Przygotowanie i charakterystyka in vitro namagnesowanych komórek śródbłonka zmodyfikowanych miR

Ogólnym celem tej procedury jest wprowadzenie techniki, która zapewnia modyfikację komórek za pomocą mikroRNA i równoległe namagnesowanie komórek. Metoda ta może sprostać kluczowym wyzwaniom w dziedzinie medycyny regeneracyjnej. Takich jak inżynieria genetyczna komórek przed przeszczepem.

Oprócz skutecznej modyfikacji komórek za pomocą mikroRNA, umożliwili to za pomocą tlenku żelaza. Można to wykorzystać do zwiększenia retencji komórek po stronie zainteresowania poprzez zastosowanie pola magnetycznego. Terapia komórkowa jest bardzo obiecująca w leczeniu chorób serca, retencji hipokomórek i pilnej poprawy przeżywalności komórek.

Rozpocznij tę procedurę od hodowli komórek śródbłonka żyły pępowinowej w celu przygotowania kompleksów transfekcji, jak opisano w protokole tekstowym. Na 48 godzin przed transfekcją wysiewaj HUVEC na plastikowych płytkach dołkowych do hodowli komórkowych o odpowiedniej wielkości. Przy początkowej gęstości komórek wynoszącej około 13 000 komórek na centymetr kwadratowy powierzchni wzrostu.

Następnie przygotuj świeże nanocząstki miR/polietylenu/super paramagnetycznego tlenku żelaza. Najpierw rozcieńczyć 2,5 pikomoli mikroRNA na centymetr kwadratowy powierzchni wzrostu komórki i pięcioprocentowy roztwór glukozy, aby uzyskać końcowe stężenie 0,125 pikomoli mikroRNA na mikrolitr. Następnie rozcieńczyć PEI w równej objętości pięcioprocentowego roztworu glukozy.

Dodaj rozcieńczony PEI do roztworu mikroRNA i wiruj otrzymaną mieszaninę przez 30 sekund. Następnie inkubować mieszaninę miR/PEI przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Sonikować MNP przez co najmniej 20 minut w sonikującej łaźni wodnej o temperaturze pokojowej.

Następnie do gotowej mieszaniny miR/PEI dodać odpowiednią ilość roztworu MNP. Po wirowaniu przez 30 sekund inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przygotowaną mieszaninę miR/PEI/MNP dodać kroplami bezpośrednio do pożywki hodowlanej na komórkach.

Zastąp tę mieszaninę świeżą pożywką hodowlaną sześć godzin po transfekcji. Po analizie bezpieczeństwa wektorów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, potwierdź i scharakteryzuj wewnątrzkomórkową lokalizację kompleksów transfekcyjnych za pomocą konfokalnej i superrozdzielczej mikroskopii oświetlenia strukturalnego. W tym celu należy wysiać HUVEC na pokrytych żelatyną szklanych szkiełkach nakrywkowych umieszczonych w dołkach 24-dołkowych płytek hodowlanych, tak jak poprzednio.

Transfekować komórki za pomocą 3-kolorowego znakowanego miR/PEI/MNP i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze zawierającej pięć procent dwutlenku węgla. Najpierw umyj szkiełka nakrywkowe dwuprocentową albuminą surowicy bydlęcej i solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, a następnie tylko PBS. Napraw komórki, inkubując w czteroprocentowym paraformaldehydzie lub PFA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Przemyć PBS, a następnie wybarwić jądra DAPI zgodnie ze standardowymi protokołami. Następnie umyj komórki PBS trzy razy po 15 minut na shakerze, aby usunąć nadmiar barwnika. Przygotowane szkiełka nakrywkowe umieścić na szkiełkach mikroskopowych za pomocą odpowiedniego podłoża montażowego i pozostawić szkiełka do wyschnięcia na co najmniej godzinę przed użyciem ich do mikroskopii.

Rejestruj obrazy za pomocą obiektywu 63-krotnie zanurzonego w oleju w ustawieniach karty SIM znajdujących się w protokole tekstowym. W przypadku celowania w komórki i symulowanych warunków dynamicznych in vitro, najpierw należy przetransfekować HUVEC na płytkę 24-dołkową, tak jak poprzednio. Po inkubacji przez 24 godziny umyj komórki.

Następnie dodaj jeden x trips w EDTA rozcieńczonym w PBS i inkubuj komórki przez cztery minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed zebraniem komórek. Odwirować zebrane komórki w temperaturze 300 razy G przez 10 minut. Wymieszaj osad komórkowy uzyskany z jednej studzienki z jednym mililitrem świeżej pożywki hodowlanej.

