Name: Identyfikacja metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie ogólnego Spodoptera littoralis za pomocą sondowania stabilnych izotopów DNA przy użyciu 13C-glukozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T20:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Poznaj metodę sondowania stabilnych izotopów DNA z użyciem ¹³C-glukozy do identyfikacji metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie Spodoptera littoralis. Protokół łączy identyfikację filogenetyczną z aktywnością metaboliczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Angelice Berg za pomoc laboratoryjną. Prace te były wspierane i finansowane przez Towarzystwo Maxa Plancka i Jena School for Microbial Communication (JSMC).

1. Hodowla owadów
<ol>
	<li>Kup lub pozyskaj lęgi jaj Spodoptera littoralis z własnej hodowli. Trzymaj je na sterylnych szalkach Petriego w temperaturze pokojowej (RT) aż do wyklucia.</li>
	<li>Przygotuj sztuczną dietę dla owadów hodowlanych w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Namocz 500 g zmielonej białej fasoli przez noc w 100 ml wody.</li>
		<li>Dodać 9,0 g kwasu askorbinowego i 75 g agaru do 1 000 ml destylowanegoH2O, a następnie zagotować.</li>
		<li>Pozostawić mieszaninę do ostygnięcia, a gdy stężeje (do postaci białej, woskowatej, stałej mieszaniny) przechowywać ją w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nowo wyklute larwy należy przenieść do czystego plastikowego pudełka i hodować je na sztucznej diecie w temperaturze 23–25 °C w reżimie długiego dnia z 16 godzinami oświetlenia i 8 godzinami ciemności. Zmieniaj pokarm codziennie, aż larwy przejdą przez wszystkie sześć stadiów larwalnych.</li>
</ol>
2. 13Znakowanie C DNA w metabolicznie aktywnych bakteriach jelitowych
<ol>
	<li>Rozpuść 186,1 mg w pełni 13glukozy znakowanej C w wodzie destylowanej i dejonizowanej (ddH2O) i dobrze wymieszaj ze 100 g sztucznej diety do eksperymentu SIP. Zapewnić końcowe stężenie 13C-glukozy wynoszące 10 mM w diecie sztucznej. Naśladuje to stężenie glukozy in situ w jelitach larw S. littoralis żerujących na roślinach bawełny według Shao i in. (przedłożone).</li>
	<li>Przenieś 9-15 zdrowych larw drugiego stadium rozwojowego z boksu hodowlanego na sterylne plastikowe szalki Petriego (jedna larwa na szalkę Petriego) zawierające świeżą sztuczną dietę zawierającą 13C-glukozy. Do karmienia grupy kontrolnej należy stosować sztuczną dietę zawierającą taką samą ilość glukozy natywnej (12C-glukozy), jak opisano.</li>
	<li>Sztuczną dietę należy często odnawiać w okresie inkubacji (1 dzień). Stosować warunki chowu jak w kroku 1.3.</li>
	<li>Z każdego zabiegu należy pobrać dziewięć larw w celu późniejszego przetworzenia (ekstrakcji DNA). Każda replika składa się z trzech osobników; Wykonać co najmniej trzy powtórzenia na zabieg.</li>
</ol>
3. Sekcja owadów
<ol>
	<li>Oczyść i zdezynfekuj narzędzia preparacyjne na początku pracy etanolem 70% (Narzędzia = nożyczki, kleszcze i skalpel Vannas z drobnymi jednorazowymi ostrzami).</li>
	<li>Weź owady miękkimi kleszczami i umyj ich skórę powierzchownie wodą destylowaną. Umieść je na lodzie na co najmniej 30 minut, aby je znieczulić.</li>
	<li>Będąc nadal znieczulonymi, umieść je w temperaturze 0 °C na 1 godzinę, aby je zabić. Zdezynfekuj martwe owady powierzchownie, zanurzając je w etanolu (70%) na kilka minut.</li>
	<li>Przeprowadzić sekcję owadów na objętość około 15 ml 1x PBS osadzonego na sterylnej szalce Petriego (1XPBS = 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, dostosować pH do 7,4 , autoklaw). Upewnij się, że całe ciało owada jest całkowicie zanurzone w roztworze przez cały okres preparacji.</li>
	<li>Rozpocznij sekcję od wykonania nacięcia w skórze wzdłuż prawej i lewej strony owada, rozpocznij na głowie i zakończ na odbycie. Usuń całą skórę, kanaliki Malpighiego i ciało tłuszczowe. Zmień na świeży bufor przed rozcięciem jelita. W razie potrzeby należy podzielić jelito na jelito przednie, środkowe i tylne. Przechowywać tkankę w zamrażarce (w temperaturze od -80 do -20 °C) do czasu ekstrakcji DNA</li>
</ol>
4. Ekstrakcja i amplifikacja DNA
<ol>
	<li>Umieścić tkankę owada w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wysuszyć wszystkie próbki w temperaturze 45 °C w koncentratorze próżniowym. Zmiażdż wysuszoną tkankę sterylnym plastikowym tłuczkiem.</li>
	<li>Wyodrębnij genomowe DNA za pomocą odpowiedniego zestawu do ekstrakcji DNA z gleby. Przenieś suchą chusteczkę do probówki reakcyjnej zestawu i postępuj zgodnie z instrukcjami wskazanymi przez producenta.</li>
	<li>Określić stężenie końcowego eluowanego DNA za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Zweryfikować pomyślną ekstrakcję metagenomicznego DNA drobnoustrojów z jelita owada, przygotowując diagnostyczny test PCR przy użyciu eubakteryjnych starterów ogólnych 27f (5- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) i 1492r (5- GGTTACCTTGTTACGACTT -3). Ustaw reakcję PCR w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Ustawić 50 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1x bufor, 1,5 mM MgCl2, 10 mM czterech trifosforanów deoksynukleozydów (dNTP), 2,5 U polimerazy DNA Taq, 0,5 mM każdego startera i 60 ng wyekstrahowanego DNA jako matrycy.</li>
		<li>Przeprowadzić reakcje PCR przy użyciu termocyklera w następujący sposób: wstępna denaturacja w temperaturze 94 °C przez 3 minuty, a następnie 35 cykli: 94 °C przez 45 sekund, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 sekund i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę. Zastosować ostatni etap przedłużania w temperaturze 72 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Sprawdź pomyślną amplifikację PCR w 1% żelu barwionym bromkiem etydyny (EB) do elektroforezy agarozowej (EB) (rozpuść 1 g agarozy w 100 ml buforu 1x TAE i zabarwij 1 μl EB). Włóż 5 μl produktu PCR + 1 μl 6x ładującego barwnika do kieszeni żelowych. (1x TAE = 40 mM Tris-Base, 20 mM lodowaty kwas octowy, 1 mM EDTA, dostosować do pH 8).</li>
