Name: Przygotowanie i charakterystyka in vitro namagnesowanych komórek śródbłonka zmodyfikowanych miR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj metodę niewirusowej dostawy mikroRNA do komórek śródbłonka z wykorzystaniem wektora PEI/MNP. Technika ta umożliwia namagnesowanie komórek i ich prowadzenie polem magnetycznym, poprawiając retencję w terapiach regeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować G. Fulda (Centrum Mikroskopii Elektronowej, Uniwersytet w Rostocku, Niemcy) za wsparcie techniczne w pozyskiwaniu obrazów TEM przefiltrowanych superparamagnetycznych nanocząstek i w przeprowadzaniu ich analizy rentgenowskiej. Prace prowadzone w RTC Rostock były wspierane przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych Niemiec (FKZ 0312138A, FKZ 316159 i VIP+03VP00241) oraz kraj związkowy Meklemburgia-Pomorze Przednie z funduszy strukturalnych UE (ESF/IV-WM-B34-0030/10 i ESF/IV-BM-B35-0010/12) oraz przez DFG (DA 1296-1), Damp-Foundation i German Heart Foundation (F/01/12). Frank Wiekhorst otrzymał wsparcie w ramach unijnego programu badawczego "Nanomag" FP7-NMP-2013-LARGE-7.

Nie mamy żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Produkcja genetycznie modyfikowanych komórek obciążonych superparamagnetycznymi nanocząstkami w celu ich dalszego sterowania magnetycznego jest przedstawiona w obecnym protokole. Skuteczne zastosowanie tej strategii pozwala na rozwiązanie niektórych trudności związanych z terapią komórkową, takich jak niska retencja i słabe wszczepienie w uszkodzony obszar 2,3,4, poprzez dostarczenie docelowego produktu komórkowego do przeszczep...

Terapia genowa i komórkowa to potężne narzędzia, które mają potencjał, aby rozwiązać obecne wyzwania w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych. Pomimo faktu, że oba te podejścia są obecnie testowane w badaniach klinicznych, nie są jeszcze gotowe do szerokiego zastosowania klinicznego1. Warto zauważyć, że powszechnym podejściem do radzenia sobie z wyzwaniami związanymi z terapią genową i komórkową jest opracowanie wielofunkcyjnych wektorów dostarczania genów odpowiednich do zastosowań klinicznych. Brak bezpiecznych i wydajnych systemów dostarczania genów jest głównym problemem terapii genowej. Jednocześnie, inżynieria genetyczna produktów komórkowych przed przeszczepem może przezwyciężyć poważne wyzwania związane z terapią komórkową, takie jak niska skuteczność (np. w dziedzinie serca tylko ~ 5% poprawy funkcjonalnej osiąga się po przeszczepie komórek macierzystych1) i słaba retencja/wszczepienie w miejscu urazu (tj. retencja komórek spada poniżej 5 - 10% w ciągu kilku minut do godzin po aplikacji, Niezależnie od ścieżki administracyjnej2,3,4).
Do tej pory, wektory wirusowe znacznie przewyższają systemy niewirusowe pod względem skuteczności, co zaowocowało ich szerszym zastosowaniem w badaniach klinicznych (~ 67%)5. Jednak nośniki wirusa niosą ze sobą poważne zagrożenia, takie jak immunogenność (i następująca po niej reakcja zapalna z poważnymi powikłaniami), onkogenność i ograniczenia w wielkości przenoszonego materiału genetycznego6. Ze względu na te obawy dotyczące bezpieczeństwa i wysokie koszty produkcji wektorów wirusowych, w niektórych przypadkach preferowane jest stosowanie systemów niewirusowych7,8. Jest szczególnie przydatny w przypadku zaburzeń, które wymagają przejściowej korekty genetycznej, takich jak ekspresja czynników wzrostu kontrolujących angiogenezę (np. w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych) lub dostarczanie szczepionek.
W naszej grupie zaprojektowano system dostarczania polegający na połączeniu rozgałęzionych 25-kDa polietylenoiminy (PEI) i superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (MNP) połączonych ze sobą przez interakcję biotyna-streptawidyna9. Wektor ten jest potencjalnym narzędziem inżynierii genetycznej komórek, pozwalającym na ich jednoczesne namagnesowanie przed przeszczepem. To ostatnie stanowi podstawę do naprowadzania/zatrzymywania magnetycznego, co jest szczególnie obiecujące w dzisiejszych czasach, ponieważ z powodzeniem rozwijane są zaawansowane techniki kierowania magnetycznego10. Co więcej, powstałe komórki reagujące magnetycznie mogą być potencjalnie nieinwazyjnie monitorowane za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI) lub obrazowania cząstek magnetycznych11,12.
W przypadku wektora PEI/MNP, poliamina zapewnia kondensację kwasów nukleinowych, a tym samym ochronę przed czynnikami degradującymi, internalizacją wektora w komórkach i ucieczką endosomalną5. MNP uzupełniają właściwości PEI, nie tylko pod względem prowadzenia magnetycznego, ale także poprzez zmniejszenie znanej toksyczności PEI7,13,14. Wcześniej właściwości wektora PEI/MNP były dostosowywane pod względem wydajności dostarczania (tj. pDNA i miRNA) oraz bezpieczeństwa przy użyciu fibroblastów i ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych15,16.
W tym manuskrypcie opisany jest szczegółowy protokół dotyczący stosowania PEI/MNPs do generowania komórek modyfikowanych miRNA17. W tym celu stosuje się HUVEC, które stanowią uznany model angiogenezy in vitro. Są trudne do przetransfekcji i są podatne na działanie toksyczne18,19,20. Ponadto udostępniamy algorytm do oceny takich komórek in vitro, w tym ich celowania, komunikacji międzykomórkowej i wykrywania MRI.

