie pojedynczych kolonii do przetestowania metodą PCR i przeprowadzenia miareczkowania.

Następnie połóż przekształcone kompetentne komórki na 15-centymetrowych płytkach agarowych 2X YT uzupełnionych chloramfenikolem i ampicyliną. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia policz kolonie, wybierając rozcieńczenie, w którym można je policzyć.

Następnie oblicz rozmiar biblioteki. Rozmiar biblioteki oblicza się w następujący sposób: średnia liczba kolonii razy współczynnik rozcieńczenia razy całkowita objętość biblioteki. Rozmiar biblioteki powinien być rzędu 10 do potęgi sześciu klonów.

Jeśli stężenie ampicyliny jest optymalne do przeprowadzenia większej filtracji, liczba klonów zmniejsza się do 1 do 20 w stosunku do liczby uzyskanej przy braku tego antybiotyku. Aby przetestować pozytywne kolonie, użyj końcówki, aby zebrać około 15 do 20 pojedynczych kolonii. Następnie rozcieńczyć kolonie 100 mikrolitrami pożywki 2X YT bez antybiotyków.

Następnie PCR amplifikuje 0,5 mikrolitra kultury jako matrycę DNA za pomocą polimerazy DNA Taq. Podczas PCR należy przeprowadzić 25 cykli amplifikacji przy użyciu temperatury wyżarzania 55 stopni Celsjusza i czasu wydłużenia 40 sekund w temperaturze 72 stopni Celsjusza. Sprawdź, czy długość wkładki mieści się w oczekiwanym zakresie od 150 do 750 par zasad.

I że różne kolonie mają różne wkładki o różnej wielkości. Świadczy to o dobrym przygotowaniu biblioteki pod względem zmienności. Następnie dodaj trzy mililitry świeżej pożywki 2X YT do 150-milimetrowych płytek, aby zebrać bakterie.

Następnie zbierz bakterie za pomocą sterylnego skrobaka. Po dokładnym wymieszaniu dodaj 20% glicerolu i pozostaw w minus 80 stopniach Celsjusza w porcjach do wykorzystania w przyszłości. Do natychmiastowego użycia należy wykonać zestaw do ekstrakcji plazmidu oparty na kolumnie, aby oczyścić plazmidowe DNA z jednej z podwielokrotności biblioteki przed dodaniem glicerolu.

Zmierz stężenie DNA w spektrofotometrze UV, a następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia. Użyj 2,5 mikrolitra biblioteki jako matrycy DNA do amplifikacji PCR. Ustaw warunki termocyklera i rozpocznij bieg.

Następnie użyj zestawu do indeksowego PCR, aby wykonać indeksowy PCR. Spowoduje to sekwencjonowanie podwójnie indeksowanych bibliotek w multipleksowanych przebiegach Illumina. Następnie ustaw warunki termocyklera i rozpocznij bieg.

Po oczyszczeniu za pomocą kulek AMPure XP, aby zweryfikować rozmiar, uruchom jeden mikrolitr rozcieńczenia od jednego do 10 końcowej biblioteki na bioanalizatorze. Następnie określ ilościowo, wybierając region końcowego śladu biblioteki. Te schematyczne przedstawienia pokazują, że po sklonowaniu do wektora filtra P, tylko kolonie odpowiadające ORF wytwarzają funkcjonalną beta-laktamazę w obecności antybiotyków.

Po przefiltrowaniu oczekuje się 20-krotnego spadku liczby klonów. Z dobrymi folderami ORF rosnącymi przy wyższych stężeniach antybiotyków. Co więcej, fragmenty ORF można łatwo odzyskać z filtrowanej biblioteki.

Biblioteka fagów ORF jest skonstruowana w celu przeprowadzenia selekcji wyświetlacza fagowego w stosunku do docelowych białek lub przeciwciał. Wszystkie biblioteki i uzyskane wyniki są następnie dogłębnie analizowane przez NGS. NGS dostarcza kompletnych informacji na temat różnorodności, zasobności i precyzyjnego odwzorowania każdego z wybranych fragmentów.

Wreszcie, opracowane narzędzie internetowe do wyszukiwania interactome generuje surowe odczyty sekwencjonowania w zakresie do listy domniemanych domen z adnotacjami genomicznymi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonstruować i zweryfikować bibliotekę domenomową z pożądanego źródła DNA. A także przeprowadzenie wysokoprzepustowego badania przesiewowego biblioteki za pomocą sekwencjonowania nowej generacji.

Zoptymalizowaliśmy sekwencjonowanie bibliotek filtrujących ORF za pomocą platform Illumina i opracowaliśmy narzędzie internetowe, które umożliwia analizę tego rodzaju danych bez konieczności posiadania umiejętności programistycznych.