		<li>Uruchomić żel za pomocą bufora 1xTAE przy napięciu 300 V, 115 mA przez ok. 20 min w komorze elektroforetycznej. Korzystając z komory dokumentacyjnej żelu (transiluminator UV podłączony do aparatu cyfrowego i komputera), obserwuj żel i porównaj wielkość produktu końcowego z również załadowanym markerem genetycznym; Prawidłowy rozmiar amplikonów musi wynosić około 1,5 kB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Produkty PCR należy przechowywać w warunkach głębokiego zamrażania, najlepiej w temperaturze -80 °C, aż do użycia.</li>
</ol>
5. Separacja DNA - ultrawirowanie gradientowe CsCl
<ol>
	<li>Przygotować odczynniki dla gradientów do ultrawirowania w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Przygotować 7,163 M roztwór chlorku cezu (CsCl), stopniowo rozpuszczając 603,0 g CsCl wddH2O i uzupełnić do końcowej objętości 500 ml.</li>
		<li>Dokładnie określić gęstość przygotowanego roztworu CsCl, ważąc 1,0 ml podwielokrotności na trzycyfrowej wadze w trzech powtórzeniach. Zwykle waha się to od 1,88 do 1,89 g/ml w RT.</li>
		<li>Przygotować bufor gradientowy (100 mM Tris, 100 mM KCl i 1 mM EDTA) przez połączenie 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 ml 0,5 M EDTA (pH 8) i 3,75 g KCl w końcowej objętości 500 ml przy użyciu ddH2O. Przefiltrować (0,22 μm), wysterylizować i autoklawować ten roztwór.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Separacja DNA
	<ol>
		<li>Po ustaleniu indywidualnego stężenia DNA owadów poddanych działaniu substancji, mierzonego zgodnie z ppkt 4.3, należy połączyć ze sobą owady odpowiadające powtórzeniu i znormalizować ich stężenie DNA, aby zapewnić, że każdy z nich w równym stopniu przyczynia się do powstania próbki zbiorczej. Końcowe stężenie 500-5 000 ng DNA (ponownie zmierz stężenie końcowe) jest odpowiednie dla procesu ultrawirowania21.</li>
		<li>Aby utworzyć pożywkę gradientową, należy połączyć ilościowo oznaczone DNA, bufor gradientowy i 4,8 ml roztworu 7,163 M CsCl razem do mieszanej objętości 6,0 ml w sterylnej probówce z nakrętką o pojemności 15 ml (wytwarzanie mieszaniny pożywki gradientowej i DNA).</li>
		<li>Ostrożnie umieścić przygotowaną gradientową mieszaninę pożywki z DNA w probówce ultrawirówki o pojemności 5,1 ml (napełnić do podstawy szyjki probówki) za pomocą strzykawki i igły. Unikaj pompowania lub tworzenia pęcherzyków powietrza. Uwzględnić co najmniej jeden ślepą próbę gradientu (przy użyciu ddH2O zamiast DNA) w każdym przebiegu wirówki jako gradient odniesienia.</li>
		<li>Wyrównać pary probówek z dokładnością do 10 mg masy po napełnieniu każdej wymaganej pożywki gradientowej do odpowiedniej probówki ultrawirówkowej. Uszczelnij rurkę za pomocą "Nakładki na rurkę" i upewnij się, że uszczelka jest szczelna, odwracając rurkę i wywierając umiarkowany nacisk ręcznie.</li>
		<li>Użyj prawie pionowego wirnika z ośmioma dołkami do przechowywania 5,1 ml probówek do ultrawirowania do ultrawirowania. Ostrożnie uszczelnij studzienki wirnika i załaduj wirnik do ultrawirówki zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw warunki ultrawirowania: wirowanie z prędkością 50 000 obr./min (około 177 000 x g), temperatura 20 °C i czas pracy ultrawirowania przez 40 godzin z próżnią. Wybierz maksymalne przyspieszenie i opóźnienie bez hamulca.</li>
		<li>Po zakończeniu ostrożnie wyjmij probówki z wirnika wirówki za pomocą kleszczy. Umieść je w stojaku, nie naruszając utworzonych gradientów w rurach. Próbki frakcjonowania gradientowego należy przetwarzać tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować dyfuzję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie DNA z gradientów oddzielonych izopikami przez frakcjonowanie
	<ol>
		<li>Użyj dokładnego systemu pomp HPLC do przeprowadzenia frakcjonowania gradientowego, który równomiernie oddziela utworzone gradienty od metody przemieszczenia górnej rurki ultrawirówki. Podłączyć pompę HPLC (100% gradient przepływu) do butelki wypełnionej 1 l wypornością ddH2O i szczelnie przymocować do otwartego przewodu pompy za pomocą igły strzykawkowej 23 G 1 cala. Dodaj wystarczającą ilość niebieskiego barwnika bromofenolowego do ddH2O, aby nadać mu ciemnoniebieski kolor. Ułatwia to wizualizację granicy faz między ośrodkiem gradientowym a przemieszczeniem ddH2O.</li>
		<li>Ustawić pompę na natężenie przepływu 850 μl/min i zrównoważyć system, aż z igły strzykawki wydobędzie się pojedyncza kropla niebieskiego ddH2O.</li>
		<li>Ostrożnie przymocuj probówkę ultrawirówki do stojaka zaciskowego i przebij spód probówki strzykawką 23 G 1 w długiej igle. Podłącz pompę do probówki ultrawirówki, wkładając igłę dołączoną do rurki pompy do górnej części probówki i zbieraj krople od dołu bezpośrednio do sterylnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Zbieraj frakcję co 30 sekund, co daje około 425 μl na frakcję i łącznie 12 frakcji na gradient. Należy pamiętać, że ostatnia frakcja (frakcja 12) zwykle zawiera przemieszczenie ddH2O i należy ją wyrzucić.</li>
		<li>Po frakcjonowaniu zmierzyć gęstość wszystkich oddzielonych frakcji za pomocą wagi analitycznej, jak wspomniano w kroku 5.1.2.</li>
		<li>Wytrącić DNA z każdej frakcji (około 425 μl), dodając najpierw 1 μl glikogenu (20 μg/μl w ddH2O, autoklawowany) jako nośnik do wytrącania niewielkiej ilości DNA. Dobrze wymieszaj przez odwrócenie.</li>
		<li>Dodać dwie objętości (850 μl) roztworu glikolu polietylenowego (PEG) (rozpuścić 150 g glikolu polietylenowego 6000 i 46,8 g NaCl w ddH2O do całkowitej objętości 500 ml. Przefiltrować, wysterylizować i przelać w autoklawie. Roztwór PEG to 30% PEG 6000 i 1,6 M NaCl) i ponownie wymieszać, odwracając dziesięć razy.</li>
		<li>Pozostaw probówki w temperaturze pokojowej na co najmniej dwie godziny (jeśli to konieczne, na noc), aby wytrącić DNA.</li>
		<li>Odwirować osady przy 13 000 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Powinna powstać widoczna osadka.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i przemyć osad 500 μl 70% etanolu. Ponownie odwirować w tych samych warunkach przez 10 minut.</li>
