Name: Chemicznie blokowana mikromacierz przeciwciał do multipleksowanego profilowania wysokoprzepustowego specyficznej glikozylacji białek w złożonych próbkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Poznaj metodę profilowania glikozylacji białek w surowicy pacjenta z rakiem wątroby za pomocą chemicznie blokowanej mikromacierzy przeciwciał. Technika ta umożliwia szybką i ekonomiczną analizę glikoprotein w ich natywnym stanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Institute for Hepatitis and Virus Research.

<ol><li>Fang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ER+UDPase+ENTPD5+promotes+protein+N-glycosylation%2C+the+Warburg+effect%2C+and+proliferation+in+the+PTEN+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway.</a> Cell. 143, 711-724 (2010).</li>
<li>Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+protein+glycosylation+analysis%3A+a+path+through+the+maze%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze.</a> Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).</li>
<li>Shental-Bechor, D., Levy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glycosylation+on+protein+folding%3A+a+close+look+at+thermodynamic+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).</li>
<li>Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+and+consistent+protein+glycosylation+in+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture.</a> Glycobiology. 19, 936-949 (2009).</li>
<li>Nothaft, H., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+glycosylation+in+bacteria%3A+sweeter+than+ever%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).</li>
<li>Sola, R. J., Griebenow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+glycosylation+on+the+stability+of+protein+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals.</a> J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).</li>
<li>Li, C., Lubman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+serum+protein+glycosylation+with+antibody-lectin+microarray+for+high-throughput+biomarker+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening.</a> Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).</li>
<li>Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+assay+to+measure+biomarker+glycosylation+demonstrates+increased+fucosylation+of+prostate+specific+antigen+%28PSA%29+in+patients+with+prostate+cancer+compared+with+benign+prostatic+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia.</a> Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).</li>
<li>Drake, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sweetening+the+pot%3A+adding+glycosylation+to+the+biomarker+discovery+equation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation.</a> Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).</li>
<li>Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+detection+of+protein+glycosylation+based+on+energy+transfer+between+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles.</a> Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).</li>
<li>Boland, M., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+related+glycosylation+changes+and+biomarker+discovery%3A+challenges+and+possibilities+in+an+emerging+field%5BTitle%5D)+AND+%22Editorial.+Dis.+Markers%22%5BJournal%5D)">Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field.</a> Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).</li>
<li>Norton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+of+the+liver+cancer+biomarker+GP73%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73.</a> J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).</li>
<li>Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomic+analysis+of+alpha-fetoprotein+L3+in+hepatoma+cell+lines+and+hepatocellular+carcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients.</a> J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).</li>
<li>Durazo, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Des-gamma-carboxyprothrombin%2C+alpha-fetoprotein+and+AFP-L3+in+patients+with+chronic+hepatitis%2C+cirrhosis+and+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma.</a> J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).</li>
<li>Kobayashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucosylated+fraction+of+alpha-fetoprotein%2C+L3%2C+as+a+useful+prognostic+factor+in+patients+with+hepatocellular+carcinoma+with+special+reference+to+low+concentrations+of+serum+alpha-fetoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatol.+Res%22%5BJournal%5D)">Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein.</a> Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).</li>
<li>Maisey, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CA19-9+as+a+prognostic+factor+in+inoperable+pancreatic+cancer%3A+the+implication+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials.</a> Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).</li>
<li>Talar-Wojnarowska, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+value+of+serum+neopterin%2C+tissue+polypeptide-specific+antigen+and+CA19-9+levels+in+differential+diagnosis+between+pancreatic+cancer+and+chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis.</a> Pancreatology. 10, 689-694 (2010).</li>
<li>Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+analysis+of+glycan+variation+on+native+proteins+captured+by+antibody+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays.</a> Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).</li>
<li>Shao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+microarray+analysis+of+serum+glycans+in+esophageal+spuamous+cell+carcinoma+cases+and+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls.</a> Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).</li>
<li>Chen, S., Haab, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+glycans+on+serum+proteins+using+antibody+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).</li>
<li>Yue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prevalence+and+Nature+of+Glycan+Alterations+on+Specific+Proteins+in+Pancreatic+Cancer+Patients+Revealed+Using+Antibody-Lectin+Sandwich+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).</li>
<li>Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+protein+function+and+signaling+using+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting protein function and signaling using protein microarrays.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).</li>
<li>Richard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+as+Applied+to+Inherited+Metabolic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases.</a> Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).</li>
<li>Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+tumor-associated+antigen+autoantibody+profiles+in+healthy+controls+detected+by+multiplex+bead-based+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay.</a> Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).</li>
<li>Kuno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+Differential+Glycan+Analysis+with+the+Platform+Antibody-assisted+Lectin+Profiling+for+Glycan-related+Biomarker+Verification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).</li>
<li>Hsu, K. -L., Mahal, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sweet+tasting+chips%3A+microarray-based+analysis+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).</li>
<li>Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+proteomics+using+antibody+microarrays%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).</li>
<li>Sanchez-Carbayo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+array-based+technologies+for+cancer+protein+profiling+and+functional+proteomic+analyses+using+serum+and+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biology%22%5BJournal%5D)">Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens.</a> Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).</li>
<li>Porter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+motif-based+analysis+of+glycan+array+data+to+determine+the+specificities+of+glycan-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins.</a> Glycobiology. 20, 369-380 (2010).</li>
<li>Maupin, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogene+Expression+Alterations+Associated+with+Pancreatic+Cancer+Epithelial-Mesenchymal+Transition+in+Complementary+Model+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems.</a> Plos One. 5, (2010).</li>
<li>Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysate+Microarrays+Enable+High-throughput%2C+Quantitative+Investigations+of+Cellular+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Wang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+fucosylated+biomarkers+for+the+early+detection+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol.+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

