Wyznaczanie przebiegu czasowego klirensu glutaminianu za pomocą analizy dekonwolucyjnej prądów transporterowych astrocytarnych

Ogólnym celem eksperymentu jest oszacowanie przebiegu czasowego usuwania glutaminianu z błon astrocytów po jego uwolnieniu z synaps pobudzających. Pierwszym krokiem w tym procesie jest rejestracja synaptycznie aktywowanego transportu glutaminianu w astrocytach w ostrych skrawkach mózgu w obecności i nieobecności subsaturującej stężenia szerokospektrowego antagonisty transporterów glutaminianu, TBOA. Drugim krokiem jest analiza zapisów w celu wyizolowania prądów synaptycznie aktywowanego transportera glutaminianu z pozostałych komponentów odpowiedzi wywołanej.

Następnie szacuje się przebieg czasowy filtracji poprzez analizę prądów transporterowych zarejestrowanych w obecności TBOA, odejmując prądy filtrujące od zjawiska transportu zarejestrowanego w warunkach kontrolnych. W ten sposób uzyskuje się przebieg czasowy usuwania glutaminianu z błon astrocytarnych. Wyniki pokazują, że w hipokampie myszy astrocyty potrzebują zaledwie kilku milisekund, aby usunąć synaptycznie uwolniony glutaminian z przestrzeni zewnątrzkomórkowej.

Podejście to stanowi czułe narzędzie do wykrywania zmian w zdolności astrocytów do wychwytu w różnych obszarach mózgu w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Główną zaletą tej metody w porównaniu z innymi metodami opartymi na przykład na analizie przemieszczania szybko dysocjujących antagonistów receptorów glutaminianu w fluorescencyjnych wskaźnikach glutaminianu lub na komputerowych symulacjach reakcji dyfuzyjnych jest zapewnienie wysokiej rozdzielczości czasowej oraz bezpośredniego eksperymentalnego odczytu klirensu glutaminianu z astrocytów. Metoda ta pozwala zrozumieć dynamikę przestrzenną i czasową przekaźnictwa synaptycznego w mózgu.

Może to pomóc w interpretacji zmian patofizjologicznych w zakresie poziomu glutaminianu, jego dyfuzji i wychwytu, które mogą występować w określonych schorzeniach neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera. Rozpocznij tę procedurę, wykonując skalpelem pięć nacięć na wypreparowanym mózgu myszy. Najpierw usuń opary węchowe oraz korę czołową.

Po drugie, należy usunąć móżdżek. Następnie usuwa się lewy i prawy płat skroniowy. Potem rozdziela się obie półkule mózgu za pomocą cięcia strzałkowego w linii środkowej.

Następnie przyklej powierzchnię boczną każdego przekroju mózgu do zimnej płyty podstawy wibratomu. Strona grzbietowa mózgu powinna być skierowana w stronę ostrza wibratomu, a strona brzuszna powinna stykać się z blokiem agaru, z dala od ostrza wibratomu. Następnie przymocuj płytę podstawy wibratomu do komory sekcyjnej.

Ustaw grubość skrawka na 250 micrometers i wyreguluj szerokość ostrza przed rozpoczęciem krojenia. Po przejściu ostrza przez korę oraz hipokamp, użyj skalpela, aby oddzielić korę i hipokamp od śródmózgowia. Następnie, po utrzymywaniu skrawków w temperaturze 34 degrees Celsius przez 30 minut, umieść skrawka w komorze zanurzeniowej w temperaturze 34 degrees Celsius.

Pozostawić je do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 30 minut przed użyciem do rejestracji elektrofizjologicznych w tej procedurze, a następnie przenieść skrawek do komory rejestracyjnej. Dokonać wizualnej inspekcji skrawka pod oświetleniem punktowym lub I-R-D-I-C. Astrocyty można zidentyfikować po niewielkim ciele komórkowym i wyraźnym jądrze do stymulacji synaptycznej.

Umieść bipolarną elektrodę ze stali nierdzewnej w odległości około 100 µm od astrocytu, który planujesz poddać rejestracji. Wykonaj patch astrocytu i przejdź do konfiguracji whole-cell poprzez zastosowanie bardzo delikatnego ssania. Następnie naprzemiennie stosuj bodźce pojedyncze i sparowane co 10 do 20 sekund, aby wyizolować ułatwione części występowania transportu aktywowanego synaptycznie.

