Podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu opracowania ilościowych mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie nowych materiałów na bazie żeli sol-żel do produkcji mikroarrayów oraz wykorzystanie ich w nanobjetomowych analizach enzymatycznych. Osiąga się to najpierw poprzez zidentyfikowanie materiałów, które charakteryzują się wystarczająco długim czasem żelowania, aby uniknąć jego wystąpienia wewnątrz igły drukującej mikroarray w trakcie procesu drukowania. W drugim kroku ocenia się materiały o długim czasie żelowania pod kątem ich zdolności do powtarzalnego drukowania mikroarrayów, odporności na pękanie, jakości adhezji, występowania niepożądanej separacji faz oraz, w ostateczności, wysokiej aktywności uwięzionych enzymów.

Następnie naniesiony jest enzym będący przedmiotem zainteresowania w formie mikroarray z wykorzystaniem optymalnych materiałów, a następnie testowana jest jego zdolność do przyjmowania roztworu testowego oraz generowania mierzalnej odpowiedzi enzymatycznej. Ostatnim krokiem jest ocena materiałów pod kątem ich zdolności do zapewnienia wysokiej powtarzalności testów z wykorzystaniem badanego enzymu i generowania danych ilościowych. Na tej podstawie wybierany jest ostateczny materiał do wytwarzania matryc.

Ostatecznie mikromacierze białkowe otrzymywane z żelu sol-żel są wykorzystywane do identyfikacji małych cząsteczek ograniczających aktywność enzymów. Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przesiewanie na płytkach, jest możliwość bardzo szybkiego i systematycznego badania dużej liczby materiałów przy użyciu niewielkich objętości odczynników. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką mogą napotkać trudności ze względu na możliwość żelowania materiałów wewnątrz pinów drukujących.

Jeśli nie zostaną one odpowiednio oczyszczone, powstaną przeoczone miejsca, które mogą zostać zinterpretowane jako materiały niedrukowalne. Aby rozpocząć, należy przygotować liczne roztwory dodatków zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Wiele z roztworów można przygotować wcześniej i przechowywać do jednego miesiąca lub dłużej w odpowiednich warunkach, jednak niektóre muszą zostać sporządzone w dniu eksperymentu.

Wymieszaj piaski na bazie krzemianu sodu bezpośrednio przed użyciem i pamiętaj, aby przechowywać je w lodzie. SOS należy wykorzystać w ciągu godziny od dodania wody, ponieważ dłuższy czas oczekiwania prowadzi do skrócenia i niezgodności czasów DATION. Następnie przygotuj różne kombinacje buforów, polimerów salanowych i organolanów zgodnie z instrukcjami w towarzyszącym protokole tekstowym, aby zidentyfikować, które kombinacje mogą być stosowane jako materiał do druku z czasami dylatacji przekraczającymi 2,5 godziny.

Po zidentyfikowaniu odpowiedniej liczby kombinacji, ustaw wilgotność w komorze drukującej na 80 do 90%; wilgotność poniżej 80% może doprowadzić do odparowania próbki oraz niespójności w drukowaniu ze względu na małe objętości nanoszenia przez drukarkę. Po przygotowaniu ustaw wzory macierzy do wydruku w programie Chip Writer Pro. Ustaw prędkość przemieszczania się w kierunku XY na 10 milimetrów na sekundę, a prędkość podejścia do próbki w kierunku Z na dwa milimetry na sekundę, z czasem ładowania próbki wynoszącym 2,5 sekundy, wykorzystując wcześniej zidentyfikowane kombinacje żelu.

Przygotować 25 µL materiałów bazowych, łącząc odpowiednie polimery, organolany i dodatki małocząsteczkowe zidentyfikowane w procesie wstępnego przesiewu. Do poszczególnych studzienek płytki mikrotitracyjnej 384-dołkowej należy wprowadzić 50 mM HEPES o pH 8,0. Następnie poddać sonikacji do czterech szczelinowych pinów osłonowych o średnicy 100 µm w wodzie dwukrotnie destylowanej.

Po 15 minutach należy je osuszyć strumieniem azotu. Następnie za pomocą wyciora należy usunąć pozostałą wilgoć z wnętrza uchwytu pinu i ostrożnie umieścić pin w głowicy drukującej robota do drukowania pinów kontaktowych. Nieusunięcie pozostałej wilgoci może utrudnić swobodne poruszanie się pinu w uchwycie, co może prowadzić do powstania braków w nadruku.

Następnie, tuż przed drukowaniem, należy dodać do dołka 25 µL odpowiedniego SA. Wymieszać roztwór, wykonując ruchy pipetowania w górę i w dół, powtarzając tę czynność 50 razy w przypadku mieszania za pomocą pipety. Należy zminimalizować ilość powietrza wprowadzanego do roztworu.

Pęcherzyki powietrza uniemożliwiają całkowite pobranie próbki do pinu. Następnie należy pobrać próbkę, opuszczając pin do jej wnętrza. Po pobraniu próbek do pinów rozpoczyna się proces drukowania i nanosi próbkę na jedną z powierzchni szkiełka.

Zatrzymaj proces drukowania przed dodaniem soli do kolejnej płytki źródłowej. Następnie, przy wstrzymanym procesie, usuń pin drukujący za pomocą magnesu i umieść w głowicy drukującej czyścik do rurek, aby zapobiec gromadzeniu się wilgoci w głowicy. Następnie opłucz pin drukujący podwójnie destylowaną wodą i poddaj go sonikacji w czystej wodzie podwójnie destylowanej przez 30 sekund.

