Name: Podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu opracowania ilościowych mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj systematyczne podejście do badań przesiewowych materiałów sol-żelowych do tworzenia mikromacierzy białkowych z enzymami. Ta metoda umożliwia szybkie przesiewowe badanie małych cząsteczek z wysoką powtarzalnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Marii Monton, Julie Lebert, Jessamyn Little, Xin Ge i Laurze Lautens za pomoc w rozwoju mikromacierzy białkowych. Autorzy dziękują również Kanadyjskiej Radzie ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC) za sfinansowanie tych prac. Autorzy dziękują również Canada Foundation for Innovation i Ontario Innovation Trust za wsparcie tych prac. J.D.B jest kierownikiem Kanadyjskiej Katedry Badawczej w dziedzinie chemii bioanalitycznej i biointerfejsów.

<ol><li>Schena, M. M., Shalon, D. D., Davis, R. W. R., Brown, P. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science (New York, N.Y.). 270 (5235), 467-470 (1995).</li>
<li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).</li>
<li>Zhu, H. H., Bilgin, M. M., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhu%2C+HH+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li>
<li>Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+discovery+of+polymers+resistant+to+bacterial+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment.</a> Nature Biotechnology. , (2012).</li>
<li>Monton, M. R. N., Lebert, J. M., Little, J. R. L., Nair, J. J., McNulty, J., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sol-Gel-Derived+Acetylcholinesterase+Microarray+for+Nanovolume+Small-Molecule+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Sol-Gel-Derived Acetylcholinesterase Microarray for Nanovolume Small-Molecule Screening.</a> Analytical Chemistry. 82 (22), 9365-9373 (2010).</li>
<li>Cho, E. J., Tao, Z., Tehan, E. C., Bright, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multianalyte+pin-printed+biosensor+arrays+based+on+protein-doped+xerogels%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multianalyte pin-printed biosensor arrays based on protein-doped xerogels.</a> Analytical Chemistry. 74 (24), 6177-6184 (2002).</li>
<li>Cho, E. J., Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+to+Rapidly+Produce+and+Screen+Biodegradable+Polymer+and+Sol-Gel-Derived+Xerogel+Formulations.+Applied+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Applied+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Tools to Rapidly Produce and Screen Biodegradable Polymer and Sol-Gel-Derived Xerogel Formulations. Applied Spectroscopy.</a> Society for Applied Spectroscopy. 56 (11), 1385-1389 (2002).</li>
<li>Ge, X., Lebert, J. M., Monton, M. R. N., Lautens, L. L., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+Screening+for+Sol-Gel-Derived+High-Density+Multi-Kinase+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Materials Screening for Sol-Gel-Derived High-Density Multi-Kinase Microarrays.</a> Chemistry of Materials. 23 (16), 3685-3691 (2011).</li>
<li>Rupcich, N., Green, J. R. A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanovolume+Kinase+Inhibition+Assay+Using+a+Sol-Gel-Derived+Multicomponent+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nanovolume Kinase Inhibition Assay Using a Sol-Gel-Derived Multicomponent Microarray.</a> Analytical Chemistry. 77 (24), 8013-8019 (2005).</li>
<li>Rupcich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+enzyme+reaction+microarrays+based+on+pin-printing+of+sol-gel+derived+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Coupled enzyme reaction microarrays based on pin-printing of sol-gel derived biomaterials.</a> Analytica Chimica Acta. 500 (1-2), 3-12 (2003).</li>
<li>MacBeath, G. G., Schreiber, S. L. S. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMacBeath%2C+GG+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 289 (5485), 1760-1763 (2000).</li>
<li>Stillman, B. A. B., Tonkinson, J. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAST+slides%3A+a+novel+surface+for+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">FAST slides: a novel surface for microarrays.</a> BioTechniques. 29 (3), 630-635 (2000).</li>
<li>Rupcich, N., Goldstein, A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+sol-gel+formulations+and+surface+treatments+for+the+development+of+pin-printed+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Optimization of sol-gel formulations and surface treatments for the development of pin-printed protein microarrays.</a> Chemistry of Materials. 15 (9), 1803-1811 (2003).</li>
<li>Gill, I., Ballesteros, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+biologicals+within+silicate%2C+siloxane%2C+and+hybrid+sol-gel+polymers%3A+An+efficient+and+generic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of biologicals within silicate, siloxane, and hybrid sol-gel polymers: An efficient and generic approach.</a> Journal of the American Chemical Society. 120 (34), 8587-8598 (1998).</li>
<li>Brook, M. A., Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+entrapped+in+silica+monoliths+prepared+from+glyceroxysilanes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sol-gel+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Proteins entrapped in silica monoliths prepared from glyceroxysilanes.</a> Journal of Sol-gel Science and Technology. 31 (1), 343-348 (2004).</li>
<li>Brook, M. A., Chen, Y., Guo, K., Zhang, Z., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-modified+silanes%3A+precursors+for+silica+monoliths%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sugar-modified silanes: precursors for silica monoliths.</a> Journal of Materials Chemistry. 14 (9), 1469(2004).</li>
<li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+of+protein+microarray+support+materials%3A+Evaluation+for+protein+and+antibody+microarray+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Next generation of protein microarray support materials: Evaluation for protein and antibody microarray applications.</a> Journal of Chromatography A. , 1-8 (2013).</li>
