Identyfikacja metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie ogólnego Spodoptera littoralis za pomocą sondowania stabilnych izotopów DNA przy użyciu ¹³C-glukozy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyszczególnienie skutecznej metodologii zastosowanej do filogenetycznego scharakteryzowania metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie owada. Osiąga się to poprzez pierwsze podanie owadowi glukozy znakowanej C 13 w celu izotopowego wzbogacenia DNA metabolicznie aktywnych bakterii w ich jelitach. Kolejnym krokiem jest ekstrakcja DNA społeczności bakteryjnej obecnej w jelitach.

Trzecim krokiem jest oddzielenie DNA metabolicznie aktywnych gatunków, które zawierają C 13. DNA jest następnie filogenetycznie identyfikowane i określane ilościowo dla obecnych gatunków za pomocą sekwencjonowania pirotechnicznego. W ten sposób identyfikuje się metabolicznie aktywne gatunki bakterii tworzące społeczność obecną w jelicie owada.

Tak więc jelito organizmu wielokomórkowego jest genialnym wynalazkiem, który wykorzystuje zdolności metaboliczne mikroorganizmów do rozpuszczania lub rozpuszczania złożonej materii organicznej, aby mogła ona ostatecznie służyć jako składniki odżywcze dla owadziego gospodarza. Aby zrozumieć ten system, musimy najpierw przeanalizować, kto tam jest, a po drugie, kto ma jaką aktywność metaboliczną. Dysponując tymi danymi, możemy zrekonstruować przepływ metabolitów i produktów degradacji między rozkładającymi się mikroorganizmami a owadem gospodarzem.

Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ekologii mikrobiologicznej, w szczególności w zakresie sposobu, w jaki te mikroorganizmy wchodzą w interakcje ze swoim gospodarzem. W tym sensie moglibyśmy wiedzieć więcej oraz wyjaśnić i zdefiniować, jakie funkcje te organizmy pełnią dla swojego gospodarza. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w ogólne aktywne bakterie jelitowe.

Śledząc poziom glukozy w ucle, można to również wykonać do innych źródeł węgla, takich jak znakowanie celozy w celu zidentyfikowania aktywnych bakterii biorących udział w procesie trawienia składnika odżywczego orantu. Utrzymuj litry operacyjne, jajka i szalki Petriego dodawaj temperaturę pokojową, aż się wyklują. Następnie przenieś nowo wyklute larwy do czystego plastikowego pudełka i hoduj je na sztucznej diecie w temperaturze od 23 do 25 stopni Celsjusza w reżimie długiego dnia z 16 godzinami oświetlenia i ośmioma godzinami ciemności, po kilku dniach przenieś 9 do 15 zdrowych larw w drugim stadium rozwojowym z boksu hodowlanego na indywidualne szalki Petriego zawierające świeżą glukozę C 13.

Sztuczna dieta z dodatkami, potrzebne są co najmniej trzy powtórzenia po trzy larwy każda na zabieg. Stosuj sztuczną dietę dostarczającą taką samą ilość natywnej glukozy, jak naturalne źródło pożywienia, takie jak bawełna, do karmienia grupy kontrolnej. W ciągu najbliższych 24 godzin.

Często odnawiaj sztuczne diety. Zacznij od przeniesienia larw miękkimi kleszczami do kałuży wody destylowanej, aby usunąć duże zanieczyszczenia. Następnie przenieś do nowego czystego naczynia, aby znieczulić i zabić owady.

Umieść je na lodzie, a następnie obniż temperaturę do minus pięciu stopni Celsjusza w lodówce. Następnie zdezynfekuj martwe owady 70% etanolem i zanurz je w PBS w celu sekcji. Narzędzia należy również czyścić 70% etanolem.

Zacznij od nacięć w naskórku po prawej i lewej stronie. Zacznij od głowy i zakończ na odbycie. Usuń cały egzoszkielet, kanaliki malijskie i ciało tłuszczowe.

Następnie zastąp bufor przed otwarciem jelita jelitem odizolowanym od innych tkanek. Przetwórz całe jelito lub sekcje jelita, jelita środkowego lub tylnego. W zależności od pytania naukowego.

Przenieś tkanki jelitowe bez PBS do małej sterylnej probówki i przechowuj je w zamrażarce. Przed ekstrakcją DNA próbki należy suszyć w temperaturze 45 stopni Celsjusza w koncentratorze próżniowym przez 30 do 90 minut, w zależności od wielkości tkanki. Następnie zmiażdż wysuszoną tkankę za pomocą sterylnego plastikowego Pelego, aby wyekstrahować genomowe DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA z gleby.

Następnie określ stężenie końcowego wymykającego się DNA za pomocą spektrofotometru. Zweryfikować pomyślną ekstrakcję metagenomicznego DNA drobnoustrojów z jelita owada, przygotowując diagnostyczny test PCR przy użyciu bakteryjnych starterów ogólnych 27 F i 1, 492 R.Do diagnozy. Uruchom pięć mikrolitrów każdego produktu PCR na 1% żelu agros o napięciu 300 woltów i natężeniu 115 miliamperów przez około 20 minut.

