Chemicznie blokowana mikromacierz przeciwciał do multipleksowanego profilowania wysokoprzepustowego specyficznej glikozylacji białek w złożonych próbkach

W tym artykule wideo opisano procedurę uzyskiwania profili glikozylacji 20 różnych glikoprotein w próbce surowicy pacjenta z rakiem wątrobowokomórkowym przy użyciu chemicznie zablokowanej mikromacierzy przeciwciał pierwszej glikoproteiny Specyficzne przeciwciała są drukowane bezpośrednio na szkiełkach mikromacierzy, a glikany przeciwciał są blokowane, aby zapobiec wiązaniu lektyny. Po nałożeniu próbek surowicy pacjenta glikoproteiny z próbki są wychwytywane przez przeciwciała. Następnie dodaje się biotynylowane białka wiążące glikany w celu wykrycia glikanów, a następnie dodaje się sprzężoną neu travainę w celu oznaczenia biotynylowanych lektyn.

Szkiełko mikromacierzy jest następnie skanowane w celu wykrycia fluorescencji uzyskanych danych, które ujawniają profile glikozylacji białek próbki. Ta technika ma kilka zalet w porównaniu z istniejącą metodą, taką jak HPLC. Metoda ta pozwala na wykrycie pojedynczych glikoprotein w ich natywnym statusie.

Szybsze i łatwiejsze jest badanie przesiewowe zmian glikozylacji dla wielu białek jednocześnie. W porządku, odkryliśmy, że biomarkery chorób, szczególnie raka i raka wątroby, którym przyjrzeliśmy się najdokładniej, są często glikozylowane. Odkryta przez nas zdolność do wykrywania określonych form glikolu znacznie zwiększa wydajność biomarkerów pod względem czułości i specyficzności.

Tak więc ten pomiar może dostarczyć informacji na temat zmian glikozylacji na wielu białkach surowicy w HCC. Może być również stosowany do badań patologicznych i odkrywania biomarkerów w innych nowotworach i chorobach, takich jak rak trzustki, cukrzyca i choroba Alzheimera. Procedurę zademonstruje Chen Lu, technik z mojego laboratorium.

Rozpocznij ten protokół od przygotowania mikromacierzy przeciwciał najpierw w mikroprobówkach wirówkowych o pojemności 0,8 mililitra na lodzie, rozcieńcz wszystkie przeciwciała, które będą używane do drukowania mikromacierzy, do stężenia 0,5 miligrama na mililitr w co najmniej 40 mililitrach PBS, tutaj 26 różnych przeciwciał zostanie użytych jako kontrola pozytywna. Przygotuj również taką samą ilość 0,5 miligrama na mililitr biotynylowanego BSA w PBS. Za pomocą pipety przesycić 40 mililitrów każdego przeciwciała do 384-dołkowej płytki źródłowej na lodzie.

Następnie w oprogramowaniu sterującym mikromacierzą wyznacz każdą lokalizację przeciwciała. Następnie załaduj płytkę na mikromacierz jako źródło. Następnie załaduj 20-ścieżkowe slajdy mikromacierzy na mikromacierz jako cel.

Ustaw mikromacierz tak, aby wydrukowała 48 identycznych macierzy subar, w których 27 przeciwciał i białek kontrolnych jest nakrapianych w trzech egzemplarzach w układzie dziewięć na dziewięć. Uruchom mikromacierz, aby wydrukować szkiełka mikromacierzy przeciwciał. Zebrać szkiełka z mikromatrycą przeciwciał i przechowywać je w kasecie z szkiełkami ze środkiem osuszającym.

Zamknij kasetę w plastikowej torbie, aby zapobiec denaturacji białek i wilgoci na szkiełkach podczas przechowywania. Przechowuj zamknięte szkiełka z mikromatrycą w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu ich użycia. Najtrudniejszym i najważniejszym aspektem tej procedury jest etap blokady chemicznej.