<li>Bhatia, R. B., Brinker, C. J., Gupta, A. K., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+Sol-Gel+Process+for+Protein+Encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation.</a> Chemistry of Materials. 12 (8), 2434-2441 (2000).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Opisana tutaj metodologia została wybrana jako najbardziej odpowiednia do identyfikacji materiałów pochodzących z zol-żelu nadających się do druku za pomocą drukarki kontaktowej, co pozwoliło na szybką i kosztową identyfikację optymalnych materiałów bez konieczności przesiewania dużej liczby materiałów. Z łącznej liczby ~20 000 potencjalnych materiałów udało się zidentyfikować ~200 materiałów, które nadawały się do druku na podstawie samego czasu żelowania. To znacznie ograniczyło ilość materiałów potrzebnych do przygotowania do kolejnych prób drukarskich. Te materiały do druku zostały następnie wydrukowane na 4 powierzchniach szkiełek, co daje łącznie 768 kombinacji materiał-szkiełko. Średnio można wydrukować 50 plamek/powtórzeń jednego materiału w ciągu ~3 minut, wliczając w to ładowanie próbki, osadzanie punktowe i czyszczenie pinów. Spośród nich 155 materiałów, czyli około 20%, pozwoliło na wydrukowanie maksymalnej liczby plamek na pobranie roztworu i uzyskało powtarzalne rozmiary plamek. Należy zauważyć, że spośród 4 badanych powierzchni szkiełka materiały drukowane są lepiej w kolejności: amina > żywica epoksydowa > aldehyd > PMMA; Szkiełka PMMA nie wytwarzały użytecznych matryc dla żadnych materiałów. Zostało to prawdopodobnie przypisane polarności powłoki powierzchniowej. Porównując wyżej wymienione powierzchnie szkiełkowe, bardziej polarne aminy i żywice epoksydowe lepiej nadawały się do zol wodnych w porównaniu ze szkiełkami z PMMA. Ponadto, spośród badanych powierzchni, szkiełka pokryte aminami zapewniają potencjalną dodatnio naładowaną powierzchnię do wiązania osadzonego zolu anionowego. Podejrzewamy, że nanocząstki krzemionki na granicy faz między szkiełkiem a zolem oddziałują wzdłuż powierzchni. Zarówno powierzchnie szkiełka epoksydowego, jak i aldehydowego nie mają tej samej początkowej interakcji opartej na ładunku. Aby zapewnić optymalne osadzanie punktowe, zdecydowanie zaleca się stosowanie wstępnie powlekanych szkiełek od dostawcy takiego jak Arrayit. Powlekanie we własnym zakresie powoduje powstawanie niespójnych powierzchni, co prowadzi do słabej odtwarzalności plamki13 , a w niektórych przypadkach może prowadzić do problemów z kwantyfikacją. 18 Równie ważne jest to, że temperatura i wilgotność mają wpływ na "drukowność" materiałów. Chociaż nie przeprowadzono szczegółowych badań nad wpływem temperatury, drukowanie zawsze odbywało się w temperaturze pokojowej (23±3 °C). Wilgotność (ponad 80%) była również kontrolowana w komorze druku, aby zapobiec osadzaniu się nieregularnych kształtów z powodu małych objętości osadzania (0,7-2,3 nl) i parowania.
Podczas gdy badanie przesiewowe materiału było ukierunkowane na identyfikację optymalnych materiałów pochodzących z zol-żel, przeznaczonych specjalnie do drukowania AChE i kinaz, zidentyfikowano niewielki zestaw materiałów, które sprawdzały się w przypadku obu typów białek. Rzeczywiście, oba materiały, które zostały zidentyfikowane do produkcji mikromacierzy kinaz, były oparte na SS + PVA + glicerolu, a oba materiały zostały również zidentyfikowane wśród 26 materiałów wybranych do mikromacierzy AChE. Te "optymalne" materiały mogą stanowić ogólny punkt wyjścia do opracowania dalszych mikromacierzy na bazie żelu domieszkowanego białkami, a małe ekrany skupione wokół tych kompozycji mogą zidentyfikować jeszcze lepsze materiały do produkcji mikromacierzy. Drugą kwestią, na którą należy zwrócić uwagę, jest znaczenie zastosowanego enzymu. W przypadku AChE (dość wytrzymałego enzymu) 26 (lub około 40%) z pierwotnych 66 materiałów zidentyfikowanych jako kompatybilne z testem zachowało aktywność uwięzionego AChE. Jednak w przypadku delikatniejszych kinaz tylko 2 z 69 kompozycji kompatybilnych z testami, czyli około 3% materiałów, były w stanie zachować aktywność wszystkich kinaz. Chociaż nie zbadano wystarczającej liczby różnych enzymów, aby sformułować rozstrzygające stwierdzenia, wydaje się, że optymalizacja wytwarzania macierzy za pomocą stosunkowo niestabilnych enzymów może prowadzić do identyfikacji materiałów, które mogą uwięzić szeroki zakres białek, aby umożliwić wytwarzanie mutliplexed microray.
Niezależnie od wybranego białka, głównym czynnikiem odcięcia dla identyfikacji materiałów do druku była potrzeba długiego czasu żelowania materiału (>2,5 godziny). Podczas opracowywania materiałów zol-żel na bazie SS bardzo ważne jest, aby upewnić się, że po wymianie jonowej i filtracji zol ma pH około 4. Sole o niższym początkowym pH mogą skutkować materiałami o pH niższym niż neutralne, co może wpływać na aktywność enzymów. 19 Dostosowanie ilości Dowex (żywicy jonowymiennej) do SS może zmienić końcowe pH zolu. Gdy przygotowuje się nową partię żywicy, stosunek żywicy do SS należy dostosować tak, aby uzyskać zol o pH około 4, zgodnie z procedurą opisaną w sekcji 2 protokołu.
Podobnie, przygotowanie krystalicznego DGS jest często źródłem błędów związanych z uszkodzeniem materiału przy użyciu zoli na bazie DGS do uwięzienia biomolekuł. Chociaż nie zostało to tutaj szczegółowo przedstawione, należy zachować szczególną ostrożność podczas syntezy krystalicznego DGS, w szczególności potrzebę unikania obecności wody podczas syntezy, która może wytwarzać poligliceryniany krzemiany, a nie monomeryczne DGS. Ponadto, ze względu na higroskopijny charakter DGS, krystaliczna próbka musi być przechowywana w stanie wysuszonym i zużyta w ciągu 6 miesięcy po syntezie. Krystaliczne DGS starsze niż 6 miesięcy mogą nie rozpuścić się całkowicie (ze względu na częściowo skondensowany materiał poliglicerolowo-krzemianowy) nawet przy sonikacji w środowisku kwaśnym. Niepełne rozpuszczenie DGS powoduje powstanie zoli o nieznanej i niekontrolowanej zawartości krzemionki, a tym samym mniej wytrzymałych materiałów.
Ważną kwestią, na którą należy zwrócić uwagę w przypadku drukowania kontaktowego, jest jakość szpilek. Uszkodzone lub niewłaściwie obsługiwane piny (ilustracja 9) nigdy nie stworzą powtarzalnych tablic niezależnie od drukowanego materiału. Zaleca się sprawdzenie jakości szpilek za pomocą mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że nie są używane złamane lub zatkane szpilki. Ostrożne obchodzenie się z kołkami zapewnia długą żywotność kołków. Ważny jest również swobodny ruch szpilki. W przypadkach, gdy wilgoć zostanie uwięziona w głowicy drukującej między głowicą a kołkiem, kołek nie zostanie prawidłowo osadzony, a tym samym nie będzie miał prawidłowego kontaktu z powierzchnią, co spowoduje brak osadzania się materiału.
Podsumowując, przedstawiliśmy szczegółowe, wieloetapowe podejście do badań przesiewowych w celu opracowania mikromacierzy o dużej gęstości z domieszką białek. Przesiewanie obejmuje optymalizację właściwości materiału (czas żelowania i drukowność), aby umożliwić drukowanie materiałów, a następnie bardziej ukierunkowane badanie przesiewowe w celu zidentyfikowania materiałów, które są kompatybilne z danym testem i są w stanie zachować aktywność enzymów. To podejście do przesiewania materiałów z przewodnikiem można zastosować do dodatkowych formatów mikromacierzy w celu skrócenia czasu i obniżenia kosztów związanych z produkcją wydajnych mikromacierzy o dużej gęstości.

