Name: Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Poznaj metodę inżynierii systemów dimeryzacji białek jako biosensory dla małych cząsteczek. Wykorzystuje bibliotekę przeciwciał jednodomenowych z fagowym wyświetlaniem do selekcji bez specjalistycznego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez University of Washington Innovation Award (dla L.G.), grant od U.S. National Institutes of Health (1R35GM128918 dla L.G.) oraz fundusz startowy Uniwersytetu Waszyngtońskiego (dla L.G.). H.J. był wspierany przez stypendium licencjackie Washington Research Foundation. K.W. był wspierany przez stypendium licencjackie z University of Washington Institute for Protein Design.

1. Konstrukcja biblioteki
<ol>
	<li>Należy użyć syntetycznej kombinatorycznej biblioteki przeciwciał jednodomenowych o różnorodności ok. 1,23–7,14 x 109, zgodnie z wcześniejszym opisem19. Choć niniejszy protokół nie obejmuje konstrukcji biblioteki, można go zastosować do innych kombinatorycznych bibliotek ligandów.</li>
</ol>
2. Biotynylacja celu ligandu lub ligandu
<ol>
	<li> przeprowadź biotynylację wybranego ligandu, na przykład CBD oraz tetrahydrokanabinolu (THC)19, stosując różne strategie syntezy chemicznej, w zależności od odpowiednich miejsc biotynylacji w cząsteczce docelowej.</li>
</ol>
3. Przesiewanie wiążących kotwic
<ol>
	<li>Rozpoczęcie selekcji
	<ol>
		<li>Każdą rundę selekcji rozpocznij od inokulacji pojedynczej kolonii komórek TG1, świeżo wyhodowanej w 6 mL pożywki 2YT w temperaturze 37 ˚C i przy 250 obrotach na minutę (rpm), do absorbancji 600 nm (OD600) na poziomie ~0,5. Inkubuj komórki na lodzie do wykorzystania w kroku 3.5.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Selekcja negatywna z użyciem kulek streptawidyny związanych z biotyną
	<ol>
		<li>Przygotuj „kuleczki do selekcji negatywnej”, przemywając 300 µL magnetycznych kuleczek pokrytych streptawidyną za pomocą statywu do separacji magnetycznej: 3x buforem fosforanowym z Tweenem 0,05% (PBST, 1 x PBS z 0,05% obj. obj. Tween 20%) oraz 2x buforem 1 x PBS.</li>
		<li>Resuspenduj kuleczki w 1 mL 1% kazeiny w 1 x PBS (pH = 7,4) i nasyć je, dodając biotynę w ilości 5-krotnie przekraczającej zgłoszoną pojemność wiązania. Inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) na rotatorze przez 1 h.</li>
		<li>Przemyj kuleczki 5x buforem 0,05% PBST i 3x buforem 1 x PBS, łącznie osiem razy.</li>
		<li>Dodaj ~1013 cząsteczek fagów w 1% kazeinie/1% BSA w 1 x PBS (pH = 7,4) i inkubuj w RT na rotatorze przez 1 h.</li>
		<li>Po inkubacji zbierz nadsącz do wykorzystania w kroku 3.3.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Selekcja pozytywna z użyciem kulek streptawidyny związanych z biotynilowanym ligandem
	<ol>
		<li>Przygotuj „kuleczki do selekcji pozytywnej”, używając połowy objętości kuleczek stosowanych w przypadku „kuleczek do selekcji negatywnej”, zgodnie z krokiem 3.2.1.</li>
		<li>Resuspenduj kuleczki w 1 mL 1% kazeiny w 1 × PBS, pH 7,4 i nasyć je, dodając wybrany biotynilowany ligand w ilości 5-krotnie przekraczającej pełną pojemność wiązania obliczoną na podstawie instrukcji. Inkubuj w RT na rotatorze przez 1 h.</li>
		<li>Przemyj kuleczki 5x buforem 0,05% PBST i 3x buforem 1 x PBS, łącznie osiem razy.</li>
		<li>Zablokuj kuleczki, dodając 1 mL 1% kazeiny/1% BSA w 1 x PBS (pH = 7,4) i inkubuj w RT na rotatorze przez 1 h, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu fagów z magnetycznymi kuleczkami pokrytymi streptawidyną.</li>
		<li>Przemyj magnetyczne kuleczki pokryte streptawidyną 3x buforem 0,05% PBST i jeden raz buforem 1 x PBS, łącznie cztery razy.</li>
		<li>Resuspenduj magnetyczne kuleczki pokryte streptawidyną, używając nie związanych fagów pobranych z kroku 3.2.5, i inkubuj w RT na rotatorze przez 1 h.</li>
		<li>Odbierz nadsącz, nie naruszając kuleczek magnetycznych. Zachowaj nie związane fagi jako materiał wejściowy (input) do wykorzystania w kroku 3.5.1.</li>
		<li>Przemyj kuleczki 10x buforem 0,05% PBST i 5x buforem 1 x PBS. Po każdych trzech przemyciach przenieś je do nowej probówki, aby uniknąć niespecyficznego wiązania fagów do ścianek probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elucja nanociał prezentowanych na fagach
	<ol>
		<li>Przeprowadź konkurencyjną elucję związanych fagów, dodając 450 µL liganda niebiotynilowanego w stężeniu z zakresu mikromolarnego (np. 10–50 µM) i inkubując w RT na rotatorze przez 30 min. Wybrane stężenie liganda do konkurencyjnej elucji związanych fagów zależy od pożądanej wartości KD „wiązacza kotwiczącego”. Stężenia liganda mogą być stosunkowo wysokie w początkowych rundach selekcji, a następnie zmniejszane w późniejszych rundach.</li>
		<li>Zbierz nadsącz i zachowaj eluowane fagi jako materiał wyjściowy (output) do wykorzystania w kroku 3.5.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tytrowanie wejścia/wyjścia i infekcja
	<ol>
		<li>Do tytrowania wejścia przygotuj 10-krotne rozcieńczenia szeregowe w 1 x PBS aż do rozcieńczenia 109-krotnego, używając fagów wejściowych z kroku 3.3.7. Wykorzystaj rozcieńczenia szeregowe 107–109 do przeprowadzenia infekcji, przenosząc 10 µL fagów wejściowych z każdego rozcieńczenia do 70 µL komórek TG1 (OD600 ~0,5). Inkubuj w 37 ˚C przez 45 min, wysiej zainfekowane komórki TG1 na trzy 90-mm szalki z agarem 2YT zawierającym 100 μg/mL ampicyliny i 2% (mas/obj) glukozy, a następnie inkubuj przez noc w 37 ˚C. Na podstawie szalek inkubowanych przez noc można obliczyć ilość fagów wejściowych według następującego wzoru: 
		<img alt="Równanie miana fagów, metoda biopanningu, układ eksperymentalny dla prezentacji fagowej, wzór na liczbę kolonii." src="/files/ftp_upload/60738/60738eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"></li>
		<li>W celu infekcji i tytrowania wyjścia, przenieś eluowane fagi z kroku 3.4.2 do 3 mL komórek TG1 (OD600 ~0,5). Inkubuj w kąpieli wodnej w 37 ˚C przez 45 min. Następnie przygotuj 10-krotne rozcieńczenia szeregowe w 2YT aż do 103-krotnego, wysiej każde rozcieńczenie na 90-mm szalki z agarem 2YT i inkubuj przez noc w 37 ˚C. Na podstawie szalek inkubowanych przez noc można obliczyć ilość fagów wyjściowych według następującego wzoru: 