		<li>Ostrożnie wyrzucić supernatant i wysuszyć osad na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
		<li>Ponownie rozpuść wysuszoną osadkę DNA w 30 μl ddH2O i dobrze wymieszaj, delikatnie stukając w probówkę. Określić ilościowo DNA w każdej frakcji gradientowej, jak w kroku 4.3 Przechowywać próbki w temperaturze poniżej -20 lub -80 °C, jeżeli wymagane jest długotrwałe przechowywanie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Charakterystyka DNA metodą pirosekwencjonowania
<ol>
	<li>Upewnij się, że nieznakowane natywne (12C) DNA zajmuje zakres gęstości od 1,705 g / ml do 1,720 g / ml, podczas gdy 13DNA znakowane C ma gęstość około 1,720-1,735 g / ml. Należy pamiętać, że zarówno natywne, jak i 13znakowane C DNA wyekstrahowane z próbek środowiskowych mogą obejmować kilka frakcji gradientowych. Spodziewaj się, że lekkie DNA będzie związane z frakcjami 9-11, a ciężkie DNA będzie związane z frakcjami 4-6.</li>
	<li>Połącz kluczowe frakcje, aby utworzyć pojedynczą "skompilowaną" frakcję reprezentatywną zgodnie z właściwą alokacją pików DNA o rozdzielczości gęstości. Alternatywnie, inne sposoby badania oddzielonych frakcji za pomocą spektrometrii mas ze stosunkiem izotopowym (IRMS)22 lub metody odcisków palców, takie jak elektroforeza żelowa z gradientem denaturacji (DGGE)23, mogą pomóc w wyborze odpowiednich frakcji przed sekwencjonowaniem.</li>
	<li>Wykonaj pirosekwencjonowanie genów bakteryjnych 16S rRNA amplifikowanych PCR ze skompilowanych ciężkich, średnich i lekkich frakcji każdego pojedynczego gradientu. Za pomocą tej metody możliwa jest identyfikacja linii i względnej liczebności metabolicznie aktywnych gatunków bakterii w próbkach inkubowanych SIP. Sekwencjonowanie pirologiczne należy wykonać w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Wykonaj pirosekwencjonowanie amplikonów za pomocą instrumentu Roche 454 FLX z odczynnikami tytanowymi.</li>
		<li>Przygotuj amplikony z kodami kreskowymi do multipleksowania za pomocą zestawu starterów fuzyjnych Gray28F (5- GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) i Gray519r (5- GTNTTACNGCGGCKGCTG -3)24,25 rozszerzonych o odpowiedni adapter startera A/B i identyfikatory multipleksu specyficzne dla próbki (MID).</li>
		<li>Zastosuj jednoetapowy PCR z 30 cyklami, używając polimerazy Hot Start Taq, aby wygenerować bibliotekę sekwencjonowania.</li>
		<li>Sekwencjonuj amplikony w oparciu o protokół dostawcy i rozszerz odczyty z kierunku do przodu (Gray28F) zgodnie z opisem w <a href="http://www.researchandtesting.com/">http://www.researchandtesting.com/</a>.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Analiza danych pirosekwencjonowania
<ol>
	<li>Przeanalizuj surowe odczyty sekwencji generowane przez pirosekwencjonowanie 454 za pomocą "ilościowego wglądu w ekologię drobnoustrojów", potok oprogramowania QIIME26. Wykonaj przetwarzanie w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Najpierw przekonwertuj plik sff wygenerowany przez maszynę 454 na pliki FASTA, QUAL i Flowgram za pomocą skryptu process_sff.py.</li>
		<li>Zweryfikuj plik mapowania (na podstawie check_id_map.py) i przypisz odczyty multipleksowane do próbek biologicznych za pomocą skryptu split_libraries.py. Przytnij końcówki o niskiej jakości za pomocą rozmiaru okna przesuwnego 50 i średniego parametru odcięcia jakości 25, wyeliminuj również krótkie niejednoznaczne sekwencje (długość <200 pz) ze zbioru danych.</li>
		<li>Odszumianie danych 454 za pomocą denoise_wrapper.py.</li>
		<li>Następnie zgrupuj wysokiej jakości odczyty w operacyjnych jednostkach taksonomicznych (OTU) przy użyciu metody wybierania wielu OTU (pick_otus.py z 97% odcięciami podobieństwa sekwencji).</li>
		<li>Wybierz reprezentatywną sekwencję z każdego OTU za pomocą pick_rep_set.py.</li>
		<li>Przypisz taksonomię do reprezentatywnego zestawu sekwencji na podstawie assign_taxonomy.py. Użyj klasyfikatora projektu bazy danych rybosomalnej (RDP) z minimalnym poziomem ufności do rekordu przypisanym na wartość 0,80.</li>
		<li>Dopasuj reprezentatywny zestaw sekwencji do wstępnie wyrównanych sekwencji rdzenia Greengenes 16S przy użyciu algorytmu PyNast (align_seqs.py z minimalnym procentem tożsamości sekwencji ustawionym na 75).</li>
		<li>Dodatkowo zuboż chimery z dalszej analizy, uruchamiając identify_chimeric_seqs.py.</li>
		<li>Usuń wszystkie pozycje luk (nieprzydatne do wnioskowania filogenetycznego) za pomocą szablonu maski pasa ruchu (filter_alignment.py) przed zbudowaniem drzewa filogenetycznego (make_phylogeny.py).</li>
		<li>Na koniec wygeneruj tabele OTU z make_otu_table.py, opisujące występowanie filotypów bakteryjnych w każdej próbce. Użyj tabeli OTU, aby skonstruować mapę cieplną w celu porównania liczebności i aktywności bakterii.</li>
		<li>W razie potrzeby oblicz różnorodność alfa i beta odpowiednio w próbkach i między nimi. W ten sam sposób można również przygotować krzywe rozrzedzenia (wykresy różnorodności w funkcji głębokości sekwencjonowania) oraz wykresy analizy głównych współrzędnych (PCoA) reprezentujące relacje między zbiorowiskami drobnoustrojów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+obligate+mutualist+Wigglesworthia+glossinidia+influences+reproduction%2C+digestion%2C+and+immunity+processes+of+its+host%2C+the+tsetse+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).</li>
<li>Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary-dependent+trans-generational+immune+priming+in+an+insect+herbivore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore.</a> Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).</li>
<li>Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Note%3A+Gut+bacteria+produce+components+of+a+locust+cohesion+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone.</a> J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).</li>
<li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+interactions+in+insect-microbial+symbioses%3A+Aphids+and+their+symbiotic+bacteria+Buchnera%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera.</a> Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).</li>