Aby zapewnić sukces, bardzo ważne jest, aby wystarczająca ilość przeciwciał została wydrukowana na lampie mikromatrycy. Zawsze przygotowuj świeże IDE sodu i hydrocyty agrokwasowe bezpośrednio przed eksperymentem. I pamiętaj, aby przeprowadzić procedurę utleniania pod czterema stopniami, unikając światła.

Wyjmij szkiełka z mikromacierzy z lodówki i wyrównaj je do temperatury pokojowej przez 30 minut. Wyjmij szkiełko z pudełka do przechowywania. Zanurz na krótko szkiełko w umywalce zawierającej PBS o zawartości 0,1%tween 20.

Następnie zanurz szkiełko w 15-milimolowym buforze octanu sodu o zawartości 0,1% na 10 minut. Następnie przygotuj świeży 150-milimolowy jodan sodu w 15-milimolowym buforze octanu sodu i przenieś go do umywalki na suwak Przechowuj w lodówce, unikając światła do czasu użycia. Wyjąć szkiełko z buforu octanu sodu i umieścić je w misce zawierającej świeży puriat sodu, stroną z przeciwciałami skierowaną do góry.

Przykryj miskę folią aluminiową, aby uniknąć światła. Następnie umieść miskę na szkiełku w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie potrząsając przez dwie godziny. Wyjąć szkiełko z miski i krótko przepłukać je trzykrotnie w buforze octanu sodu przez pięć minut.

Inkubować szkiełko w 300 mililitrach świeżo przygotowanego 10-milimolowego roztworu blokującego kwas hydroglutaminowy w komorze inkubacyjnej przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Wyjmij szkiełka z komory i myj je PBS z 0,1% tween przez trzy minuty. Następnie, w umywalce do szkiełek, inkubuj szkiełko mikromacierzy w 300 mililitrach 1% BSA w PBS z 0,5% animacją przez godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem.

Przepłucz szkiełka w PBS za pomocą 0,1% teen trzy razy przez trzy minuty. Umieść szkiełko na stojaku do szkiełek i obracaj z prędkością 1 200 razy G przez dwie minuty, aby następnie wysuszyć szkiełko do mikromacierzy. Aby oddzielić każdą tablicę subar, na szkiełku nadrukowana jest woskowa siatka.

Po wstępnym podgrzaniu drukarki woskowej w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut, załaduj zablokowane szkiełko do drukarki woskowej stroną z przeciwciałem skierowaną w stronę wosku. Delikatnie pociągnij za uchwyt, aby równomiernie odcisnąć wosk na szkiełku. Metoda ta może być stosowana do wykonywania testów profilowania glikologicznego dla pojedynczej próbki lub do pomiaru pojedynczego epitopu glikologicznego w wielu próbkach.

Tutaj zademonstrujemy testy profilowania glikotechniki. Zacznij od rozcieńczenia 40 mikrolitrów surowicy na 360 mikrolitrów PBS zawierających 0,1% między 0,1% a 0,1% wypełnionymi 35 i 100 mikrogramami na mililitr, każdy z IgG myszy, szczura, królika, kozy i osła. Objętość ta jest wystarczająca do nałożenia sześciu mikrolitrów rozcieńczonego roztworu surowicy na każdą podmatrycę.

Ostrożnie nanieść sześć mikrolitrów rozcieńczonej próbki lub próby kontrolnej na każdą podtablicę szkiełka. Inkubować szkiełko w nawilżonej kasecie z mokrymi ręcznikami papierowymi w temperaturze pokojowej przez godzinę. Przepłucz szkiełko za pomocą PBS za pomocą 0,1% teen trzy razy przez trzy minuty.