		<img alt="Równanie miana fagów, metoda biopanningu, układ eksperymentalny dla prezentacji fagowej, wzór na liczbę kolonii." src="/files/ftp_upload/60738/60738eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"></li>
		<li>Pozostałe zainfekowane komórki TG1 rozdziel na trzy 150-mm szalki z agarem 2YT zawierające 100 μg/mL ampicyliny i 2% (mas/obj) glukozy. Inkubuj szalki przez noc w 37 ˚C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amplifikacja biblioteki i odzysk do kolejnych rund selekcji
	<ol>
		<li>Dodaj 3 mL pożywki 2YT na szalkę, zeskrob komórki sterylnym skrobakiem i zbierz wszystkie komórki do 50-mL probówki stożkowej. Wymieszaj zebrane komórki ze sterylnym glicerolem (końcowe stężenie 20% mas/obj). Zmierz OD600 mieszaniny i przygotuj 3–5 aliquotów zapasowych. Przechowuj w -80 ˚C do długotrwałego przechowywania.</li>
		<li>W celu odzyskania fagów, rozcieńcz bakteryjną mieszaninę TG1 zawierającą fagmid w 25 mL pożywki 2YT uzupełnionej o 2% glukozy i 100 μg/mL ampicyliny do OD600 ~0,1. Hoduj komórki w 37 ˚C i przy 250 rpm do uzyskania OD600 ~0,5.</li>
		<li>Przeprowadź superinfekcję komórek, dodając faga pomocniczego CM13 w stężeniu 5 x 109 pfu/mL i inkubuj w 37 ˚C i przy 250 rpm przez 45 min. Fag pomocniczy CM13 dostarcza niezbędnych białek kapsydu faga do montażu kompletnych cząsteczek fagowych.</li>
		<li>Wirowarkuj kulturę przy 8 000 x g przez 10 min, aby usunąć glukozę. Resuspenduj komórki w 50 mL pożywki 2YT uzupełnionej o 100 μg/mL ampicyliny i 50 μg/mL kanamycyny i inkubuj w 25 ˚C i przy 250 rpm przez noc.</li>
		<li>Wirowarkuj komórki z kultury nocnej przy 9 000 x g w 4 ˚C przez 30 min. Przenieś nadsącz do nowej probówki i wytrącaj fagi z nadsączu, używając 1/5 objętości roztworu PEG/NaCl (20% mas/obj glikolu polietylenowego-6000 i 2,5 M NaCl). Wymieszaj delikatnie i pozostaw na lodzie na 1 h.</li>
		<li>Zbierz cząsteczki fagowe poprzez wirowanie przy 12 000 x g w 4 ˚C przez 30 min. Resuspenduj osad w 1 mL 1 x PBS i przenieś zawiesinę do probówki do mikrowirowarki. Wirowarkuj probówkę przy 20 000 x g i w 4 ˚C przez 10 min, aby usunąć pozostałości bakterii.</li>
		<li>Przenieś nadsącz do nowej probówki do mikrowirowarki, nie naruszając osadu bakteryjnego. Użyj rozcieńczenia 1:100, aby zmierzyć absorbancję przy 269 nm i 320 nm. Całkowitą liczbę fagów można obliczyć za pomocą następującego wzoru23: 
		<img alt="Schemat wzoru na miano fagów, obliczanie liczby fagów na ml przy użyciu absorbancji i wielkości wektora." src="/files/ftp_upload/60738/60738eq3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3"></li>
		<li>Przechowuj bibliotekę fagową w 4 ˚C do krótkotrwałego użytku lub z 25% glicerolem w -80 ˚C do długotrwałego przechowywania.</li>
		<li>Powtarzaj rundy selekcji (kroki 3.1–3.6) przez 3–6 rund lub do momentu zaobserwowania pożądanego wzbogacenia (patrz sekcja Wyniki). Wysiej i wybierz pojedyncze klony (sekcja 4) w celu scharakteryzowania ich powinowactwa i specyficzności do liganda (sekcje 5–7).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Izolacja pojedynczych klonów
<ol>
	<li>Aby wyizolować pojedyncze klony z wzbogaconej subbiblioteki, przygotować 10-krotne rozcieńczenia szeregowe zainfekowanych fagami komórek TG1 (krok 3.5.2). Rozcieńczenia szeregowe wysiać na 90 mm szalki z agarem 2YT zawierającym 100 μg/mL ampicyliny i 2% (mas/obj) glukozy, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 37 ˚C.</li>
	<li>Z szalek inkubowanych przez noc wybrać pojedyncze kolonie do sterylnych płytek głębokodnnych zawierających w każdym dołku 250 μL pożywki 2YT uzupełnionej o 100 μg/mL ampicyliny i hodować przez noc w temperaturze 37 ˚C.</li>
	<li>Z kultur hodowanych przez noc zaszczepić 10 µL do 500 µL świeżej pożywki 2YT uzupełnionej o 100 μg/mL ampicyliny.</li>
	<li>Hodować komórki do osiągnięcia OD600 na poziomie ~0,5, dodać pomocnicze fagi CM13 w stężeniu 5 x 109 pfu/mL i inkubować w temperaturze 37 ˚C przy 250 rpm przez 45 min.</li>
	<li>Dodać 500 µL pożywki 2YT uzupełnionej o 100 μg/mL ampicyliny i 50 μg/mL kanamycyny. Inkubować przez noc w temperaturze 25 ˚C przy 250 rpm.</li>
	<li>Płytki głębokodnne z kulturami hodowanymi przez noc wirować z prędkością 3,000 x g przez 10 min. Zebrać nadsącz zawierający cząsteczki fagów, nie naruszając osadu komórkowego.</li>
	<li>Cząsteczki fagów można wykorzystać w teście ELISA w celu określenia swoistości wybranych klonów względem liganda. Jako kontrolę negatywną można zastosować biotynę lub homolog strukturalny celu.</li>
</ol>
5. Walidacja wiązania kotwicy metodą ELISA
<ol>
	<li>Płytki ELISA z 96 dołkami pokryć 100 μL streptawidyny o stężeniu 5 μg/mL w buforze do pokrywania (bufor węglanowy 100 mM, pH = 8.6) i inkubować przez noc w temperaturze 4 ˚C.</li>
	<li>Płytki ELISA przemyć 3x roztworem 0.05% PBST, a następnie do dołków z celem dodać 100 μL biotynilowanego celu o stężeniu 1 μM. Do dołków kontrolnych dodać 100 μL biotyny lub homologu celu o stężeniu 1 μM. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 h.</li>
	<li>Płytki przemyć 5x roztworem 0.05% PBST i zablokować nieswoiste wiązania, dodając 300 µL 1% kazeiny w 1 x PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 h.</li>
	<li>Płytki ELISA przemyć 3x roztworem 0.05%-PBST i dodać oczyszczony nadsącz fagowy. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Płytki ELISA przemyć 10x roztworem 0.05% PBST i dodać 100 μL przeciwciał przeciwko głównemu białku otoczki M13 znakowanych peroksydazą chrzanową (HRP) (rozcieńczenie 1:10 000 w 1 x PBS z 1% kazeiną). Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 h.</li>
	<li>Płytki ELISA przemyć 3x roztworem 0.05% PBST i dodać 100 μL substratu tetrametylobenzytydyny (TMB). Inkubować przez 10 min lub do momentu zaobserwowania widocznej zmiany barwy. Reakcję zatrzymać, dodając 100 μL 1 M HCl. Odczytać wynik z płytki przy 450 nm za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Do ekspresji i oczyszczania białka wybrać klony wykazujące wysokie powinowactwo i specyficzność względem celu (patrz sekcja Dyskusja).</li>