<li>Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+stable+isotopes+to+measure+the+metabolic+activity+of+the+human+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).</li>
<li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li>
<li>Gil, R., Latorre, A., Moya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+endosymbionts+of+insects%3A+insights+from+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics.</a> Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).</li>
<li>Brune, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrune%2C+A+%22Encyclopedia+of+Insects%22">Encyclopedia of Insects</a>. VH, R. esh, Cardé, R. T. , Elsevier. 1132(2005).</li>
<li>Breznak, J. A., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microorganisms+in+the+digestion+of+lignocellulose+by+termites%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites.</a> Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).</li>
<li>Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Census+of+the+bacterial+community+of+the+gypsy+moth+larval+midgut+by+using+culturing+and+culture-independent+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).</li>
<li>Funke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+hydrolysis+of+quorum-sensing+molecules+in+the+gut+of+lepidopteran+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae.</a> Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).</li>
<li>Tang, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+and+variability+of+gut+commensal+microbiota+in+polyphagous+lepidopteran+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae.</a> PloS One. 7, (2012).</li>
<li>Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+identification+and+in-situ+detection+of+individual+microbial-cells+without+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation.</a> Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).</li>
<li>Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+ecology+and+evolution+-+a+ribosomal-rna+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach.</a> Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).</li>
<li>Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+acceptor-dependent+identification+of+key+anaerobic+toluene+degraders+at+a+tar-oil-contaminated+aquifer+by+Pyro-SIP%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).</li>
<li>Lu, Y. H., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+stable+isotope+probing+of+methanogenic+archaea+in+the+rice+rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere.</a> Science. 309, 1088-1090 (2005).</li>
<li>Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+probing+as+a+tool+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology.</a> Nature. 403, 646-649 (2000).</li>
<li>Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+probing+of+microorganisms+thriving+at+thermodynamic+limits%3A+Syntrophic+propionate+oxidation+in+flooded+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).</li>
<li>Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+stable+isotope+probing+to+identify+key+iron-reducing+microorganisms+involved+in+anaerobic+benzene+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation.</a> ISME J. 1, 643-653 (2007).</li>
<li>Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+identification+and+quantification+of+glucose+metabolism+in+seven+bacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species.</a> J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).</li>
<li>Dunford, E. A., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Stable-Isotope+Probing+%28DNA-SIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP).</a> J. Vis. Exp. (42), (2010).</li>
<li>Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation-independent+identification+of+candidate+dehalorespiring+bacteria+in+tetrachloroethylene+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation.</a> Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).</li>
<li>Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+of+DNA-+and+rRNA-based+stable+isotope+probing+by+fractionation+and+quantitative+analysis+of+isopycnic+centrifugation+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients.</a> Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).</li>
<li>Ishak, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+diversity+in+Solenopsis+invicta+and+Solenopsis+geminata+ant+colonies+characterized+by+16S+amplicon+454+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing.</a> Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).</li>
<li>Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tag-encoded+FLX+amplicon+pyrosequencing+for+the+elucidation+of+microbial+and+functional+gene+diversity+in+any+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment.</a> Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).</li>
<li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+QIIME+to+Analyze+16S+rRNA+Gene+sequences+from+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5(2012).</li>
<li>Dillon, R. J., Dillon, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+bacteria+of+insects%3A+nonpathogenic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions.</a> Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).</li>
<li>Neufeld, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).</li>
<li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Jelita większości owadów są siedliskiem bogatej i złożonej społeczności drobnoustrojów; Zazwyczaj zagnieżdża się tam 107-10 9 komórek prokariotycznych, w większości przypadków przewyższając liczebnie własne komórki gospodarza. W ten sposób jelito owadów jest "gorącym punktem" dla różnych działań mikrobiologicznych, reprezentujących wiele aspektów relacji mikrobiologicznych, od patogenezy po obligatoryjny mutualizm27. Chociaż w wielu badaniach opisano zdumiewającą różnorodność społeczności...