Następnie wysuszyć pin drukujący strumieniem azotu, a potem umieścić go z powrotem w głowicy drukującej. Kontynuować mieszanie, drukowanie i czyszczenie dla wszystkich pozostałych próbek na płytce źródłowej; na pojedynczym preparacie można nanieść do 12 000 punktów o średnicy 100 mikronów. Po zakończeniu drukowania inkubować macierz przez minimum 30 minut, maksymalnie do 24 godzin, w komorze drukującej przy wilgotności od 80 do 90%.

Przygotuj 50 µL kontroli pozytywnej bezpośrednio przed użyciem, łącząc 25 µL 1 mM jodku acetylcholiny, 0,14 µL 5 mM BODIPY-FL cysteiny oraz 25 mM TRIS o pH 7,0 z 4% glicerolem w dołku płytki mikrotytrurowej 384-dołkowej; pipetuj roztwór powoli w górę i w dół, aby wymieszać go bez tworzenia pęcherzyków powietrza. Następnie przygotuj kontrole negatywne bezpośrednio przed użyciem, łącząc 0,14 µL 5 mM BODIPY-FL cysteiny z 49,86 µL 25 mM TRIS o pH 7,0 z 4% glicerolem w innym dołku płytki mikrotytrurowej 384-dołkowej i delikatnie wymieszaj. Nanieś kontrole na przygotowane mikromacierze, stosując te same procedury opisane w poprzedniej sekcji. Jednak zamiast pinów o średnicy 100 µm, użyj pinów o średnicy 235 µm.

Zapewnia to całkowite pokrycie wcześniej naniesionych plamek przez roztwory. Plamki starzeją się na matrycach przy wilgotności 80-90% przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej ze względu na autohydrolizę acetylocholiny. Dłuższy czas inkubacji może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich z powodu zwiększonej aktywności enzymatycznej.

Upewnij się, że skaner tablic Alpha Innotech Novo Array Imager jest włączony i wyposażony w filtr wzbudzenia 478 ± 17 nm oraz filtr emisji 538 ± 21 nm do pomiaru mikromacierzy acetylocholinoesterazy. Następnie umieść preparat w uchwycie na slajdy, tak aby plamki były skierowane do góry. Ustaw liczbę sekcji podglądu w taki sposób, aby po każdej stronie slajdu mikroskopowego wyświetlano podgląd z minimalną rozdzielczością 4 µm przy użyciu automatycznej ekspozycji.

Po uznaniu parametrów za odpowiednie, należy pozyskać obraz preparatu i zapisać go w formacie TIFF. Następnie otwórz pozyskany obraz preparatu w programie ImageJ 64. Kliknij narzędzie Oval Selection Tool i zaznacz każdą plamkę.

Wybierz obszar nieco większy niż obserwowana plamka i upewnij się, że stosujesz jednolity rozmiar dla wszystkich plamek, aby ograniczyć subiektywność pomiarów w programie ImageJ. Następnie zmierz intensywność sygnału każdej plamki, korzystając z opcji Measure w zakładce Analyze. Oblicz średnią intensywność z 25 podobnych plamek kontroli pozytywnej i podziel ją przez średnią intensywność 25 podobnych plamek kontroli negatywnej, aby uzyskać stosunki kontroli pozytywnej do kontroli negatywnej dla poszczególnych składów materiałowych.

Przedstawiono tutaj przykład zakresu dynamicznego otrzymanych mikromacierzy przygotowanych przy użyciu tych metod. Kontrole wysokiej intensywności zaowocowały jasnozielonymi obszarami, natomiast kontrole niskiej intensywności dały znacznie słabsze sygnały w plamkach. Intensywność zmierzona za pomocą programu ImageJ 64 wykazuje, że kontrole wysokie osiągnęły średnio około 22 000 względnych jednostek fluorescencji, a kontrole niskie średnio blisko 8 000.

Linie przerywane reprezentują trzy odchylenia standardowe od średniej. Przedstawione są przykładowe mikromacierze dla przesiewu macierzy honor w celu analizy syntetycznych analogów alkaloidów ameral sier, zidentyfikowanych jako związek jeden i związek dwa. Obie osie reprezentują procent aktywności enzymu określony na podstawie sygnału fluorescencyjnego.

W układzie dubletowym bliskość punktów do przekątnej świadczy o wysokiej powtarzalności testu. Przedstawiono tutaj wykresy IC 50 dla dwóch różnych potencjalnych inhibitorów. Związek pierwszy wykazał wartość IC 50 na poziomie 16 micromolar, podczas gdy IC 50 związku drugiego wyniosło 21 micromolar. Powyżej wyświetlone są reprezentatywne plamki, aby zilustrować różnice w sygnale proporcjonalne do stężeń inhibitorów.

Przedstawiony tutaj macierz został wydrukowany z czterema różnymi kinazami: kinazą MAP p38, EGFR i GSK, a następnie nadrukowano na nim sam bufor, bufor zawierający ATP oraz bufor zawierający ATP i staurosporynę, która jest inhibitorem aktywności enzymatycznej. Wyniki wykazują istotny wpływ inhibitora kinazy staurosporyny na podstawie uzyskanych intensywności fluorescencji, zgodnie z opisem. Największa różnica przy zastosowanym tutaj stężeniu staurosporyny była widoczna w plamkach p38.

Poniżej przedstawiono reprezentatywne punkty macierzy mikroprzepływowej P 30 8:00 AM BP, na których naniesiono różne stężenia stor sporiny. Jak wskazano, IC 50 tej cząsteczki określono na 1 µM, co przedstawiono na wykresie po prawej stronie. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje zaledwie kilka godzin, pod warunkiem właściwego zastosowania opisanej procedury.

W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące diagnostyki lub odkrywania małych cząsteczek można zastosować inne metody, takie jak testy immunochemiczne lub analizy oddziaływań białkowych.