</ol>
6. Ekspresja, oczyszczanie i biotinylacja białka
<ol>
	<li>Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami19, przeprowadzić subklonowanie wybranych klonów z sekcji 5 i wyekspresować je jako nanociała z C-końcowymi znacznikami Avi i His.</li>
	<li>Wyekspresować wybrane nanociała w periplazmie komórek E. coli WK6 (zazwyczaj w 1 L hodowli), uwolnić je poprzez szok osmotyczny i oczyścić przy użyciu kolumny niklowo-NTA (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wymienić bufor za pomocą kolumny odsalającej (1 x PBS z 5% glicerolu; patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Biotynilować nanociała za pomocą komercyjnego zestawu (patrz Tabela materiałów) do dalszego wykorzystania.</li>
</ol>
7. Charakterystyka wiązania kotwicy metodą BLI
<ol>
	<li>Przeanalizować powinowactwo i kinetykę wiązania wybranych binderów kotwic poprzez unieruchomienie 200 nM biotinylowanych binderów kotwic na biosensorach z streptawidyną (patrz Tabela materiałów) w buforze do testów wiązania (1 x PBS (pH = 7.4), 0,05% Tween 20, 0,2% BSA, 3% metanolu).</li>
	<li>Obliczyć stałe dysocjacji (KD) dla oddziaływań binder kotwica-ligand za pomocą analizy stanu stacjonarnego przy użyciu oprogramowania do analizy danych (patrz Tabela materiałów). Uzyskane wartości KD zazwyczaj mieszczą się w zakresie od jedności do kilkunastu mikromoli.</li>
</ol>
8. Przesiewowe badanie wiązania dimerów
UWAGA: Przesiewanie metodą biopanningu w celu wyłonienia „wiązań dimeryzujących” jest podobne do przesiewania wiązań kotwiczących, z wyjątkiem dwóch kluczowych kroków: 1) Wiązania dimeryzujące są selekcjonowane przy użyciu wybranego biotynurowanego wiązania kotwiczącego oraz kompleksu wiązania kotwiczącego z ligandem, odpowiednio dla selekcji negatywnej i pozytywnej. 2) Podczas etapu elucji stosuje się 100 mM trietyloaminy w celu elucji fagów wyselekcjonowanych pozytywnie, które związały się wyłącznie z docelowym kompleksem wiązania kotwiczącego i ligandu. Roztwór 100 mM trietyloaminy (pH = 11.5) jest wykorzystywany do elucji klonów pozytywnych poprzez rozrywanie oddziaływań białkowych.
<ol>
	<li>Rozpoczęcie selekcji
	<ol>
		<li>Każdą rundę selekcji należy rozpocząć od zaszczepienia pojedynczej kolonii komórek TG1, świeżo wyhodowanej na pożywce minimalnej, w 6 mL 2YT w temperaturze 37 ˚C i przy 250 rpm do osiągnięcia OD600 ~0,5. Komórki należy inkubować w lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie nanociał selekcjonowanych negatywnie
	<ol>
		<li>Przygotować „probówkę do subtrakcji”, używając 400 µL magnetycznych kulek pokrytych streptawidyną, postępując zgodnie z krokiem 3.2. Jednak zamiast nasycania biotyną, należy dodać 5-krotność obliczonej pełnej pojemności wiążącej, używając wybranego biotynolowanego wiązacza kotwiczącego, a nieprzypisane fagi zachować do wykorzystania w kroku 8.3.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Selekcja nanociał selekcjonowanych pozytywnie
	<ol>
		<li>Przygotować „probówkę do wychwytywania”, używając 1/2 objętości magnetycznych kulek pokrytych streptawidyną wykorzystanych w „probówce do subtrakcji” i postępując zgodnie z krokami od 3.3.2 do 3.3.3. Jednak zamiast nasycania biotynolowanym ligandem, należy dodać pięciokrotność obliczonej pełnej pojemności wiążącej, używając wybranego biotynolowanego wiązacza kotwiczącego.</li>
		<li>Aby utworzyć kompleks wiązacz kotwiczący–ligand dla pozytywnej selekcji wiązacza dimeryzującego, należy dodać odpowiednio wysokie stężenie liganda niebiotynolowanego. Pozwoli to większości związanych ze streptawidyną wiązaczy kotwiczących utworzyć kompleks związany z ligandem.</li>
		<li>Postępować zgodnie z krokami od 3.3.3 do 3.3.8, używając nieprzypisanych fagów pobranych z „probówki do subtrakcji”.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elucja nanociał selekcjonowanych pozytywnie
	<ol>
		<li>Fagi związane z kompleksem wiązacz kotwiczący–ligand należy eluować poprzez dodanie 450 µL 100 mM trietyloaminy i inkubowanie w RT na rotatorze przez 10 min.</li>
		<li>Zebrać fagi eluowane konkurencyjnie i postępować zgodnie z krokami od 3.4.1 do 3.4.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolejne rundy selekcji wiązacza dimeryzującego
	<ol>
		<li>Postępować zgodnie z krokami 3.5 i 3.6, aby namnożyć i odzyskać bibliotekę w celu przeprowadzenia kolejnych rund selekcji. Powtarzać rundy selekcji przez 3–6 cykli lub do momentu zaobserwowania pożądanego wzbogacenia. Wysiać na płytki i wyselekcjonować pojedyncze klony (patrz sekcja 4), aby scharakteryzować ich powinowactwo i swoistość względem celu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. Charakterystyka wiązania dimerów metodą ELISA
<ol>
	<li>Należy postępować zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 4 w celu wyizolowania poszczególnych klonów do charakterystyki za pomocą testu ELISA.</li>
	<li>Aby przetestować powinowactwo kandydatów na białka wiążące dimeryzację do kompleksu białka wiążącego kotwicę z ligandem, należy pokryć płytkę docelową ELISA 100 μL 100 nM biotynilowanego białka wiążącego kotwicę. Po inkubacji przez 1 h należy dodać 1 μM liganda docelowego w celu utworzenia kompleksu białka wiążącego kotwicę z ligandem.</li>
	<li>Płytkę kontrolną należy pokryć samym biotynilowanym białkiem wiążącym kotwicę, aby wyeliminować klony, które mogą wiązać się również z wolnym białkiem wiążącym kotwicę. Należy dodać 100 μL 100 nM biotynilowanego białka wiążącego kotwicę i inkubować w RT przez 1 h.</li>
	<li>Należy postępować zgodnie z sekcjami 5.3–5.7.</li>
</ol>
10. Charakterystyka wiązania dimerów metodą BLI
<ol>
	<li>Powinowactwo wiązania i kinetykę dimeryzujących cząsteczek wiążących dla kompleksu kotwica wiążąca--ligand można analizować poprzez unieruchomienie biotynylowanych dimeryzujących cząsteczek wiążących na biosensorach z streptawidyną (SA) w buforze do analizy wiązania, a następnie przeprowadzenie testu z użyciem 1 μM kotwicy wiążącej uprzednio równoważonej z szeregiem rozcieńczeń liganda. Wartości KD, kon oraz koff oddziaływań można obliczyć, korzystając z naszej opisanej metody19.</li>
</ol>