Symbiotyczne stowarzyszenia owadów i bakterii są znane z dużej liczby gatunków owadów7. W tych symbiotycznych związkach mikroorganizmy odgrywają ważną rolę we wzroście i rozwoju owadów. Wykazano, że drobnoustroje przyczyniają się do rozmnażania owadów1, biosyntezy feromonów3, odżywiania, w tym syntezy niezbędnych aminokwasów4 oraz trawienia pokarmu niedostępnego dla gospodarza. Pomimo ogromnej różnorodności powiązań jelitowo-bakteryjnych, znacznie mniej wiadomo o funkcjonalnej roli, jaką odgrywają one na korzyść owada. Tylko w przypadku termitów szeroko zbadano symbiotyczne trawienie lignocelulozy przez prokariota, pierwotniaki i grzyby8,9. W przeciwieństwie do tego, niewiele wiadomo o symbiozie obecnej w jelitach owadów ogólnych, tj. dżdżownicy bawełnianej, Spodoptera littoralis. Co więcej, ze względu na częstą zmianę gospodarzy roślinnych, owady ogólne i ich społeczności bakteryjne związane z jelitami są stale narażone na nowe wyzwania związane z ich nawykami żywieniowymi, konsumując rośliny mnóstwem fitochemikaliów. Poza tym środowisko jelitowe u Lepidoptera samo w sobie stanowi trudne środowisko dla rozwoju bakterii ze względu na wysokie pHjelit 10. Szczególnie w przypadku S. littoralis waha się od 10,5 w jelicie przednim, ok. 9 w jelicie środkowym do pH prawie 7 w jelicie tylnym11. Z drugiej strony, społeczność bakteryjna związana z jelitami S. littoralis jest prosta. Tang, Freitak i wsp.12 zgłosiło maksymalnie 36 filotypów należących do łącznie 7 różnych gatunków bakterii jako jedynych członków społeczności bakteryjnej związanej z tym owadem. Poza tym do hodowli owadów w laboratorium nie jest wymagana żadna skomplikowana procedura hodowlana. Co więcej, w połączeniu z krótkim cyklem życiowym owada ułatwia to wielopokoleniowe badania, przekształcając ten gatunek w idealny system modelowy do badania interakcji jelitowo-mikrobiowych.
Wraz z pojawieniem się technologii sekwencjonowania opartych na PCR, liczba badań dotyczących bioty jelitowej kilku organizmów (np. ludzi, owadów lub organizmów morskich) wzrosła. Co więcej, wyniki są niezależne od izolacji i hodowli bakterii jelitowych, jak to miało miejsce w przeszłości. Prawie 99% bakterii nie nadaje się do hodowli, a symulacja warunków środowiskowych panujących w jelitach jest trudna12. Za pomocą PCR fragmenty genu 16S rRNA (szeroko stosowany filogenetyczny marker genowy wśród bakterii) mogą być selektywnie amplifikowane z mieszanej matrycy DNA społeczności bakterii jelitowych, sekwencjonowane i klonowane. Dzięki tym informacjom użytkownik jest w stanie zidentyfikować gatunek bakterii po pobraniu informacji o sekwencji z publicznych baz danych13,14. Niemniej jednak podejścia sekwencjonowania do opisu społeczności bakteryjnych pozostają niewystarczające ze względu na brak informacji na temat wewnętrznego wkładu metabolicznego poszczególnych gatunków w społeczność.
Sondowanie stabilnymi izotopami (SIP) jest obiecującą techniką bez hodowli. Jest często stosowany w mikrobiologii środowiskowej do analizy filogenezy drobnoustrojów związanych z określonymi czynnościami metabolicznymi. Osiąga się to poprzez śledzenie stabilnych, znakowanych izotopowo atomów z substratów do biomarkerów mikrobiologicznych, takich jak kwasy tłuszczowe pochodzące z fosfolipidów, DNA i RNA5. Jeśli chodzi o kwasy nukleinowe, metodologia opiera się na oddzieleniu 13znakowanych C DNA lub RNA od nieznakowanego DNA za pomocą ultrawirowania w gradiencie gęstości6. Ze względu na ten bezpośredni związek między etykietą DNA a aktywnością metaboliczną, dalsza analiza molekularna kwasów nukleinowych identyfikuje gatunki i dostarcza informacji na temat aktywności metabolicznej. Co więcej, połączenie DNA-SIP i pirosekwencjonowania zastosowane przez Pilloni, von Netzer i wsp.15, pozwala na szczególnie prostą i czułą identyfikację gatunków bakterii obecnych w ciężkiej frakcji DNA znakowanej 13C. Do tej pory technika ta była stosowana do opisu zbiorowisk bakteryjnych biorących udział w procesach biogeochemicznych w glebie w warunkach tlenowych16,17 i beztlenowych18,19. Oprócz zastosowania w naukach o środowisku, technika ta znalazła zastosowanie w naukach medycznych, jak donoszą Reichardt i wsp.5, który opisał aktywność metaboliczną różnych grup filogenetycznych ludzkiej mikrobioty jelitowej w odpowiedzi na niestrawne węglowodany.
Tutaj używamy 13C-glukozy do 'oznaczania' DNA metabolicznie aktywnych gatunków bakterii w jelitach. Glukoza jest cukrem wykorzystywanym przez większość gatunków bakterii wzdłuż szeroko rozpowszechnionego szlaku Entnera-Doudoroffa (ED), chociaż znane są wyjątki20. Uzasadnia to zastosowanie 13C-glukozy jako niezawodnej sondy metabolicznej, która zapewnia powiązanie między interesującymi metabolitami a źródłem węgla wzdłuż ustalonych szlaków. W zależności od kwestii naukowej, inne substraty, tj. 13C-metan, 13CO2 lub rośliny hodowane w atmosferze 13CO2 mogą być wykorzystywane do przeciwdziałania aktywności metabolicznej.
W tym momencie prezentujemy protokół zastosowany w metabolicznej charakterystyce społeczności bakteryjnej jelit owada ogólnego, a mianowicie S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Co więcej, technika ta została połączona z pirosekwencjonowaniem, co z kolei pozwala na identyfikację społeczności bakterii jelitowych owadów z wysoką rozdzielczością i precyzją. Jako główny substrat podczas eksperymentów wykorzystano 13glukozy znakowanej C.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Kleszcze do lustrzanego wykończenia</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11251-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vannas Nożyczki sprężynowe</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>15000-00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Szybki koncentrator próżni 5301</td><td>Eppendorf Niemcy</td><td>5305 000.304</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tłuczek plastikowy</td><td>Carl Roth GmbH Co. Niemcy</td><td>P986.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoVue</td><td>GE HealthCare, Wielka Brytania</td><td>28-9569-58</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mastercycler pro/thermocycler</td><td>Eppendorf Niemcy</td><td>6321 000.515</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agagel Standardowa pozioma komora do elektroforezy żelowej</td><td>Biometra Wycofane</td> ze <td>sprzedaży</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultrawirówka (Optima L-90K)</td><td>Beckman</td><td>A20684</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirnik ultrawirówkowy (NVT 90)</td><td>Beckman</td><td>362752</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pompa HPLC</td><td>Agilent</td><td>1100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Szybkozłączka, rurka polialomerowa</td><td>Beckman</td><td>342412</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Oświetlacz UVstar 15&nbsp;</td><td>Biometria</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