<table><tbody><tr><td>PEI 25 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Kolumny odsalające</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td>zawierające Sephadex G-25 Medium</td></tr><tr><td>Ninhydrin Roztwór odczynnika 2%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7285</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do kwantyfikacji biotyny</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>28005</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Model 680</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna MagneSphere Cząstki paramagnetyczne</td><td>Promega</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV Filtr PVDF Merck</td><td></td><td>SLHV013SL</td><td>0,45 i mikro; m</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy Libra 120</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Napięcie przyspieszenia 120&nbsp; </td></tr><tr><td>Detektor promieniowania rentgenowskiego kV Sapphire</td><td>EDAX-Amatek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa hodowla komórkowa</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHS-Esther Atto 565</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-31</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Esther Atto 488&nbsp;</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 488-31</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 miRNA Label Zestaw IT</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna Atto 565</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen Typ IV Gibco</td><td>Thermo Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże do wzrostu śródbłonka, EGM-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 & CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Scientific 15140122</td><td></td><td>100 U/mL, 100 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-PECAM-1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1506</td><td></td></tr><tr><td>MS kolumny MACS</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia żywych/martwych komórek w bliskiej podczerwieni</td><td>Thermo Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 Znakowana barwnikiem kontrola negatywna Pre-miR</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM17120</td><td>"Cy3-miR" lub "Cyanina-miR3" w manuskrypcie</td></tr><tr><td>Cząsteczki prekursorowe miRNA Pre-miR - kontrola negatywna&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM17110</td><td>"scr-miR" w manuskrypcie Syntetyczny</td></tr><tr><td>inhibitor anty-has-miR92a-3p&nbsp;</td><td>System Thermo Scientific</td><td>AM10916</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 ELYRA PS.1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>4% roztwór w</td></tr><tr><td>barwieniu jądrowym PBS DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA NucleoSpin</td><td>Machery-Nagel</td><td>740955</td><td></td></tr><tr><td>mirVana Zestaw do izolacji miRNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA TaqMan</td><td>Thermo Scientific</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>Thermo Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-92a Test TaqMan</td><td>Thermo Scientific</td><td>000431</td><td>Sekwencja dojrzałego miRNA: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU</td></tr><tr><td>FastGene Taq Ready Mix</td><td>Nippon Genetics</td><td>LS27</td><td></td></tr><tr><td>ITGA5 Test TaqMan</td><td>Test Thermo Scientific</td><td>Hs01547673_m1</td><td></td></tr><tr><td>RNU6B Test TaqMan</td><td>Thermo Scientific</td><td>001093</td><td></td></tr><tr><td>18S rRNA Kontrola endogenna</td><td>Thermo Scientific</td><td>4333760F</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Calcein Czerwono-pomarańczowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS bufor</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>7.1 System MRI zwierząt Tesla</td><td>Oprogramowanie Bruker Corporation</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>zaktualizowane o urządzenie AngiogenesisAnalyzer (NIH)</td></tr><tr><td>MPS</td> Oprogramowanie <td>Bruker Biospin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnes pierścieniowy neodymowy&nbsp;</td><td>magnets4you GmbH</td><td>RM-10x04x05-G</td><td>&oslash; 10 mm; remanescencja wynosi ~ 1,3&nbsp; T, przymus &ge; 955 kA/m</td></tr><tr><td>Zestaw do obrazowania Click-iT EdU Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik FluorSave</td><td>Merck</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa</td><td>Bandelin elektroniczna</td><td>Typ: RK 100 SH</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i charakterystyka in vitro namagnesowanych komórek śródbłonka zmodyfikowanych mir

