Name: Czuła i specyficzna metoda ilościowa do oznaczania białka C wiążącego miozynę sercową w surowicy za pomocą elektrochemiluminescencyjnego testu immunologicznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj czułą metodę ilościową do oznaczania białka C wiążącego miozynę sercową w surowicy za pomocą testu immunologicznego z elektrochemiluminescencją. Technika ta umożliwia wykrywanie zawału mięśnia sercowego z wysoką specyficznością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez granty National Institutes of Health R01HL105826 i K02HL114749 (Dr. Sadayappan) oraz American Heart Association Midwest Fellowships; 11PRE7240022 (Mr. Barefield) i 13POST14720024 (Dr. Govindan). Autorzy wyrażają wdzięczność za pomoc dr Jimmy'emu Page'owi, Jill Clampit i dr Johnowi Hudsonowi, MSD, za ich doskonałe wsparcie techniczne i literaturowe w opracowywaniu testu.

1. Test Uniplex cMyBP-C
<ol>
	<li>Dzień przed eksperymentem pokryj 96-dołkową płytkę wzorcową MSD przeciwciałem wychwytującym. W przypadku cMyBP-C należy użyć 30 μl mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-cMyBP-C (bez żelatyny) o stężeniu 5 μg/ml rozcieńczonego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Ponieważ studzienka jest hydrofobowa, odpipetuj roztwór do dolnego rogu studzienki, a następnie postukaj w boki płytki, aby rozprowadzić roztwór po całej studzience.</li>
	<li>Płytkę pokrywa się zgrzewarką do płytek i inkubuje O/N w temperaturze 4 °C bez wstrząsania.</li>
	<li>Usuń roztwór przeciwciała wychwytującego, wystukując roztwór nad zlewem, a następnie na stos ręczników papierowych. Niespecyficzne wiązanie z płytką blokuje się przez dodanie 150 μl 5% (w/v) roztworu blokera A (wysokiej jakości BSA) w PBS do każdego dołka.</li>
	<li>Uszczelnić płytkę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, wytrząsając z prędkością 700 obr./min.</li>
	<li>Na etapie blokowania należy przygotować wzorce i próbki. Wykonać serię wzorcową, rozcieńczając rekombinowany fragment białka cMyBP-C (aminokwasy 1 - 271) do początkowego stężenia 2 000 ng / ml w 1% (w/v) blokerze A/PBS. Następnie należy seryjnie rozcieńczyć w stosunku 5 do 1% (w/v) bloker A/PBS. Łącznie użyto 7 wzorców + 1 ślepą próbę (sam bloker A/PBS 1% (w/v)).</li>
	<li>Usunąć roztwór blokujący i przemyć płytkę 3x 150 μl 0,05% (v/v) Tween-20/PBS. Za każdym razem usuń roztwór myjący, odwracając talerz nad zlewem. Po trzecim etapie mycia energicznie przesuń talerz nad zlew i energicznie poklep talerz o warstwę ręczników papierowych, aż całkowicie wyschnie. Jest to kluczowy krok, ponieważ objętości inkubacji są małe, a pozostały roztwór do mycia znacznie rozcieńczy następną inkubację.</li>
	<li>Odpipetować 25 μl wzorców i próbek do studzienek. Uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej, wytrząsając z prędkością 700 obr./min przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała wykrywającego o stężeniu 1 μg/ml w 1% blokerze A/PBS. Jako przeciwciało wykrywające służy wykonane na zamówienie przeciwciało cMyBP-C (aminokwasy epitopowe 2 - 14) ze znakowaniem MSD SULFO-TAG. Dostępne są zestawy do znakowania SULFO-TAG, dzięki czemu znakowanie dowolnego przeciwciała jest stosunkowo prostą procedurą.</li>
	<li>Powtórz krok prania zgodnie z opisem w kroku 1.4.</li>
	<li>Dodać 25 μl roztworu przeciwciała wykrywającego do każdej studzienki, uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na wytrząsarce płytek ustawionej na 700 obr./min.</li>
	<li>W okresie inkubacji uruchom płytkę demonstracyjną MSD (płytkę z diodami LED), aby zapewnić prawidłowe działanie Sector Imager i oprogramowania (patrz rozdział Odczynnik). Należy również rozcieńczyć bufor do odczytu, który jest dostarczany przez MSD, dodając 5 ml 4x buforu do odczytu do 15 ml wody destylowanej.</li>
	<li>Powtórz krok prania zgodnie z opisem w kroku 1.4.</li>
