Name: Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Poznaj metodę transferu mikroRNA do komórek macierzystych CD133+ przy użyciu niewirusowej transfekcji magnetycznej. Ta technika umożliwia bezpieczną modyfikację genetyczną komórek szpiku kostnego z zachowaniem ich właściwości terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych Niemcy (FKZ 0312138A i FKZ 316159), Kraj Związkowy Meklemburgia-Pomorze Przednie z funduszy strukturalnych UE (ESF/IVWM-B34-0030/10 i ESF/IVBM-B35-0010/12), DFG (DA1296/2-1), Niemiecka Fundacja Kardiologiczna (F/01/12), BMBF (VIP+ 00240) i Fundacja DAMP. Ponadto F.H. i P.M. są wspierani przez program FORUN Centrum Medycznego Uniwersytetu w Rostocku (889001).

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W ostatnich latach SC CD133 + okazały się obiecującą populacją komórek dla terapii opartych na SC, o czym świadczy kilka badań klinicznych fazy I, II i III 43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54<sup clas...

CD133+ SCs reprezentują heterogeniczną populację komórek macierzystych i progenitorowych z obiecującym potencjałem dla medycyny regeneracyjnej. Ich hematopoetyczny, śródbłonkowy i miogenny potencjał różnicowania1,2,3 umożliwia komórkom CD133+, np. przyczynianie się do procesów neowaskularyzacji poprzez różnicowanie się w nowo tworzące się naczynia krwionośne i aktywację sygnalizacji proangiogennej przez mechanizmy parakrynne4,5,6,7.
Pomimo ich wysokiego potencjału wykazanego w ponad 30 zatwierdzonych badaniach klinicznych (ClinicalTrails.gov), ich wynik terapeutyczny jest nadal przedmiotem kontrowersyjnych dyskusji4. Rzeczywiście, kliniczne zastosowanie SC jest utrudnione przez niską retencję w narządzie będącym przedmiotem zainteresowania i masywną początkową śmierć komórki5,8,9. Dodatkowa inżynieria CD133+ SC przed przeszczepem może pomóc w przezwyciężeniu tych wyzwań.
Jednym z warunków wstępnych skutecznej terapii komórkowej byłoby zmniejszenie masowej początkowej śmierci komórki, aby zwiększyć wszczepianie komórek istotnych terapeutycznie10. Obecne badania wykazały ogromną utratę komórek wynoszącą 90–99% w wysoce ukrwionych narządach, takich jak mózg i serce, w ciągu pierwszych 1–2 godzin, niezależnie od typu przeszczepionej komórki lub drogi aplikacji11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Znakowanie SC za pomocą nanocząstek magnetycznych (MNP) umożliwia innowacyjną, nieinwazyjną strategię kierowania komórek w miejsce zainteresowania22,23,24,25,26 i jednocześnie umożliwia monitorowanie komórek za pomocą MRI27 i obrazowania cząstek magnetycznych (MPI). Najbardziej efektywne badania in vivo z zastosowaniem ukierunkowania na namagnesowane komórki wykorzystywały retencję komórek po miejscowym podaniu zamiast kierowania komórkami po wstrzyknięciu dożylnym23,24,28. Dlatego nasza grupa zaprojektowała system dostarczania składający się z superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza29. Dzięki tej technice, CD133+ SC i ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) mogą być skutecznie celowane, jak wykazano w próbach in vitro30,31.
Kolejną przeszkodą w terapiach SC jest wrogie środowisko zapalne dotkniętej tkanki po przeszczepie, które przyczynia się do początkowej śmierci komórki32. Oprócz kilku badań kondycjonowania wstępnego, przetestowano zastosowanie terapeutycznych miR 33; Udało się wykazać, że antyapoptotyczne miR hamują apoptozę in vitro i zwiększają wszczepianie komórek in vivo33. Te małe cząsteczki, złożone z 20–25 nukleotydów, odgrywają kluczową rolę jako posttranskrypcyjne modulatory informacyjnego RNA (mRNA), a tym samym wpływają na los i zachowanie komórek macierzystych34. Co więcej, egzogenne wprowadzenie miR pozwala uniknąć niepożądanej stabilnej integracji z genomem gospodarza34.
Obecne próby skutecznego wprowadzenia kwasów nukleinowych (NA) do pierwotnych SC opierają się głównie na rekombinowanych wirusach8,35. Pomimo wysokiej skuteczności transfekcji, manipulacja rekombinowanym wirusem stanowi główną przeszkodę dla translacji z laboratorium na łóżko, np. niekontrolowana ekspresja genów, patogenność, immunogenność i mutageneza insercji35,36. Dlatego opracowanie niewirusowych systemów dostarczania, takich jak konstrukty na bazie polimerów, ma kluczowe znaczenie. Wśród nich polietylenenina (PEI) stanowi ważny nośnik oferujący korzyści dla miR, takie jak kondensacja NA w celu ochrony przed degradacją, wychwytem komórkowym i uwalnianiem wewnątrzkomórkowym poprzez ucieczkę endosomalną37,38. Ponadto kompleksy miR-PEI wykazały wysoką biokompatybilność w badaniach klinicznych39. Dlatego nasz system dostarczania składa się z biotynylowanego, rozgałęzionego PEI o masie 25 kDa związanego z pokrytym streptawidyną rdzeniem MNP30,31,40.
W tym manuskrypcie prezentujemy obszerny protokół opisujący (i) ręczną izolację CD133+ SC od dawcy ludzkiego szpiku kostnego (BM) ze szczegółową charakterystyką produktu SC oraz (ii) efektywną i delikatną strategię transfekcji magnetycznie niewirusowego systemu dostarczania opartego na polimerach do inżynierii genetycznej SC CD133+ przy użyciu miRs. CD133+ SC są izolowane i magnetycznie wzbogacane z ludzkich aspiracji BM mostka przy użyciu systemu sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) opartego na przeciwciałach powierzchniowych. Następnie żywotność i czystość komórek są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Następnie przygotowuje się kompleksy miR/PEI/MNP i transfekuje CD133+ SC. 18 godzin po transfekcji analizowana jest skuteczność wychwytu i wpływ transfekcji na ekspresję markera SC i żywotność komórek. Ponadto ocena wewnątrzkomórkowego rozmieszczenia związków kompleksu transfekcji odbywa się za pomocą znakowania czterokolorowego i mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SIM).

