Przygotowanie i charakterystyka in vitro namagnesowanych komórek śródbłonka zmodyfikowanych miR
2 maja 2017
Ten manuskrypt opisuje efektywne, niewirusowe dostarczanie miR do komórek śródbłonka przez wektor PEI/MNP i ich namagnesowanie. Tak więc, oprócz modyfikacji genetycznej, podejście to pozwala na magnetyczne prowadzenie komórek i wykrywalność MRI. Technika ta może być stosowana w celu poprawy właściwości terapeutycznych produktów komórkowych.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie techniki zapewniającej modyfikację komórek za pomocą microRNA przy jednoczesnej magnetyzacji komórek. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, takich jak inżynieria genetyczna komórek przed transplantacją.
Oprócz efektywnej modyfikacji komórek za pomocą mikroRNA, przeprowadzono ją również z zastosowaniem tlenku żelaza. Może to być wykorzystane do zwiększenia retencji komórek w interesującym obszarze poprzez zastosowanie pola magnetycznego. Terapia komórkowa jest bardzo obiecująca w leczeniu chorób serca, jednak niska retencja oraz przeżywalność komórek wymagają pilnej poprawy.
Należy rozpocząć procedurę od hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej w celu przygotowania kompleksów do transfekcji, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Na 48 godzin przed transfekcją należy wysiać komórki HUVEC na plastikowe płytki hodowlane o odpowiednim rozmiarze, przy początkowej gęstości nasienienia wynoszącej około 13 000 komórek na centymetr kwadratowy powierzchni wzrostu.
Następnie należy przygotować świeże nanocząstki miR/polietylenoiminu/superparamagnetycznego tlenku żelaza. Najpierw rozcieńczyć 2,5 pmol mikroRNA na centymetr kwadratowy powierzchni wzrostu komórek w pięcioprocentowym roztworze glukozy, aby uzyskać końcowe stężenie 0,125 pmol mikroRNA na µL. Następnie rozcieńczyć PEI w równym objętościowo pięcioprocentowym roztworze glukozy.
Dodaj rozcieńczony PEI do roztworu mikroRNA i wymieszaj otrzymaną mieszaninę w wortexerze przez 30 sekund. Następnie inkubuj mieszaninę miR/PEI przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Poddaj MNP działaniu ultradźwięków przez co najmniej 20 minut w sonikacyjnej kąpieli wodnej w temperaturze pokojowej.
Następnie należy dodać odpowiednią ilość roztworu MNP do gotowej mieszaniny miR/PEI. Po wymieszaniu w wirówce typu vortex przez 30 seconds, inkubować przez 30 minutes w temperaturze pokojowej. Następnie przygotowaną mieszaninę miR/PEI/MNP dodawać kroplami bezpośrednio do pożywki hodowlanej na komórki.
Sześć godzin po transfekcji należy zastąpić tę mieszaninę świeżą pożywką hodowlaną. Po analizie bezpieczeństwa wektora, opisanej w protokole tekstowym, potwierdzić i scharakteryzować wewnątrzkomórkową lokalizację kompleksów transfekcyjnych za pomocą konfokalnej i super-rozdzielczej mikroskopii z iluminacją strukturalną. W tym celu wysiać komórki HUVEC na pokrywkach szklanych powlekanych żelatyną, umieszczonych w dołkach 24-dołkowych płytek hodowlanych, analogicznie jak wcześniej.
Przeprowadź transfekcję komórek za pomocą znakowanego trzema kolorami miR/PEI/MNP i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5% CO2. Przemyj szkiełka podstawowe najpierw 2% albuminą surowicy bydlęcej i solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, a następnie samym PBS. Utrwal komórki, inkubując je w 4% paraformaldehydzie lub PFA w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
Przemyj próbki za pomocą PBS, a następnie zabarw jądra komórkowe barwnikiem DAPI zgodnie ze standardowymi protokołami. Następnie przemyj komórki PBS-em trzykrotnie przez 15 minut na wytrząsarce, aby usunąć nadmiar barwnika. Umieść przygotowane szkiełka nakrywki na preparatach mikroskopowych, używając odpowiedniego medium montażowego, i pozostaw preparaty do wyschnięcia na co najmniej jedną godzinę przed przystąpieniem do analizy mikroskopowej.
