Wyznaczanie przebiegu czasowego klirensu glutaminianu za pomocą analizy dekonwolucyjnej prądów transporterowych astrocytarnych

Ogólnym celem eksperymentu jest oszacowanie przebiegu w czasie klirensu glutaminianu z błon astrocytarnych po jego uwolnieniu z synaps pobudzających. Pierwszym krokiem w tym procesie jest zarejestrowanie występowania synaptycznie aktywowanego transportu glutaminianu z astrocytów w ostrych wycinkach mózgu przy braku i obecności substurującego stężenia antagonisty transportera glutaminianu o szerokim spektrum działania, TBOA. Drugim krokiem jest analiza nagrań w celu wyizolowania synaptycznie aktywowanych prądów transportera glutaminianu od wszystkich innych składników wywołanej odpowiedzi.

Następnie szacuje się przebieg czasu filtra poprzez analizę prądów transportera zarejestrowanych w obecności TBOA przez de z udziałem filtra z wystąpienia transportu zarejestrowanego w warunkach kontrolowanych. Uzyskuje się przebieg czasowy klirensu glutaminianu z błon astrocytarnych. Wyniki pokazują, że w hipokampie myszy astrocyty potrzebują tylko kilku milisekund, aby usunąć synaptycznie uwolniony glutaminian z pozakomórkowej podstawy przestrzennej.

Podejście to zapewnia czułe narzędzie do wykrywania zmian w zdolności wychwytu astrocytarnego w różnych regionach mózgu w stanach fizjologicznych i patologicznych. Główną przewagą tego podejścia nad innymi metodami opartymi np. na analizie przemieszczeń szybko dysocjujących antagonistów receptora glutaminianu na fluorescencyjnych wskaźnikach glutaminianu lub na komputerowych symulacjach reakcji dyfuzji, jest to, że zapewnia ono wysoką rozdzielczość czasową, bezpośredni eksperymentalny odczyt klirensu glutaminianu z astrocytów. Metoda ta pozwala nam zrozumieć przestrzenną i czasową dynamikę transmisji synaptycznej w mózgu.

Może pomóc nam zinterpretować patofizjologiczne zmiany w glutaminianie, dyfuzji i wychwytzie, które mogą wystąpić w niektórych zaburzeniach neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera. Rozpocznij tę procedurę od wykonania skalpelem pięciu nacięć na wypreparowanym mózgu myszy. Najpierw usuń opuszki węchowe i korę czołową.

Po drugie, usuń móżdżek. Następnie usuń lewy i prawy płat skroniowy. Następnie oddziel dwie półkule mózgowe za pomocą środkowego cięcia strzałkowego.

Następnie przyklej boczną powierzchnię każdej sekcji mózgu do zimnej płyty podstawy vibram. Grzbietowa strona mózgu powinna być skierowana w stronę ostrza Vibram, a brzuszna strona mózgu powinna stykać się z blokiem agarowym z dala od ostrza vibrato. Następnie przymocuj płytę podstawy vibrato do komory preparacyjnej.

Ustaw grubość plastra na 250 mikrometrów i dostosuj szerokość ostrza przed krojeniem. Gdy ostrze przejdzie przez korę i hipokamp, użyj skalpela, aby przeciąć hipokamp kory mózgowia od śródmózgowia. Następnie umieść plasterek w komorze zanurzeniowej w temperaturze 34 stopni Celsjusza po trzymaniu plastrów w temperaturze 34 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej przez 30 minut przed użyciem ich do zapisów elektrofizjologicznych w tej procedurze, przenieś plasterek do komory nagrywającej. Sprawdź wzrokowo plasterek pod podświetleniem punktowym lub I-R-D-I-C. Astrocyty można rozpoznać po ich małym ciele komórkowym i wydatnym jądrze do stymulacji synaptycznej.

Umieść bipolarną elektrodę ze stali nierdzewnej w odległości około 100 mikrometrów od astrocytu, który planujesz załatać. Załataj astrocyt i rozbij całą konfigurację komórek, stosując bardzo delikatne odsysanie. Następnie naprzemiennie pojedyncze i sparowane bodźce co 10 do 20 sekund, aby wyizolować ułatwione części występowania transportu aktywowanego synaptycznie.