identyfikacja metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie ogólnego spodoptera littoralis za pomocą sondowania stabilnych izotopów dna przy użyciu 13c-glukozy

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

Wnętrzności większości owadów są zamieszkiwane przez złożone społeczności symbiotycznych bakterii niepatogennych. W takich zbiorowiskach drobnoustrojów możliwa jest identyfikacja gatunków bakterii komensalnych lub mutualistycznych. Zaobserwowano, że te ostatnie pełnią wiele funkcji dla owadów, tj. pomagają w rozmnażaniu owadów1, wzmacniają odpowiedź immunologiczną2, produkcję feromonów3, a także odżywiają, w tym syntezę niezbędnych aminokwasów4.    
Ze względu na znaczenie tych stowarzyszeń, podjęto wiele wysiłków, aby scharakteryzować społeczności aż do poszczególnych członków. Jednak większość tych wysiłków opierała się albo na metodach hodowli, albo opierała się na generowaniu fragmentów genu 16S rRNA, które zsekwencjonowano w celu ostatecznej identyfikacji. Niestety, metody te zidentyfikowały tylko gatunki bakterii obecne w jelitach i nie dostarczyły żadnych informacji na temat aktywności metabolicznej mikroorganizmów.
Aby scharakteryzować metabolicznie aktywne gatunki bakterii w jelitach owada, użyliśmy sondowania stabilnymi izotopami (SIP) in vivo, wykorzystując 13C-glukozy jako uniwersalny substrat. Jest to obiecująca technika niewymagająca hodowli, która pozwala na powiązanie filogenezy drobnoustrojów z ich szczególną aktywnością metaboliczną. Jest to możliwe dzięki śledzeniu stabilnych, znakowanych izotopowo atomów z substratów do biomarkerów mikrobiologicznych, takich jak DNA i RNA5. Włączenie izotopów 13C do DNA zwiększa gęstość znakowanego DNA w porównaniu z nieznakowanym (12C). Ostatecznie 13DNA lub RNA znakowane C jest oddzielane przez ultrawirowanie w gradiencie gęstości od 12C-nieznakowanych podobnych6. Późniejsza analiza molekularna oddzielonych izotopomerów kwasów nukleinowych zapewnia związek między aktywnością metaboliczną a tożsamością gatunku.
Tutaj prezentujemy protokół używany do scharakteryzowania metabolicznie aktywnych bakterii w jelitach ogólnego owada (nasz system modelowy), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Analizę filogenetyczną DNA przeprowadzono za pomocą pirosekwencjonowania, co pozwoliło na wysoką rozdzielczość i precyzję w identyfikacji społeczności bakterii jelitowych owadów. Jako główny substrat w eksperymentach użyto 13glukozy znakowanej C. Substratem podawano owadom za pomocą sztucznej diety.

Aby uzyskać wystarczające znakowanie metabolicznie aktywnych bakterii obecnych w jelitach owada, owad musi być eksponowany na podłoże bogate w 13C przez uprzednio zoptymalizowany okres, pozwalający na łatwe oddzielenie znakowanej frakcji cięższej od nieznakowanej frakcji lżejszej. W naszym przypadku do sztucznej diety dodano 13C-glukozę w końcowym stężeniu 10 mM przez 1 dzień (Rysunek 1A). Taka sama ilość zwykłej glukozy (Rysunek 1B) została podana w sztucznej dieci...

Aktywna społeczność bakteryjna związana z jelitami Spodoptera littoralis, została określona przez sondowanie stabilnymi izotopami (SIP) sprzężone z pirosekwencjonowaniem. Korzystając z tej metodologii, identyfikacja metabolicznie aktywnych gatunków bakterii w społeczności została przeprowadzona z wysoką rozdzielczością i precyzją.

Identyfikacja metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie ogólnego Spodoptera littoralis za pomocą sondowania stabilnych izotopów DNA przy użyciu 13C-glukozy