<ol><li>Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+induced+proximity+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemically induced proximity in biology and medicine.</a> Science. 359 (6380), (2018).</li>
<li>Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), (2015).</li>
<li>Straathof, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+caspase+9+safety+switch+for+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy.</a> Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).</li>
<li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li>
<li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).</li>
<li>Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+monoclonal+antibodies+to+the+cardiac+glycoside%2C+digoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin.</a> Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).</li>
<li>Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+natural+antibodies%3A+the+power+of+in+vitro+display+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-affinity+ligand-binding+proteins+by+periplasmic+expression+with+cytometric+screening+%28PECS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS).</a> Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).</li>
<li>Tinberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+design+of+ligand-binding+proteins+with+high+affinity+and+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity.</a> Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).</li>
<li>Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+signal+transduction+with+synthetic+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Controlling signal transduction with synthetic ligands.</a> Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).</li>
<li>Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimeric+ligands+define+a+role+for+transcriptional+activation+domains+in+reinitiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation.</a> Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).</li>
<li>Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+protein+association+and+subcellular+localization+with+a+synthetic+ligand+that+induces+heterodimerization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).</li>
<li>Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li>
<li>Erhart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Development+of+Intracellular+Protein+Heterodimerizers%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers.</a> Chemistry & Biology. 20 (4), 549-557 (2013).</li>
<li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 17 (5), 5475(2014).</li>
<li>Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody-based+chemically+induced+dimerizers+for+cell+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications.</a> Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).</li>
<li>Foight, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-input+chemical+control+of+protein+dimerization+for+programming+graded+cellular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses.</a> Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).</li>
<li>Kang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COMBINES-CID%3A+An+efficient+method+for+de+novo+engineering+of+highly+specific+chemically+induced+protein+dimerization+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).</li>
<li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies%3A+natural+single-domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).</li>
<li>Fanning, S. W., Horn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-hapten+camelid+antibody+reveals+a+cryptic+binding+site+with+significant+energetic+contributions+from+a+nonhypervariable+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop.</a> Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).</li>
<li>Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+epitope+recognition+by+heavy-chain+camelid+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).</li>
<li>Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDenhardt%2C+DT+%22The+Single-Stranded+DNA+Phages%22">The Single-Stranded DNA Phages</a>. , 605-625 (1978).</li>
<li>Virnekas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+phosphoramidites%3A+ideal+reagents+for+the+synthesis+of+mixed+oligonucleotides+for+random+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.</a> Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).</li>
<li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+single-molecule+interaction+profiling+of+DNA-barcoded+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins.</a> Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).</li>
</ol>

