Name: Wyznaczanie przebiegu czasowego klirensu glutaminianu za pomocą analizy dekonwolucyjnej prądów transporterowych astrocytarnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj metodę analizy dekonwolucyjnej prądów transporterowych astrocytarnych do wyznaczania przebiegu czasowego klirensu glutaminianu w hipokampusie myszy. Technika ta pozwala badać dynamikę neuroprzekaźnika z wysoką rozdzielczością czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institute of Neurological Disorders and Stroke Intramural Research Program (NS002986). AS napisał manuskrypt i przeprowadził analizę dekonwolucyjną. JSD opracowało wstępną wersję analizy dekonwolucyjnej i skomentowało tekst.

<ol><li>Ventura, R., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+relationships+between+hippocampal+synapses+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes.</a> J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).</li>
<li>Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+perisynaptic+astroglia+during+synaptogenesis+in+the+mature+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus.</a> Glia. 55, 13-23 (2007).</li>
<li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li>
<li>Herman, M. A., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+glutamate+concentration+in+hippocampal+slice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice.</a> J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).</li>
<li>Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+independent+hippocampal+synapses+is+controlled+by+glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake.</a> Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).</li>
<li>Barbour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+synapse+independence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An evaluation of synapse independence.</a> J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).</li>
<li>Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrasynaptic+glutamate+diffusion+in+the+hippocampus%3A+ultrastructural+constraints%2C+uptake%2C+and+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation.</a> J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).</li>
<li>Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flux+coupling+in+a+neuronal+glutamate+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flux coupling in a neuronal glutamate transporter.</a> Nature. 383, 634-637 (1038).</li>
<li>Eliasof, S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+cell+glutamate+transporter+is+coupled+to+an+anionic+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).</li>
<li>Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+fluxes+associated+with+excitatory+amino+acid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport.</a> Neuron. 15, 721-728 (1995).</li>
<li>Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+and+microscopic+properties+of+a+cloned+glutamate+transporter%2Fchloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel.</a> J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).</li>
<li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activation+of+glutamate+transporters+in+hippocampal+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes.</a> Neuron. 19, 1297-1308 (1997).</li>
<li>Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+the+glutamate+clearance+time+course+from+transporter+currents+in+CA1+hippocampal+astrocytes%3A+transmitter+uptake+gets+faster+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development.</a> J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).</li>
<li>Scimemi, A., Tian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+transporters+regulate+glutamate+clearance%2C+NMDA+receptor+activation%2C+and+synaptic+plasticity+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).</li>
<li>Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+enhances+glutamate+uptake+via+glutamate+transporters+in+rat+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells.</a> Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).</li>
<li>Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrogenic+uptake+of+glutamate+and+aspartate+into+glial+cells+isolated+from+the+salamander+%28Ambystoma%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina.</a> J. Physiol. 436, 169-193 (1991).</li>
<li>Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+coupled+and+uncoupled+currents+during+glutamate+uptake+by+GLT-1+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters.</a> J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).</li>
<li>Diamond, J. S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+does+not+overwhelm+transporters+on+hippocampal+astrocytes+during+high-frequency+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation.</a> J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).</li>
<li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+glutamate+transporter+dynamics+in+developing+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes.</a> Glia. 60, 175-188 (2012).</li>
<li>Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+synaptic+glutamate+spillover+and+reuptake+by+linker+optimized+glutamate-sensitive+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).</li>
<li>Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid%CE%B21-42+slows+clearance+of+synaptically-released+glutamate+by+mislocalizing+astrocytic+GLT-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1.</a> J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W tym miejscu opisujemy eksperymentalne podejście do uzyskiwania zapisów elektrofizjologicznych z astrocytów, protokół analityczny do izolowania prądów transportera glutaminianu w astrocytach oraz metodę matematyczną do wyznaczania przebiegu czasowego klirensu glutaminianu z prądów transportera astrocytarnego.
Powodzenie analizy zależy od możliwości uzyskania wysokiej jakości nagrań z astrocytów oraz od dokładności algorytmów dopasowania używanych do opisu prądów transporterowych. Analiza deko...