Mikromacierze zyskały popularność w środowisku naukowym jako metoda zwiększania przepustowości testów. Od czasu opracowania technologii mikromacierzy do oceny ekspresji genów1 w połowie lat dziewięćdziesiątych XX wieku, mikromacierze znalazły zastosowanie w opracowywaniu wysokoprzepustowych testów do identyfikacji interakcji białko-białko i białko-małe cząsteczki, a także do znajdowania nowych materiałów o unikalnych właściwościach. 2-5 Niedawno opracowano mikromacierze, w których określone materiały są używane do unieruchamiania funkcjonalnych białek, wytwarzając trójwymiarowy element mikromacierzy, w którym białka są uwięzione, co pozwala na łatwy pomiar aktywności enzymatycznej i inhibicji samej mikromacierzy przy użyciu odpowiedniego testu fluorescencyjnego, który jest sprzężony z wymianą substratu. 5-10 Co ważne, takie mikromacierze mogą być zaprojektowane tak, aby zawierały wszystkie niezbędne komponenty do przesiewania próbek i kontroli razem w wysoce równoległy sposób. 5,8 pkt.
Wczesne przykłady mikromacierzy białkowych były zazwyczaj przygotowywane przy użyciu standardowych metod immobilizacji białek na stałych podłożach, takich jak kowalencyjne przyłączanie,11 przechwytywanie powinowactwa3 i adsorpcja fizyczna. 12 Chociaż te metody bioimmobilizacji pozwalają na zwiększenie stężenia próbki i przyspieszoną kinetykę reakcji wymaganą do miniaturyzacji testu, każda z nich ma wady. Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie powodują zmniejszenie natywnej funkcjonalności biomolekuły z powodu chemicznej modyfikacji powierzchni, utrudnionego dostępu do miejsc aktywnych lub niewłaściwej orientacji z powodu niespecyficznego unieruchomienia. W związku z tym wszystkie metody skutkują niższą czułością testu pomimo wzrostu osadzania się biomolekuł, odpowiedzi, która prawdopodobnie wynika z potrzeby sztucznego wiązania biomolekuł z powierzchnią.
Pojawiającym się podejściem do produkcji funkcjonalnych mikromacierzy biomolekuł jest drukowanie pinami domieszkowanych białkiem zoli krzemionkowych na stałych podłożach, które zazwyczaj są albo funkcjonalizowanymi szkiełkami podstawowymi, albo pojedynczymi dołkami płytek mikrodołkowych. Sam proces zol-żel odbywa się w środowisku wodnym w temperaturze pokojowej i to właśnie ciekły prekursor jest drukowany, a następnie żeluje w celu uwięzienia biomolekuł w matrycy 3D, co pozwala na wysokie obciążenie białkami13, a także uwięzienie wielu składników w tym samym elemencie mikromacierzy. 13,14 Dostosowanie materiału pochodzącego zol-żel można przeprowadzić poprzez staranny dobór różnych prekursorów krzemionki, jak również poprzez zmianę składnika wodnego poprzez zastosowanie różnych (pH, siła jonowa) i włączenie różnych dodatków (polimerów, małych cząsteczek) w celu uzyskania optymalnego materiału, którego specyficzny charakter zależy od uwięzionej biocząsteczki. 10
Potencjalnym ograniczeniem związanym z tworzeniem mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel za pomocą drukowania pinów jest potrzeba identyfikacji materiałów kompozytowych na bazie zol-żel, które mogą być drukowane bez żelowania w szpilce lub wykazywania niepożądanych właściwości (niepowtarzalne rozmiary plamek, pękanie, słaba adhezja, niekompatybilność ze składnikami testu, słaba aktywność białka) po wydrukowaniu na powierzchni. 5 Jednoczesna optymalizacja wszystkich tych parametrów wyklucza podejście, w którym materiały mogą być projektowane de novo lub badane powoli w sposób seryjny. Z drugiej strony, wyrywkowe przesiewanie wielu tysięcy lub dziesiątek tysięcy materiałów nie jest ani czasochłonne, ani opłacalne.
W tym artykule opisujemy podejście do ukierunkowanego badania, które pozwala na szybką identyfikację odpowiednich materiałów do produkcji mikromacierzy białkowych bez potrzeby losowego przesiewania dużej liczby materiałów. Stosując podejście kierowane, najpierw identyfikowane są materiały nadające się do drukowania mikromacierzy, a następnie przeprowadza się serię małych ekranów w celu zidentyfikowania optymalnych kombinacji materiałów pochodzących zol i żel, które można drukować w sposób powtarzalny, bez pęknięć i są kompatybilne z danym testem. Na koniec identyfikowane są optymalne materiały na podstawie zachowania aktywności enzymu i wydajności w końcowym teście przesiewowym małych cząsteczek. W ten sposób optymalne materiały można zidentyfikować spośród wielu tysięcy kandydatów przy użyciu zaledwie kilkuset kroków testu. Demonstrujemy to podejście do wytwarzania zarówno acetylocholinoesterazy o dużej gęstości, jak i mikromacierzy multikinazy oraz zastosowania takich mikromacierzy do badań przesiewowych małych cząsteczek.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><silny>Odczynnik/Materiał</mocny></td></tr><tr><td>Poli(alkohol winylowy) (PVA)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>360627</td><td>80% hydrolozyzowany, Mw 600</td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 600 (PEG)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>87333&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Polietyleniminę (PEI)</td> <td>Sigma-Alderich</td><td>482595</td><td>50% wag. roztwór w wodzie</td></tr><tr><td>Karboksyetylosilanetriol (Si-COOH)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIC2263,0</td><td>25% w wodzie</td></tr><tr><td>N-(3-trietoksysililopropylo)glukonamid (GLS)</td> <td>Gelest, Inc.</td><td>SIT8189,0</td><td>50% w etanolu</td></tr><tr><td>tlenek bis[(3-metylodimetoksysililo)propylo]polipropylenu (MDSPPO)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1660.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Metylotrimetoksysilan (MTMS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIM6560.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bis(trietoksysylili)etan (Bis-TEOS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1817.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3-aminopropylotrietoksysilan (APTES)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIA0610.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Alderich</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Alderich</td><td>240850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-(+)-trehaloza dwuwodna</td><td>Sigma-Alderich</td><td>T9531</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Alderich</td><td>X-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N&epsilon; -Acetylo-L-lizyna</td><td>Sigma-Alderich</td><td>A4021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>Sigma-Alderich</td><td>154563</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Alderich</td><td>H3375</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, 1,0 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC24350-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas solny, 1,0 N/0,1 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC15300-2/LC152220-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Alderich</td><td>M8266</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Diglicerolsilan (DGS)</td><td></td><td></td><td>Przygotowany w laboratorium</td></tr><tr><td>Roztwór krzemianu sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS338-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Żywica jonowa Dowex 50WX8-100</td><td>Sigma-Alderich</td><td>217492</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Jodek acetylotiocholiny</td><td>Sigma-Alderich</td><td>1480</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetylocholinoesterazy z Electrophorus electricus (węgorz elektryczny)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>C2888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BODIPY FL L-Cystyna</td><td>Invitrogen</td><td>B-20340</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pro-Q Zestaw barwników do mikromacierzy z fosfoproteiną diamentową/fosfopeptydem</td><td>Invitrogen</td><td>P33706</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór soli disodowej adenozyno-5'trifosforanu (ATP)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>A6559</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kinaza MAP 2 (MAPK2)</td><td>EMD Milipor</td><td>454850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p38&alpha;/SAPK2a (T106M), aktywny</td><td>EMD Millipore</td><td>14-687M</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu (EGFR)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Dawany przez Millipore</td></tr><tr><td>Kinaza syntazy glikogenu 3 i beta; (GSK-3&beta;)</td><td>EMD Milipory</td><td>14-306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Podstawowe białko mielinowe (MBP)</td><td>EMD Milipore</td><td></td><td>Substrat dla MAPK2 i p38&alpha;, Przekazane przez Millipore</td></tr><tr><td>GSM</td><td>EMD Millipore</td><td>12-533</td><td>Substrat dla GSK-3&beta;</td></tr><tr><td>Polipeptyd poli-glu-tyr p(E4Y)</td><td>EMD Milipor</td><td>12-440</td><td>Podłoże do EGFR</td></tr><tr><td>Stealth</td><td>pin ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pin ukryty</td><td>ArrayIt</td><td>SMP7</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Prowadnice z powłoką aminową</td><td>ArrayIt</td><td>SMM2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Prowadnice powlekane aldehydem</td><td>ArrayIt</td><td>SMA2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Szkiełka z powłoką Exposy</td><td>ArrayIt</td><td>SME2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Prowadnice powlekane poli(metakrylanem metylu) (PMMA) Exakt</td><td>Technologies Inc.</td><td>41500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0,2-&mu; m filtr strzykawkowy</td><td>PALL Nauki Przyrodnicze</td><td>4612</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Virtek Drukarka kontaktowa</td><td>BioRad</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Imager do slajdów fluorescencyjnych Novaray</td><td>Alpha Innotech Corporation</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka do mikromatryc biurkowych</td><td>ArrayIt</td><td>MHC110V</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MilliQ Synthesis A10</td><td>Millipore</td><td></td><td>Służy do filtrowania całej wody potrzebnej do eksperymentów</td></tr></tbody></table>

podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu opracowania ilościowych mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

Mikromacierze znalazły zastosowanie w rozwoju wysokoprzepustowych testów dla nowych materiałów i odkrywaniu małocząsteczkowych leków prowadzących. W niniejszym artykule opisano podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu identyfikacji materiałów na bazie zol-żel, które są odpowiednie do produkcji trójwymiarowych mikromacierzy białkowych. Podejście to najpierw identyfikuje materiały, które można wydrukować jako mikromacierze, zawęża liczbę materiałów, identyfikując te, które są kompatybilne z danym testem enzymatycznym, a następnie koncentruje się na optymalnych materiałach w oparciu o zachowanie maksymalnej aktywności enzymatycznej. Podejście to stosuje się do opracowania mikromacierzy odpowiednich do dwóch różnych testów enzymatycznych, jednego przy użyciu acetylocholinoesterazy, a drugiego przy użyciu zestawu czterech kluczowych kinaz zaangażowanych w raka. W każdym przypadku udało się wyprodukować mikromacierze, które można było wykorzystać do ilościowych testów przesiewowych małych cząsteczek i produkcji zależnych od dawki krzywych odpowiedzi inhibitora. Co ważne, możliwość badania przesiewowego wielu materiałów dostarczyła informacji na temat rodzajów materiałów, które najlepiej nadają się zarówno do produkcji mikromacierzy, jak i do utrzymania aktywności enzymów. Dane materiałowe zapewniają wgląd w podstawowe wymagania materiałowe niezbędne do dostosowania optymalnych mikromacierzy pochodzących z zol-żelu o dużej gęstości.