1. Wybór białka docelowego i przeciwciała wychwytującego
Przed przeprowadzeniem analizy z użyciem mikroarray przeciwciał należy rozważyć i przygotować odpowiednie odczynniki oraz materiały. Aby zaprojektować mikroarray przeciwciał do profilowania glikanów lub przesiewania biomarkerów glikanowych, należy wyznaczyć panel przeciwciał specyficznych dla potencjalnych glikoprotein na podstawie literatury lub wcześniejszych wyników. Przeciwciała te były zazwyczaj nabywane od różnych dostawców, takich ja...

<table><tbody><tr><td>biotynilowana konkanawalina A</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-1000</td><td>ConA</td></tr><tr><td>Biotynylowana lektyna z Sambucus nigra</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1305</td><td>SNA</td></tr><tr><td>Biotynilowana aglutynina z Lens culinaris</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-2000</td><td>LCA</td></tr><tr><td>Biotynilowana aglutynina I z Ricinus communis</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-1000</td><td>RCA (amplifikacja rolling-circle)</td></tr><tr><td>biotynilowana lektyna z Aleuria aurantia</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1395</td><td>AAL</td></tr><tr><td>Biotynilowana lektyna z Erythrina cristagalli</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-3000</td><td>ECL</td></tr><tr><td>biotynilowana lektyna II z Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-3000</td><td>GSL II</td></tr><tr><td>biotynilowana aglutynina zarodków pszenicy</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-1000</td><td>WGA</td></tr><tr><td>biotynilowana erytroaglutynina z Phaseolus vulgaris</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-2000</td><td>PHA-E</td></tr><tr><td>biotynilowana lekoglutynina z Phaseolus vulgaris</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-2000</td><td>PHA-L</td></tr><tr><td>Biotynilowana lektyna PNA (Peanut Agglutinin)</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-1000</td><td>PNA</td></tr><tr><td>biotynylowana aglutynina z grochu zwyczajnego (Pisum Sativum)</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-2000</td><td>PSA (antygen swoisty dla prostaty)</td></tr><tr><td>biotynilowana aglutynina Dolichos biflorus</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-1000</td><td>DBA</td></tr><tr><td>Biotynilowana lektyna z Datura stramonium</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-3000</td><td>DSL</td></tr><tr><td>Biotynilowana aglutynina z Sophora japonica</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-2000</td><td>SJA</td></tr><tr><td>Biotynilowana aglutynina sojowa</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-1000</td><td>SBA</td></tr><tr><td>Biotynilowana lektyna z Solanum tuberosum (ziemniaka)*</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-3000</td><td>STL</td></tr><tr><td>biotynilowana lektyna I z Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-2000</td><td>GSL I</td></tr><tr><td>Biotynilowana lektyna z Vicia villosa</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-2000</td><td>VVL</td></tr><tr><td>lektyna z pomidora (Lycopersicon esculentum) biotynilowana</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-3000</td><td>LEL</td></tr><tr><td>Biotynylowana aglutynina I z *Ulex europaeus*</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-1000</td><td>UEA I</td></tr><tr><td>biotynilowana jakalina</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-3000</td><td>jakalina</td></tr><tr><td>Fragment F(ab')2 przeciwciała koziego przeciwko ludzkiej IgM, Fc5&amp;#956; przeciwciało</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>109-006-129</td><td>IgM</td></tr><tr><td>przeciwciało donkey F(ab')2 Frag anty-ludzkie IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>709-006-149</td><td>AB1</td></tr><tr><td>mysie monoklonalne przeciwciało anty-ludzkie IgG F(ab')2</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>209-005-097</td><td>AB3</td></tr><tr><td>Kozie poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-2-makroglobulinie</td><td>GeneTex</td><td>GTX62924</td><td>A2M</td></tr><tr><td>Królicze wielomieszałkowe przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1-antytrypsynie</td><td>Lee Biosciences</td><td>CA1T-80A</td><td>A1AT</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej alfa-1-antytrypsynie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4200198</td><td>A1AT</td></tr><tr><td>Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1-antytrypsynie</td><td>NeoMarkery</td><td>RB-367-A1</td><td>ACT</td></tr><tr><td>Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1-antychymotrypsynie</td><td>Fisher Scientific</td><td>RB9213R7</td><td>ACT</td></tr><tr><td>mysi monoklonalny przeciwciało anty-ludzka transferryna</td><td>GeneTex</td><td>GTX101035</td><td>Transferryna</td></tr><tr><td>Królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej transferrynie</td><td>GeneTex</td><td>GTX77130</td><td>Transferryna</td></tr><tr><td>Kozie poliklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej apolipoproteinie J</td><td>Abcam</td><td>ab7610</td><td>ApoJ</td></tr><tr><td>mysi monoklonalny przeciwciało przeciwko ludzkiemu GP73</td><td>Abbott Laboratories</td><td>14H4-23</td><td>GP73</td></tr><tr><td>mysi przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie GP73</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC</td><td>sc-101275</td><td>GP73</td></tr><tr><td>Królicze wielomieszałkowe przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1 fetoproteinie</td><td>GenWay</td><td>GWB-41C966</td><td>AFP</td></tr><tr><td>Mysi monoklonalny przeciwciało przeciwko ludzkiej alfa-1 fetoproteinie</td><td>Fitzgerald</td><td>10-A05A</td><td>AFP</td></tr><tr><td>Mysie monoklonalne przeciwciało anty-ludzka hemopeksyna</td><td>Assaypro</td><td>60190-05011</td><td>Hemopeksyna</td></tr><tr><td>mysi przeciwciało monoklonalne anty-ludzki glipikan-3 (1G12)</td><td>Santa Cruz Bio</td><td>sc-65443</td><td>GPL3</td></tr><tr><td>Mysi przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu kininogenowi (LMW)</td><td>Assaypro</td><td>20333-05011</td><td>Kininogen</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej MMP-21</td><td>Epitomic</td><td>1955-1</td><td>MMP21</td></tr><tr><td>mysi monoklonalny przeciwciało anty-ludzki CEACAM-1</td><td>R&amp;R&D Systems</td><td>MAB1180</td><td>CEACAM</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne szczurze przeciwko ludzkiemu DPPIV/CD26</td><td>R&amp;R&D Systems</td><td>MAB22441</td><td>DPPIV</td></tr><tr><td>mysia przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie PIVKA II</td><td>Chemia kryształów</td><td>8040</td><td>PIVICA</td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie anty-karcino...&amp;#8211;antygen embrionalny</td><td>biologiczny USA</td><td>C1300</td><td>CEA</td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie przeciwko antygenowi nowotworowemu CA125</td><td>biologia USA</td><td>C0050-01D</td><td>CA125</td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie przeciwko antygenowi nowotworowemu CA19-9</td><td>biologia USA</td><td>C0075-18</td><td>CA19-9</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-Lewis x</td><td>Calbiochem</td><td>434631</td><td>Lewis X</td></tr><tr><td>Biotynilowana BSA (kontrola pozytywna)</td><td>Własnej roboty</td><td>Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o przesłanie materiałów, które mają zostać przełożone na język polski.</td><td>Bio</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Lista lektyn i przeciwciał użytych w tym protokole.</td></tr><tr><td>Bezkontaktowy system do nanoszenia mikromacierzy</td><td>BioDot Inc</td><td>sciFLEXARRAYER</td><td></td></tr><tr><td>płytka mikrotitracyjna 384-dołkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-230-243</td><td></td></tr><tr><td>FoodSaver</td><td>FoodSaver</td><td>V3835</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy do mikromacierzy z ultracienką powłoką z nitrocelulozy</td><td>Gentel</td><td>ŚCIEŻKA</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do odcisków na szkiełkach (opcjonalnie)</td><td>The Gel Company</td><td>WSP60-1</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło orbitalne</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-453-211</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5804 000.013</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta do płukania/barwienia szkiełek z wyjmowaną wkładką</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-812</td><td></td></tr><tr><td>Komora inkubacyjna do szkiełek / pudełko na szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-5</td><td></td></tr><tr><td>roztwór Brij 35 w stężeniu 30% w/v w wodzie</td><td>Acros Organics</td><td>AC32958-0025</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>P337-100</td><td></td></tr><tr><td>Periodynian sodu (NaIO4)&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311448</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy &amp;#947;-hydrazyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7257</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu bezwodny (CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;COONa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Lampire Biological Labs</td><td>7500804</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy (PBS) (10X)</td><td>Denville Scientific</td><td>CP4390-48</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidyna sprzężona z DyLight 549</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22837</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki z koktajlem inhibitorów proteaz</td><td>Grupa Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>ChromPure Human IgG, fragment Fc</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>ChromPure Human IgG, cała cząsteczka</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-003</td><td></td></tr><tr><td>ChromPure Mouse IgG, cała cząsteczka</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>015-000-003</td><td></td></tr><tr><td>ChromPure Mouse IgG, fragment Fc</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>015-000-008</td><td></td></tr><tr><td>ChromPure Rabbit IgG, cała cząsteczka</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>011-000-003</td><td></td></tr><tr><td>ChromPure Donkey IgG, cała cząsteczka</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Skaner do mikromacierzy</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>LS Reloaded</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Tabela 2.&lt;/strong&gt; Lista aparatury i odczynników użytych w tym protokole.</td></tr></tbody></table>

mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

W niniejszym badaniu opisujemy skuteczny protokół do zastosowania w multipleksowej wysokoprzepustowej mikrotablicy przeciwciał z detekcją białek wiążących glikany, który umożliwia profilowanie glikozylacji specyficznych białek. Glikozylacja białek jest najpowszechniejszą modyfikacją potranslacyjną występującą w białkach, która prowadzi do zróżnicowanych zmian ich właściwości fizycznych, chemicznych i biologicznych. Ponieważ mechanizm glikozylacji jest szczególnie podatny na postęp choroby i transformację złośliwą, aberracyjna glikozylacja została uznana za biomarker wczesnego wykrywania raka i innych schorzeń. Jednakże obecne metody badania glikozylacji białek są zazwyczaj zbyt skomplikowane lub kosztowne, aby można je było stosować w większości standardowych warunków laboratoryjnych lub klinicznych, w związku z czym istnieje potrzeba opracowania bardziej praktycznej metody badania glikozylacji białek. Nowy protokół opisany w niniejszym badaniu wykorzystuje chemicznie blokowaną mikrotablicę przeciwciał z detekcją białek wiążących glikany (GBP), co znacząco redukuje czas, koszty oraz wymagania sprzętowe niezbędne do badania glikozylacji białek. W tej metodzie wiele unieruchomionych przeciwciał specyficznych dla glikoprotein jest nanoszonych bezpośrednio na szkiełka mikrotablicy, a N-glikany na przeciwciałach zostają zablokowane. Zablokowane, unieruchomione przeciwciała specyficzne dla glikoprotein są w stanie wychwycić i wyizolować glikoproteiny z kompleksowej próbki naniesionej bezpośrednio na szkiełka mikrotablicy. Detekcja glikanów może być następnie przeprowadzona poprzez naniesienie biotynylowanych lektyn i innych GBP na szkiełko mikrotablicy, natomiast poziomy wiązania można określić przy użyciu Dylight 549-Streptavidiny. Dzięki zastosowaniu panelu przeciwciał i sondowaniu wieloma biotynylowanymi lektynami, metoda ta pozwala na skuteczne opracowanie profilu glikozylacji różnych białek obecnych w danej próbce ludzkiej lub zwierzęcej.
Wstęp
Glikozylacja białek, będąca najpowszechniejszą modyfikacją potranslacyjną białek, zmienia ich właściwości fizyczne, chemiczne i biologiczne oraz odgrywa fundamentalną rolę w różnych procesach biologicznych1-6. Ponieważ aparat glikozylacyjny jest szczególnie podatny na progresję chorób i transformację złośliwą, aberracyjna glikozylacja została uznana za biomarker wczesnego wykrywania raka i innych schorzeń 7-12. W rzeczywistości większość obecnych biomarkerów nowotworowych, takich jak frakcja L3 α-1 fetoproteiny (AFP) dla raka hepatokomórkowego 13-15 oraz CA199 dla raka trzustki 16, 17, to aberracyjne fragmenty glikanów w glikoproteinach. Jednak metody badania glikozylacji białek są skomplikowane i nie nadają się do rutynowego zastosowania w warunkach laboratoryjnych i klinicznych. Chen et al. opracowali niedawno macierz przeciwciał z blokowaniem chemicznym wraz z metodą detekcji białek wiążących glikany (GBP) do wysokoprzepustowego i multipleksowego profilowania glikozylacji natywnych glikoprotein w złożonej próbce 18. W tej metodzie macierzy opartej na powinowactwie wiele unieruchomionych przeciwciał specyficznych dla glikoprotein wychwytuje i izoluje glikoproteiny z złożonej mieszaniny bezpośrednio na płytce macierzy, a następnie glikany na każdym poszczególnym wychwyconym białku są mierzone za pomocą GBP. Ponieważ wszystkie normalne przeciwciała zawierają N-glikany, które mogłyby być rozpoznawane przez większość GBP, krytycznym krokiem tej metody jest chemiczne zablokowanie glikanów na przeciwciałach, aby zapobiec ich wiązaniu z GBP. W procedurze grupy cis-diolowe glikanów w przeciwciałach zostały najpierw utlenione do grup aldehydowych przy użyciu NaIO4 w buforze octanu sodu z osłoną przed światłem. Grupy aldehydowe skoniugowano następnie z grupą hydrazydową łącznika, 4-(4-N-maleimidylofenylo)maślanu hydrazydowego HCl (MPBH), a następnie skoniugowano didektyd Cys-Gly z grupą maleimidową MPBH. W ten sposób grupy cis-diolowe w glikanach przeciwciał zostały przekształcone w rozbudowane grupy niehydroksylowe, co uniemożliwiło wiązanie lektyn i innych GBP do przeciwciał wychwytujących. Procedura blokowania ta sprawia, że GBP i lektyny wiążą się wyłącznie z glikanami wychwyconych białek. Po tym chemicznym blokowaniu próbki surowicy inkubowano z macierzą przeciwciał, a następnie wykryto glikany za pomocą różnych biotynylowanych lektyn i GBP, wizualizując je za pomocą Cy3-streptawidyny. Równoległe zastosowanie panelu przeciwciał i wielu sond lektynowych pozwala na uzyskanie oddzielnych profili glikozylacji wielu białek w danej próbce 18-20. Metoda ta była z sukcesem stosowana w wielu różnych laboratoriach 1, 7, 13, 19-31. Jednak stabilność MPBH i Cys-Gly oraz skomplikowana i czasochłonna procedura wpływają na powtarzalność, skuteczność i wydajność tej metody. W nowym protokole zastąpiliśmy zarówno MPBH, jak i Cys-Gly jednym, znacznie bardziej stabilnym odczynnikiem – hydrazydem kwasu glutaminowego (Glu-hydrazydem), co znacząco poprawiło powtarzalność metody oraz uprościło i skróciło całą procedurę tak, aby można było ją ukończyć w ciągu jednego dnia roboczego. W tym nowym protokole opisujemy szczegółową procedurę, która może zostać łatwo przyjęta przez standardowe laboratoria do rutynowych badań glikozylacji białek, oraz techniki niezbędne do uzyskania powtarzalnych i odtwarzalnych wyników.