	<li>Dodać 150 μl bufora do odczytu do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej. Należy unikać pęcherzyków powietrza (odpowiednią metodą jest pipetowanie odwrotne). Po dodaniu bufora odczytu należy natychmiast zeskanować płytę w programie Sector Imager.</li>
</ol>
2. Test 3-plex cMyBP-C, CK-MB i cTnI
<ol>
	<li>96-dołkową płytkę 3-plex i roztwory rozcieńczalnika pozostawia się do zrównoważenia do RT przed użyciem. Ta płytka jest wstępnie pokryta przeciwciałami wychwytującymi dla cMyBP-C, CK-MB i cTnI przez MSD.</li>
	<li>Dodać 25 μl 1% (w/v) blokera A/PBS do każdego dołka. Postukaj w boki płytki, aby upewnić się, że cała studzienka jest pokryta roztworem.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę zgrzewarką do płyt, umieść płytkę na wytrząsarce do płyt i potrząsaj z prędkością 700 obr./min przez 30 minut.</li>
	<li>W międzyczasie przygotowywana jest seria rozcieńczeń poszczególnych kalibratorów. Ponieważ każda studzienka ma trzy przeciwciała wychwytujące, trzy kalibratory muszą być zmieszane i seryjnie rozcieńczone przed użyciem. Rozcieńczyć rekombinowane cMyBP-C, CK-MB (MSD) i cTnI (MSD) razem w 1% (w/v) blokerze A/PBS, aby utworzyć jedną próbkę z 2,000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml CK-MB i 25 ng / ml cTnI (próbka A).</li>
	<li>Dla każdego wzorca przygotowuje się końcową objętość co najmniej 100 μl. Aby ukończyć serię standardową, należy seryjnie rozcieńczyć próbki o współczynnik 5. Użyj 25 μl próbki A w 100 μl 1% (w/v) blokera A/PBS, aby utworzyć próbkę B. Następnie użyj 25 μl próbki B w 100 μl 1% (w/v) blokera A/PBS, aby utworzyć próbkę C i tak dalej. Próbki ludzkiej surowicy od 16 osób z zawałem mięśnia sercowego i 16 osób kontrolnych wykorzystano do pomiaru poziomów cMyBP-C, CK-MB i cTnI. Próbki te rozcieńczono 2x w 1% (w/v) blokerze A/PBS.</li>
	<li>Dodać 25 μl wzorców i rozcieńczonych próbek do 25 μl już obecnych w studzienkach płytki 3-plex. Ważne jest, aby dołączyć ślepą próbę (tylko rozcieńczalnik). Aby ustalić technikę, próbki są ładowane w trzech egzemplarzach technicznych. W przeciwnym razie wystarczą duplikaty.</li>
	<li>Ponownie uszczelnić płytkę (można ponownie użyć zgrzewarki do płytek) i inkubować na wytrząsarce płytek (700 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Tuż przed zakończeniem inkubacji przygotowuje się roztwór przeciwciała detekcyjnego. Stosowany rozcieńczalnik to 1% (w/v) bloker A w PBS. Wszystkie trzy przeciwciała detekcyjne znakowane sulfo rozcieńcza się razem do końcowego stężenia 1 μg/ml każde. Przeciwciała detekcyjne są zwykle dostarczane przy 50-krotnym stężeniu podstawowym.</li>
	<li>Do sporządzenia pełnej płytki 96-dołkowej potrzeba 2 700 μl całkowicie rozcieńczonego roztworu (z uwzględnieniem błędu pipetowania). Dodać 54 μl każdego przeciwciała wykrywającego do 2,538 μl 1% (w/v) blokera A/PBS.</li>
	<li>Po 2 godzinach usuń roztwory, energicznie przesuwając talerz nad zlewem. Przemyć studzienki 3x 150 μl 0,05% Tween-20 w PBS. Dodać 25 μl roztworu przeciwciała detekcyjnego do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej, a boki płytki należy postukać, aby upewnić się, że cała studzienka jest pokryta roztworem.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę i inkubuj przez 1 godzinę, wytrząsając z prędkością 700 obr./min.</li>
	<li>W okresie inkubacji uruchom płytkę demonstracyjną MSD (płytkę z diodami LED), aby zapewnić prawidłowe działanie Sector Imager i oprogramowania. Rozcieńczyć również bufor do odczytu, który jest dostarczany przez MSD, dodając 5 ml 4x buforu do odczytu do 15 ml wody destylowanej.</li>
	<li>Powtórz krok prania opisany w kroku 2.8.</li>
	<li>Dodać 150 μl bufora do odczytu do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej. Unikanie pęcherzyków powietrza ma kluczowe znaczenie (odpowiednią metodą jest pipetowanie wsteczne). Po dodaniu bufora odczytu należy natychmiast zeskanować płytę w programie Sector Imager.</li>
</ol>