Astrocyty to jeden z najliczniejszych typów komórek w mózgu, o gwiaździstej morfologii i drobnych wypukłościach błony, które rozciągają się przez cały neuropil i docierają do sąsiednich kontaktów synaptycznych 1,2. Błona komórkowa astrocytów jest gęsto upakowana cząsteczkami transportera glutaminianu 3. W warunkach fizjologicznych transportery glutaminianu szybko wiążą glutaminian po zewnątrzkomórkowej stronie błony i przenoszą go do cytoplazmy komórki. W ten sposób transportery utrzymują niskie podstawowe stężenie glutaminianu w przestrzeni zewnątrzkomórkowej 4. Transportery glutaminianu w drobnych procesach astrocytarnych sąsiadujących z synapsami pobudzającymi są idealnie ustawione do wiązania glutaminianu uwalnianego podczas zdarzeń synaptycznych, gdy dyfunduje on ze szczeliny synaptycznej. W ten sposób transportery ograniczają również rozlewanie się glutaminianu w kierunku regionów około- i pozasynaptycznych oraz do sąsiednich synaps, zmniejszając przestrzenne rozprzestrzenianie się sygnałów pobudzających w mózgu 5-7.
Transport glutaminianu to proces elektrogeniczny sprzężony stechiometrycznie z ruchem 3 Na+ i 1 H+ wzdłuż ich gradientu elektrochemicznego oraz z przeciwtransportem 1 K+ 8. Transport glutaminianu jest związany (ale nie jest z nim sprzężony stechiometrycznie) (ale nie jest z nim sprzężony) anionowy przewodność przepuszczalna dla SCN- (tiocyjanianu) > NO3- (azotan) ≈ ClO4- (nadchloran) > I- > Br- > Cl- > F-, nie do CH3 SO3- (sulfonian metanu) i C6H11O7- (glukonian) 9-11. Oba prądy (stechiometryczny i niestechiometryczny) można zarejestrować, uzyskując zapisy całokomórkowe z astrocytów, wizualnie zidentyfikowane w świetle Dodt lub kontraście różnicowym interferencji podczerwieni (IR-DIC) w ostrych wycinkach mózgu 12. Składowa stechiometryczna prądu związanego z transportem glutaminianu przez błonę może być izolowana za pomocą roztworów wewnątrzkomórkowych na bazieCH3, SO, lub C, 6, H, 11,O7 i może być wywoływana przez błyskawiczne uwalnianie glutaminianu na astrocytach 13,14 lub przez aktywację uwalniania glutaminianu z sąsiednich synaps, elektrycznie 12 lub z ukierunkowaną kontrolą optogenetyczną.
Przebieg czasowy stechiometrycznej składowej prądu transportera jest kształtowany przez czas życia profilu stężenia glutaminianu na błonach astrocytarnych (tj. klirens glutaminianu), kinetykę transporterów glutaminianu, pasywne właściwości błony astrocytów, a podczas stymulacji synaptycznej przez synchroniczność uwalniania glutaminianu przez aktywowane synapsy 13. Tutaj opisujemy szczegółowo: (1) eksperymentalne podejście do izolowania stechiometrycznej składowej prądów transportera glutaminianu z zapisów całokomórkowych patch-clamp z astrocytów przy użyciu ostrych mysich wycinków hipokampa jako przykładowego preparatu eksperymentalnego; (2) Analityczne podejście do wyprowadzenia przebiegu czasowego klirensu glutaminianu z tych zapisów 13,14. Metody te mogą być używane do rejestrowania i analizowania prądów transportujących glutaminian z astrocytów w dowolnym regionie ośrodkowego układu nerwowego.