I przenieś komórki do pojedynczego dołka na 12-dołkowej płytce. Przymocuj mały magnes lokalnie za pomocą taśmy. Umieścić płytkę hodowlaną na wytrząsarce i inkubować zawiesinę komórek przez 12 godzin przy 150 obr./min, aby zasymulować warunki dynamiczne.

Następnie umyj komórki i utrwal je za pomocą czterech procent PFA. Wybarwić jądra za pomocą DAPI. Nagraj przyczepienie komórki za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej z laserami wzbudzającymi 405 i 504 nanometry w trybie z-stack, aby uzyskać surowe dane.

Użyj przetwarzania obrazu projekcji o maksymalnej intensywności, aby utworzyć obrazy do analizy. W celu analizy ilościowej komórek magnetycznie reagujących i niereagujących, należy najpierw przetransfekować HUVEC w 24-dołkowej płytce. Inkubować komórki przez 24 godziny przed umyciem i zebraniem komórek, jak opisano powyżej.

Ponownie zawiesić osad komórkowy uzyskany z każdej studzienki za pomocą 500 mikrolitrów podgrzanego sterylnego buforu do sortowania komórek. Nałóż zawiesinę ogniw na magnetyczną kolumnę sortującą zamocowaną za pomocą dostarczonego magnesu. Następnie umyj kolumny na magnesie trzykrotnie świeżym buforem do sortowania komórek.

Zbierz przepływ jako frakcję niereagującą magnetycznie. Wyjmij kolumny z magnesu i natychmiast zbierz magnetycznie reagującą frakcję komórki, popychając świeży bufor sortujący komórki, pomyślał kolumna za pomocą tłoka. Odwirować zarówno frakcje Mag-, jak i Mag+ w temperaturze 300 razy G przez 10 minut.

Po ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w PBS, policz komórki i oceń żywotność komórek za pomocą testu wykluczania błękitu trypanowego. Wyizolowane z pępowiny HUVEC charakteryzują się ekspresją markera śródbłonka CD31 oraz tworzeniem się jajowodów na macierzy błony podstawnej. HUVEC transfekowane miR/PEI/MNP wszystkie przyjmują oznaczone miR.

A ich przeżycie pozostaje nienaruszone 24 godziny po transfekcji. Ponadto mikroskopia superrozdzielcza pokazuje parajądrkową lokalizację 3-kolorowych znakowanych kompleksów transfekcyjnych. Toksyczność PEI potwierdza zmniejszona funkcjonalność komórek transfekowanych miR/PEI.

Co ważne, MNP przywraca komórkom właściwości. Komórki zmodyfikowane miR/PEI/MNP nie różnią się od komórek nieleczonych pod względem budowy rurek. Co więcej, komórki te utrzymują komunikację łączącą szczeliny międzykomórkowe, co ujawnia się poprzez odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu.

Po wysianiu zawiesiny komórek zmodyfikowanych miR/PEI/MNP w dołkach płytki hodowlanej umieszczonej na obracającym się wytrząsaczu, komórki mają tendencję do migracji i przyczepiania się w obszarze lokalnego zastosowania magnesu. Reprezentatywne obrazy przedstawiają wzrost komórek w obszarze z zastosowaniem magnesu. Bez aplikacji magnesu.

A w środku hodowli studnia, gdzie przepływ cieczy koncentrował komórki. Po opanowaniu transfekcji komórek można ją przeprowadzić w ciągu dwóch godzin. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć bardzo dobre wrażenie na temat tego, jak przejściowo, ale bardzo skutecznie modyfikować komórki śródbłonka, w tym namagnesowanie.

A także jak scharakteryzować produkt komórkowy w sposób końcowy. Podejmując próbę tej procedury, ważne jest, aby przestrzegać podanych liczb dotyczących ilości składników wysiewających komórki do przygotowania kompleksów transfekcyjnych, czasu inkubacji i etapu mycia po transfekcji. Jesteśmy bardzo optymistycznie nastawieni do tego, że to podejście będzie można łatwo przenieść na inne typy komórek w celu leczenia innych dotkniętych chorobą narządów.

Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić badania in vivo ze zmodyfikowanymi namagnesowanymi komórkami. Mogą one odpowiedzieć na dodatkowe pytania, czy obciążenie komórek żelazem jest skuteczne w celu zapewnienia ich utrzymania po stronie zainteresowania. A także do określenia granic wykrywalności za pomocą MRI in vivo.