Podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu opracowania ilościowych mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie nowych materiałów na bazie żelu duszy do wytwarzania mikromacierzy i wykorzystanie ich do testów enzymatycznych o nanoobjętości. Osiąga się to poprzez uprzednie zidentyfikowanie materiałów, które mają wystarczająco długi czas integracji, aby uniknąć żelowania kołka drukującego mikromatrycy podczas procesu drukowania. Drugim krokiem jest ocena materiałów o długim czasie znacji pod kątem ich zdolności do drukowania w postaci mikromacierzy, powtarzalności, odporności na pękanie, jakości adhezji, niepożądanej separacji faz i ostatecznie wysokiej aktywności uwięzionych enzymów.

Następnie badany enzym jest drukowany jako mikromacierz przy użyciu optymalnych materiałów i testowana jest jego zdolność do nadmiernego wykrywania roztworu testowego i generowania mierzalnej odpowiedzi enzymatycznej. Ostatnim krokiem jest ocena materiałów pod kątem ich zdolności do zapewnienia wysoce powtarzalnych testów przy użyciu enzymu będącego przedmiotem zainteresowania i wygenerowania danych ilościowych. Następnie wybierany jest ostateczny materiał do produkcji tablicy.

Ostatecznie mikromacierze białkowe pochodzące z żelu duszy są wykorzystywane do identyfikacji małych cząsteczek, które zmniejszają aktywność enzymów. Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przesiewanie na płytkach, jest to, że można przesiewać dużą liczbę materiałów w systematyczny sposób bardzo szybko przy użyciu małych ilości odczynników. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej technice, będą miały problemy, ponieważ możliwe jest posiadanie materiałów żelowych w szpilkach drukarskich.

Jeśli zostaną one następnie odpowiednio wyczyszczone, spowoduje to pominięcie miejsc, które mogą być interpretowane jako materiały nienadające się do druku. Na początek przygotuj liczne roztwory addytywne zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Wiele roztworów można przygotować i przechowywać przez okres do jednego miesiąca lub dłużej w odpowiednich warunkach, ale niektóre muszą być przygotowane w dniu eksperymentu.

Wymieszaj piły na bazie krzemianu sodu bezpośrednio przed użyciem i pamiętaj, aby trzymać je na lodzie. SOS należy zużyć w ciągu jednej godziny od dodania wody, ponieważ dłuższe okresy oczekiwania skutkują skróceniem i niespójnym czasem DATION. Następnie przygotuj różne kombinacje, polimerów Salansa i pasów narządów zgodnie z zaleceniami w dołączonym protokole tekstowym, aby określić, które kombinacje można wykorzystać jako materiał do druku o czasie dylatacji dłuższym niż 2,5 godziny.

Po zidentyfikowaniu kilku kombinacji ustaw wilgotność w komorze drukowania na 80 do 90% wilgotności poniżej 80%może spowodować parowanie próbki i niespójności w drukowaniu ze względu na małe objętości osadzania w drukarce. Teraz gotowy, ułóż wzory tablic do wydrukowania za pomocą programu Chip Writer Pro. Ustaw przesuw w kierunku XY na 10 milimetrów na sekundę, a prędkość zbliżania się próbki w kierunku Z na dwa milimetry na sekundę przy czasie ładowania próbki wynoszącym 2,5 sekundy, używając kombinacji żelu do piłowania określonych wcześniej.

Przygotuj 25 mikrolitrów materiałów bazowych, łącząc odpowiednie polimery, pasy organo i dodatki małocząsteczkowe zidentyfikowane w procesie wstępnego przesiewania. Za pomocą 50 milimolowych hałd o pH 8,0 do pojedynczych dołków 384-dołkowej płytki mikromiareczkowej. Następnie poddać sonikacji do czterech szczelinowych kołków osłonowych o średnicy 100 mikronów w wodzie podwójnie destylowanej.

Po 15 minutach wypróbuj je pod strumieniem azotu. Następnie użyj środka do czyszczenia rur, aby usunąć resztki wilgoci z uchwytu szpilki i ostrożnie umieść szpilkę w głowicy drukującej robota drukującego kołki kontaktowe. Brak usunięcia wilgoci resztkowej może utrudnić swobodne przesuwanie się kołka z uchwytem, powodując pominięcie miejsc.

Następnie dodaj 25 mikrolitrów odpowiedniego SA do dołka tuż przed drukowaniem. Wymieszać roztwór, wykonując ruch pipetowania w górę i w dół, Powtórzyć 50 razy podczas mieszania za pomocą pipety. Zminimalizuj ilość powietrza wprowadzanego do roztworu.

Pęcherzyki powietrza zapobiegają całkowitemu załadowaniu próbki do trzpienia. Następnie załaduj szpilkę, opuszczając ją do próbki. Po załadowaniu szpilek rozpocznij proces drukowania i wydrukuj próbkę na jednej powierzchni szkiełka.

Wstrzymaj proces drukowania przed dodaniem soli do kolejnej płyty źródłowej. Cóż, po wstrzymaniu procesu wyjmij kołek drukujący za pomocą magnesu i umieść środek do czyszczenia rur w głowicy drukującej, aby zapobiec gromadzeniu się wilgoci w głowicy drukującej. Następnie opłucz szpilkę drukarską podwójnie destylowaną wodą i poddaj ją sonikacji w czystej wodzie podwójnie destylowanej przez 30 sekund.