<table><tbody><tr><td>CGP52432</td><td>Tocris</td><td>1246</td><td></td></tr><tr><td>(R,S)-CPP</td><td>Tocris</td><td>173</td><td></td></tr><tr><td>DPCPX</td><td>Tocris</td><td>439</td><td></td></tr><tr><td>LY341495 sól disodowa</td><td>Tocris</td><td>4062</td><td></td></tr><tr><td>MSOP</td><td>Tocris</td><td>803</td><td></td></tr><tr><td>NBQX sól disodowa</td><td>Tocris</td><td>1044</td><td></td></tr><tr><td>D,L-TBOA</td><td>Tocis</td><td>1223</td><td></td></tr><tr><td>Pikrotoksyna</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>MNI-L-glutaminian</td><td>Tocris</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A10438</td><td>Opcjonalne</td></tr><tr><td>elektrody matrycowe</td><td>Frederick Haer Company</td><td>MX21AES(JD3)</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>World Precision Instruments</td><td>PG10165-4</td><td></td></tr><tr><td>Dwustopniowy szklany ściągacz do mikropipet</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 404 klej błyskawiczny</td><td>Ted Pella</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>Lampa Xe</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>FlashMic</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wyznaczanie przebiegu czasowego klirensu glutaminianu za pomocą analizy dekonwolucyjnej prądów transporterowych astrocytarnych

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Największe zagęszczenie transporterów glutaminianu w mózgu znajduje się w astrocytach. Transportery glutaminianu sprzężają ruch glutaminianu przez błonę z kotransportem 3 Na+ i 1 H+ oraz przeciwtransportem 1 K+. Prąd stechiometryczny generowany w procesie transportu może być monitorowany za pomocą zapisów z astrocytów z całych komórek. Przebieg czasowy rejestrowanego prądu jest kształtowany przez przebieg czasowy profilu stężenia glutaminianu, na który narażone są astrocyty, kinetykę transporterów glutaminianu oraz pasywne właściwości elektrotoniczne błon astrocytowych. W tym miejscu opisujemy metody eksperymentalne i analityczne, które można wykorzystać do rejestrowania prądów transportera glutaminianu w astrocytach i izolowania przebiegu w czasie klirensu glutaminianu od wszystkich innych czynników kształtujących przebieg prądów transportera astrocytarnego. Opisane tutaj metody można wykorzystać do oszacowania czasu życia glutaminianu uwalnianego w mgnieniu oka i uwalnianego synaptycznie na błonach astrocytarnych w dowolnym regionie ośrodkowego układu nerwowego podczas zdrowia i choroby.

Sukces opisanego tutaj podejścia analitycznego zależy w sposób krytyczny od uzyskania wysokiej jakości zapisów elektrofizjologicznych prądów transporterowych z astrocytów w dowolnym regionie ośrodkowego układu nerwowego. W ostrych skrawkach hipokampa myszy astrocyty można łatwo zidentyfikować przy użyciu oświetlenia Dodt lub IR-DIC ze względu na ich małe ciało komórki (Ø = 10 μm) i wyraźne jądro (Rysunek 1). Ich charakterystyczna, gwiaździsta morfologia jest widoczna w mikroskopii epifluorescencyjnej, ko...

Opisujemy metodę analityczną do szacowania czasu życia glutaminianu na błonach astrocytarnych na podstawie elektrofizjologicznych zapisów prądów transportera glutaminianu w astrocytach.

Wyznaczanie przebiegu czasowego klirensu glutaminianu za pomocą analizy dekonwolucyjnej prądów transporterowych astrocytarnych