W niniejszym badaniu opisujemy ulepszony protokół wieloparametrycznego, wysokoprzepustowego mikrociągu przeciwciał z metodą detekcji lektynami, który może być wykorzystany do profilowania glikozylacji specyficznych białek. Protokół ten wprowadza nowe, niezawodne odczynniki i znacząco redukuje czas, koszty oraz zapotrzebowanie na sprzęt laboratoryjny w porównaniu do poprzedniej procedury.

Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

W niniejszym badaniu opisujemy skuteczny protokół do zastosowania w wielopleksowej macierzy przeciwciał o wysokiej przepustowości z detekcją białek wiążących glikany, który ...

Niniejszy artykuł wideo opisuje procedurę pozyskiwania profili glikozylacji 20 różnych glikoprotein z próbki surowicy pacjenta z rakiem hepatokomórkowym przy użyciu mikroarray przeciwciał z chemicznie zablokowanymi glikanami. W pierwszej kolejności przeciwciała specyficzne dla glikoprotein są naniesione bezpośrednio na płytki mikroarray, a glikany przeciwciał są blokowane, aby zapobiec wiązaniu lektyn. Po naniesieniu próbek surowicy pacjenta, glikoproteiny z próbki są wychwytywane przez przeciwciała. Następnie dodawane są biotynilowane białka wiążące glikany w celu wykrycia glikanów, a następnie dodawany jest koniugowany z neutrawidyną detektor w celu znakowania biotynilowanych lektyn.Następnie przesuwa się lampkę z mikromacierzą w celu zeskanowania i wykrycia fluorescencji; analiza uzyskanych danych ujawnia profile glikozylacji białek z próbki. Technika ta posiada kilka zalet w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak HPLC. Metoda ta umożliwia wykrycie poszczególnych glikoprotein w ich stanie natywnym.Szybsze i łatwiejsze jest jednoczesne badanie zmian w glikozylacji wielu białek. Stwierdziliśmy, że biomarkery chorób, w szczególności nowotworów i raka wątroby, które analizowaliśmy najdokładniej, są często glikozylowane. Zauważyliśmy również, że zdolność do wykrywania specyficznych glikoform znacznie poprawia skuteczność biomarkerów w zakresie ich czułości i swoistości.W związku z tym pomiar ten może dostarczyć informacji o zmianach w glikozylacji wielu białek surowiczych w HCC. Może on zostać zastosowany również w badaniach patologicznych i poszukiwaniu biomarkerów w innych nowotworach i chorobach, takich jak rak trzustki, cukrzyca oraz choroba Alzheimera. Procedurę zademonstruje Chen Lu, technik z mojego laboratorium.Rozpocznij ten protokół od przygotowania mikroarray przeciwciał; najpierw w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 0,8 ml na lodzie rozcieńcz wszystkie przeciwciała, które będą wykorzystane do druku mikroarray, do stężenia 0,5 mg/ml w minimum 40 ml PBS. W tym przypadku jako kontrola pozytywna zostanie wykorzystanych 26 różnych przeciwciał. Przygotuj również taką samą ilość biotynilowanego BSA w PBS o stężeniu 0,5 mg/ml. Za pomocą pipety odmierz 40 ml każdego przeciwciała do płyty źródłowej z 384 dołkami na lodzie.Następnie w oprogramowaniu sterującym mikroarray wyznacz położenie każdego przeciwciała. Potem załaduj płytkę na urządzenie do mikroarray jako źródło. Następnie załaduj 20 szkiełek mikroarray do tkanek na urządzenie do mikroarray jako cel.Skonfiguruj mikroarray tak, aby wydrukować 48 identycznych macierzy cząstkowych, w których 27 przeciwciał i białek kontrolnych jest nanoszonych w trzech powtórzeniach w układzie dziewięć na dziewięć. Uruchom proces drukowania szkiełek do mikroarray przeciwciał. Zbierz szkiełka z mikroarray przeciwciał i przechowuj je w kasecie na szkiełka z osuszaczem.Zamknij kasetę w plastikowej torebce, aby zapobiec denaturacji białek oraz osadzaniu się wilgoci na szkiełkach