Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych

Protokół ten jest istotny, ponieważ zapewnia ogólne podejście do inżynierii systemów dimeryzacji białek jako bioczujników dla różnych małych cząsteczek. Ponadto wykorzystuje jedną bardzo zróżnicowaną bibliotekę białek do wyboru bioczujników dla różnych ligandów w wydajny i opłacalny sposób, bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu. Opracowany bioczujnik może być wykorzystywany do chemicznej kontroli zachowania komórek i monitorowania zmian metabolitów komórkowych w czasie rzeczywistym.

Dzięki tej wizualnej demonstracji badacze mogą obserwować szczegółowe instrukcje dotyczące technik z wyraźnym oczekiwaniem na wynik eksperymentu. Rozpocznij każdą rundę selekcji od wyhodowania pojedynczej kolonii komórek zdolnych do elektroporacji TG1 w sześciu mililitrach pożywki 2YT w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 250 obrotach na minutę do absorbancji 600 nanometrów wynoszącej około 0,5. Po osiągnięciu optymalnej gęstości optycznej umieść komórki na lodzie.

Aby przygotować kulki selekcji negatywnej, umyj 300 mikrolitrów kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną trzykrotnie jednym mililitrem buforu 05% PBS plus Tween i dwa razy jednym mililitrem PBS na pranie na stojaku do separacji magnetycznej. Ponownie zawiesić kulki jednym mililitrem 1% kazeiny w PBS i nasącz kulki biotyną przy pięciokrotności podanej zdolności wiązania kulek. Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej z rotacją umyj koraliki pięć razy za pomocą PBS plus Tween i trzy razy za pomocą PBS, jak pokazano.

Po ostatnim przemyciu dodać około 10 razy do 13 cząstek fagów w 1% kazeinie i 1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS do kulek na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej z rotacją. Pod koniec inkubacji przenieść supernatant do 1,5-mililitrowej probówki. W przypadku selekcji pozytywnej za pomocą biotynylowanych kulek streptawidyny związanych z ligandem, należy nasycić połowę objętości kulek użytych do selekcji negatywnej w wybranym ligandzie biotynylowym przy pięciokrotności pełnej zdolności wiązania, jak obliczono zgodnie z instrukcją.

Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej z rotacją, umyć kulki pięć razy PBS plus Tween i trzy razy samym PBS, jak pokazano, i zablokować kulki jednym mililitrem 1% kazeiny i 1% albuminy surowicy bydlęcej na jedną godzinę z rotacją. Pod koniec inkubacji przemyć kulki magnetyczne pokryte streptawidyną trzy razy w PBS plus Tween i jeden raz w samym PBS, jak pokazano, i użyć niezwiązanego faga do ponownego zawieszenia kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną. Ekstrahować niezwiązany supernatant zawierający fagi, nie naruszając kulek, i odłożyć próbkę na bok w celu wykorzystania jako dane wejściowe.

Następnie umyj kulki 10 razy za pomocą PBS plus Tween i pięć razy za pomocą PBS, jak pokazano, przenosząc kulki do nowej probówki po każdych trzech płukaniach, aby uniknąć niespecyficznego wiązania związanych fagów ze ściankami probówki. Aby konkurencyjnie eluować związane fagi, dodaj 450 mikrolitrów mikromolowego stężenia niebiotynylowanego ligandu do kulek pozytywnej selekcji i umieść kulki na rotacji na 30 minut. Pod koniec inkubacji przenieść supernatant do nowej probówki, która ma być wykorzystana jako wyjście.

Do miareczkowania wejściowego należy przygotować 10 seryjnych rozcieńczeń w PBS do 1 razy 10 do dziewięciokrotnie z wejściowym fagiem. Przenieść 10 mikrolitrów wejściowego faga z jednego razy 10 do siedmiu do 10 do dziewięciu rozcieńczeń do 70-mikrolitrowych podwielokrotności przygotowanych komórek TG1. Po 45 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza ułóż zakażone komórki TG1 na pojedynczych 90-milimetrowych szalkach agarowych 2YT zawierających 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny i 2% glukozy do całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego ranka użyj wzoru, aby obliczyć wejście faga. W celu uzyskania infekcji wyjściowej i miareczkowania dodaj eluowane fagi do trzech mililitrów komórek TG1 na 45-minutową inkubację w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj 10 seryjnych rozcieńczeń zakażonych komórek w świeżym pożywce 2YT do jednego razy 10 do trzeciego stężenia i umieść każde rozcieńczenie na 90-milimetrowych szalkach agarowych 2YT do ich nocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego ranka oblicz produkcję faga zgodnie ze wzorem. Aby wyizolować pojedyncze klony ze wzbogaconej podbiblioteki, przenieś pojedyncze kolonie z hodowanych przez noc, zakażonych fagami płytek komórkowych TG1 do 250 mikrolitrów pożywki 2YT uzupełnionej ampicyliną na studzienkę na basenie w sterylnych płytkach głębokich do ich hodowli przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki osiągną gęstość 600 nanometrów około 0,5, dodaj pięć razy 10 do dziewięciu jednostek tworzących płytki nazębne na mililitr faga pomocniczego CM13 do każdej studzienki i inkubuj komórki przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 250 obrotach na minutę.