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Do tej pory dostępne chirurgiczne i farmakologiczne metody leczenia chorób sercowo-naczyniowych (CVD) są ograniczone i często paliatywne. Jednocześnie terapie genowe i komórkowe są bardzo obiecującymi alternatywnymi metodami leczenia chorób układu krążenia. Jednak szerokie zastosowanie kliniczne terapii genowej jest znacznie ograniczone przez brak odpowiednich systemów dostarczania genów. Opracowanie odpowiednich wektorów dostarczania genów może stanowić rozwiązanie obecnych wyzwań w terapii komórkowej. W szczególności istniejące wady, takie jak ograniczona wydajność i niska retencja komórek w uszkodzonym narządzie, można przezwyciężyć poprzez odpowiednią inżynierię komórkową (tj. genetyczną) przed przeszczepem. Prezentowany protokół opisuje wydajną i bezpieczną przejściową modyfikację komórek śródbłonka za pomocą wektora dostarczania opartego na superparamagnetycznych nanocząstkach magnetycznych polietylenoiminy (PEI/MNP). Zdefiniowano również algorytm i metody charakterystyki komórek. Pomyślne wewnątrzkomórkowe dostarczanie mikroRNA (miR) do ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostało osiągnięte bez wpływu na żywotność komórek, funkcjonalność lub komunikację międzykomórkową. Co więcej, udowodniono, że takie podejście powoduje silny efekt funkcjonalny w przypadku wprowadzonego egzogennego miR. Co ważne, zastosowanie tego wektora opartego na MNP zapewnia namagnesowanie komórek, wraz z towarzyszącymi mu możliwościami celowania magnetycznego i nieinwazyjnego śledzenia MRI. Może to stanowić podstawę dla magnetycznie sterowanych, genetycznie modyfikowanych terapii komórkowych, które mogą być monitorowane nieinwazyjnie za pomocą rezonansu magnetycznego.

Głównym celem proponowanego protokołu jest wytworzenie komórek zmodyfikowanych miR, które reagują na pole magnetyczne, oraz przeprowadzenie ich dokładnej charakterystyki (Rysunek 1). W rezultacie powinny zostać uzyskane wydajnie przetransfekowane komórki, reagujące na selekcję i sterowanie magnetyczne oraz wykrywalne w badaniu MRI.
W pierwszej kolejności tożsamość wyizolowanych HUVEC potwierdzono za pomocą typow...

Ten manuskrypt opisuje efektywne, niewirusowe dostarczanie miR do komórek śródbłonka przez wektor PEI/MNP i ich namagnesowanie. Tak więc, oprócz modyfikacji genetycznej, podejście to pozwala na magnetyczne prowadzenie komórek i wykrywalność MRI. Technika ta może być stosowana w celu poprawy właściwości terapeutycznych produktów komórkowych.

Przygotowanie i charakterystyka in vitro namagnesowanych komórek śródbłonka zmodyfikowanych miR