Prawidłowy rozmiar amplikonów to 1,5 kilozasady. Ściągnąć ze sobą wyekstrahowane DNA odpowiadające każdej kontrpróbie doświadczalnej. Trzymanie dzieci z glukozą C 13 i bez niej.

Znormalizuj stężenia DNA, aby upewnić się, że każda próbka w równym stopniu przyczynia się do swojej puli. Końcowe stężenie od 500 do 5 000 nanogramów DNA jest odpowiednie dla procesu ultrawirowania. Dokładnie sprawdź przewidywane stężenie za pomocą spektrofotometru w sterylnej 15-mililitrowej probówce z nakrętką.

Skonfiguruj medium gradientu. Połącz ilościowo oznaczone DNA z 4,8 mililitra roztworu chlorku cezu. Następnie uzupełnij objętość sześcioma mililitrami bufora gradientowego.

Ostrożnie przenieś mieszaniny do 5,1 mililitrowych probówek ultrawirówek. Za pomocą strzykawki i igły napełnij rurki do podstawy szyjki i unikaj pompowania lub tworzenia pęcherzyków powietrza. Uwzględnij co najmniej jeden ślepy gradient bez DNA w każdym przebiegu.

Aby działać jako gradient odniesienia, wybierz pary rurek i zrównoważ je z dokładnością do 10 miligramów. Nałóż nakładkę na rurkę do każdej rurki i upewnij się, że są szczelne, odwracając rurkę i wywierając umiarkowany nacisk ręcznie. Użyj prawie pionowego wirnika z ośmioma dołkami.

Ostrożnie uszczelnij studzienki wirnika i załaduj wirnik do ultrawirówki zgodnie z instrukcjami producenta. Wiruj DNA z prędkością 50 000 obr./min w 20 stopniach Celsjusza w próżni przez 40 godzin. Wybierz maksymalne przyspieszenie i opóźnienie bez hamowania.

Dwa dni później ostrożnie wyjmij probówki z wirnika wirówki za pomocą kleszczy. Umieść je w stojaku, nie naruszając powstałych gradientów i natychmiast przetwarzaj rurki. Najpierw zrównoważyć HPLC przy natężeniu przepływu 850 mikrolitrów na minutę.

Następnie przymocuj probówkę ultrawirówki do stojaka zaciskowego i przebij spód probówki jednocalową igłą o rozmiarze 23 przymocowaną do strzykawki. Dlatego ostrożnie przebij górną część rury górnikiem kontrolnym, aby zapobiec zakłóceniu formy, nachylenia i praktyki przed przejściem, aby zapewnić udany ruch PSA. Następnie włóż igłę przymocowaną do rurki pompy do górnej części rurki, w której nie ma płynu i zbieraj krople od dołu bezpośrednio do sterylnych 1,5 mililitrowych probówek Micro fuge, zbieraj frakcję co 30 sekund po 425 mikrolitrów na frakcję.

W tym przykładzie z każdego gradientu zbieranych jest 12 frakcji. Następnie zmierz gęstość każdej oddzielonej frakcji na wadze analitycznej. Kontynuuj odzyskiwanie DNA i sekwencjonowanie pirotechniczne, zapoznając się z protokołem tekstowym przez 24 godziny.

10 milimolowa glukoza C 13 została uzupełniona w diecie litrów ssop. Larwa. Taką samą ilość normalnej glukozy dodano do pokarmu owadów kontrolnych. Następnie wyekstrahowano DNA ze społeczności bakteryjnej jelita owada.

Na żelu do elektroforezy, silny prążek genomowego DNA na górze potwierdził udaną ekstrakcję DNA, diagnostyczny PCR. Użycie uniwersalnych starterów bakteryjnych wykazało obecność bakteryjnego DNA, ilościowe sekwencjonowanie pirologiczne przeprowadzono bezpośrednio na reprezentatywnych gradientach SIP, aby ujawnić linię gatunkową i ich względną liczebność. Łącznie wygenerowano 120 045 odczytów wysokiej jakości o średniej długości 404 OT.

Profil sekwencjonowania pirologicznego wykazał zwiększoną liczebność niektórych gatunków, w tym enterococcus i panto w znakowanej próbce w porównaniu z grupą kontrolną. Dlatego bakterie te są uważane za aktywne metabolicznie i zasługują na dalsze badania. Dlatego próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o włączeniu odpowiedniej kontroli do analizy CYP.

Tak więc, co odejmowałoby wpływ tła, zanieczyszczenia w błysku włosów i zapewniałyby, że różnorodność i obfitość bakterii pojawiające się lub znikające nie są artefaktem samej masy. Postępując zgodnie z tą procedurą lub metodologiami, takimi jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, można zastosować i przeprowadzić w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania. W takim przypadku będzie się zajmować lokalizacją i rozmieszczeniem bakterii w jelicie owada.