Tymczasowy patent związany z tą pracą został złożony przez Uniwersytet Waszyngtoński.

Bardzo ważne jest, aby wybrać odpowiednie stężenia wejściowych bibliotek fagowych dla różnych rund biopanowania. Zazwyczaj zaczynaliśmy od biblioteki wejściowej składającej się z ~1012–1013 cząstek fagowych o różnorodności >109, co pozwalało na przedstawienie ~100–1,000 kopii każdego klonu faga w teście pull-down. Jeśli stężenie faga w teście wiązania jest zbyt wysokie lub niskie, prawdopodobieństwo niespecyficznego wiązania lub utraty dodatnich klonów wzrośnie. Wybór spoiwa kotwiczącego ...

Systemy CID, w których dwa białka dimeryzują tylko w obecności liganda o małych cząsteczkach (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), oferują wszechstronne narzędzia do analizowania i manipulowania szlakami metabolicznymi, sygnałowymi i innymi szlakami biologicznymi1. Wykazali oni potencjał biologicznej aktywacji, takiej jak aktywacja limfocytów T kontrolowana przez leki2 i apoptoza3,4, w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności adoptywnej terapii limfocytami T. Ponadto opracowano nową metodologię wykrywania celów małocząsteczkowych in vivo lub in vitro. Na przykład, białka CID mogą być genetycznie łączone z systemami reporterowymi fluorescencji (np. transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET)5 i cyrkularnie permutowane białka fluorescencyjne)6 do pomiarów in vivo w czasie rzeczywistym lub służyć jako odczynniki powinowactwa do testów podobnych do testów immunoenzymatycznych (ELISA).
Pomimo ich szerokich zastosowań, tworzenie nowych systemów CID, które mogą być kontrolowane przez dany ligand małocząsteczkowy, stanowi poważne wyzwanie. Uznane metody inżynierii wiązarek białkowych, w tym immunizacja zwierząt7, selekcja in vitro8,9 i obliczeniowe projektowanie białek10 mogą generować białka wiążące ligandy, które działają poprzez binarne interakcje białko-ligand. Jednak metody te mają trudności z utworzeniem indukowanego ligandem trójskładnikowego kompleksu CID. Niektóre metody tworzą CID poprzez chemiczne połączenie dwóch ligandów, które niezależnie wiążą się z tymi samymi lub różnymi białkami11,12,13,14,15,16 lub polegają na wyborze białek wiążących, takich jak przeciwciała skierowane przeciwko istniejącym wcześniej kompleksom białko-cząsteczka drobnocząsteczkowa17,18, a zatem mają ograniczony wybór ligandów.
Niedawno opracowaliśmy kombinacyjnąmetodę wyboru CID (COMBINES-CID) do inżynierii de novo systemów CID19. Metoda ta pozwala uzyskać wysoką swoistość dimeryzacji indukowanej ligandem (np. stała dysocjacji spoiwa zakotwiczenia-dimeryzacji, KD (bez liganda) / KD (z ligandem) > 1 000). Specyficzność dimeryzacji uzyskuje się przy użyciu spoiw kotwiczących z elastycznymi miejscami wiązania, które mogą wprowadzać zmiany konformacyjne po związaniu liganda, stanowiąc podstawę do wyboru spoiw konformacyjnie selektywnych, rozpoznając tylko wiązania kotwiczne związane z ligandem. Wykazaliśmy dowód słuszności zasady, tworząc indukowane kannabidiolem (CBD) heterodimery nanociał, funkcjonalny fragment przeciwciała o sile 12-15 kDa z wielbłądowatych, składający się z uniwersalnego rusztowania i trzech elastycznych pętli CDR (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)20, które mogą tworzyć kieszeń wiążącą o rozmiarach dostosowanych do epitopów małocząsteczkowych21,22. Warto zauważyć, że selekcja in vitro kombinatorycznej biblioteki białek powinna być opłacalna i możliwa do uogólnienia dla inżynierii CID, ponieważ ta sama wysokiej jakości biblioteka może być stosowana do różnych ligandów.
W tym protokole i filmie skupiamy się na opisie dwuetapowej selekcji in vitro i walidacji spoiw kotwiczących (Rysunek 3A) i dimeryzacyjnych (Rysunek 3B) poprzez przesiewanie kombinatorycznej biblioteki nanokomórek o różnorodności wyższej niż 109 przy użyciu CBD jako celu, ale protokół powinien mieć zastosowanie do innych bibliotek białek lub celów małocząsteczkowych. Badanie przesiewowe spoiw CID trwa zwykle 6–10 tygodni (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).