Dzięki przeprowadzeniu ukierunkowanej analizy czynników podczas przesiewu materiałów udało nam się zminimalizować liczbę testowanych materiałów z ~20 000 do kilkuset, które charakteryzowały się czasami żelowania odpowiednimi do drukowania. Poprzez zastosowanie rygorystycznego wytycznego wymagającej czasu żelowania materiału wynoszącego 2,5 hr lub więcej, materiały mogące zapchać piny drukujące lub spowodować powstanie nieodtwarzalnych matryc nie były drukowane. Materiały nadające się do druku, które zidentyfikowano jako posiadające wystarczające (&gt;2,5 hr) czasy żelowania, zostały naniesione na 4 różne funkcjonalizowane powierzchnie szkiełek przedmiotowych. Aby materiał został uznany za „nadający się do druku”, należało wydrukować maksymalną liczbę plamek na objętość pobrania pinu (SMP3 = 200). Oceniano również morfologię plamek za pomocą prostej mikroskopii w jasnym polu, jak pokazano na Rysunku 2, aby upewnić się, że nie wystąpiły pęknięcia ani niepożądana separacja faz.
Na tym etapie zidentyfikowanych materiałów nadających się do druku przygotowano macierze z AChE i kinazami wbudowanymi w buforowy składnik wodny. Materiały kompatybilne z procedurą analizy (w tym z potencjalnym nadrukiem oraz etapami przemywania lub barwienia) zidentyfikowano poprzez obserwację trwałości plamek macierzy (brak pęknięć, ubytków plamek lub nietypowych wzorów fluorescencji) oraz stosunku kontroli pozytywnej (PC) do kontroli negatywnej (NC) większego niż 1, ocenianego na podstawie obrazów. Ponieważ kryteria te spełniło około 50% materiałów, do zdefiniowania materiałów optymalnych z zachowaną aktywnością białek zastosowano wyższy stosunek PC/NC wynoszący 3. Metodą tą wyłoniono 26 materiałów pochodzenia sol-gel zawierających AChE oraz 2 materiały zawierające kinazy, które spełniły kryterium PC/NC &gt;3. Rysunek 3 oraz Rysunek 4 przedstawiają graficzny schemat 5 etapów ukierunkowanego przesiewu materiałów w celu identyfikacji optymalnych macierzy AChE odpowiednio dla AChE i kinaz.
Testy można było również zwalidować poprzez wyznaczenie współczynnika Z'.17 Zostało to wykonane przy użyciu materiału, który dał najwyższy stosunek PC/NC. Rycina 5 przedstawia wykres Z' otrzymany poprzez porównanie sygnału generowanego z 200 punktów, 100 PC i 100 NC, po naniesieniu barwnika wskaźnikowego i substratu na matrycę AChE. Matryce AChE i kinazy dały odpowiednio współczynniki Z' na poziomie 0,60 i 0,67, co świadczy o doskonałej jakości testu. Należy jednak zauważyć, że przed walidacją testu konieczna była optymalizacja stężeń enzymu, barwnika, substratu i kofaktora na matrycy poprzez naniesienie zakresu stężeń każdego z komponentów i wybranie stężenia dającego najwyższy sygnał, co zostało szczegółowo opisane w innym opracowaniu.5
Aby zwalidować testy, uzyskano ilościowe dane dotyczące inhibicji przy użyciu znanych i nieznanych inhibitorów AChE; pomiary wykonano w dubletach, które posłużyły do sporządzenia podwójnych wykresów (Rycina 6A) oraz krzywych inhibicji (Ryciny 6B i 6C). Na plamki naniesiono najpierw mieszaniny znanych, biologicznie czynnych inhibitorów małocząsteczkowych, a następnie barwnik i substrat, uwzględniając mieszaniny kontrolne zawierające znane inhibitory lub brak inhibitora. Wygenerowano podwójne wykresy w celu oceny aktywności enzymu; wszystkie mieszaniny, w których aktywność enzymu spadła poniżej 25%, uznano za pozytywne pod kątem inhibicji. Następnie poszczególne związki z takich mieszanin przetestowano w dubletach, aby zidentyfikować konkretne małe cząsteczki odpowiedzialne za inhibicję. Po ich zidentyfikowaniu małe cząsteczki te wykorzystano do wygenerowania ilościowych krzywych inhibicji w celu wyznaczenia wartości IC50 oraz stałych inhibicji.
Podobne wyniki jakościowe uzyskano, stosując macierz multikinazową z powszechnie znanym inhibitorem kinaz, staurosporyną. Rycina 7A oraz 7B przedstawiają obraz mikromacierzy i wskazują, że intensywności sygnału po naniesieniu próbek i barwieniu macierzy multikinazowej są zgodne z oczekiwaniami dla kontroli negatywnej (- ATP), kontroli pozytywnej (+ ATP) oraz znanego inhibitora (+ ATP + inh). Aby zademonstrować możliwość uzyskania ilościowych danych o inhibicji z mikromacierzy, przeprowadzono test inhibicji zależnej od stężenia dla pojedynczej kinazy. Jak pokazano na Ryciniach 8A i 8B, intensywność sygnału maleje wraz ze wzrostem stężenia inhibitora, a odpowiedź podąża za oczekiwaną krzywą inhibicji zależnej od stężenia dla układu kinaza/substrat p38α/MBP.
<img alt="Schemat reakcji prekursor-krzemionka z wariantami polimeru, organosilanu i dodatków do syntezy." src="/files/ftp_upload/50689/50689fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Ogólny schemat ukierunkowanego podejścia do przesiewania materiałów. Każdy blok reprezentuje krok przesiewania w kolejności sekwencyjnej. Liczby po lewej stronie oznaczają całkowitą liczbę materiałów przygotowanych do analizy. Przy założeniu czasu żelowania przekraczającego 2,5 hr (materiały z czasem żelowania krótszym niż 2,5 hr są przekreślone), liczba materiałów, które przeszły każdy etap i zostały przekazane do dalszego przesiewania, jest wskazana liczbą po prawej stronie. *Oznacza materiały z nieoptymalnym rozdzieleniem faz.
<img alt="Wyniki nanoszenia plamek na mikromacierzy; wariacje chemiczne; efekty epoksydowe, aminowe i aldehydowe; mikroskopia." src="/files/ftp_upload/50689/50689fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Obrazy optyczne przedstawiające różne tryby uszkodzeń materiałów na etapie sprawdzania drukowalności sita. Dla porównania przedstawiono również obraz materiału „dobrego” (drugi wiersz, trzecia kolumna). Przedrukowano za zgodą źródła 8, copyright 2013 American Chemical Society.
<img alt="Schemat optymalizacji materiałów dla aktywności enzymatycznej: czas żelowania, drukowalność, etapy integralności plamek." src="/files/ftp_upload/50689/50689fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Podejście do ukierunkowanego przesiewania materiałów w celu identyfikacji optymalnych materiałów do wytwarzania mikrotablic AChE pochodnych z sol-gelu. Przedrukowano za zgodą z odniesienia 5, copyright 2013 American Chemical Society.
<img alt="Schemat wyboru materiałów z danymi dotyczącymi żelowania, drukowalności, barwienia i aktywności kinazy." src="/files/ftp_upload/50689/50689fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Ukierunkowane podejście do przesiewania materiałów w celu identyfikacji optymalnych materiałów do wytwarzania mikromacierzy kinaz pochodnych sol-gel. Przedrukowano za zgodą z referencji 8, copyright 2013 American Chemical Society.
<img alt="Analiza danych z mikromacierzy; wysoka/niska fluorescencja kontrolna; schemat z siatką i wykresem RFU do analizy." src="/files/ftp_upload/50689/50689fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. (A) Fragment mikromacierzy AChE przedstawiający plamki HC (jasnozielone) i LC (bladozielone) (zastosowano paletę czarno-zieloną jako pseudokolor w celu przejrzystości prezentacji); (B) powiększony widok obszaru w ramce w celu uwidocznienia morfologii i wyrównania plamek; oraz (C) wykres Z'. Linie ciągłe oznaczają średnią z powtórzeń, natomiast linie przerywane odpowiadają 3SD. Przedruk za zgodą z referencji 5, copyright 2013 American Chemical Society.
<img alt="Analiza korelacji aktywności z wartościami IC₅₀; diagram, wykres punktowy, wyniki testu fluorescencyjnego." src="/files/ftp_upload/50689/50689fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. (A) Wykres duplikatów dla przesiewania na macierzy syntetycznych analogów alkaloidów Amaryllidaceae; (B) wykresy IC50 zidentyfikowanych potencjalnych inhibitorów oznaczonych jako związek 1 oraz (C) związek 2, z słupkami błędów reprezentującymi jedno odchylenie standardowe średniej z 25 powtórzeń. Reprezentatywne plamki pokazano w celu zilustrowania różnic w sygnale proporcjonalnych do stężeń inhibitora. Przedruk za zgodą z odniesienia 5, copyright 2013 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50689/50689fig6large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię</a>.
<img alt="Schemat testu aktywności kinazy białkowej, wyniki intensywności fluorescencji z ATP i inhibicją staurosporyną." src="/files/ftp_upload/50689/50689fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Test na macierzy czterech kinaz z wykorzystaniem 1.4SS/1.0PVA do unieruchomienia, nadrukowany na slajdzie pochodnej aminy. (A) Obraz fragmentu macierzy, w której plamki z kinazami współunieruchomionymi z ich odpowiednimi substratami zostały nadrukowane buforem (NC, górny rząd), roztworami zawierającymi ATP (PC, środkowy rząd) lub ATP + staurosporynę (dolny rząd). (B) Wykresy słupkowe porównujące intensywności sygnałów między reakcjami inhibowanymi a nieinhibowanymi, po odjęciu sygnałów tła; słupki błędów reprezentują jedno odchylenie standardowe średniej z 25 powtórzeń. Przedrukowano za zgodą z referencji 8, copyright 2013 American Chemical Society.
<img alt="Analiza staurosporyny: wzór fluorescencji mikromacierzy i krzywa zależność dawka-odpowiedź wykazująca IC50=1μM." src="/files/ftp_upload/50689/50689fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Analiza inhibicji na mikromacierzy p38a/MBP. (A) Fragmenty mikromacierzy pokazujące reprezentatywne plamki naniesione z różnymi stężeniami staurosporyny, zgodnie z oznaczeniami (obrazy uzyskano podczas pojedynczego skanowania tej samej płytki; dla przejrzystości przedstawiono obraz kompozytowy). (B) Krzywa IC50 wygenerowana na podstawie analizy obrazów macierzy. Intensywność uzyskaną przy 100 mM odjęto od wszystkich obrazów; pozostałe intensywności znormalizowano, przyjmując intensywność uzyskaną przy 10 nM za wartość 100% aktywności. Przedrukowano za zgodą z odniesienia 8, copyright 2013 American Chemical Society.
<img alt="Porównanie końcówek mikropipety pod mikroskopem; analiza mikroskopowa w badaniu precyzji." src="/files/ftp_upload/50689/50689fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9. Obrazy mikroskopowej igły stealth używanej do drukowania kontaktowego, wykazujące różne niedoskonałości: (A) zapchana, (B) wygięta.