Najpierw oblicz średnią z co najmniej 20 prób uzyskanych przy stymulacjach parzystych w warunkach kontrolnych oraz w obecności 10 µM szerokospektrowego antagonisty transporterów glutaminianu (TBOA). Następnie oblicz średnią z identycznej liczby prób uzyskanych przy stymulacjach pojedynczych w warunkach kontrolnych oraz w obecności 10 µM TBOA. Od średniego śladu uzyskanego przy stymulacjach parzystych odejmij średni ślad uzyskany przy stymulacjach pojedynczych. Krok ten pozwala na wyizolowanie geometrycznej STO oraz podtrzymującego prądu potasowego wywołanego przez drugi bodziec.

W następnym kroku średni ślad uzyskany przy pojedynczych stymulacjach przesunięto w czasie o interwał odpowiadający interwałowi PUL zastosowanemu przy impulsach parowanych, a następnie odśrednioną odpowiedź na drugi bodziec, uzyskaną wcześniej, odjęto od tej przesuniętej w czasie średniej odpowiedzi uzyskanej przy pojedynczych stymulacjach. Krok ten izoluje część ułatwioną prądu transporterowego wywołanego przez drugi bodziec. W większości przypadków etap ten całkowicie usuwa trwały prąd potasowy.

W takim przypadku izolacja FSTC jest zakończona i można przystąpić do analizy dekonwolucyjnej, aby wyznaczyć przebieg czasowy usuwania glutaminianu przez astrocyty. W niektórych przypadkach jednak nadal występuje niewielki, utrzymujący się prąd potasowy, co wymaga dalszej analizy. Należy zmierzyć amplitudę utrzymującego się prądu potasowego pozostałego po wykonaniu procedury.

Analiza opisana wcześniej skaluje amplitudę funkcji monoeksponencjalnej do amplitudy resztkowego podtrzymującego prądu potasowego, przyjmując amplitudę zmierzonego podtrzymującego prądu potasowego jako wartość a w tym równaniu. Jednak stała czasu narastania reprezentuje średnią wartość narastania oszacowaną w oddzielnych eksperymentach, w których wyizolowano podtrzymujący prąd potasowy. Farmakologicznie, przy użyciu wysokiego stężenia nasycającego TBOA, następnie odjęto wynikającą funkcję monoeksponencjalną od FSTC oraz podtrzymującego prądu potasowego.

Aby zakończyć izolację FSTC. W celu wyizolowania zjawiska transportu aktywowanego błyskiem światła. Wyciągnij średnią z co najmniej 20 pomiarów uzyskanych przy otwartej drodze optycznej w warunkach kontrolnych oraz w obecności 10 micromolar TBOA, a następnie wyciągnij średnią z tej samej liczby pomiarów uzyskanych przy zamkniętej drodze optycznej w warunkach kontrolnych oraz w obecności 10 micromolar TBOA; od średniego śladu uzyskanego przy otwartej drodze optycznej odejmij średni ślad uzyskany przy zablokowanej drodze optycznej.

Krok ten pozwala na usunięcie artefaktu stymulacji i wyizolowanie FTC. Na tym etapie dopasowuje się prąd transportowy, albo FSTC, albo FTC zarejestrowany w warunkach kontrolnych oraz w obecności 10 µM TBOA, wykorzystując funkcję wielowykładniczą. Tworzy się funkcję gwałtownie rosnącą, która zanika mono-wykładniczo zgodnie z tą funkcją i która najlepiej opisuje fazę zaniku prądu transportera zarejestrowanego przy 10 µM TBOA. Następnie wykonuje się splot funkcji mono-wykładniczej z dopasowania prądu transportera zarejestrowanego w 10 µM TBOA, aby wyprowadzić filtr. Następnie stosuje się splot filtra z dopasowaniem prądu transportera w warunkach kontrolnych.

Aby uzyskać ilościową ocenę całkowitego przebiegu czasowego usuwania glutaminianu, należy obliczyć OID przebiegu podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest potwierdzenie, że zdarzenia transportu są rejestrowane w warunkach eksperymentalnych, w których filtr pracuje w reżimie liniowym i wprowadza jedynie liniowe zniekształcenia transportu. Prąd fali można zweryfikować poprzez sprawdzenie manipulacji zmieniających wielkość prądu transportu.

Nie zmieniaj przebiegu stemplowania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania rejestracji astrocytów do pozyskiwania informacji o glutaminianie, dyfuzji i wychwycie w mózgu.