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Ogólnym celem eksperymentu jest oszacowanie przebiegu czasowego usuwania glutaminianu z błon astrocytów po jego uwolnieniu z synaps pobudzających. Pierwszym krokiem w tym procesie jest rejestracja synaptycznie aktywowanego transportu glutaminianu w astrocytach w ostrych skrawkach mózgu w obecności i nieobecności subsaturującej stężenia szerokospektrowego antagonisty transporterów glutaminianu, TBOA. Drugim krokiem jest analiza zapisów w celu wyizolowania prądów synaptycznie aktywowanego transportera glutaminianu z pozostałych komponentów odpowiedzi wywołanej.Następnie szacuje się przebieg czasowy filtracji poprzez analizę prądów transporterowych zarejestrowanych w obecności TBOA, odejmując prądy filtrujące od zjawiska transportu zarejestrowanego w warunkach kontrolnych. W ten sposób uzyskuje się przebieg czasowy usuwania glutaminianu z błon astrocytarnych. Wyniki pokazują, że w hipokampie myszy astrocyty potrzebują zaledwie kilku milisekund, aby usunąć synaptycznie uwolniony glutaminian z przestrzeni zewnątrzkomórkowej.Podejście to stanowi czułe narzędzie do wykrywania zmian w zdolności astrocytów do wychwytu w różnych obszarach mózgu w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Główną zaletą tej metody w porównaniu z innymi metodami opartymi na przykład na analizie przemieszczania szybko dysocjujących antagonistów receptorów glutaminianu w fluorescencyjnych wskaźnikach glutaminianu lub na komputerowych symulacjach reakcji dyfuzyjnych jest zapewnienie wysokiej rozdzielczości czasowej oraz bezpośredniego eksperymentalnego odczytu klirensu glutaminianu z astrocytów. Metoda ta pozwala zrozumieć dynamikę przestrzenną i czasową przekaźnictwa synaptycznego w mózgu.Może to pomóc w interpretacji zmian patofizjologicznych w zakresie poziomu glutaminianu, jego dyfuzji i wychwytu, które mogą występować w określonych schorzeniach neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera. Rozpocznij tę procedurę, wykonując skalpelem pięć nacięć na wypreparowanym mózgu myszy. Najpierw usuń opary węchowe oraz korę czołową.Po drugie, należy usunąć móżdżek. Następnie usuwa się lewy i prawy płat skroniowy. Potem rozdziela się obie półkule mózgu za pomocą cięcia strzałkowego w linii środkowej.Następnie przyklej powierzchnię boczną każdego przekroju mózgu do zimnej płyty podstawy wibratomu. Strona grzbietowa mózgu powinna być skierowana w stronę ostrza wibratomu, a strona brzuszna powinna stykać się z blokiem agaru, z dala od ostrza wibratomu. Następnie przymocuj płytę podstawy wibratomu do komory sekcyjnej.Ustaw grubość skrawka na 250 micrometers i wyreguluj szerokość ostrza przed rozpoczęciem krojenia. Po przejściu ostrza przez korę oraz hipokamp, użyj skalpela, aby oddzielić korę i hipokamp od śródmózgowia. Następnie, po utrzymywaniu skrawków w temperaturze 34 degrees Celsius przez 30 minut, umieść skrawka w komorze zanurzeniowej w temperaturze 34 degrees Celsius.Pozostawić je do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 30 minut przed użyciem do rejestracji elektrofizjologicznych w tej procedurze, a następnie przenieść skrawek do komory rejestracyjnej. Dokonać wizualnej inspekcji skrawka pod oświetleniem punktowym lub I-R-D-I-C. Astrocyty można zidentyfikować po niewielkim ciele komórkowym i wyraźnym jądrze do stymulacji synaptycznej.Umieść bipolarną elektrodę ze stali nierdzewnej w odległości około 100 µm od astrocytu, który planujesz poddać rejestracji. Wykonaj patch astrocytu i przejdź do konfiguracji whole-cell poprzez zastosowanie bardzo delikatnego ssania. Następnie naprzemiennie stosuj bodźce pojedyncze i sparowane co 10 do 20 sekund, aby wyizolować ułatwione części występowania transportu aktywowanego synaptycznie.Najpierw oblicz średnią z co najmniej 20 prób uzyskanych przy