Guts of most insects are inhabited by complex communities of symbiotic nonpathogenic bacteria. Within such microbial communities it is possible to ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest szczegółowe przedstawienie wydajnej metodologii stosowanej do charakterystyki filogenetycznej bakterii metabolicznie aktywnych w jelitach owada. Osiąga się to poprzez uprzednie podanie owadowi glukozy znakowanej C 13, aby izotopowo wzbogacić DNA bakterii metabolicznie aktywnych w ich jelitach. Kolejnym krokiem jest wyizolowanie DNA społeczności bakteryjnej obecnej w jelitach.Trzecim krokiem jest wydzielenie DNA gatunków aktywnych metabolicznie, które włączyły C 13. Następnie DNA jest identyfikowane filogenetycznie i ilościowo określane pod kątem obecnych gatunków za pomocą sekwencjonowania pirosekwencją. Pozwala to na identyfikację metabolicznie aktywnych gatunków bakterii tworzących społeczność obecną w jelitach owada.Układ pokarmowy organizmów wielokomórkowych jest błyskotliwym rozwiązaniem ewolucyjnym, pozwalającym wykorzystać zdolności metaboliczne mikroorganizmów do rozkładu lub solubilizacji złożonej materii organicznej, aby mogła ona ostatecznie służyć jako składniki odżywcze dla owada-gospodarza. Aby zrozumieć ten system, musimy najpierw przeanalizować, jakie mikroorganizmy tam występują, a następnie, które z nich wykazują konkretne aktywności metaboliczne. Dysponując tymi danymi, możemy zrekonstruować przepływ metabolitów i produktów degradacji pomiędzy mikroorganizmami rozkładającymi materię a owadem-gospodarzem.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny ekologii mikrobowej, w szczególności w kwestii sposobu, w jaki mikroby te oddziałują ze swoim gospodarzem. Dzięki temu moglibyśmy dowiedzieć się więcej oraz wyjaśnić i zdefiniować funkcje, jakie organizmy te pełnią w stosunku do gospodarza. Metoda ta może ponadto dostarczyć wglądu w ogólną aktywność bakterii jelitowych.Śledzenie glukozy może być również zastosowane do innych źródeł węgla, na przykład poprzez znakowanie celulozy w celu zidentyfikowania aktywnych bakterii uczestniczących w procesie trawienia danego składnika odżywczego. Przechowywać litry, jaja i szalki Petriego w temperaturze pokojowej aż do wyklucia. Następnie przenieść nowo wyklute larwy do czystego plastikowego pudełka i hodować je na sztucznej diecie w temperaturze od 23 do 25 °C w reżimie długiego dnia z 16 godzinami oświetlenia i ośmioma godzinami ciemności; po kilku dniach przenieść od 9 do 15 zdrowych larw drugiego stadium z pudełka hodowlanego do poszczególnych szalek Petriego zawierających świeżą C 13 glukozę.W przypadku sztucznej diety z dodatkiem, na każdą grupę badawczą wymagane są co najmniej trzy powtórzenia, po trzy larwy w każdym. W celu karmienia grupy kontrolnej należy zastosować sztuczną dietę zawierającą taką samą ilość naturalnej glukozy, jak w przypadku naturalnego źródła pożywienia, np. bawełny. Przez kolejne 24 godziny.Często wymieniaj pożywki sztuczne. Rozpocznij od przeniesienia larw za pomocą miękkich pęset do kąpieli w wodzie destylowanej w celu usunięcia dużych zanieczyszczeń. Następnie przenieś owady do nowej czystej szalki w celu znieczulenia i uśmiercenia.Umieścić je na lodzie, a następnie obniżyć temperaturę do -5 °C w chłodziarce. Następnie zdezynfekować martwe owady 70% etanolem i zanurzyć je w PBS w celu przeprowadzenia sekcji. Narzędzia również należy oczyścić 70% etanolem.Rozpocznij od wykonania nacięć w kutykuli wzdłuż prawej i lewej strony. Zacznij od głowy i zakończ na odbycie. Usuń cały egzoszkielet, cewki Malpighiego oraz ciało tłuszczowe.Następnie, przed otwarciem przewodu pokarmowego, należy zastąpić bufor przewodem pokarmowym odizolowanym od pozostałych tkanek. Przetwarzamy cały przewód pokarmowy lub jego fragmenty, takie jak jelito środkowe lub jelito tylne, w zależności od postawionego pytania badawczego.Przenieś tkanki jelitowe, usuwając PBS, do małej sterylnej probówki i przechowuj je w zamrażarce. Przed ekstrakcją DNA wysusz próbki w temperaturze 45 °C w koncentratorze próżniowym przez 30 do 90 minut, w zależności od wielkości tkanki. Następnie rozdrobnij wysuszoną tkankę za pomocą sterylnego plastikowego pestuka, aby wyekstrahować genomowe DNA przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA z gleby.Następnie określ stężenie końcowego eluatu DNA za pomocą spektrofotometru. Potwierdź prawidłową ekstrakcję mikrobiologicznego DNA metagenomowego z jelita owada, przeprowadzając diagnostyczny test PCR z wykorzystaniem uniwersalnych starterów bakteryjnych 27 F i 1, 492 R. W celu diagnostyki nanieś pięć mikrolitrów każdego produktu PCR na żel agarozowy 1% i prowadź elektroforezę przy napięciu 300 V oraz natężeniu 115 mA przez około 20 minut.Prawidłowa wielkość amplikonów wynosi 1,5 kilobazy. Połącz wyizolowane DNA odpowiadające każdemu powtórzeniu eksperymentalnemu. Próbki z glukozą C 13 oraz bez niej należy trzymać oddzielnie.Znormalizuj stężenia DNA, aby każda próbka wnosiła równy wkład do puli. Do procesu ultrawirowania odpowiednie jest stężenie końcowe od 500 do 5 000 nanogramów DNA. Zweryfikuj przewidywane stężenie za pomocą spektrofotometru w sterylnej probówce z nakrętką o pojemności 15 mililitrów.Przygotuj medium gradientowe. Połącz wyznaczoną ilość DNA z 4,8 milliliters roztworu chlorku cezu. Następnie uzupełnij objętość do poziomu sześciu milliliters buforu gradientowego.Ostrożnie przenieś mieszaniny do probówek do ultrawirówki o pojemności 5,1 ml. Za pomocą strzykawki i igły napełnij probówki do podstawy szyjki, unikając pompowania i tworzenia pęcherzyków powietrza. W każdym cyklu uwzględnij co najmniej jeden gradient kontrolny bez DNA.Aby stworzyć gradient referencyjny, należy wybrać pary probówek i zrównoważyć ich masę z dokładnością do 10 milligrams. Każda probówka powinna zostać zamknięta korkiem, a szczelność należy sprawdzić, odwracając probówkę i wywierając umiarkowany nacisk dłonią. Należy użyć rotora niemal pionowego z ośmioma gniazdami.Starannie uszczelnij otwory rotora i umieść go w ultrawirówce zgodnie z instrukcją producenta. Wirować DNA przy 50 000 RPM w temperaturze 20 °C w próżni przez 40 godzin. Wybrać maksymalne przyspieszenie oraz zwolnienie bez hamowania.Dwa dni później ostrożnie wyjmij probówki z rotora wirówki za pomocą pincety. Umieść je w statywie, nie naruszając utworzonych gradientów, i niezwłocznie przetwórz próbki. Najpierw przeprowadź równoważenie układu HPLC, stosując szybkość przepływu 850 µL/min.Następnie przymocuj probówkę do ultracentryfugi do statywu z zaciskiem i przebij dno probówki igłą o rozmiarze 23 G i długości jednego cala przymocowaną do strzykawki. Ostrożnie przebij górną część probówki, aby uniknąć zaburzenia formy i gradientu, a wcześniej przeprowadź próbę, aby zapewnić pomyślny przebieg procesu PSA. Następnie wprowadź igłę podłączoną do przewodów pompy do górnej części probówki, w miejscu wolnym od cieczy, i zbieraj krople z dna bezpośrednio do sterylnych probówek Microfuge o pojemności 1,5 ml, pobierając frakcję co 30 sekund, tak aby każda frakcja miała objętość 425 µL.W tym przykładzie z każdego gradientu zbiera się 12 frakcji. Następnie należy zmierzyć gęstość każdej oddzielonej frakcji na wadze analitycznej. Odzyskiwanie DNA oraz sekwencjonowanie pirosequencing należy przeprowadzić zgodnie z protokołem tekstowym przez 24 godziny.Do diety larw ssop dodano 10 mM glukozy C 13. Do pożywienia owadów kontrolnych dodano taką samą ilość zwykłej glukozy. Następnie wyekstrahowano DNA z populacji bakteryjnej jelit owadów.Na żelu do elektroforezy silny prążek genomowego DNA u góry potwierdził pomyślną ekstrakcję DNA, a diagnostyczny PCR z użyciem uniwersalnych starterów bakteryjnych wykazał obecność bakteryjnego DNA. Przeprowadzono ilościowe sekwencjonowanie pirosekwencją bezpośrednio na reprezentatywnych gradientach SIP, aby ujawnić linie gatunkowe i ich względną liczność. Wygenerowano łącznie 120 045 wysokiej jakości odczytów o średniej długości 404 OTs.Profil sekwencjonowania pirosekwencyjnego wykazał zwiększoną liczebność niektórych gatunków, w tym enterococcus i panto, w próbce znakowanej w porównaniu z grupą kontrolną. W związku z tym bakterie te są uznawane za metabolicznie aktywne i zasługują na dalsze badania. Dlatego podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby w analizie CYP uwzględnić odpowiednią kontrolę.Dzięki temu zostanie zniwelowany wpływ tła oraz zanieczyszczeń w próbce włosa, co zapewni, że pojawianie się lub znikanie różnorodności i liczebności bakterii nie jest artefaktem samej masy próbki. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania można zastosować tę procedurę lub inne metodologie, takie jak hybrydyzacja in situ fluorescencyjna. W takim przypadku analizowana będzie lokalizacja i rozmieszczenie bakterii wewnątrz jelit owada.