Opisano podejście do badań przesiewowych materiałów w celu opracowania mikromacierzy domieszkowanych białkiem pochodzącym zol-żel przy użyciu nowej metody produkcji druku pinów. Metodologia ta została zademonstrowana poprzez opracowanie mikromacierzy acetylocholinoesterazy i multikinaz, które są wykorzystywane do opłacalnych badań przesiewowych małych cząsteczek.

Podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu opracowania ilościowych mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie nowych materiałów na bazie żeli sol-żel do produkcji mikroarrayów oraz wykorzystanie ich w nanobjetomowych analizach enzymatycznych. Osiąga się to najpierw poprzez zidentyfikowanie materiałów, które charakteryzują się wystarczająco długim czasem żelowania, aby uniknąć jego wystąpienia wewnątrz igły drukującej mikroarray w trakcie procesu drukowania. W drugim kroku ocenia się materiały o długim czasie żelowania pod kątem ich zdolności do powtarzalnego drukowania mikroarrayów, odporności na pękanie, jakości adhezji, występowania niepożądanej separacji faz oraz, w ostateczności, wysokiej aktywności uwięzionych enzymów.Następnie naniesiony jest enzym będący przedmiotem zainteresowania w formie mikroarray z wykorzystaniem optymalnych materiałów, a następnie testowana jest jego zdolność do przyjmowania roztworu testowego oraz generowania mierzalnej odpowiedzi enzymatycznej. Ostatnim krokiem jest ocena materiałów pod kątem ich zdolności do zapewnienia wysokiej powtarzalności testów z wykorzystaniem badanego enzymu i generowania danych ilościowych. Na tej podstawie wybierany jest ostateczny materiał do wytwarzania matryc.Ostatecznie mikromacierze białkowe otrzymywane z żelu sol-żel są wykorzystywane do identyfikacji małych cząsteczek ograniczających aktywność enzymów. Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przesiewanie na płytkach, jest możliwość bardzo szybkiego i systematycznego badania dużej liczby materiałów przy użyciu niewielkich objętości odczynników. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką mogą napotkać trudności ze względu na możliwość żelowania materiałów wewnątrz pinów drukujących.Jeśli nie zostaną one odpowiednio oczyszczone, powstaną przeoczone miejsca, które mogą zostać zinterpretowane jako materiały niedrukowalne. Aby rozpocząć, należy przygotować liczne roztwory dodatków zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Wiele z roztworów można przygotować wcześniej i przechowywać do jednego miesiąca lub dłużej w odpowiednich warunkach, jednak niektóre muszą zostać sporządzone w dniu eksperymentu.Wymieszaj piaski na bazie krzemianu sodu bezpośrednio przed użyciem i pamiętaj, aby przechowywać je w lodzie. SOS należy wykorzystać w ciągu godziny od dodania wody, ponieważ dłuższy czas oczekiwania prowadzi do skrócenia i niezgodności czasów DATION. Następnie przygotuj różne kombinacje buforów, polimerów salanowych i organolanów zgodnie z instrukcjami w towarzyszącym protokole tekstowym, aby zidentyfikować, które kombinacje mogą być stosowane jako materiał do druku z czasami dylatacji przekraczającymi 2,5 godziny.Po zidentyfikowaniu odpowiedniej liczby kombinacji, ustaw wilgotność w komorze drukującej na 80 do 90%; wilgotność poniżej 80% może doprowadzić do odparowania próbki oraz niespójności w drukowaniu ze względu na małe objętości nanoszenia przez drukarkę. Po przygotowaniu ustaw wzory macierzy do wydruku w programie Chip Writer Pro. Ustaw prędkość przemieszczania się w kierunku XY na 10 milimetrów na sekundę, a prędkość podejścia do próbki w kierunku Z na dwa milimetry na sekundę, z czasem ładowania próbki wynoszącym 2,5 sekundy, wykorzystując wcześniej zidentyfikowane kombinacje żelu.Przygotować 25 µL materiałów bazowych, łącząc odpowiednie polimery, organolany i dodatki małocząsteczkowe zidentyfikowane w procesie wstępnego przesiewu. Do poszczególnych studzienek płytki mikrotitracyjnej 384-dołkowej należy wprowadzić 50 mM HEPES o pH 8,0. Następnie poddać sonikacji do czterech szczelinowych pinów osłonowych o średnicy 100 µm w wodzie dwukrotnie destylowanej.Po 15 minutach należy je osuszyć strumieniem azotu. Następnie za pomocą wyciora należy usunąć pozostałą wilgoć z wnętrza uchwytu pinu i ostrożnie umieścić pin w głowicy drukującej robota do drukowania pinów kontaktowych. Nieusunięcie pozostałej wilgoci może utrudnić swobodne poruszanie się pinu w uchwycie, co może prowadzić do powstania braków w nadruku.Następnie, tuż przed drukowaniem, należy dodać do dołka 25 µL odpowiedniego SA. Wymieszać roztwór, wykonując ruchy pipetowania w górę i w dół, powtarzając tę czynność 50 razy w przypadku mieszania za pomocą pipety. Należy zminimalizować ilość powietrza wprowadzanego do roztworu.Pęcherzyki powietrza uniemożliwiają całkowite pobranie próbki do pinu. Następnie należy pobrać próbkę, opuszczając pin do jej wnętrza. Po pobraniu próbek do pinów rozpoczyna się proces drukowania i nanosi próbkę na jedną z powierzchni szkiełka.Zatrzymaj proces drukowania przed dodaniem soli do kolejnej płytki źródłowej. Następnie, przy wstrzymanym procesie, usuń pin drukujący za pomocą magnesu i umieść w głowicy drukującej czyścik do rurek, aby zapobiec gromadzeniu się wilgoci w