<table><tbody><tr><td>1-stopniowy roztwór substratu Ultra TMB ELISA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34029</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 (odcięcie 3 kDa)</td><td>Milipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Zestaw do oznaczania białek II</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>5000002</tr><tr><td>BirA Standardowy zestaw reakcyjny ligazy biotynowo-białkowej</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>Kazeina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CM13 pomocniczy</td><td>Przeciwciało Design Labs</td><td>PH020L</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Monohydrat glukozy</td><td>Alfa</td><td>Aesar A11090</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11205D</td><td></td></tr><tr><td>Magnes DynaMag-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>Szybka drabina DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3238S</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest BglI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0074</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 Kolumna odsalająca</td><td>GE Healthcare</td><td>17508701</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap-FF-1ml</td><td>GE Healthcare</td><td>11000458</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Alfa Aesar</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34060</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>M13 Przeciwciało białkowe Major</td><td>Coat Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spektrofotometry</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96-Well Polipropylen DeepWell Talerze do przechowywania</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>260251</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Octet RED96</td><td>ForteBio</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pADL-23c Phagemid Vector</td><td>Antibody Design Labs</td><td>PD0111</td><td></td></tr><tr><td>PEG-6000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81260-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Platynowa polimeraza</td> <td>DNA SuperFiZestaw do oczyszczania PCR Invitrogen</td><td>12351010</td><td></td></tr><tr><td>PureLink</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K310001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw QIAprep Spin M13</td><td>Qiagen</td><td>27704</td><td></td></tr><tr><td>Medium regeneracyjne</td><td>Lucigen</td><td>80026-1</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Plus 384</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Nie dotyczy Sacharozy</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Biosensory Super Streptawidyny (SSA)</td><td>ForteBio</td><td>18-5057</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 75 wzrost 10/300 GL Kolumna</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9909-44</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>TG1 Komórki elektrokompetentne</td><td>Lucigen</td><td>60502-1</td><td></td></tr><tr><td>Trietyloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471283-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP9726-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna odsalająca Zeba Spin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr></tbody></table>

tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Zdarzenia dimeryzacji białek, które występują tylko w obecności ligandu drobnocząsteczkowego, umożliwiają rozwój biosensorów małocząsteczkowych do analizy i manipulacji szlakami biologicznymi. Obecnie istnieje tylko ograniczona liczba systemów dimeryzacji indukowanej chemicznie (CID), a opracowanie nowych systemów o pożądanej czułości i selektywności dla określonych ligandów małocząsteczkowych pozostaje wyzwaniem w dziedzinie inżynierii białek. Opisujemy tutaj wysokoprzepustową metodę przesiewową, kombinatoryczny wybórCID (COMBINES-CID), do inżynierii de novo systemów CID mających zastosowanie do szerokiej gamy ligandów. Metoda ta wykorzystuje dwuetapową selekcję kombinatorycznej biblioteki nanoników wyświetlanej przez fagi w celu uzyskania 1) "spoiw kotwicznych", które najpierw wiążą się z interesującym ligandem, a następnie 2) "wiązań dimeryzacyjnych", które wiążą się tylko z kompleksami wiążącymi spoiwo-ligand. Aby wybrać wiązania kotwiczne, kombinatoryczna biblioteka ponad 109 randomizowanych nanociał w regionie determinującym komplementarność (CDR) jest przesiewana za pomocą biotynylowanego liganda, a trafienia są weryfikowane za pomocą nieznakowanego liganda za pomocą interferometrii warstwy biologicznej (BLI). Aby uzyskać spoiwa dimeryzacyjne, biblioteka nanoma jest przesiewana kompleksami wiążąco-ligandowymi jako celami do pozytywnego przesiewania i niezwiązanymi wiązaniami kotwicznymi do ujemnego przesiewu. COMBINES-CID ma szerokie zastosowanie do selekcji spoiw CID z innymi immunoglobulinami, nieimmunoglobulinami lub rusztowaniami zaprojektowanymi obliczeniowo w celu stworzenia bioczujników do wykrywania in vitro i in vivo leków, metabolitów, cząsteczek sygnałowych itp.

Opisujemy dwuetapową selekcję in vitro oraz walidację wiążących nanociał kotwiczących i dimeryzujących poprzez przesiewanie kombinatorycznej biblioteki nanociał o różnorodności przekraczającej 109 z wykorzystaniem CBD jako celu. Ważna jest ocena wzbogacenia podczas biopanningu fagowego w kolejnych rundach selekcji zarówno dla wiążących nanociał kotwiczących, jak i dimeryzujących. Typowe wyniki wzbogacenia po 4–6 rundach selekcji, przedstawione na Rysunku 5, stanowią dobrą wskazówk...

Tworzenie chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek o pożądanym powinowactwie i specyficzności dla dowolnego ligandu małych cząsteczek miałoby wiele zastosowań w biologicznym wykrywaniu i uruchamianiu. W tym miejscu opisujemy wydajną, uogólnioną metodę inżynierii de novo chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji poprzez krokowy wybór kombinatorycznej biblioteki przeciwciał jednodomenowych wyświetlanej przez fagi.

Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ zapewnia ogólne podejście do inżynierii systemów dimeryzacji białek jako bioczujników dla różnych małych cząsteczek. Ponadto wykorzystuje jedną bardzo zróżnicowaną bibliotekę białek do wyboru bioczujników dla różnych ligandów w wydajny i opłacalny sposób, bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu. Opracowany bioczujnik może być wykorzystywany do chemicznej kontroli zachowania komórek i monitorowania zmian metabolitów komórkowych w czasie rzeczywistym.Dzięki tej wizualnej demonstracji badacze mogą obserwować szczegółowe instrukcje dotyczące technik z wyraźnym oczekiwaniem na wynik eksperymentu. Rozpocznij każdą rundę selekcji od wyhodowania pojedynczej kolonii komórek zdolnych do elektroporacji TG1 w sześciu mililitrach pożywki 2YT w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 250 obrotach na minutę do absorbancji 600 nanometrów wynoszącej około 0,5. Po osiągnięciu optymalnej gęstości optycznej umieść komórki na lodzie.Aby przygotować kulki selekcji negatywnej, umyj 300 mikrolitrów kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną trzykrotnie jednym mililitrem buforu 05% PBS plus Tween i dwa razy jednym mililitrem PBS na pranie na stojaku do separacji magnetycznej. Ponownie zawiesić kulki jednym mililitrem 1% kazeiny w PBS i nasącz kulki biotyną przy pięciokrotności podanej zdolności wiązania kulek. Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej z rotacją umyj koraliki pięć razy za pomocą PBS plus Tween i trzy razy za pomocą PBS, jak pokazano.Po ostatnim przemyciu dodać około 10 razy do 13 cząstek fagów w 1% kazeinie i 1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS do kulek na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej z rotacją. Pod koniec inkubacji przenieść supernatant do 1,5-mililitrowej probówki. W przypadku selekcji pozytywnej za pomocą biotynylowanych kulek streptawidyny związanych z ligandem, należy nasycić połowę objętości kulek użytych do selekcji negatywnej w wybranym ligandzie biotynylowym przy pięciokrotności pełnej zdolności wiązania, jak obliczono zgodnie z instrukcją.Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej z rotacją, umyć kulki pięć razy PBS plus Tween i trzy razy samym PBS, jak pokazano, i zablokować kulki jednym mililitrem 1% kazeiny i 1% albuminy surowicy bydlęcej na jedną godzinę z rotacją. Pod koniec inkubacji przemyć kulki magnetyczne pokryte streptawidyną trzy razy w PBS plus Tween i jeden raz w samym PBS, jak pokazano, i użyć niezwiązanego faga do ponownego zawieszenia kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną. Ekstrahować niezwiązany supernatant zawierający fagi, nie naruszając kulek, i odłożyć próbkę na bok w celu wykorzystania jako dane wejściowe.Następnie umyj kulki 10 razy za pomocą PBS plus Tween i pięć razy za pomocą PBS, jak pokazano, przenosząc kulki do nowej probówki po każdych trzech płukaniach, aby uniknąć niespecyficznego wiązania związanych fagów ze ściankami probówki. Aby konkurencyjnie eluować związane fagi, dodaj 450 mikrolitrów mikromolowego stężenia niebiotynylowanego ligandu do kulek pozytywnej selekcji i umieść kulki na rotacji na 30 minut. Pod koniec inkubacji przenieść supernatant do nowej probówki, która ma być wykorzystana jako wyjście.Do miareczkowania wejściowego należy przygotować 10 seryjnych rozcieńczeń w PBS do 1 razy 10 do dziewięciokrotnie z wejściowym fagiem. Przenieść 10 mikrolitrów wejściowego faga z jednego razy 10 do siedmiu do 10 do dziewięciu rozcieńczeń do 70-mikrolitrowych podwielokrotności przygotowanych komórek TG1. Po 45 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza ułóż zakażone komórki TG1 na pojedynczych 90-milimetrowych szalkach agarowych 2YT zawierających 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny i 2% glukozy do całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego ranka użyj wzoru, aby obliczyć wejście faga. W celu uzyskania infekcji wyjściowej i miareczkowania dodaj eluowane fagi do trzech mililitrów komórek TG1 na 45-minutową inkubację w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj 10 seryjnych rozcieńczeń zakażonych komórek w świeżym pożywce 2YT do jednego razy 10 do trzeciego stężenia i umieść każde rozcieńczenie na 90-milimetrowych szalkach agarowych 2YT do ich nocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego ranka oblicz produkcję faga zgodnie ze wzorem. Aby wyizolować pojedyncze klony ze wzbogaconej podbiblioteki, przenieś pojedyncze kolonie z hodowanych przez noc, zakażonych fagami płytek komórkowych TG1 do 250 mikrolitrów pożywki 2YT uzupełnionej ampicyliną na studzienkę na basenie w sterylnych płytkach głębokich do ich hodowli przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki osiągną gęstość 600 nanometrów około 0,5, dodaj pięć razy 10 do dziewięciu jednostek tworzących płytki nazębne na mililitr faga pomocniczego CM13 do każdej studzienki i inkubuj komórki przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 250 obrotach na minutę.Pod koniec inkubacji dodać 500 mikrolitrów pożywki 2YT uzupełnionej ampicyliną i 50 mikrogramów na mililitr kanamycyny do każdej studzienki i umieścić płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza i 250 obrotów na minutę przez noc. Następnego ranka osadź komórki przez odwirowanie, aby umożliwić zebranie cząstek faga. Aby zweryfikować wiązanie kotwicy za pomocą testu ELISA, należy pokryć 96-dołkowe płytki ELISA 100 mikrolitrami po pięć mikrogramów na mililitr streptawidyny w buforze powlekającym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Następnego ranka umyj płytki trzy razy w 300 mikrolitrach PBS plus Tween przed dodaniem 100 mikrolitrów jednomikromolowej biotynylowanej tarczy do dołków docelowych i 100 mikrolitrów jednomikromolowej biotyny lub homologu docelowego do odpowiednich studzienek kontrolnych. Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej umyj płytki pięć razy PBS plus Tween na pranie i zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą 300 mikrolitrów 1% kazeiny na studzienkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyć płytki trzy razy w świeżym PBS plus Tween na jedno pranie i dodać oczyszczony supernatant fagowy.Po godzinie w temperaturze pokojowej umyj płytki 10 razy świeżym PBS plus Tween na jedno pranie. Dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała przeciwko białku głównego płaszcza peroksydazy chrzanowej M13 do każdego dołka na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Następnie umyj płytki trzy razy, jak pokazano, i dodaj 100 mikrolitrów substratu TMB do każdej studzienki na 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy zaobserwuje się widoczną zmianę koloru.Następnie zatrzymaj reakcję ze 100 mikrolitrami jednomolowego kwasu solnego na studzienkę i odczytaj płytkę przy 450 nanometrach na spektrofotometrze. Po walidacji spoiwa kotwicznego, należy również przeprowadzić badanie przesiewowe spoiwa dimeryzacyjnego przy użyciu tej samej biblioteki białek ukierunkowanej na kompleks wiążący i ligand. Typowe wyniki wzbogacania po czterech do sześciu rundach selekcji są dobrą wskazówką, że w podbibliotekach występuje wysoki współczynnik potencjalnych trafień, w którym to przypadku kolejne rundy selekcji mogą nie być konieczne.Test ELISA z pojedynczym klonem nadaje się do analizy względnego powinowactwa i selektywności wiązań spoiw kotwiczących i dimeryzacyjnych oraz ułatwia porównanie selektywności wiązania między klonami. Podobnie, wybór spoiwa dimeryzacyjnego pozwala na identyfikację klonów, które tworzą heterodimer z unieruchomionym spoiwem kotwicznym tylko z ligandem lub bez niego. Te dane dotyczące wiązania zależnego od stężenia ligandów sugerują, że badane nanociała nadają się do budowy chemicznie indukowanego systemu dimeryzacji w porównaniu ze słabym wiązaniem wykazanym przez próbki kontrolne.Ponadto można zastosować analityczną chromatografię wykluczania wielkości w celu potwierdzenia tworzenia heterodimerów między spoiwami kotwiczącymi i dimeryzacyjnymi w obecności liganda. Na przykład w tym eksperymencie zaobserwowano szczyt dimeryzacji po zmieszaniu spoiw kotwiczących i dimeryzacyjnych oraz kannabidiolu. W przeciwieństwie do tego, nie wykryto piku dimeryzacji przy braku kannabidiolu lub gdy każde spoiwo było załadowane do samej kolumny.System dimeryzacji białek powinien być genetycznie zakodowany w komórkach drożdży lub ssaków, aby umożliwić dalszą weryfikację wybranych biosensorów do opracowywania zastosowań in vivo. Oczekujemy, że ta metoda da innym badaczom skuteczne i niezbędne narzędzia do wykrywania ważnych metabolitów, cząsteczek sygnałowych lub leków in vivo z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.