Najpierw uśrednić co najmniej 20 wymiatania uzyskanych z sparowanymi stymulacjami w kontrolowanych warunkach i w obecności 10 mikromolowych antagonistów transportera glutaminianu o szerokim spektrum działania. TBOA następnie uśrednia identyczną liczbę wymiatania uzyskaną przy pojedynczych stymulacjach w warunkach kontrolnych, a w 10 mikromolowych TBOA odejmuje średni ślad uzyskany przy pojedynczych stymulacjach od średniego śladu uzyskanego przy sparowanych stymulacjach. Ten krok pozwala na wyizolowanie geometrycznego STO i podtrzymywanego prądu potasowego wywołanego przez drugi bodziec.

Następna zmiana, średni ślad uzyskany przy pojedynczych stymulacjach przez przedział czasu, który odpowiada interwałowi PUL używanemu do dostarczania sparowanych impulsów, odejmuje przesuniętą w czasie, średnią odpowiedź uzyskaną przy pojedynczych stymulacjach od średniej odpowiedzi na drugi bodziec uzyskany wcześniej. Ten krok izoluje ułatwioną część prądu transportera wywołanego przez drugi bodziec. W większości przypadków ten krok całkowicie usuwa utrzymujący się prąd potasu.

W takim przypadku izolacja FSTC jest kompletna i można przystąpić do analizy dekonwolucyjnej i uzyskać przebieg czasowy usuwania glutaminianu z astrocytów. Jednak w niektórych przypadkach nadal występuje niewielki, trwały prąd potasu i konieczna jest dalsza analiza. Zmierz amplitudę utrzymującego się prądu potasu pozostałego po wykonaniu.

Opisana wcześniej analiza skalowała amplitudę funkcji monowykładniczej do amplitudy resztkowego trwałego prądu potasowego, ustawiając amplitudę mierzonego stałego prądu potasowego jako a w tym równaniu. Ale stała czasu narastania reprezentuje średnią wartość narastania oszacowaną w oddzielnych eksperymentach, w których izolowany jest ciągły prąd potasu. Farmakologicznie przy użyciu wysokiego stężenia nasycenia TBOA, a następnie odejmij wynikową funkcję monowykładniczą od FSTC i utrzymującego się prądu potasu.

Aby zakończyć izolację FSTC. Aby wyizolować zdarzenie transportu aktywowane przez lampę błyskową. Uśrednić co najmniej 20 przemiatania uzyskanych przy otwartej ścieżce światła w warunkach kontrolnych i w 10 mikromolowych TBOA, a następnie uśrednić taką samą liczbę przemiatania uzyskanych przy zamkniętej drodze światła w warunkach kontrolnych, a w 10 mikromolowych TBOA odjąć średni ślad uzyskany przy zablokowanej ścieżce światła od średniego śladu uzyskanego przy otwartej ścieżce światła.

Ten krok pozwala na usunięcie artefaktu bodźca i wyizolowanie FTC w tym kroku dopasuj prąd transportowy FSTC lub FTC zarejestrowany w warunkach kontrolnych i w 10 mikromolowych TBOA i dopasuj je do funkcji wielowykładniczej, tworząc natychmiastowo rosnącą funkcję, która zanika mono wykładniczo zgodnie z tą funkcją i która najlepiej opisuje fazę zaniku transportera Prąd zarejestrowany przy 10 mikromolowym TBOA. Następnie należy przekazać funkcję wykładniczą mono z dopasowania prądu transportera zarejestrowanego w 10 mikromolowym TBOA, aby uzyskać filtr. Następnie należy zdegenerować filtr z pasowania prądu transportera w kontrolowanych warunkach.

Aby uzyskać ilościowe oszacowanie całkowitego przebiegu klirensu glutaminianu w czasie, oblicz OID kształtu fali Podczas próby wykonania tej procedury. Ważne jest, aby potwierdzić, że występowanie transportu jest rejestrowane w warunkach eksperymentalnych, w których filtr działa w reżimie liniowym i wprowadza tylko liniowe zniekształcenia transportu. Fala prądowa z nich może być wykonana poprzez sprawdzenie manipulacji, które zmieniają wielkość prądu transportowego.

Nie zmieniaj jego przebiegu stempla. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać nagrań astrocytowych do wydobywania informacji o glutaminianie, dyfuzji i wychwytywaniu w mózgu.