głowicy. Następnie opłucz pin drukujący podwójnie destylowaną wodą i poddaj go sonikacji w czystej wodzie podwójnie destylowanej przez 30 sekund.Następnie wysuszyć pin drukujący strumieniem azotu, a potem umieścić go z powrotem w głowicy drukującej. Kontynuować mieszanie, drukowanie i czyszczenie dla wszystkich pozostałych próbek na płytce źródłowej; na pojedynczym preparacie można nanieść do 12 000 punktów o średnicy 100 mikronów. Po zakończeniu drukowania inkubować macierz przez minimum 30 minut, maksymalnie do 24 godzin, w komorze drukującej przy wilgotności od 80 do 90%.Przygotuj 50 µL kontroli pozytywnej bezpośrednio przed użyciem, łącząc 25 µL 1 mM jodku acetylcholiny, 0,14 µL 5 mM BODIPY-FL cysteiny oraz 25 mM TRIS o pH 7,0 z 4% glicerolem w dołku płytki mikrotytrurowej 384-dołkowej; pipetuj roztwór powoli w górę i w dół, aby wymieszać go bez tworzenia pęcherzyków powietrza. Następnie przygotuj kontrole negatywne bezpośrednio przed użyciem, łącząc 0,14 µL 5 mM BODIPY-FL cysteiny z 49,86 µL 25 mM TRIS o pH 7,0 z 4% glicerolem w innym dołku płytki mikrotytrurowej 384-dołkowej i delikatnie wymieszaj. Nanieś kontrole na przygotowane mikromacierze, stosując te same procedury opisane w poprzedniej sekcji. Jednak zamiast pinów o średnicy 100 µm, użyj pinów o średnicy 235 µm.Zapewnia to całkowite pokrycie wcześniej naniesionych plamek przez roztwory. Plamki starzeją się na matrycach przy wilgotności 80-90% przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej ze względu na autohydrolizę acetylocholiny. Dłuższy czas inkubacji może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich z powodu zwiększonej aktywności enzymatycznej.Upewnij się, że skaner tablic Alpha Innotech Novo Array Imager jest włączony i wyposażony w filtr wzbudzenia 478 ± 17 nm oraz filtr emisji 538 ± 21 nm do pomiaru mikromacierzy acetylocholinoesterazy. Następnie umieść preparat w uchwycie na slajdy, tak aby plamki były skierowane do góry. Ustaw liczbę sekcji podglądu w taki sposób, aby po każdej stronie slajdu mikroskopowego wyświetlano podgląd z minimalną rozdzielczością 4 µm przy użyciu automatycznej ekspozycji.Po uznaniu parametrów za odpowiednie, należy pozyskać obraz preparatu i zapisać go w formacie TIFF. Następnie otwórz pozyskany obraz preparatu w programie ImageJ 64. Kliknij narzędzie Oval Selection Tool i zaznacz każdą plamkę.Wybierz obszar nieco większy niż obserwowana plamka i upewnij się, że stosujesz jednolity rozmiar dla wszystkich plamek, aby ograniczyć subiektywność pomiarów w programie ImageJ. Następnie zmierz intensywność sygnału każdej plamki, korzystając z opcji Measure w zakładce Analyze. Oblicz średnią intensywność z 25 podobnych plamek kontroli pozytywnej i podziel ją przez średnią intensywność 25 podobnych plamek kontroli negatywnej, aby uzyskać stosunki kontroli pozytywnej do kontroli negatywnej dla poszczególnych składów materiałowych.Przedstawiono tutaj przykład zakresu dynamicznego otrzymanych mikromacierzy przygotowanych przy użyciu tych metod. Kontrole wysokiej intensywności zaowocowały jasnozielonymi obszarami, natomiast kontrole niskiej intensywności dały znacznie słabsze sygnały w plamkach. Intensywność zmierzona za pomocą programu ImageJ 64 wykazuje, że kontrole wysokie osiągnęły średnio około 22 000 względnych jednostek fluorescencji, a kontrole niskie średnio blisko 8 000.Linie przerywane reprezentują trzy odchylenia standardowe od średniej. Przedstawione są przykładowe mikromacierze dla przesiewu macierzy honor w celu analizy syntetycznych analogów alkaloidów ameral sier, zidentyfikowanych jako związek jeden i związek dwa. Obie osie reprezentują procent aktywności enzymu określony na podstawie sygnału fluorescencyjnego.W układzie dubletowym bliskość punktów do przekątnej świadczy o wysokiej powtarzalności testu. Przedstawiono tutaj wykresy IC 50 dla dwóch różnych potencjalnych inhibitorów. Związek pierwszy wykazał wartość IC 50 na poziomie 16 micromolar, podczas gdy IC 50 związku drugiego wyniosło 21 micromolar. Powyżej wyświetlone są reprezentatywne plamki, aby zilustrować różnice w sygnale proporcjonalne do stężeń inhibitorów.Przedstawiony tutaj macierz został wydrukowany z czterema różnymi kinazami: kinazą MAP p38, EGFR i GSK, a następnie nadrukowano na nim sam bufor, bufor zawierający ATP oraz bufor zawierający ATP i staurosporynę, która jest inhibitorem aktywności enzymatycznej. Wyniki wykazują istotny wpływ inhibitora kinazy staurosporyny na podstawie uzyskanych intensywności fluorescencji, zgodnie z opisem. Największa różnica przy zastosowanym tutaj stężeniu staurosporyny była widoczna w plamkach p38.Poniżej przedstawiono reprezentatywne punkty macierzy mikroprzepływowej P 30 8:00 AM BP, na których naniesiono różne stężenia stor sporiny. Jak wskazano, IC 50 tej cząsteczki określono na 1 µM, co przedstawiono na wykresie po prawej stronie. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje zaledwie kilka godzin, pod warunkiem właściwego zastosowania opisanej procedury.W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące diagnostyki lub odkrywania małych cząsteczek można zastosować inne metody, takie jak testy immunochemiczne lub analizy oddziaływań białkowych.