podczas przechowywania. Przechowuj szczelnie zamknięte szkiełka z mikromacierzami w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza do momentu ich użycia. Najtrudniejszym i najważniejszym elementem całej procedury jest etap blokowania chemicznego.Aby zapewnić sukces, krytyczne jest naniesienie odpowiedniej ilości przeciwciał na podłoże mikroarray. Zawsze należy przygotować świeży roztwór jodku sodu i kwasu azotowego bezpośrednio przed eksperymentem. Należy również pamiętać, aby przeprowadzić procedurę utleniania w temperaturze 4 °C, unikając ekspozycji na światło.Wyjmij preparaty mikroarray z lodówki i pozostaw je na 30 minut w temperaturze pokojowej w celu wyrównania temperatury. Wyjmij jeden preparat z pudełka do przechowywania. Zanurz go na krótko w naczyniu z roztworem PBS z dodatkiem 0,1% tween 20.Następnie zanurz preparat w 15 mM buforze octanu sodu z dodatkiem 0,1% tweeny na 10 minut. W kolejnym kroku przygotuj świeży roztwór 150 mM nadwęglanu sodu w 15 mM buforze octanu sodu i przelej go do kuwety do płukania preparatów. Przechowuj w lodówce, chroniąc przed światłem do momentu użycia. Wyjmij preparat z buforu octanu sodu i umieść go w kuwecie zawierającej świeży nadwęglan sodu, stroną z przeciwciałami skierowaną do góry.Przykryć kuwetę folią aluminiową, aby zapobiec dostępowi światła. Następnie umieścić kuwetę z preparatem w temperaturze 4 °C przy łagodnym wstrząsaniu przez dwie godziny. Wyjąć preparat z kuwety i krótko wypłukać go w buforze octanu sodu trzykrotnie przez pięć minut.Inkubować preparat na szkiełku w 300 ml świeżo przygotowanego 10 mM roztworu blokującego kwasu glutaminowego w komorze inkubacyjnej przez dwie godziny w temperaturze pokojowej przy łagodnym wstrząsaniu. Wyjąć szkiełka z komory i przemyć je PBS z 0,1% tween przez trzy minuty. Następnie, w kuwecie do mycia szkiełek, inkubować szkiełko z mikroarray w 300 ml 1% BSA w PBS z 0,5% tween przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym wstrząsaniu.Przepłucz preparaty w PBS z 0,1% tween trzy razy przez trzy minuty. Umieść preparat na statywie do slajdów i wiruj z prędkością 1 200 ×g przez dwie minuty, aby osuszyć slajd z mikromacierzą. W celu oddzielenia poszczególnych podmacierzy na slajdzie odciskano siatkę woskową.Po wstępnym podgrzaniu urządzenia do odcisków woskowych w temperaturze 70 °C przez pięć minut, należy umieścić zablokowane slajd mikromacierzy w urządzeniu stroną z przeciwciałami skierowaną w stronę wosku. Delikatnie pociągnij za uchwyt, aby równomiernie odcisnąć wosk na slajdzie. Metodę tę można zastosować zarówno do przeprowadzania analiz profilowania glikanów dla pojedynczej próbki, jak i do pomiaru pojedynczego epitopu glikanowego w wielu próbkach.W niniejszym materiale zaprezentujemy analizy profilowania glikowego. Należy rozpocząć od rozcieńczenia 40 µL surowicy w 360 µL buforu PBS zawierającego 0,1% tween 20, 0,1% bridge 35 oraz po 100 µg/mL IgG mysiego, szczurzego, króliczego, koziego i osiołkowego. Taka objętość jest wystarczająca do naniesienia 6 µL roztworu rozcieńczonej surowicy na każdą podmacierz.Ostrożnie nanieś 6 µL rozcieńczonej próbki lub kontroli na każdy podzespół matrycy na szkiełku. Inkubuj szkiełko w zwilżonej kasecie z mokrymi ręcznikami papierowymi w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Przepłucz szkiełko trzykrotnie przez trzy minuty w PBS z 0,1% tween.Następnie wysusz preparat, wirując go z prędkością 1200 ×g przez dwie minuty. W probówce mikroodśrodkowej o pojemności 0,8 ml na lodzie przygotuj 20 µL biotynilowanych białek wiążących glikany w stężeniu 10 mg/mL w PBS tween. Nanieś 6 µL rozcieńczonych