stymulacjach parzystych w warunkach kontrolnych oraz w obecności 10 µM szerokospektrowego antagonisty transporterów glutaminianu (TBOA). Następnie oblicz średnią z identycznej liczby prób uzyskanych przy stymulacjach pojedynczych w warunkach kontrolnych oraz w obecności 10 µM TBOA. Od średniego śladu uzyskanego przy stymulacjach parzystych odejmij średni ślad uzyskany przy stymulacjach pojedynczych. Krok ten pozwala na wyizolowanie geometrycznej STO oraz podtrzymującego prądu potasowego wywołanego przez drugi bodziec.W następnym kroku średni ślad uzyskany przy pojedynczych stymulacjach przesunięto w czasie o interwał odpowiadający interwałowi PUL zastosowanemu przy impulsach parowanych, a następnie odśrednioną odpowiedź na drugi bodziec, uzyskaną wcześniej, odjęto od tej przesuniętej w czasie średniej odpowiedzi uzyskanej przy pojedynczych stymulacjach. Krok ten izoluje część ułatwioną prądu transporterowego wywołanego przez drugi bodziec. W większości przypadków etap ten całkowicie usuwa trwały prąd potasowy.W takim przypadku izolacja FSTC jest zakończona i można przystąpić do analizy dekonwolucyjnej, aby wyznaczyć przebieg czasowy usuwania glutaminianu przez astrocyty. W niektórych przypadkach jednak nadal występuje niewielki, utrzymujący się prąd potasowy, co wymaga dalszej analizy. Należy zmierzyć amplitudę utrzymującego się prądu potasowego pozostałego po wykonaniu procedury.Analiza opisana wcześniej skaluje amplitudę funkcji monoeksponencjalnej do amplitudy resztkowego podtrzymującego prądu potasowego, przyjmując amplitudę zmierzonego podtrzymującego prądu potasowego jako wartość a w tym równaniu. Jednak stała czasu narastania reprezentuje średnią wartość narastania oszacowaną w oddzielnych eksperymentach, w których wyizolowano podtrzymujący prąd potasowy. Farmakologicznie, przy użyciu wysokiego stężenia nasycającego TBOA, następnie odjęto wynikającą funkcję monoeksponencjalną od FSTC oraz podtrzymującego prądu potasowego.Aby zakończyć izolację FSTC. W celu wyizolowania zjawiska transportu aktywowanego błyskiem światła. Wyciągnij średnią z co najmniej 20 pomiarów uzyskanych przy otwartej drodze optycznej w warunkach kontrolnych oraz w obecności 10 micromolar TBOA, a następnie wyciągnij średnią z tej samej liczby pomiarów uzyskanych przy zamkniętej drodze optycznej w warunkach kontrolnych oraz w obecności 10 micromolar TBOA; od średniego śladu uzyskanego przy otwartej drodze optycznej odejmij średni ślad uzyskany przy zablokowanej drodze optycznej.Krok ten pozwala na usunięcie artefaktu stymulacji i wyizolowanie FTC. Na tym etapie dopasowuje się prąd transportowy, albo FSTC, albo FTC zarejestrowany w warunkach kontrolnych oraz w obecności 10 µM TBOA, wykorzystując funkcję wielowykładniczą. Tworzy się funkcję gwałtownie rosnącą, która zanika mono-wykładniczo zgodnie z tą funkcją i która najlepiej opisuje fazę zaniku prądu transportera zarejestrowanego przy 10 µM TBOA. Następnie wykonuje się splot funkcji mono-wykładniczej z dopasowania prądu transportera zarejestrowanego w 10 µM TBOA, aby wyprowadzić filtr. Następnie stosuje się splot filtra z dopasowaniem prądu transportera w warunkach kontrolnych.Aby uzyskać ilościową ocenę całkowitego przebiegu czasowego usuwania glutaminianu, należy obliczyć OID przebiegu podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest potwierdzenie, że zdarzenia transportu są rejestrowane w warunkach eksperymentalnych, w których filtr pracuje w reżimie liniowym i wprowadza jedynie liniowe zniekształcenia transportu. Prąd fali można zweryfikować poprzez sprawdzenie manipulacji zmieniających wielkość prądu transportu.Nie zmieniaj przebiegu stemplowania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania rejestracji astrocytów do pozyskiwania informacji o glutaminianie, dyfuzji i wychwycie w mózgu.