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy z błękitem metylenowym</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>7060</td><td>3%</td></tr> <tr><td>anty-CD133/2-PE (klon: 293C3)</td> <td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD34-FITC (klon: AC136)</td> <td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-081-001</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD45-APC-H7 (klon: 2D1)</td> <td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>560178</tr><tr><td>barwnik rodaminy; Barwnik Atto 565 sprzężony z biotyną</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>CD133 superparamagnetyczne cząstki dekstranu żelaza sprzężone z przeciwciałem; CD133 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-049</td><td></td></tr><tr><td>kolagenaza B</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>komora licząca</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyjanina 3 barwnik oznaczony jako prekursor miR; Cy3 Znakowana barwnikiem kontrola ujemna Pre-miR #1</td><td>Zestaw</td><td></td> do znakowania Ambion AM17120 <td></td></tr><tr><td>Cyjanina 5 barwnik miR; Cy5 dye Label IT Zestaw do znakowania miRNA Mirus</td><td>Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10104159001</td><td>(100 U/mL)</td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 mikroskop konfokalny</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR, ludzki</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>jasnozielony zestaw do znakowania białek; Oregon Green 488 Zestaw do znakowania białek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O10241</td><td></td></tr><tr><td>wodne podłoże montażowe; Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>probówka wirówkowa z gradientem gęstości; Probówka wirówkowa Leukosep</td><td>Greiner Bio-One</td><td>89048-932</td><td></td></tr><tr><td>MACS uchwyt magnetyczny; MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Filtr do separacji wstępnej MACS</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-041-407</td><td>30 &micro; m</td></tr><tr><td>Kolumna separacyjna MACS (MS / LS)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-201 / 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Magnes trwały MACS; Separator MACS</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV Filtr PVDF</td><td>Merck</td><td>SLHV013SL</td><td>0,45 &mu; m</td></tr><tr><td>mysz IgG 2b-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-215</td><td></td></tr><tr><td>barwnik reaktywny aminowy; Near-IR LIVE/DEAD Zestaw do naprawy barwienia martwych komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>pożywka do separacji ludzkich limfocytów; Pancoll</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-60500</td><td>gęstość: 1,077 g/ml</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-53500</td><td>bez Ca i Mg</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>408727</td><td>rozgałęziony; 25 kDa</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>PFA</td><td>, Merck, Schuchardt, OHG</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>nieznakowany prekursor miR; Pre-miR miRNA Prekursor Kontrola negatywna #1</td><td>Ambion</td><td>AM17110</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do dekontaminacji RNAzy; RNaseZap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>pożywka dla ludzkich limfocytów; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-16500</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany suplement cytokin ludzkich; StemSpan CC100</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2690</td><td></td></tr><tr><td>pożywka do namnażania komórek krwiotwórczych bez surowicy; StemSpan H3000</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9800</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna MagneSphere Cząstki paramagnetyczne</td><td>Promega Corporation</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>T8154</td><td>0,4 %</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>0,5 M; pH 8,0</td></tr><tr><td>ZEN2011 oprogramowanie</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 1000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonorex RK 100 SH sonikująca łaźnia wodna</td><td>Bandelin elektroniczna</td><td></td><td>Ultradźwiękowa moc nominalna: 80 W; Częstotliwość ultradźwiękowa: 35 kHz</td></tr></tbody></table>