biotynilowanych lektyn na każdy podzespół macierzy na szkiełku i inkubuj w nawilżonej kasecie do szkiełek z mokrymi ręcznikami papierowymi w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Po trzykrotnym wypłukaniu preparatów w PBS z 0,1% tween, analogicznie jak poprzednio, osusz preparat poprzez wirowanie w wirówce przy 1200 ×g przez dwie minuty. W probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,8 ml na lodzie przygotuj 400 µL neutravain znakowanego DITE 5 49 w stężeniu 10 mg/mL w PBS z 0,1% tween. Za pomocą pipety wielokrotnej nanieś 6 µL neutravain znakowanego DITE 5 49 na każdą macierz i inkubuj preparat w nawilżonej kasecie do szkiełek w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę po inkubacji.Płucz preparat trzy razy przez trzy minuty w PBS z 0,1% tween. Osusz preparat, wirując go w wirówce przy 1200 ×g przez dwie minuty. Zeskanuj preparat za pomocą fluorescencyjnego skanera mikromacierzy z rozdzielczością 10 millimeter.Ustawienia lasera i PMT powinny być tak wysokie, jak to możliwe, przy jednoczesnym zapewnieniu braku nasycenia sygnału. Otwórz obraz w programie array Pro 3.2. Skonfiguruj szablon macierzy zgodnie z mapą macierzy wskazującą położenie plamek przeciwciał.Należy starannie dopasować każdy okrąg szablonu do odpowiadającej mu plamki na obrazie, a następnie wyeksportować intensywność każdej plamki do pliku Excel w celu przeprowadzenia dalszej analizy. Mikromacierze przeciwciał zawierające 48 identycznych podmacierzy z 26 przeciwciałami przeciwko 20 glikoprotein serum oraz streptawidynie i BSA zostały zaprojektowane i wykonane zgodnie z opisem w tym filmie, aby zbadać znaczenie procedury blokowania.W analizie profilowania glikoprotein przygotowano dwa identyczne szkiełka do mikromacierzy. Jedno z nich nie zostało zablokowane chemicznie, natomiast drugie tak. Próbkę kontrolną nanieśli na macierze podłoża w kolumnach pierwszej i trzeciej, a połączoną próbkę surowicy HCC nanieśli na macierze podłoża w kolumnach drugiej i czwartej.Następnie na każdą podmacierz naniesiono biotynilowane lektyny specyficzne dla różnych glikanów, co przedstawiono na obrazach podmacierzy. Lektyny związały się z przeciwciałami przechwytującymi w kolumnach kontrolnych, co spowodowało wysokie tło, nierozróżnialne od kolumn z naniesionym surowicą w mikrotablicach nieblokowanych. Jednakże, gdy ten sam eksperyment przeprowadzono na chemicznie blokowanej płytce mikrotablicy przeciwciał, w kolumnach kontrolnych nie odnotowano wiązania lub było ono bardzo niskie, natomiast w kolumnach z naniesionym surowicą zaobserwowano wysokie wiązanie antygenów.Wyniki te dowodzą, że procedura blokowania chemicznego jest krytycznym etapem pomiaru glikanów w glikoproteinach wychwyconych przez przeciwciała. Po opanowaniu protokołu możliwe jest uzyskanie profili glikozylacji 22 glikoprotein w surowicy z HCC. Technika ta może zostać przeprowadzona w ciągu ośmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Przeciwciała po modyfikacji mogą utracić powinowactwo do swoich antygenów oraz inne właściwości.Warto zatem o tym pamiętać i stosować kilka różnych przeciwciał z różnych źródeł podczas wykonywania tej procedury. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy zmiana glikozylacji wynika ze zmiany poziomu ekspresji białek, czy wyłącznie z samej zmiany glikozylacji każdego poszczególnego białka, można przeprowadzić dodatkowe pomiary, np. oznaczanie stężenia każdego białka z wykorzystaniem tej samej płytki do mikroanalizy. Należy pamiętać, że praca z próbkami surowicy zawierającymi patogeny może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak rękawice ochronne.