a-guided-materials-screening-approach-for-developing-quantitative-sol

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Zaawansowane podejście do badania materiałów w celu opracowania ilościowych mikroarrayów białek uzyskiwanych metodą sol-gel

SDD-AGE jest użyteczną techniką wykrywania i charakteryzacji polimerów amyloidopodobnych w komórkach. Przedstawiamy tutaj adaptację, która sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań na szeroką skalę.

Przesiewowe badanie agregacji amyloidu metodą półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym z detergentem

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

W niniejszym badaniu opisujemy ulepszony protokół wieloparametrycznego, wysokoprzepustowego mikrociągu przeciwciał z metodą detekcji lektynami, który może być wykorzystany do profilowania glikozylacji specyficznych białek. Protokół ten wprowadza nowe, niezawodne odczynniki i znacząco redukuje czas, koszty oraz zapotrzebowanie na sprzęt laboratoryjny w porównaniu do poprzedniej procedury.

Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Ten protokół opisuje wytwarzanie wielkoskalowego, multipleksowanego dwuwymiarowego DNA lub matrycy przeciwciał, z potencjalnymi zastosowaniami w badaniach nad sygnalizacją komórkową i wykrywaniem biomarkerów.

Wytwarzanie mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi o dużej gęstości pod kontrolą przepływu

Test mikromacierzy sialoglycan może być używany do oceny przeciwciał anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich, co czyni go potencjalnym wysokoprzepustowym testem diagnostycznym dla raka i innych przewlekłych chorób ludzkich, w których pośredniczy stan zapalny.

Profilowanie IgG anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich za pomocą testu mikromacierzy sialoglikanu

Demonstrujemy technologię chipową do wykonywania testów immunologicznych typu sandwich bez reaktywności krzyżowej, po prostu pstrykając dwa slajdy. Aparat zatrzaskowy służy do niezawodnego przenoszenia odczynników z mikromacierzy do mikromacierzy. Chip zatrzaskowy może być stosowany do wszelkich reakcji biochemicznych wymagających kolokalizacji różnych odczynników bez zanieczyszczenia krzyżowego.

Snap Chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i Spotterów

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Przedstawiono szczegółowy protokół generowania samodzielnie składających się mikromacierzy białek ludzkich do badań przesiewowych inhibitorów kinaz.

Badania przesiewowe inhibitorów kinaz w samoorganizujących się mikromacierzach białek ludzkich

Profilowanie polimerów w mikromatrycach (MAPP) to wysokoprzepustowa technika analizy składu glikanów w próbkach biologicznych.

Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

System do automatycznej i szybkiej analizy glikanów na białkach został wcześniej opracowany. W artykule przedstawiono protokół "analizy glikojakościowej", zoptymalizowany dla szerokiego spektrum użytkowników, takich jak osoby zajmujące się analizą struktur glikanów w biofarmaceutykach i innych materiałach glikokoniugatowych.

Szybka ocena glikojakościowa białek rekombinowanych przy użyciu w pełni zautomatyzowanego systemu

Poznaj systematyczne podejście do badań przesiewowych materiałów sol-żelowych do tworzenia mikromacierzy białkowych z enzymami. Ta metoda umożliwia szybkie przesiewowe badanie małych cząsteczek z wysoką powtarzalnością.

Podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu opracowania ilościowych mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel (Wideo) | JoVE Journal

Podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu opracowania ilościowych mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel

Przeglądaj więcej filmów