creating-highly-specific-chemically-induced-protein-dimerization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy technikę wyświetlania fagów w celu wyizolowania wstępnie zaprojektowanych fagów wyrażających białka o wysokim powinowactwie do docelowego białka.

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do wyboru białek o wysokim powinowactwie do białka docelowego

Wyświetlanie fagów to potężna technika do wychwytywania białek lub ugrupowań białkowych, które oddziałują z unieruchomioną cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. Po podjęciu decyzji o rodzaju biblioteki cDNA fagów, którą należy utworzyć i przebadać, opisany tutaj protokół pozwala na skuteczną selekcję powinowactwa prowadzącą do identyfikacji interaktorów.

Protokół wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa przy użyciu rekombinowanych przynęt białkowych

Metoda jest opisana z wizualnym akompaniamentem do przeprowadzania skalowalnych, wysokoprzepustowych selekcji z kombinatorycznych bibliotek syntetycznych przeciwciał wyświetlanych przez fagi przeciwko setkom antygenów jednocześnie. Stosując to równoległe podejście, wyizolowaliśmy fragmenty przeciwciał, które wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla różnych antygenów, które są funkcjonalne w standardowych testach immunologicznych.

Skalowalny wybór przeciwciał syntetycznych o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi

Oferujemy metodę jednoczesnego badania biblioteki fragmentów przeciwciał pod kątem powinowactwa wiązania i rozpuszczalności cytoplazmatycznej za pomocą szlaku translokacji podwójnej argininy Escherichia coli, który ma nieodłączny mechanizm kontroli jakości dla wewnątrzkomórkowego fałdowania białek, w celu wyświetlenia fragmentów przeciwciała na wewnętrznej błonie.

Bakteryjny wyświetlacz błony wewnętrznej do badania przesiewowego biblioteki fragmentów przeciwciał

Opisane protokoły pozwalają na budowę, charakterystykę i selekcję (w stosunku do wybranego celu) biblioteki "domenomowej" wykonanej z dowolnego źródła DNA. Jest to możliwe dzięki procesowi badawczemu, który łączy różne technologie: wyświetlanie fagów, składany reporter i sekwencjonowanie nowej generacji z narzędziem internetowym do analizy danych.

Interactome-Seq: Protokół do budowania, walidacji i wyboru bibliotek domenomowych poprzez wyświetlanie fagów i sekwencjonowanie nowej generacji

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę budowy biblioteki syntetycznych przeciwciał wyświetlanych przez fagi z dostosowaną różnorodnością. Przeciwciała syntetyczne mają szerokie zastosowanie, od badań podstawowych po diagnostykę chorób i terapię.

Budowa biblioteki Fab Display z syntetycznymi fagami z dostosowaną różnorodnością

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Ubikwitynacja jest krytyczną modyfikacją potranslacyjną białka, której dysregulacja jest przyczyną wielu chorób ludzkich. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób można wykorzystać wyświetlanie fagów do izolowania nowych wariantów ubikwityny, które mogą wiązać i modulować aktywność ligazów E3, które kontrolują specyficzność, wydajność i wzorce ubikwitynacji.

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do opracowania modulatorów wariantów ubikwityny dla ligaz E3

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego dla danego miejsca wprowadzania sond chemicznych do fragmentu przeciwciała poprzez genetyczne włączenie aminokwasu zawierającego azydek, a następnie sprzężenie azydu z sondą chemiczną za pomocą promowanej przez szczep cykloaddycji azydkowo-alkinowej (SPAAC).

Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez cykloaddycję azydowo-alkinową promowaną przez szczep

Ten protokół opisuje metodę testowania zdolności białka do współosadzania z nitkowatą aktyną (F-aktyną) i, jeśli zaobserwowano wiązanie, do pomiaru powinowactwa interakcji.

Pomiar wiązania białek z F-aktyną przez kosedymentację

Poznaj metodę inżynierii systemów dimeryzacji białek jako biosensory dla małych cząsteczek. Wykorzystuje bibliotekę przeciwciał jednodomenowych z fagowym wyświetlaniem do selekcji bez specjalistycznego sprzętu.

Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych (Wideo) | JoVE Journal

Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych

Przeglądaj więcej filmów