protokół transferu mikrorna do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Chociaż udowodniono, że hematopoetyczne komórki macierzyste (SC) CD133+ mają duży potencjał w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, ich niskie wskaźniki retencji po wstrzyknięciu do uszkodzonych tkanek, jak również obserwowane masowe wskaźniki śmierci komórek prowadzą do bardzo ograniczonych efektów terapeutycznych. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, staraliśmy się ustalić protokół nieoparty na wirusach dla odpowiedniej inżynierii komórkowej przed ich podaniem. Modyfikacja ludzkich SC z ekspresją CD133+ za pomocą polipleksów magnetycznych obciążonych mikroRNA (miR) została skupiona pod kątem wydajności i bezpieczeństwa wychwytu, a także potencjału celowania komórek. Opierając się na naszym protokole, możemy osiągnąć wysokie wskaźniki wychwytu miR na poziomie 80-90%, podczas gdy właściwości komórek macierzystych CD133+ pozostają nienaruszone. Co więcej, te zmodyfikowane ogniwa oferują opcję celowania magnetycznego. Opisujemy tutaj bezpieczną i wysoce wydajną procedurę modyfikacji SC CD133+. Oczekujemy, że takie podejście zapewni standardową technologię optymalizacji efektów terapeutycznych komórek macierzystych i monitorowania podawanego produktu komórkowego za pomocą obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI).

Przedstawiony protokół opisuje ręczną izolację i magnetyczne wzbogacenie ludzkich komórek macierzystych CD133+ pochodzących z szpiku kostnego, z następującą strategią inżynierii komórkowej niezależnej od wirusów, jako nieinwazyjną technologię do manipulacji komórkami in vitro oraz narzędzie do monitorowania in vivo.
Ta trzyetapowa technologia izolacji umożliwia oddzielenie MNC z uprzednio strawionego...

Ten protokół ilustruje bezpieczną i skuteczną procedurę modyfikacji krwiotwórczych komórek macierzystych CD133+. Zaprezentowane niewirusowe, oparte na polipleksie magnetycznym podejście może stanowić podstawę do optymalizacji efektów terapeutycznych komórek macierzystych, a także do monitorowania podawanego produktu komórkowego za pomocą rezonansu magnetycznego.

Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Nasz protokół może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, takie jak to, czy komórki można ulepszyć pod kątem korzystnych właściwości, a także czy można je ukierunkować na interesujące Cię miejsce. Główną zaletą naszego protokołu jest fakt, że komórki mogą być przejściowo, genetycznie modyfikowane przy użyciu naszej metody transfekcji niewirusowej, zachowując w ten sposób właściwości komórek. Metoda Sautera może dostarczyć informacji na temat modyfikacji hematopoetycznych komórek macierzystych, które można zastosować do innych typów komórek stosowanych do przeszczepów, takich jak mezenchymalne komórki macierzyste.Aby rozpocząć protokół, podgrzej pożywkę ludzkich limfocytów do temperatury pokojowej i rozmroź kolagenazę B i DNazę. Zbierz szpik kostny lub BM do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Wyrzuć wszystkie istniejące skrzepy.Pobrać próbkę BM o objętości 200 mikrolitrów do późniejszej analizy cytometrii przepływowej. Przechowywać próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu, gdy będzie potrzebna. Następnie przenieś dziesięć mililitrów BM do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki i dodaj sześć mililitrów PBS EDTA, 20 mililitrów ludzkiej pożywki limfocytowej, 175 mikrolitrów kolagenazy B i 175 mikrolitrów DNazy.Delikatnie wymieszaj roztwór i inkubuj go przez 30 minut w temperaturze pokojowej na shakerze. Zagruntować probówkę wirówkową o gradientowej gęstości 50 mililitrów, nakładając 15 mililitrów pożywki do separacji ludzkich limfocytów do probówki o pojemności 50 mililitrów i odwirowując ją w temperaturze 1,000 razy G przez 30 sekund. Ostrożnie nałożyć 35 mililitrów rozcieńczonego BM na filtr probówkowy wirówki z gradientem gęstości i odwirować probówkę pod ciśnieniem 445 razy G przez 35 minut.Delikatnie wyjmij probówkę z wirówki, nie potrząsając. Ostrożnie wyrzuć maksymalnie 20 mililitrów z górnego klarownego roztworu, nie dotykając mętnej warstwy bezpośrednio na filtrze. Ostrożnie przenieś mętną warstwę zawierającą komórki jednojądrzaste lub MNC do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i napełnij ją PBS EDTA do końcowej objętości 50 mililitrów.Policz MNC, przenosząc 10 mikrolitrów 50-mililitrowej zawiesiny komórkowej do 1,5-mililitrowej probówki. Dodaj 10 mikrolitrów 3% kwasu octowego z błękitem metylenowym. Delikatnie wymieszaj zawartość i nałóż 10 mikrolitrów do komory liczącej.Oblicz liczbę MNC. Odwiruj zawiesinę MNC pod ciśnieniem 300 razy G przez 10 minut. Odrzucić supernatant.Aby przygotować wybór magnetyczny dla jednej razy od 10 do ósmej całkowitej liczby komórek, ostrożnie ponownie zawieś MNC w 300 mikrolitrach bufora MACS. Dodaj 100 mikrolitrów odczynnika blokującego FCR i 100 mikrolitrów superparamagnetycznych cząstek dekstranu żelaza połączonych z przeciwciałem CD133. Następnie delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową i inkubuj ją przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Delikatnie wstrząsnąć zawiesiną komórkową podczas inkubacji dwa do trzech razy. Po inkubacji dodaj dwa mililitry buforu MACS na jeden razy 10 komórek. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową i odwiruj mieszaninę w temperaturze 300 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Skonfiguruj uchwyt magnesu MACS i przymocuj magnes trwały MACS. Zainstaluj kolumnę MACS i nałóż filtr wstępnej separacji na górze. Zrównoważyć pierwszą kolumnę MACS i filtr wstępnej separacji z buforem MACS.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu MACS. Nanieść zawiesinę komórek na filtr wstępnej separacji. Umyj kolumnę MACS i filtr wstępnej separacji trzy razy i wyrzuć filtr wstępnej separacji.Eluuj frakcję komórkową bezpośrednio do drugiej kolumny MACS. Natychmiast przenieś pierwszą kolumnę MACS nad drugą kolumnę MACS i przepchnij zawiesinę ogniw przez kolumnę MACS za pomocą dostarczonego tłoka. Umyj kolumnę MACS 3 razy za pomocą bufora MACS.Eluuj frakcję komórkową z kolumny, dodając bufor MACS do drugiej kolumny MACS i usuwając kolumnę MACS z magnesu trwałego MACS. Natychmiast przenieś drugą kolumnę MACS nad probówkę i przepchnij zawiesinę roztworu komórkowego przez kolumnę MACS. Odwirować probówkę.Ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu MACS. Pobrać próbkę o rozmiarze 10 razy 10 do czwartej komórki do późniejszej analizy cytometrii przepływowej. Ponownie zawiesić pozostałe komórki w pożywce hodowlanej i wysiać nasiona pięć razy 10 do czwartych komórek na 24-dołkowej płytce w celu transfekcji.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2 i 20% O2. Do analizy należy użyć dwóch 10 mikrolitrowych próbek podwielokrotności BM i jednej próbki świeżo wyizolowanych SC z dodatnim wynikiem CD133. Przenieś komórki do probówki o pojemności 1,5 mililitra.Dodać 10 mikrolitrów odczynnika blokującego FcR i napełnić probówkę buforem MACS do objętości 33 mikrolitrów. Dodać przeciwciała na wewnętrzną stronę probówki. Po dodaniu wszystkich przeciwciał należy wstrząsnąć stroną probówki zawierającą przeciwciała.Delikatnie wymieszaj roztwór, który ma końcową objętość 50 mikrolitrów, i inkubuj go przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj jeden mililitr jednej X czerwonej krwinki lub buforu do lizy RBC. Delikatnie wymieszać zawiesinę i inkubować roztwór na lodzie przez 10 minut.Następnie odwirować zawiesinę. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić otrzymany osad w 100 mikrolitrach PBS. Oceń czystość i żywotność komórek za pomocą pomiarów cytometrii przepływowej.Użyj 20 pikomoli MIR na dołek na płytkę 24-dołkową. Rozcieńczyć MIR w 5% roztworze glukozy do końcowego stężenia 0,25% MIR pikomoli na mikrolitr. Rozcieńczyć PEI w równej ilości 5% roztworu glukozy.Następnie dodaj wstępnie rozcieńczony PEI do wstępnie rozcieńczonego MIR i wiruj przez 30 sekund. Podczas inkubacji kompleksów MIR PEI przez 30 minut w temperaturze pokojowej, należy sonikować nanocząstki magnetyczne lub MNP przez 20 minut przy 35 kilohercach w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej. Upewnij się, że cząstki są w zawiesinie i nie agregują się.Dodaj sonikowane MNP do kompleksów MIR PEI i wiruj roztwór przez 30 sekund. Inkubować kompleksy MIR PEI MNP przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dodać kompleks MIRNA PEI MNP kroplami bezpośrednio do odpowiedniego dołka zawierającego świeżo wyizolowane CD133 dodatnie SC w pożywce hodowlanej.Delikatnie wymieszaj, kołysząc talerzem w przód iw tył. Inkubuj komórki. 18 godzin po transfekcji zbierz zawartość każdej studzienki w osobnej probówce o pojemności 1,5 mililitra.Przemyć każdą studzienkę raz 500 mikrolitrami PBS i przenieść tę zawiesinę komórek do tej samej probówki. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 300 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach bufora MACS.Dodaj 0,5 mikrolitra barwnika reagującego z aminami, aby odróżnić żywe i martwe komórki. Delikatnie wymieszaj zawiesinę i inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj jeden mililitr PBS i ponownie odwiruj komórki w temperaturze 300 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wyrzuć supernatant, ponownie zawiesić otrzymany osad w 100 mikrolitrach PBS, dodaj 33 mikrolitry 4% PFA i energicznie wymieszaj. Oceń skuteczność wychwytu MIR i cytotoksyczność za pośrednictwem transfekcji za pomocą pomiarów cytometrii przepływowej. Postępując zgodnie z metodą opisaną w protokole, cytometria przepływowa wykazała, że magnetycznie wzbogacona frakcja komórek CD133 dodatnich dawała żywotność i czystość wyższą niż 80%Opisana tutaj metoda transfekcji pozwala na bardzo skuteczne wprowadzenie MIR do tych świeżo izolowanych ludzkich CD133-dodatnich SC.Ze skutecznością absorpcji wynoszącą około 80% żywotnych komórek. Ponadto nie ma znaczących efektów cytotoksycznych widocznych 18 godzin po transfekcji w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Co więcej, wystarczające dostarczanie i zwykłą dystrybucję związków kompleksu transfekcji można zaobserwować w cytoplazmie komórek za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego lub SIM.Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak aplikacja zmodyfikowanych komórek macierzystych in vivo. Pozwoli to na zbadanie rzeczywistego przeżycia i skutków w warunkach dynamicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować transfekcję opartą na polimerach i nanocząstkach magnetycznych, aby skutecznie wprowadzić mikroRNA do świeżo hematopoetycznych komórek macierzystych.