Następnie wysusz szkiełko, obracając je z prędkością 1200 razy G przez dwie minuty. Przygotuj 20 mikrolitrów biotynylowanych białek wiążących glikan w ilości 10 miligramów na mililitr w PBS tween w 0,8 mililitrowej mikroprobówce fuge na lodzie. Nałożyć sześć mikrolitrów rozcieńczonych biotynylowanych lektyn na każdą podmatrycę szkiełka i inkubować w nawilżonym pudełku na szkiełka z mokrymi ręcznikami papierowymi w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Po trzykrotnym przepłukaniu szkiełek PBS z 0,1% tween, jak poprzednio, wysuszyć szkiełko, obracając je w wirówce przez dwie minuty z prędkością 1200 razy G. Przygotuj 400 mikrolitrów po 10 miligramów na mililitr DITE 5 49 oznaczony neut travain w PBS 0,1%tween w 0,8 mililitrowej mikro tubie fuge na lodzie. Za pomocą powtórnego pipetera nanieść sześć mikrolitrów DITE 5 49 znakowanego neut travain na każdą podmatrycę i inkubować szkiełko w kasecie z nawilżanym szkiełkiem w temperaturze pokojowej przez godzinę po inkubacji.

Przepłucz szkiełko za pomocą PBS 0,1% teen trzy razy przez trzy minuty. Wysuszyć szkiełko, obracając je w wirówce przez dwie minuty z prędkością 1200 razy G. Zeskanuj szkiełko za pomocą skanera fluorescencyjnego o rozdzielczości 10 milimetrów.

Ustawienia lasera i PMT powinny być jak najmocniejsze, przy jednoczesnym zapewnieniu, że nie obserwuje się nasycenia. Otwórz obraz w array Pro 3.2. Skonfiguruj szablon macierzy zgodnie z mapą macierzy, która pokazuje lokalizacje plamek przeciwciał.

Ostrożnie wyrównaj każdy okrąg szablonu do odpowiedniego miejsca na obrazie, wyodrębnij intensywność każdego punktu do pliku Excel w celu dalszej analizy. Mikromacierz przeciwciał zawierająca 48 identycznych macierzy subar z 26 przeciwciałami przeciwko 20 glikoproteinom surowicy i biotynie. BSA został zaprojektowany i wyprodukowany zgodnie z opisem w tym filmie w celu zbadania znaczenia procedury blokowania.

W analizie profilowania glikoprotein wygenerowano dwa identyczne preparaty mikromacierzy. Jedna z nich nie została zablokowana chemicznie, podczas gdy druga była próbką kontrolną, którą nałożono na macierze subar w kolumnach pierwszej i trzeciej, a zbiorczą próbkę surowicy HCC nałożono na matryce subarowe. W kolumnach drugiej i 4 22.

Biotynylowane lektyny specyficzne dla różnych glikanów zostały następnie nałożone na każdą podmatrycę, jak pokazano na tych obrazach macierzy subar. Lektyny związane z wychwytywaniem przeciwciał w kolumnach kontrolnych dających wysokie tło, które było nie do odróżnienia od kolumn załadowanych surowicą w niezablokowanych mikromacierzach. Jednakże, gdy ten sam eksperyment przeprowadzono na chemicznie zablokowanym szkiełku mikromacierzy przeciwciał, nie było lub było bardzo słabe wiązanie w celu wychwycenia przeciwciał w kolumnach kontrolnych i wysokie wiązanie antygenu w kolumnach załadowanych surowicą.

Wyniki te pokazują, że procedura blokowania chemicznego jest krytycznym krokiem w pomiarze glikanów na glikoproteinach wychwyconych przez przeciwciała: postępując zgodnie z protokołem, można uzyskać profile glikozylacji 22 glikoprotein w surowicy HCC Po opanowaniu. Tę technikę można wykonać w ciągu ośmiu godzin, jeśli działa prawidłowo. Zmodyfikowane przeciwciała mogą stracić swoje powinowactwo do swoich antygenów i inne właściwości.

Dlatego ważne jest, aby o tym pamiętać i stosować kilka różnych przeciwciał w różnych źródłach przeciwciał Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne środki, takie jak wykrywanie stężenia każdego białka za pomocą tego samego szkiełka mikrorentgenowskiego, można przeprowadzić w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy zmiana glikozylacji jest spowodowana zmianą poziomów ekspresji białka, czy wyłącznie zmianą glikozylacji na każdym pojedynczym białku. Nie zapominaj, że praca z próbkami surowicy zawierającymi patogeny może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak rękawice ochronne.