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie techniki zapewniającej modyfikację komórek za pomocą microRNA przy jednoczesnej magnetyzacji komórek. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, takich jak inżynieria genetyczna komórek przed transplantacją.Oprócz efektywnej modyfikacji komórek za pomocą mikroRNA, przeprowadzono ją również z zastosowaniem tlenku żelaza. Może to być wykorzystane do zwiększenia retencji komórek w interesującym obszarze poprzez zastosowanie pola magnetycznego. Terapia komórkowa jest bardzo obiecująca w leczeniu chorób serca, jednak niska retencja oraz przeżywalność komórek wymagają pilnej poprawy.Należy rozpocząć procedurę od hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej w celu przygotowania kompleksów do transfekcji, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Na 48 godzin przed transfekcją należy wysiać komórki HUVEC na plastikowe płytki hodowlane o odpowiednim rozmiarze, przy początkowej gęstości nasienienia wynoszącej około 13 000 komórek na centymetr kwadratowy powierzchni wzrostu.Następnie należy przygotować świeże nanocząstki miR/polietylenoiminu/superparamagnetycznego tlenku żelaza. Najpierw rozcieńczyć 2,5 pmol mikroRNA na centymetr kwadratowy powierzchni wzrostu komórek w pięcioprocentowym roztworze glukozy, aby uzyskać końcowe stężenie 0,125 pmol mikroRNA na µL. Następnie rozcieńczyć PEI w równym objętościowo pięcioprocentowym roztworze glukozy.Dodaj rozcieńczony PEI do roztworu mikroRNA i wymieszaj otrzymaną mieszaninę w wortexerze przez 30 sekund. Następnie inkubuj mieszaninę miR/PEI przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Poddaj MNP działaniu ultradźwięków przez co najmniej 20 minut w sonikacyjnej kąpieli wodnej w temperaturze pokojowej.Następnie należy dodać odpowiednią ilość roztworu MNP do gotowej mieszaniny miR/PEI. Po wymieszaniu w wirówce typu vortex przez 30 seconds, inkubować przez 30 minutes w temperaturze pokojowej. Następnie przygotowaną mieszaninę miR/PEI/MNP dodawać kroplami bezpośrednio do pożywki hodowlanej na komórki.Sześć godzin po transfekcji należy zastąpić tę mieszaninę świeżą pożywką hodowlaną. Po analizie bezpieczeństwa wektora, opisanej w protokole tekstowym, potwierdzić i scharakteryzować wewnątrzkomórkową lokalizację kompleksów transfekcyjnych za pomocą konfokalnej i super-rozdzielczej mikroskopii z iluminacją strukturalną. W tym celu wysiać komórki HUVEC na pokrywkach szklanych powlekanych żelatyną, umieszczonych w dołkach 24-dołkowych płytek hodowlanych, analogicznie jak wcześniej.Przeprowadź transfekcję komórek za pomocą znakowanego trzema kolorami miR/PEI/MNP i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5% CO2. Przemyj szkiełka podstawowe najpierw 2% albuminą surowicy bydlęcej i solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, a następnie samym PBS. Utrwal komórki, inkubując je w 4% paraformaldehydzie lub PFA w temperaturze 37 °C przez 15 minut.Przemyj próbki za pomocą PBS, a następnie zabarw jądra komórkowe barwnikiem DAPI zgodnie ze standardowymi protokołami. Następnie przemyj komórki PBS-em trzykrotnie przez 15 minut na wytrząsarce, aby usunąć nadmiar barwnika. Umieść przygotowane szkiełka nakrywki na preparatach mikroskopowych, używając odpowiedniego medium montażowego, i pozostaw preparaty do wyschnięcia na co najmniej jedną godzinę przed przystąpieniem do analizy mikroskopowej.Należy pozyskać obrazy, korzystając z obiektywu imersyjnego olejowego 63x, zgodnie z ustawieniami SIM opisanymi w protokole tekstowym. W celu targetowania komórek i symulacji dynamicznych warunków in vitro, najpierw należy przeprowadzić transfekcję HUVEC w płytce 24-dołkowej, postępując jak poprzednio. Po 24-godzinnej inkubacji należy wypłukać komórki.Następnie dodaj 1x trips w EDTA rozcieńczonym w PBS i inkubuj komórki przez cztery minuty w temperaturze 37 °C przed ich zebraniem. Odwiruj zebrane komórki przy 300 ×g przez 10 minut. Wymieszaj osad komórkowy otrzymany z jednej studni z 1 mL świeżej pożywki hodowlanej.Następnie przenieś komórki do pojedynczej studni