Należy pozyskać obrazy, korzystając z obiektywu imersyjnego olejowego 63x, zgodnie z ustawieniami SIM opisanymi w protokole tekstowym. W celu targetowania komórek i symulacji dynamicznych warunków in vitro, najpierw należy przeprowadzić transfekcję HUVEC w płytce 24-dołkowej, postępując jak poprzednio. Po 24-godzinnej inkubacji należy wypłukać komórki.
Następnie dodaj 1x trips w EDTA rozcieńczonym w PBS i inkubuj komórki przez cztery minuty w temperaturze 37 °C przed ich zebraniem. Odwiruj zebrane komórki przy 300 ×g przez 10 minut. Wymieszaj osad komórkowy otrzymany z jednej studni z 1 mL świeżej pożywki hodowlanej.
Następnie przenieś komórki do pojedynczej studni płytki 12-dołkowej. Przymocuj lokalnie mały magnes za pomocą taśmy. Umieść płytkę hodowlaną na wytrząsarce i inkubuj zawiesinę komórek przez 12 godzin przy 150 RPM, aby zasymulować warunki dynamiczne.
Następnie przemyć komórki i utrwal je za pomocą 4% PFA. Przebarw jądra komórkowe barwnikiem DAPI. Przechwyć obraz przylegania komórek za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego z laserami wzbudzenia 405 i 504 nm w trybie z-stack w celu uzyskania surowych danych.
W celu przygotowania obrazów do analizy należy zastosować przetwarzanie obrazu metodą maksymalnej projekcji intensywności. Do analizy ilościowej komórek reagujących i niereagujących na pole magnetyczne należy najpierw przeprowadzić transfekcję HUVECs w płytce 24-dołkowej. Komórki należy inkubować przez 24 godziny przed ich wypłukaniem i zebraniem zgodnie z wcześniej opisaną procedurą.
Osad komórkowy uzyskany z każdej studni resuspender w 500 µL podgrzanego, sterylnego buforu do sortowania komórek. Zawiesinę komórkową nanieść na kolumnę do sortowania magnetycznego zamocowaną za pomocą dostarczonego magnesu. Następnie przemyć kolumny na magnesie trzykrotnie świeżym buforem do sortowania komórek.
Zbierz prześwit jako frakcję nieodpowiadającą na pole magnetyczne. Zdejmij kolumny z magnesu i natychmiast zbierz frakcję komórek odpowiadającą na pole magnetyczne, przepychając świeży bufor do sortowania komórek przez kolumnę za pomocą tłoka. Odwiruj obie frakcje Mag- oraz Mag+ przy 300 ×g przez 10 minut.
Po ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w PBS, należy policzyć komórki i ocenić ich żywotność za pomocą testu wykluczania błękitu trypanu. Komórki HUVEC, izolowane z pępków, charakteryzują się ekspresją markera śródbłonkowego CD31 oraz zdolnością do tworzenia rurek na matrycy błony podstawnej. Komórki HUVEC przetransfekowane kompleksem miR/PEI/MNP wykazują pobranie znakowanego miR.
Ich przeżywalność pozostaje niezmieniona 24 godziny po transfekcji. Ponadto mikroskopia superrozdzielcza wykazuje paranuklearną lokalizację kompleksów transfekcyjnych znakowanych trzema kolorami. Toksyczność PEI została potwierdzona przez obniżoną funkcjonalność komórek transfekowanych miR/PEI.
Co istotne, MNP przywraca właściwości komórkowe. Komórki zmodyfikowane za pomocą miR/PEI/MNP nie różnią się od komórek niepoddanych działaniu preparatu pod względem tworzenia cewek. Ponadto komórki te zachowują międzykomórkową komunikację poprzez połączenia szczelinowe, co wykazano w badaniu fluorescencyjnym po fotowybielaniu (FRAP).
Po wysianiu zawiesiny komórek zmodyfikowanych miR/PEI/MNP w dołkach płytki hodowlanej umieszczonej na wytrząsarce rotacyjnej, komórki mają tendencję do migracji i przywierania w obszarze lokalnego przyłożenia magnesu. Reprezentatywne obrazy przedstawiają wzrost komórek w obszarze z zastosowaniem magnesu. Bez zastosowania magnesu.