deriving-time-course-glutamate-clearance-with-deconvolution-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Określanie przebiegu czasowego likwidacji glutaminianu za pomocą analizy dekonwolucja prądów transportera astrocytów

Opisujemy sposób pomiaru dynamiki wapnia wewnątrzkomórkowego w pobliżu błony oraz w całej objętości komórki w hodowlach astrocytów, wykorzystując mikroskopię całkowitego wewnętrznego odbicia oraz epifluorescencyjną.

Pomiar dynamiki wapnia w pobliżu błony plazmatycznej oraz w całej przestrzeni wewnątrzkomórkowej astrocytów

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Ten film demonstruje ocenę uwalniania i usuwania glutaminianu w pojedynczych synapsach korowo-prążkowych w wycinku mózgu myszy. Stymulacja elektryczna ułatwia uwalnianie glutaminianu w synapsie. Uwolniony glutaminian zmienia fluorescencję białka czujnika, która zanika z czasem, wskazując na skuteczność uwalniania i klirensu.

Analiza uwalniania i klirensu glutaminianu w pojedynczej synapsie neuronu w wycinku mózgu myszy

Tutaj opisujemy adaptację protokołów używanych do indukowania plastyczności homeostatycznej w neuronach do badania plastyczności receptorów sprzężonych z białkiem G astrocytów. Metoda ta, ostatnio wykorzystana do badania zmian w mGluR grupy astrocytarnej I u młodych myszy, może być stosowana do pomiaru skalowania różnych astrocytarnych GPCR w tkance dorosłych myszy in situ i in vivo oraz do lepszego zrozumienia wrażliwości receptorów astrocytarnych na zmiany aktywności neuronalnej.

Indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów

Tutaj opisujemy konfigurację, nawigację po oprogramowaniu i analizę danych dla przestrzennie i czasowo precyzyjnej metody pomiaru tonicznych i fazowych zmian zewnątrzkomórkowego glutaminianu in vivo za pomocą układów mikroelektrod połączonych enzymami (MEA).

Wykorzystanie bioczujników opartych na enzymach do pomiaru toniku i glutaminianu fazowego w mysich modelach choroby Alzheimera

W tym raporcie przedstawiono dwie metody oparte na biotynylacji, przeznaczone do określania ekspresji na powierzchni komórki i szybkości endocytarnej białek wyrażanych na błonie plazmatycznej.

Określanie ekspresji białek na powierzchni komórki i szybkości endocytów w pierwotnych kulturach astrocytów za pomocą biotynylacji

Przedstawiamy protokół do oceny równowagi między uwalnianiem glutaminianu a klirensem w pojedynczych synapsach glutaminergicznym korowo-prążkowych w ostrych wycinkach od dorosłych myszy. Protokół ten wykorzystuje czujnik fluorescencyjny iGluu do wykrywania glutaminianu, kamerę sCMOS do akwizycji sygnału oraz urządzenie do ogniskowego oświetlenia laserowego.

Wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą Huntingtona

Tutaj opisujemy metodę obrazowania na żywo in vitro, która umożliwia wizualizację wewnątrzkomórkowego transportu organelli i transportu białek błony komórkowej w mysich astrocytach. W protokole tym przedstawiono również metodologię analizy obrazu w celu wyznaczenia tras transportu i kinetyki transportu ładunków.

Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach

Ten protokół zapewnia zintegrowaną metodę, która obejmuje dostarczenie wirusowe, implantację optrodu, indukcję fototrombotyczną, jednoczesne rejestrowanie aktywności astrocytów i neuronów oraz optogenetyczną stymulację astrocytów. Ta zintegrowana metoda ma na celu zapewnienie jednoczesnego badania relacji astrocyt-neuron na wszystkich etapach przewlekłych udaru niedokrwiennego.

Zintegrowana metoda modelowania udaru fototrombotycego i in vivo rejestracji optrodem aktywności neuronowej i astrocytów u myszy wykonujących zachowania

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół elektroporacji in utero kory mózgowia oraz hipokampa u myszy w stadium E14.5. Wykazujemy również, że jest to cenna metoda badania dendrytów i kolców dendrytycznych w tych dwóch obszarach mózgu.

Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgu i hipokampie myszy z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Poznaj metodę analizy dekonwolucyjnej prądów transporterowych astrocytarnych do wyznaczania przebiegu czasowego klirensu glutaminianu w hipokampusie myszy. Technika ta pozwala badać dynamikę neuroprzekaźnika z wysoką rozdzielczością czasową.

Wyznaczanie przebiegu czasowego klirensu glutaminianu za pomocą analizy dekonwolucyjnej prądów transporterowych astrocytarnych

Przeglądaj więcej filmów