płytki 12-dołkowej. Przymocuj lokalnie mały magnes za pomocą taśmy. Umieść płytkę hodowlaną na wytrząsarce i inkubuj zawiesinę komórek przez 12 godzin przy 150 RPM, aby zasymulować warunki dynamiczne.Następnie przemyć komórki i utrwal je za pomocą 4% PFA. Przebarw jądra komórkowe barwnikiem DAPI. Przechwyć obraz przylegania komórek za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego z laserami wzbudzenia 405 i 504 nm w trybie z-stack w celu uzyskania surowych danych.W celu przygotowania obrazów do analizy należy zastosować przetwarzanie obrazu metodą maksymalnej projekcji intensywności. Do analizy ilościowej komórek reagujących i niereagujących na pole magnetyczne należy najpierw przeprowadzić transfekcję HUVECs w płytce 24-dołkowej. Komórki należy inkubować przez 24 godziny przed ich wypłukaniem i zebraniem zgodnie z wcześniej opisaną procedurą.Osad komórkowy uzyskany z każdej studni resuspender w 500 µL podgrzanego, sterylnego buforu do sortowania komórek. Zawiesinę komórkową nanieść na kolumnę do sortowania magnetycznego zamocowaną za pomocą dostarczonego magnesu. Następnie przemyć kolumny na magnesie trzykrotnie świeżym buforem do sortowania komórek.Zbierz prześwit jako frakcję nieodpowiadającą na pole magnetyczne. Zdejmij kolumny z magnesu i natychmiast zbierz frakcję komórek odpowiadającą na pole magnetyczne, przepychając świeży bufor do sortowania komórek przez kolumnę za pomocą tłoka. Odwiruj obie frakcje Mag- oraz Mag+ przy 300 ×g przez 10 minut.Po ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w PBS, należy policzyć komórki i ocenić ich żywotność za pomocą testu wykluczania błękitu trypanu. Komórki HUVEC, izolowane z pępków, charakteryzują się ekspresją markera śródbłonkowego CD31 oraz zdolnością do tworzenia rurek na matrycy błony podstawnej. Komórki HUVEC przetransfekowane kompleksem miR/PEI/MNP wykazują pobranie znakowanego miR.Ich przeżywalność pozostaje niezmieniona 24 godziny po transfekcji. Ponadto mikroskopia superrozdzielcza wykazuje paranuklearną lokalizację kompleksów transfekcyjnych znakowanych trzema kolorami. Toksyczność PEI została potwierdzona przez obniżoną funkcjonalność komórek transfekowanych miR/PEI.Co istotne, MNP przywraca właściwości komórkowe. Komórki zmodyfikowane za pomocą miR/PEI/MNP nie różnią się od komórek niepoddanych działaniu preparatu pod względem tworzenia cewek. Ponadto komórki te zachowują międzykomórkową komunikację poprzez połączenia szczelinowe, co wykazano w badaniu fluorescencyjnym po fotowybielaniu (FRAP).Po wysianiu zawiesiny komórek zmodyfikowanych miR/PEI/MNP w dołkach płytki hodowlanej umieszczonej na wytrząsarce rotacyjnej, komórki mają tendencję do migracji i przywierania w obszarze lokalnego przyłożenia magnesu. Reprezentatywne obrazy przedstawiają wzrost komórek w obszarze z zastosowaniem magnesu. Bez zastosowania magnesu.Oraz w centrum dołka hodowlanego, gdzie przepływ cieczy koncentrował komórki. Po opanowaniu techniki transfekcja komórek może zostać przeprowadzona w ciągu dwóch godzin. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć bardzo dobre wyobrażenie o tym, jak w sposób przejściowy, lecz wysoce wydajny, modyfikować komórki śródbłonka, wliczając w to ich magnetyzację.A także jak przeprowadzić końcową charakterystykę produktu komórkowego. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest przestrzeganie podanych wartości w odniesieniu do liczby wysiewanych komórek, ilości składników do przygotowania kompleksów transfekcyjnych, czasu inkubacji oraz etapu płukania po transfekcji. Jesteśmy bardzo optymistycznie nastawieni do tego, że podejście to będzie możliwe do przeniesienia na inne typy komórek w celu leczenia innych dotkniętych chorobą narządów.Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać badania in vivo z użyciem zmodyfikowanych komórek namagnesowanych. Pozwolą one odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, czy obciążenie komórek żelazem jest wystarczające, aby zapewnić ich retencję w obszarze zainteresowania, a także określić granice detekcji za pomocą MRI in vivo.