identification-metabolically-active-bacteria-gut-generalist

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Identyfikacja metabolicznie aktywnych bakterii w jelitach ogólniaka Spodoptera littoralis poprzez badanie sondami stabilnych izotopów DNA za pomocą 13C-Glukozy

Metoda znakowania stabilnymi izotopami DNA (DNA stable-isotope probing) jest metodą niezależną od hodowli, służącą do identyfikacji i charakterystyki aktywnych społeczności mikroorganizmów zdolnych do wykorzystania określonych substratów. Asymilacja substratu wzbogaconego w ciężki izotop prowadzi do wbudowania znakowanych atomów w biomasę mikrobiologiczną. Ultracentryfugacja w gradiencie gęstości pozwala na odzyskanie znakowanego DNA do dalszych analiz molekularnych.

Analiza stabilnych izotopów w DNA (DNA-SIP)

Opisano profilowanie stabilnych izotopów za pomocą analizy chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas w celu badania przepływu metabolitów pośrednich u nicienia Caenorhabditis elegans. Szczegółowo przedstawiono metody oceny wzbogacenia izotopowego w dwutlenku węgla, kwasach organicznych i aminokwasach po ekspozycji na izotopy, zarówno podczas rozwoju na płytkach agarowych, jak i w okresie dorosłości w hodowli ciekłej.

Stabilne profilowanie izotopowe strumieni metabolicznych produktów pośrednich u Caenorhabditis elegans w stadium rozwojowym i dorosłym

Znakowanie izotopem 13C jest użyteczną techniką określania centralnego metabolizmu komórkowego dla różnych typów mikroorganizmów. Po hodowli komórek ze specyficznym znakowanym substratem, pomiar GC-MS może ujawnić funkcjonalne szlaki metaboliczne na podstawie unikalnych wzorów znakowania w aminokwasach proteinogennych.

Potwierdzanie i odkrywanie szlaków metabolicznych poprzez znakowanie 13C aminokwasów proteinogennych

Najczęstsze analizy zawartości jelit makrobezkręgowców są wizualne. Wymagając intensywnej wiedzy na temat różnorodności morfologicznej organizmów drapieżnych, pomijają zdobycz o miękkim ciele, a ze względu na silne rozdrobnienie zdobyczy są prawie niemożliwe dla niektórych organizmów, w tym obunogów. Zapewniamy szczegółowe, nowatorskie podejścia genetyczne do identyfikacji zdobyczy makrobezkręgowców w diecie obunogów.

Protokół laboratoryjny do analizy genetycznej zawartości jelit makrobezkręgowców wodnych przy użyciu starterów rDNA specyficznych dla grupy

Podejście markerów troficznych kwasów tłuszczowych, tj. asymilacja kwasów tłuszczowych jako całej cząsteczki i transfer do tkanki konsumenckiej bez lub z niewielkimi modyfikacjami, jest utrudnione przez luki w wiedzy na temat metabolizmu kwasów tłuszczowych u małych bezkręgowców glebowych. Profilowanie izotopologiczne jest cennym narzędziem do rozplątywania oddziaływań troficznych.

Profilowanie izotopologu kwasów tłuszczowych 13C zapewnia wgląd w troficzny transfer węgla i metabolizm lipidów u konsumentów bezkręgowców

Ten artykuł przedstawia protokół szybkiego testu identyfikacyjnego dla Bemisia tabaci opartego na technologii amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP). Protokół wymaga minimalnego przeszkolenia laboratoryjnego i dlatego może być wdrażany na miejscu w punktach wejścia dla importu roślin, takich jak porty morskie i lotnicze.

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) do szybkiej identyfikacji Bemisia tabaci

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Przedstawiamy proces izolacji, rozmnażania i charakteryzowania bakterii rozkładających węglowodory z siedlisk wodnych. W protokole opisano izolację bakterii, identyfikację metodą 16S rRNA oraz badanie ich potencjału degradacji węglowodorów. Ten artykuł pomoże naukowcom w scharakteryzowaniu różnorodności biologicznej drobnoustrojów w próbkach środowiskowych, a w szczególności w badaniach przesiewowych pod kątem drobnoustrojów o potencjale bioremediacji.

Izolacja, rozmnażanie i identyfikacja gatunków bakterii o właściwościach metabolizowania węglowodorów z siedlisk wodnych

Aby uzyskać aksenicznego owada, jego powierzchnia jaja jest sterylizowana, a wykluta larwa jest następnie hodowana za pomocą aksonicznych liści. Metoda ta zapewnia skuteczny sposób przygotowania owadów aksenowych bez podawania antybiotyków lub opracowywania sztucznej diety, którą można również zastosować do innych owadów żywiących się liśćmi.

Przygotowanie i hodowla owadów aksonowych z siewkami z hodowli tkankowej do badań interakcji mikrobioty gospodarz-jelito chrząszcza liściowego

Caenorhabditis elegans to potężny model do badania molekularnych determinantów kierujących interakcjami gospodarz-mikrobiom. Przedstawiamy wysokoprzepustowy potok profilujący poziomy kolonizacji mikrobiomu jelitowego u pojedynczych zwierząt wraz z kluczowymi aspektami fizjologii C. elegans.

Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący optyczną fototermiczną hybrydyzację in situ z fluorescencją podczerwieni (OPTIR-FISH), znaną również jako fototermiczna RYBA w średniej podczerwieni (MIP-FISH), do identyfikacji pojedynczych komórek i zrozumienia ich metabolizmu. Metodologia ta może być szeroko stosowana do różnych zastosowań, w tym do mapowania metabolizmu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Optyczna fototermiczna hybrydyzacja in situ z fluorescencją w podczerwieni (OPTIR-FISH)

Poznaj metodę sondowania stabilnych izotopów DNA z użyciem ¹³C-glukozy do identyfikacji metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie Spodoptera littoralis. Protokół łączy identyfikację filogenetyczną z aktywnością metaboliczną.

Identyfikacja metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie ogólnego Spodoptera littoralis za pomocą sondowania stabilnych izotopów DNA przy użyciu 13C-glukozy (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie ogólnego Spodoptera littoralis za pomocą sondowania stabilnych izotopów DNA przy użyciu ¹³C-glukozy

Przeglądaj więcej filmów