Oraz w centrum dołka hodowlanego, gdzie przepływ cieczy koncentrował komórki. Po opanowaniu techniki transfekcja komórek może zostać przeprowadzona w ciągu dwóch godzin. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć bardzo dobre wyobrażenie o tym, jak w sposób przejściowy, lecz wysoce wydajny, modyfikować komórki śródbłonka, wliczając w to ich magnetyzację.
A także jak przeprowadzić końcową charakterystykę produktu komórkowego. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest przestrzeganie podanych wartości w odniesieniu do liczby wysiewanych komórek, ilości składników do przygotowania kompleksów transfekcyjnych, czasu inkubacji oraz etapu płukania po transfekcji. Jesteśmy bardzo optymistycznie nastawieni do tego, że podejście to będzie możliwe do przeniesienia na inne typy komórek w celu leczenia innych dotkniętych chorobą narządów.
Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać badania in vivo z użyciem zmodyfikowanych komórek namagnesowanych. Pozwolą one odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, czy obciążenie komórek żelazem jest wystarczające, aby zapewnić ich retencję w obszarze zainteresowania, a także określić granice detekcji za pomocą MRI in vivo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy manuskrypt przedstawia technikę wydajnego, niewirusowego dostarczania mikroRNA do komórek śródbłonka z wykorzystaniem wektora PEI/MNP w celu namagnesowania. Metoda ta usprawnia modyfikację genetyczną oraz umożliwia magnetyczne kierowanie komórkami i wykrywalność w badaniu MRI, rozwiązując tym samym problemy występujące w medycynie regeneracyjnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Medycyna regeneracyjna
- Terapia komórkowa
- Inżynieria genetyczna
Wstęp
- Terapia komórkowa jest obiecującą metodą leczenia chorób serca.
- Kluczowe jest zwiększenie retencji i przeżywalności komórek.
- Modyfikacja mikroRNA może zwiększyć skuteczność terapeutyczną.
- Magnetyzacja wspomaga ukierunkowane dostarczanie komórek.
Cel badania
- Wprowadzenie metody dostarczania mikroRNA oraz namagnesowania komórek.
- Poprawa retencji komórek w miejscach docelowych z wykorzystaniem pól magnetycznych.
- Rozwiązanie problemów związanych z przeżywalnością i retencją komórek podczas transplantacji.
Zastosowane metody
- Niewirusowe dostarczanie mikroRNA z wykorzystaniem wektora PEI/MNP.
- Magnetyzacja komórek śródbłonka w celu ich kierowania.
- Zastosowanie pól magnetycznych w celu zwiększenia retencji komórek.
- Ocena wydajności modyfikacji genetycznej.
Główne wyniki
- Skuteczne dostarczenie microRNA do komórek śródbłonka.
- Efektywna magnetyzacja komórek w celu umożliwienia detekcji w MRI.
- Poprawione właściwości terapeutycznych produktów komórkowych.
- Potencjał do zwiększenia skuteczności terapii komórkowych.
Wnioski
- Technika ta oferuje nowatorskie podejście do modyfikacji komórek.
- Naprowadzanie magnetyczne może znacząco poprawić skuteczność terapeutyczną.
- Metoda ta rozwiązuje kluczowe problemy w medycynie regeneracyjnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół rozwiązuje krytyczne problemy w terapii komórkowej, umożliwiając przejściowe dostarczenie mikroRNA oraz jednoczesną magnetyzację komórek śródbłonka, co poprawia wydajność modyfikacji genetycznej i retencję komórek po transplantacji. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w projektowaniu terapeutycznych produktów komórkowych poprzez połączenie inżynierii genetycznej z nieinwazyjnym śledzeniem za pomocą MRI oraz możliwościami celowania magnetycznego. Stanowi ono skalowalną, niewirusową platformę służącą do minimalizowania ryzyka interwencji opartych na komórkach w procesach medycyny regeneracyjnej układu sercowo-naczyniowego.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalną analizę mechanizmów działania mikroRNA w komórkach śródbłonka bez naruszania ich żywotności lub komunikacji międzykomórkowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną metodę przejściowej modulacji genów w celu walidacji celów terapeutycznych w biologii naczyniowej.
