Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym

Nasz protokół może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, takie jak to, czy komórki można ulepszyć pod kątem korzystnych właściwości, a także czy można je ukierunkować na interesujące Cię miejsce. Główną zaletą naszego protokołu jest fakt, że komórki mogą być przejściowo, genetycznie modyfikowane przy użyciu naszej metody transfekcji niewirusowej, zachowując w ten sposób właściwości komórek. Metoda Sautera może dostarczyć informacji na temat modyfikacji hematopoetycznych komórek macierzystych, które można zastosować do innych typów komórek stosowanych do przeszczepów, takich jak mezenchymalne komórki macierzyste.

Aby rozpocząć protokół, podgrzej pożywkę ludzkich limfocytów do temperatury pokojowej i rozmroź kolagenazę B i DNazę. Zbierz szpik kostny lub BM do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Wyrzuć wszystkie istniejące skrzepy.

Pobrać próbkę BM o objętości 200 mikrolitrów do późniejszej analizy cytometrii przepływowej. Przechowywać próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu, gdy będzie potrzebna. Następnie przenieś dziesięć mililitrów BM do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki i dodaj sześć mililitrów PBS EDTA, 20 mililitrów ludzkiej pożywki limfocytowej, 175 mikrolitrów kolagenazy B i 175 mikrolitrów DNazy.

Delikatnie wymieszaj roztwór i inkubuj go przez 30 minut w temperaturze pokojowej na shakerze. Zagruntować probówkę wirówkową o gradientowej gęstości 50 mililitrów, nakładając 15 mililitrów pożywki do separacji ludzkich limfocytów do probówki o pojemności 50 mililitrów i odwirowując ją w temperaturze 1,000 razy G przez 30 sekund. Ostrożnie nałożyć 35 mililitrów rozcieńczonego BM na filtr probówkowy wirówki z gradientem gęstości i odwirować probówkę pod ciśnieniem 445 razy G przez 35 minut.

Delikatnie wyjmij probówkę z wirówki, nie potrząsając. Ostrożnie wyrzuć maksymalnie 20 mililitrów z górnego klarownego roztworu, nie dotykając mętnej warstwy bezpośrednio na filtrze. Ostrożnie przenieś mętną warstwę zawierającą komórki jednojądrzaste lub MNC do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i napełnij ją PBS EDTA do końcowej objętości 50 mililitrów.

Policz MNC, przenosząc 10 mikrolitrów 50-mililitrowej zawiesiny komórkowej do 1,5-mililitrowej probówki. Dodaj 10 mikrolitrów 3% kwasu octowego z błękitem metylenowym. Delikatnie wymieszaj zawartość i nałóż 10 mikrolitrów do komory liczącej.

Oblicz liczbę MNC. Odwiruj zawiesinę MNC pod ciśnieniem 300 razy G przez 10 minut. Odrzucić supernatant.

Aby przygotować wybór magnetyczny dla jednej razy od 10 do ósmej całkowitej liczby komórek, ostrożnie ponownie zawieś MNC w 300 mikrolitrach bufora MACS. Dodaj 100 mikrolitrów odczynnika blokującego FCR i 100 mikrolitrów superparamagnetycznych cząstek dekstranu żelaza połączonych z przeciwciałem CD133. Następnie delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową i inkubuj ją przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Delikatnie wstrząsnąć zawiesiną komórkową podczas inkubacji dwa do trzech razy. Po inkubacji dodaj dwa mililitry buforu MACS na jeden razy 10 komórek. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową i odwiruj mieszaninę w temperaturze 300 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Skonfiguruj uchwyt magnesu MACS i przymocuj magnes trwały MACS. Zainstaluj kolumnę MACS i nałóż filtr wstępnej separacji na górze. Zrównoważyć pierwszą kolumnę MACS i filtr wstępnej separacji z buforem MACS.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu MACS. Nanieść zawiesinę komórek na filtr wstępnej separacji. Umyj kolumnę MACS i filtr wstępnej separacji trzy razy i wyrzuć filtr wstępnej separacji.

Eluuj frakcję komórkową bezpośrednio do drugiej kolumny MACS. Natychmiast przenieś pierwszą kolumnę MACS nad drugą kolumnę MACS i przepchnij zawiesinę ogniw przez kolumnę MACS za pomocą dostarczonego tłoka. Umyj kolumnę MACS 3 razy za pomocą bufora MACS.

Eluuj frakcję komórkową z kolumny, dodając bufor MACS do drugiej kolumny MACS i usuwając kolumnę MACS z magnesu trwałego MACS. Natychmiast przenieś drugą kolumnę MACS nad probówkę i przepchnij zawiesinę roztworu komórkowego przez kolumnę MACS. Odwirować probówkę.

Ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu MACS. Pobrać próbkę o rozmiarze 10 razy 10 do czwartej komórki do późniejszej analizy cytometrii przepływowej. Ponownie zawiesić pozostałe komórki w pożywce hodowlanej i wysiać nasiona pięć razy 10 do czwartych komórek na 24-dołkowej płytce w celu transfekcji.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2 i 20% O2. Do analizy należy użyć dwóch 10 mikrolitrowych próbek podwielokrotności BM i jednej próbki świeżo wyizolowanych SC z dodatnim wynikiem CD133. Przenieś komórki do probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Dodać 10 mikrolitrów odczynnika blokującego FcR i napełnić probówkę buforem MACS do objętości 33 mikrolitrów. Dodać przeciwciała na wewnętrzną stronę probówki. Po dodaniu wszystkich przeciwciał należy wstrząsnąć stroną probówki zawierającą przeciwciała.

Delikatnie wymieszaj roztwór, który ma końcową objętość 50 mikrolitrów, i inkubuj go przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj jeden mililitr jednej X czerwonej krwinki lub buforu do lizy RBC. Delikatnie wymieszać zawiesinę i inkubować roztwór na lodzie przez 10 minut.

Następnie odwirować zawiesinę. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić otrzymany osad w 100 mikrolitrach PBS. Oceń czystość i żywotność komórek za pomocą pomiarów cytometrii przepływowej.

Użyj 20 pikomoli MIR na dołek na płytkę 24-dołkową. Rozcieńczyć MIR w 5% roztworze glukozy do końcowego stężenia 0,25% MIR pikomoli na mikrolitr. Rozcieńczyć PEI w równej ilości 5% roztworu glukozy.

Następnie dodaj wstępnie rozcieńczony PEI do wstępnie rozcieńczonego MIR i wiruj przez 30 sekund. Podczas inkubacji kompleksów MIR PEI przez 30 minut w temperaturze pokojowej, należy sonikować nanocząstki magnetyczne lub MNP przez 20 minut przy 35 kilohercach w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej. Upewnij się, że cząstki są w zawiesinie i nie agregują się.

Dodaj sonikowane MNP do kompleksów MIR PEI i wiruj roztwór przez 30 sekund. Inkubować kompleksy MIR PEI MNP przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dodać kompleks MIRNA PEI MNP kroplami bezpośrednio do odpowiedniego dołka zawierającego świeżo wyizolowane CD133 dodatnie SC w pożywce hodowlanej.

Delikatnie wymieszaj, kołysząc talerzem w przód iw tył. Inkubuj komórki. 18 godzin po transfekcji zbierz zawartość każdej studzienki w osobnej probówce o pojemności 1,5 mililitra.

Przemyć każdą studzienkę raz 500 mikrolitrami PBS i przenieść tę zawiesinę komórek do tej samej probówki. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 300 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach bufora MACS.

Dodaj 0,5 mikrolitra barwnika reagującego z aminami, aby odróżnić żywe i martwe komórki. Delikatnie wymieszaj zawiesinę i inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj jeden mililitr PBS i ponownie odwiruj komórki w temperaturze 300 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wyrzuć supernatant, ponownie zawiesić otrzymany osad w 100 mikrolitrach PBS, dodaj 33 mikrolitry 4% PFA i energicznie wymieszaj. Oceń skuteczność wychwytu MIR i cytotoksyczność za pośrednictwem transfekcji za pomocą pomiarów cytometrii przepływowej. Postępując zgodnie z metodą opisaną w protokole, cytometria przepływowa wykazała, że magnetycznie wzbogacona frakcja komórek CD133 dodatnich dawała żywotność i czystość wyższą niż 80%Opisana tutaj metoda transfekcji pozwala na bardzo skuteczne wprowadzenie MIR do tych świeżo izolowanych ludzkich CD133-dodatnich SC.

Ze skutecznością absorpcji wynoszącą około 80% żywotnych komórek. Ponadto nie ma znaczących efektów cytotoksycznych widocznych 18 godzin po transfekcji w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Co więcej, wystarczające dostarczanie i zwykłą dystrybucję związków kompleksu transfekcji można zaobserwować w cytoplazmie komórek za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego lub SIM.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak aplikacja zmodyfikowanych komórek macierzystych in vivo. Pozwoli to na zbadanie rzeczywistego przeżycia i skutków w warunkach dynamicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować transfekcję opartą na polimerach i nanocząstkach magnetycznych, aby skutecznie wprowadzić mikroRNA do świeżo hematopoetycznych komórek macierzystych.