Następnie wysusz kołek drukujący pod strumieniem azotu, a następnie umieść kołek z powrotem w głowicy drukującej. Kontynuuj mieszanie, drukowanie i czyszczenie wszystkich próbek pozostających na płycie źródłowej do 12 000 plamek o średnicy 100 mikronów można osadzić na jednym szkiełku. Po zakończeniu drukowania należy postarzać matrycę przez co najmniej 30 minut i do 24 godzin w komorze drukującej w temperaturze od 80 do 90% wilgotności.

Przygotować 50 mikrolitrów kontroli pozytywnej tuż przed użyciem, łącząc 25 mikrolitrów jednego milimolowego jodku acetylocholiny i 0,14 mikrolitra pięciu milimolowych bodi pi, cysteiny FIL i 25 milimolowych trisów przy pH 7,0 z 4% glicerolem w studzience płytki do mikromiareczkowania 384 dołków, powoli pipetować roztwór w górę iw dół, aby wymieszać bez tworzenia pęcherzyków. Następnie przygotuj kontrole ujemne tuż przed użyciem, łącząc 0,14 mikrolitra pięciomilimolowej cysteiny boai PI FIL z 49,86 mikrolitrami 25-milimolowej trisy o pH 7,0 z 4% glicerolem do innego dołka 384-dołkowej płytki mikromiareczkowej i delikatnie wymieszaj je nad wydrukowaniem kontroli na postarzanych mikromacierzach, stosując te same procesy opisane w poprzedniej sekcji. Jednak zamiast kołków o średnicy 100 mikronów, wsadziłeś główne kołki o średnicy 235 mikronów.

Dzięki temu roztwory całkowicie pokrywają wcześniej osadzone miejsca. Plamy starzeją matryce w wilgotności od 80 do 90% przez godzinę w temperaturze pokojowej z powodu automatycznej hydrolizy acetylocholiny. Dłuższy czas inkubacji może skutkować fałszywie dodatnimi wynikami ze względu na zwiększoną aktywność enzymów.

Upewnij się, że imager alpha innotech novo array jest włączony i wyposażony w filtr emisyjny 478 plus minus 17 nanometrów i 538 plus minus 21 nanometrów do pomiaru mikromacierzy esterazy acetylocholiny. Następnie umieść szkiełko w uchwycie szkiełka miejscami skierowanymi do góry. Ustaw liczbę sekcji podglądu w taki sposób, aby co najmniej jedna z każdej strony szkiełka mikroskopu była podglądana z minimalną rozdzielczością czterech mikrometrów przy użyciu automatycznej ekspozycji.

Gdy parametry zostaną uznane za akceptowalne, pobierz obraz slajdu i zapisz go jako plik TIFF. Następnie otwórz uzyskany obraz slajdu na obrazie J 64. Kliknij narzędzie Zaznaczanie owalne i zaznacz każde miejsce.

Wybierz obszar nieco większy niż obserwowana plamka i upewnij się, że używasz spójnego rozmiaru między punktami, aby zmniejszyć subiektywność obrazu J. Następnie zmierz intensywność sygnału każdego punktu za pomocą opcji pomiaru. Na karcie analizy. Uśrednić intensywność z 25 podobnych punktów kontroli dodatniej i podzielić przez średnią intensywność 25 podobnych punktów kontroli ujemnej, aby uzyskać stosunek kontroli dodatniej do kontroli ujemnej dla poszczególnych składów materiałów.

Pokazano tutaj przykład zakresu dynamicznego otrzymanych mikromacierzy przygotowanych przy użyciu tych metod. Wysokie kontrole skutkowały jasnozielonymi obszarami, podczas gdy niskie kontrole skutkowały znacznie ciemniejszymi plamami. Intensywność mierzona na obrazie J 64 pokazuje, że wysokie kontrole wynoszą średnio około 22 000 względnych jednostek fluorescencyjnych, a niskie kontrole wynoszą średnio blisko 8 000.

Linie przerywane reprezentują trzy odchylenia standardowe od średniej. Oto przykładowe mikromacierze do badania przesiewowego macierzy honorowej syntetycznych analogów alkaloidów ameralnych sier zidentyfikowanych jako związek pierwszy i związek drugi. Obie osie reprezentują procentową zawartość enzymu określoną przez sygnał fluorescencyjny.

W duplikacie bliskość punktów do przekątnej oznacza wysoką odtwarzalność testu. Pokazano tutaj wykresy IC 50 dwóch różnych potencjalnych inhibitorów. Związek pierwszy powodował poziom IC 50 wynoszący 16 mikromolów, podczas gdy IC 50 związku drugiego wynosił 21 mikromolowych Reprezentatywne plamki są wyświetlane powyżej, aby zilustrować różnice w sygnale proporcjonalnym do stężeń inhibitora.

Pokazana tutaj tablica została wydrukowana z czterema różnymi kinazami, kinazą mapową P 38, EGFR i GSK, i została nadrukowana samym buforem zawierającym A TP i buforem zawierającym A TP i starro sporynę, inhibitor aktywności enzymu. Wyniki wskazują na znaczący wpływ inhibitora kinazy starro sporin w oparciu o wynikową intensywność fluorescencji, jak opisano tutaj. Największa różnica zaobserwowana przy stężeniu zastosowanej tu sporyny pochodziła z plamek P 38.

Pokazano tu reprezentatywne plamy mikromacierzy P 30 8:00 AM BP, które były przesiane różnymi stężeniami stor sporin. Jak wskazano, IC 50 tej cząsteczki określono jako jeden mikromol i jest pokazany na wykresie po prawej stronie Po opanowaniu. Tę technikę można wykonać w ciągu kilku godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, postępując zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak testy immunologiczne lub testy interakcji z białkami, mogą być również wykonane, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane z diagnostyką lub odkrywaniem małych cząsteczek.