preparation-vitro-characterization-magnetized-mir-modified

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje technikę oczyszczania komórek progenitorowych śródbłonka CD31+ (EPC) z hodowli za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS). Zawiesinę komórkową traktuje się przeciwciałem sprzężonym z fluoroforem, które wiąże się z CD31 na EPC. Zakończenie znakowania CD31 + EPC polega na dodaniu kompleksu przeciwciał, który wiąże się z fluoroforami, oraz pokrytej polimerem nanocząstki magnetycznej, która wiąże się z kompleksem przeciwciał. Znakowane komórki są następnie...

Oczyszczanie śródbłonkowych komórek prekursorowych CD31+ za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie

Pierwotna hodowla komórkowa jest użyteczną techniką do analizy określonych populacji komórek, szczególnie z transgenicznych zarodków myszy w określonych stadiach rozwoju. W tym przypadku komory embrionalne są preparowane i dysocjowane, a kulki sprzężone z przeciwciałami rozpoznają i oddzielają komórki śródbłonka do dalszej analizy.

Izolacja embrionalnych komórek śródbłonka komór

Naszym celem było zaprojektowanie, wyprodukowanie i przetestowanie ferromagnetycznych stentów do wychwytywania komórek śródbłonka. Dziesięć stentów przetestowano pod kątem złamań, a 10 kolejnych stentów przetestowano pod kątem magnetyzmu zatrzymanego. Na koniec przetestowano 10 stentów in vitro, a 8 kolejnych stentów wszczepiono 4 świniom, aby wykazać wychwytywanie i zatrzymywanie komórek.

Ferromagnetyczny stent z gołego metalu do wychwytywania i zatrzymywania komórek śródbłonka

Ten protokół jest przygotowany, aby podzielić się naszą metodą izolowania komórek śródbłonka naczyń wieńcowych myszy w celu obrazowania lub przeprowadzania eksperymentów z biologii molekularnej.

Izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych

Ten protokół ilustruje bezpieczną i skuteczną procedurę modyfikacji krwiotwórczych komórek macierzystych CD133+. Zaprezentowane niewirusowe, oparte na polipleksie magnetycznym podejście może stanowić podstawę do optymalizacji efektów terapeutycznych komórek macierzystych, a także do monitorowania podawanego produktu komórkowego za pomocą rezonansu magnetycznego.

Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mięśni szkieletowych (MMEC) kształtują wewnętrzną ścianę naczyń włosowatych mięśni i regulują zarówno wymianę płynów/molekuł, jak i migrację komórek (immunologicznych) między tkanką mięśniową a krwią. Opisana tutaj izolacja pierwotnego mysiego MMEC umożliwia kompleksowe badania in vitro "jednostki mięśniowo-naczyniowej".

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mięśni szkieletowych

Przedstawiamy szczegółowy protokół generowania mysiego modelu ksenoprzeszczepu malformacji żylnej. Model ten opiera się na podskórnym wstrzyknięciu komórek śródbłonka pochodzących od pacjenta zawierających hiperaktywujące mutacje genu TIE2 i/lub PIK3CA. Zmiany ksenoprzeszczepowe ściśle odwzorowują cechy histopatologiczne tkanki pacjenta z VM.

Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta w przypadku malformacji żylnej

Ten protokół szczegółowo opisuje dostosowaną metodę pozyskiwania, rozszerzania i kriokonserwacji mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu uzyskanych przez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, oraz badania właściwości bariery krew-mózg w modelu ex vivo.

Wyprowadzanie, ekspansja, kriokonserwacja i charakterystyka mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy protokół, rozszerzoną metodę hodowli komórek śródbłonka (EECM), która umożliwia różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do komórek mikronaczyniowych śródbłonka mózgu (BMEC). Komórki te wykazują ekspresję cząsteczki adhezyjnej komórek śródbłonka, a zatem są modelem bariery krew-mózg odpowiednim do badania interakcji komórek odpornościowych in vitro.

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do mikronaczyń śródbłonka mózgu o dojrzałym fenotypie immunologicznym

Tutaj opisujemy metodę szybkiej homogenizacji wspomaganą separacją magnetyczną do produkcji na dużą skalę nanopęcherzyków pochodzących z endosomów jako nowy typ egzosomów naśladujących (EM), które mają to samo pochodzenie biologiczne i podobną strukturę, morfologię i skład białkowy natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).

Metoda szybkiej homogenizacji wspomagana separacją magnetyczną do produkcji pęcherzyków pochodzących z endosomów na dużą skalę

Poznaj metodę niewirusowej dostawy mikroRNA do komórek śródbłonka z wykorzystaniem wektora PEI/MNP. Technika ta umożliwia namagnesowanie komórek i ich prowadzenie polem magnetycznym, poprawiając retencję w terapiach regeneracyjnych.

Przygotowanie i charakterystyka in vitro namagnesowanych komórek śródbłonka zmodyfikowanych miR

Przeglądaj więcej filmów