Pod koniec inkubacji dodać 500 mikrolitrów pożywki 2YT uzupełnionej ampicyliną i 50 mikrogramów na mililitr kanamycyny do każdej studzienki i umieścić płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza i 250 obrotów na minutę przez noc. Następnego ranka osadź komórki przez odwirowanie, aby umożliwić zebranie cząstek faga. Aby zweryfikować wiązanie kotwicy za pomocą testu ELISA, należy pokryć 96-dołkowe płytki ELISA 100 mikrolitrami po pięć mikrogramów na mililitr streptawidyny w buforze powlekającym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego ranka umyj płytki trzy razy w 300 mikrolitrach PBS plus Tween przed dodaniem 100 mikrolitrów jednomikromolowej biotynylowanej tarczy do dołków docelowych i 100 mikrolitrów jednomikromolowej biotyny lub homologu docelowego do odpowiednich studzienek kontrolnych. Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej umyj płytki pięć razy PBS plus Tween na pranie i zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą 300 mikrolitrów 1% kazeiny na studzienkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyć płytki trzy razy w świeżym PBS plus Tween na jedno pranie i dodać oczyszczony supernatant fagowy.

Po godzinie w temperaturze pokojowej umyj płytki 10 razy świeżym PBS plus Tween na jedno pranie. Dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała przeciwko białku głównego płaszcza peroksydazy chrzanowej M13 do każdego dołka na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Następnie umyj płytki trzy razy, jak pokazano, i dodaj 100 mikrolitrów substratu TMB do każdej studzienki na 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy zaobserwuje się widoczną zmianę koloru.

Następnie zatrzymaj reakcję ze 100 mikrolitrami jednomolowego kwasu solnego na studzienkę i odczytaj płytkę przy 450 nanometrach na spektrofotometrze. Po walidacji spoiwa kotwicznego, należy również przeprowadzić badanie przesiewowe spoiwa dimeryzacyjnego przy użyciu tej samej biblioteki białek ukierunkowanej na kompleks wiążący i ligand. Typowe wyniki wzbogacania po czterech do sześciu rundach selekcji są dobrą wskazówką, że w podbibliotekach występuje wysoki współczynnik potencjalnych trafień, w którym to przypadku kolejne rundy selekcji mogą nie być konieczne.

Test ELISA z pojedynczym klonem nadaje się do analizy względnego powinowactwa i selektywności wiązań spoiw kotwiczących i dimeryzacyjnych oraz ułatwia porównanie selektywności wiązania między klonami. Podobnie, wybór spoiwa dimeryzacyjnego pozwala na identyfikację klonów, które tworzą heterodimer z unieruchomionym spoiwem kotwicznym tylko z ligandem lub bez niego. Te dane dotyczące wiązania zależnego od stężenia ligandów sugerują, że badane nanociała nadają się do budowy chemicznie indukowanego systemu dimeryzacji w porównaniu ze słabym wiązaniem wykazanym przez próbki kontrolne.

Ponadto można zastosować analityczną chromatografię wykluczania wielkości w celu potwierdzenia tworzenia heterodimerów między spoiwami kotwiczącymi i dimeryzacyjnymi w obecności liganda. Na przykład w tym eksperymencie zaobserwowano szczyt dimeryzacji po zmieszaniu spoiw kotwiczących i dimeryzacyjnych oraz kannabidiolu. W przeciwieństwie do tego, nie wykryto piku dimeryzacji przy braku kannabidiolu lub gdy każde spoiwo było załadowane do samej kolumny.

System dimeryzacji białek powinien być genetycznie zakodowany w komórkach drożdży lub ssaków, aby umożliwić dalszą weryfikację wybranych biosensorów do opracowywania zastosowań in vivo. Oczekujemy, że ta metoda da innym badaczom skuteczne i niezbędne narzędzia do wykrywania ważnych metabolitów, cząsteczek sygnałowych lub leków in vivo z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.