chemically-blocked-antibody-microarray-for-multiplexed-high

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroarray przeciwciał chemicznie zablokowanych do wielokrotnego profilowania wysokoprężności specyficznej glikozylacji białek w złożonych próbkach

Ten film demonstruje technologię drukowanej macierzy glikanowej do analizy krążących przeciwciał anty-glikanowych w surowicy myszy. Przeciwciała w surowicy oddziałują ze specyficznymi glikanami na chipie, co potwierdza się za pomocą barwienia immunologicznego, a następnie skanowania fluorescencyjnego.

Wykrywanie krążących przeciwciał anty-glikanowych za pomocą drukowanej matrycy glikanów

Ten film demonstruje technikę, która wykorzystuje technologię mikromacierzy peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał rozpoznających modyfikacje potranslacyjne (PTM) na peptydach histonowych. Szkiełko mikromacierzy zawierające unieruchomione peptydy histonowe sprzężone z fluoroforem ze znanymi kombinacjami PTM poddaje się działaniu docelowych przeciwciał specyficznych dla PTM. Proces ten pomaga zidentyfikować swoistość przeciwciała dla celu i jego potencjalną reaktywność krzyżową z...

Technologia mikromacierzy peptydowych do profilowania swoistości przeciwciał

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Ten protokół opisuje wytwarzanie wielkoskalowego, multipleksowanego dwuwymiarowego DNA lub matrycy przeciwciał, z potencjalnymi zastosowaniami w badaniach nad sygnalizacją komórkową i wykrywaniem biomarkerów.

Wytwarzanie mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi o dużej gęstości pod kontrolą przepływu

Modułowe podejście do syntezy N-glikanów do dołączania do szkiełka pokrytego tlenkiem glinu (ACG) jako mikromatrycy glikanowej zostało opracowane i zademonstrowano jego zastosowanie do profilowania przeciwciała neutralizującego wirusa HIV.

Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

Test mikromacierzy sialoglycan może być używany do oceny przeciwciał anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich, co czyni go potencjalnym wysokoprzepustowym testem diagnostycznym dla raka i innych przewlekłych chorób ludzkich, w których pośredniczy stan zapalny.

Profilowanie IgG anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich za pomocą testu mikromacierzy sialoglikanu

Ta praca pokazuje potencjał technologii drukowanych tablic glikanowych (PGA) do analizy krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt.

Drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Opisano szczegółowy protokół oczyszczania i późniejszej analizy przeciwciała monoklonalnego z pobranego płynu do hodowli komórek (HCCF) zautomatyzowanych mikrobioreaktorów. Przedstawiono również wykorzystanie analiz do określenia krytycznych atrybutów jakości (CQA) i maksymalizacji ograniczonej objętości próbki w celu wyodrębnienia istotnych informacji.

Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora

Profilowanie polimerów w mikromatrycach (MAPP) to wysokoprzepustowa technika analizy składu glikanów w próbkach biologicznych.

Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną przez glikomikę, zintegrowaną technologię omiczną, która oferuje wszechstronny wgląd w heterogeniczny glikoproteom w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych, niezbędny do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

Poznaj metodę profilowania glikozylacji białek w surowicy pacjenta z rakiem wątroby za pomocą chemicznie blokowanej mikromacierzy przeciwciał. Technika ta umożliwia szybką i ekonomiczną analizę glikoprotein w ich natywnym stanie.

Chemicznie blokowana mikromacierz przeciwciał do multipleksowanego profilowania wysokoprzepustowego specyficznej glikozylacji białek w złożonych próbkach (Wideo) | JoVE Journal

Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

Przeglądaj więcej filmów