- Wartość prognostyczna: Wspiera redukcję ryzyka związanego z wyborem celu terapeutycznego poprzez powiązanie nadekspresji miR z efektami funkcjonalnymi w procesach tworzenia cewek oraz komunikacji przez połączenia szczelinowe.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia generowanie populacji komórek sortowalnych magnetycznie do ilościowej analizy wydajności transfekcji oraz odpowiedzi fenotypowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie komórek do dalszych analiz przy użyciu określonych stosunków kompleksów transfekcyjnych i harmonogramów inkubacji.
- Wartość skalowalności: Ułatwia ponowne wykorzystanie platformy dla różnych typów komórek dzięki modułowej konstrukcji wektora PEI/MNP oraz przepływom pracy opartym na separacji magnetycznej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Zachowanie funkcjonalności śródbłonka po modyfikacji, co wspiera modelowanie procesów naprawy naczyniowej i angiogenezy istotnych dla przebiegu chorób.
- Ciągłość przedkliniczna: Umożliwienie śledzenia za pomocą MRI oraz naprowadzania magnetycznego w symulowanych warunkach dynamicznych, co stanowi pomost między wynikami in vitro a badaniami nad dostarczaniem in vivo.
- Łagodzenie ryzyka: Zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej poprzez potwierdzenie, że namagnesowanie nie upośledza tworzenia cewek ani sprzęgania w złączach szczelinowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając genetycznie zmodyfikowanych, magnetycznie responsywnych komórek śródbłonka do walidacji celów terapeutycznych i opracowywania testów, co ma bezpośrednie znaczenie translacyjne dla optymalizacji przedklinicznej terapii komórkowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez kontrolowane dostarczanie miR oraz analizę fenotypową w testach tworzenia cewek i komunikacji międzykomórkowej.
- Przesiewanie: Dostarcza komórki gotowe do analizy o mierzalnej podatności magnetycznej, co umożliwia standaryzowane przesiewanie związków lub modyfikatorów genetycznych.
- Analityka: Umożliwia ilościowe oddzielenie frakcji transfekowanych od nietransfekowanych za pomocą sortowania magnetycznego, co zwiększa precyzję danych w analizie komórek przepływowych i zatrzymanych.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość badań przedklinicznych, umożliwiając nieinwazyjne śledzenie za pomocą MRI oraz celowanie magnetyczne w warunkach przypominających perfuzję.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę transfekcji i namagnesowania, którą można dostosować do innych typów komórek pierwotnych w zastosowaniach naczyniowych i regeneracyjnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Przewidywalność i pewność walidacji celu dzięki połączonej modulacji genetycznej i funkcjonalnej komórek śródbłonka.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja wydajności transfekcji i powtarzalności dzięki określonym stosunkom PEI/miR/MNP oraz zdefiniowanym czasowo etapom inkubacji.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji go/no-go poprzez redukcję ryzyka niepowodzeń na późnych etapach związanych ze słabą retencją komórek i przejściowym przyjęciem przeszczepu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwienie priorytetyzacji kandydatów do terapii komórkowej z uwzględnieniem ryzyka dzięki możliwości śledzenia i funkcjonalnej walidacji produktów komórkowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie transfekcji kwasów nukleinowych, pracy z nanocząsteczkami oraz mikroskopii fluorescencyjnej w celu walidacji.
- Zależy od dostępu do sprzętu do sonikacji, kolumn do separacji magnetycznej oraz systemów obrazowania konfokalnego/SIM.
- Wymaga standaryzacji gęstości wysiewu komórek (13,000 cells/cm²) oraz przygotowania kompleksów transfekcyjnych pomiędzy laboratoriami.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji dla różnych typów komórek śródbłonka lub komórek progenitorowych pod kątem wydajności transfekcji i podatności na oddziaływanie magnetyczne.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność optymalizacji dawki miR oraz stężenia PEI w celu zminimalizowania cytotoksyczności przy zachowaniu namagnesowania.