protocol-for-microrna-transfer-into-adult-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Ukierunkowane dostarczanie komórek jest przydatne w różnych zastosowaniach biomedycznych.  Celem tego protokołu jest wykorzystanie superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (SPION) do znakowania komórek, a tym samym umożliwienie podejścia do magnetycznego celowania w komórki w celu uzyskania wysokiego stopnia kontroli nad dostarczaniem i lokalizacją komórek.

Znakowanie i celowanie w komórki za pomocą superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza

Chondrogeneza z komórek macierzystych wymaga precyzyjnego dostrojenia warunków hodowli. W tym miejscu przedstawiamy magnetyczne podejście do kondensacji komórek, które jest niezbędnym krokiem do zainicjowania chondrogenezy. Ponadto wykazaliśmy, że dynamiczne dojrzewanie w bioreaktorze stosuje mechaniczną stymulację konstruktów komórkowych i zwiększa produkcję chrzęstnej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Agregacja magnetycznych komórek macierzystych 3D i dojrzewanie bioreaktora w celu regeneracji chrząstki

Ten manuskrypt opisuje efektywne, niewirusowe dostarczanie miR do komórek śródbłonka przez wektor PEI/MNP i ich namagnesowanie. Tak więc, oprócz modyfikacji genetycznej, podejście to pozwala na magnetyczne prowadzenie komórek i wykrywalność MRI. Technika ta może być stosowana w celu poprawy właściwości terapeutycznych produktów komórkowych.

Przygotowanie i charakterystyka in vitro namagnesowanych komórek śródbłonka zmodyfikowanych miR

Ten protokół opisuje przejściową inżynierię genetyczną komórek macierzystych zębów pobranych z ludzkiego mieszków zębowych. Zastosowana strategia modyfikacji niewirusowej może stać się podstawą do udoskonalenia terapeutycznych produktów z wykorzystaniem komórek macierzystych.

Izolacja, charakterystyka i modyfikacja genetyczna ludzkich komórek pęcherzyków zębowych w oparciu o mikroRNA

Opisujemy zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) do oceny potencjału nowotworowego genetycznie modyfikowanych komórek krwiotwórczych. HSCT jest przydatny do oceny różnych złośliwych komórek krwiotwórczych in vivo, a także do generowania dużej kohorty myszy z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub białaczką w celu oceny nowych terapii.

Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek CD34+ naczelnych innych niż człowiek z przygotowanego szpiku kostnego, modyfikowanie genów tych komórek za pomocą wektorów lentiwirusowych oraz przygotowanie produktu do infuzji do autologicznego gospodarza. Łączna długość protokołu wynosi około 48 godzin.

Przygotowanie i modyfikacja genów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę hodowli hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w celu solidnego wszczepienia komórek z edytowanymi genami in vivo.

Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej

Ten protokół opisuje procedurę edycji genomu w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy przy użyciu kompleksów rybonukleoprotein Cas9-sgRNA składanych in vitro i dostarczanych przez elektroporację.

Wysokowydajne rozrywanie genów w pierwotnych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego przy użyciu elektroporowanych kompleksów Cas9-sgRNA

Ten protokół opisuje doudowe wstrzyknięcie kilku krwiotwórczych lub białaczkowych komórek macierzystych, w tym komórek z edytowanymi genami, w mysich modelach ksenoprzeszczepów, co nie tylko umożliwi szybki i bezpieczny przeszczep komórek, ale także seryjne analizy szpiku kostnego.

Uproszczone iniekcje doudowe przy użyciu żywych myszy pozwalają na ciągłą analizę szpiku kostnego

Poznaj metodę transferu mikroRNA do komórek macierzystych CD133+ przy użyciu niewirusowej transfekcji magnetycznej. Ta technika umożliwia bezpieczną modyfikację genetyczną komórek szpiku kostnego z zachowaniem ich właściwości terapeutycznych.

Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym (Wideo) | JoVE Journal

Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym

Przeglądaj więcej filmów