<ol><li>Thygesen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third+universal+definition+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Third universal definition of myocardial infarction.</a> Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).</li>
<li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A.+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).</li>
<li>Thompson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+electrochemiluminescence+wash+and+no-wash+immunoassays+for+detection+of+serum+antibodies+to+smooth+Brucella+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains.</a> Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).</li>
<li>Kingsmore, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+measurement%3A+technologies+and+applications+of+protein+and+antibody+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).</li>
<li>Altan, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long-acting+tumor+necrosis+factor+alpha-binding+protein+demonstrates+activity+in+both+in+vitro+and+in+vivo+models+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).</li>
<li>Patel, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+cytokine+detection+in+acute+coronary+syndrome+reveals+up-regulation+of+interferon+gamma+and+interleukin-10+post+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction.</a> Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).</li>
<li>Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multiplex+immunoassay+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of multiplex immunoassay platforms.</a> Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).</li>
<li>Mahajan, V. S., Jarolim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+interpret+elevated+cardiac+troponin+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">How to interpret elevated cardiac troponin levels.</a> Circulation. 124, 2350-2354 (2011).</li>
<li>Govindan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myosin+binding+protein-C+is+a+potential+diagnostic+biomarker+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).</li>
<li>Barefield, D., Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+and+function+of+cardiac+myosin+binding+protein-C+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).</li>
<li>Kuster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myosin+binding+protein+C+phosphorylation+in+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).</li>
<li>Sadayappan, S., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myosin+binding+protein-C%3A+redefining+its+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function.</a> Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).</li>
<li>Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myosin+binding+protein-C%3A+a+potential+early-stage%2C+cardiac-specific+biomarker+of+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury.</a> Biomark Med. 6, 69-72 (2012).</li>
<li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+technical+variables+affecting+immunoassay+recovery+of+cytokines+from+human+serum+and+simulated+vaginal+fluid%3A+a+multicenter+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study.</a> Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).</li>
<li>Malekzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+multi-plex+and+mono-plex+platforms+for+the+discovery+of+inflammatory+profiles+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases.</a> Methods. 56, 508-513 (2012).</li>
</ol>

Pełne zgłoszenie patentowe jest w toku (zgłoszenie nr seryjny 13/464,466, nr publikacji. US 2012/0282618 A1 i Data: 05/04/12) w celu określenia czynników ryzyka związanych z degradacją i uwalnianiem cMyBP-C do płynu ustrojowego człowieka oraz ilościowego określenia poziomu cMyBP-C w płynie ustrojowym człowieka.

W tym badaniu pokazujemy możliwość zastosowania multipleksowego testu immunologicznego do wykrywania wielu biomarkerów sercowych w surowicy pacjentów. Technika ta ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnym testem ELISA. Po pierwsze, ECL w zestawie testowym jest używany zamiast wykrywania kolorymetrycznego. W ECL sygnał elektryczny stymuluje lokalną produkcję mierzonej właściwości (światła), odłączając w ten sposób zdarzenie stymulacji od sygnału, co zmniejsza tło14. Pozwala to na uzyskanie wysokiej czułości, co...

Pomiar małych ilości białka w złożonych próbkach biologicznych, takich jak surowica, ma coraz większe znaczenie kliniczne dla leczenia pacjentów, jak również dla nauk podstawowych. Na przykład wzrost poziomu biomarkerów sercowych w surowicy, takich jak troponina I, w warunkach klinicznych jest zgodny z ostrym zawałem mięśnia sercowego (MI)1. Do wykrywania białek w próbkach surowicy najczęściej stosowaną techniką jest standardowy test immunoenzymatyczny (ELISA), ponieważ ma wysoką czułość i pozwala na bezwzględną kwantyfikację analitu. Jednak tradycyjne testy ELISA wymagają stosunkowo dużej ilości próbki (zwykle 100 μl), mają wysoki sygnał tła w niektórych płynach biologicznych i są ograniczone do pomiaru tylko jednego analitu na test ELISA2.	
Niedawno wprowadzono nową technikę testów immunologicznych, która pozwala obejść wiele z tych wad. Ten zmodyfikowany test, opracowany przez MSD, wykorzystuje elektrochemiluminescencję (ECL) do wykrywania sygnału, co pozwala na uzyskanie bardzo niskiego tła i zwiększonej czułości, umożliwiając wykorzystanie małych objętości próbek. Elektrochemiluminescencja opiera się na cząsteczce reporterowej rutenu (II) trisbipirydalu, która jest przyłączona do przeciwciał wykrywających. Ta cząsteczka reporterowa emituje światło o długości fali 620 nm po elektrycznej stymulacji dna 96-dołkowej płytki, która ma zintegrowane elektrody węglowe3. Ponadto, dzięki zastosowaniu powlekania punktowego, wiele przeciwciał wychwytujących można pokryć w jednym dołku (do 10 na płytce 96-dołkowej), co pozwala na jednoczesną kwantyfikację różnych białek w jednej próbce4. Technika ta została ostatnio wykorzystana do pomiaru profili cytokin prozapalnych w surowicy5,6. Płytki multipleksowe firmy MSD wypadają korzystnie w porównaniu z innymi platformami testowymimultipleksów 7.
Używając MSD jako głównej platformy testowej, opracowaliśmy niestandardową płytkę 3-plex, która może jednocześnie określać ilościowo poziom białka C wiążącego miozynę sercową (cMyBP-C), kinazy kreatynowej MB (CK-MB) i troponiny sercowej I (cTnI), a wyniki zostały porównane z wykrywaniem cMyBP-C za pomocą monopleksu. CK-MB i cTnI są dobrze znanymi biomarkerami zawału serca. Jednak wzrost tych biomarkerów może być spowodowany patologiami innymi niż zawał mięśnia sercowego, np. zapaleniem mięśnia sercowego lub niewydolnością nerek8. Przemawia to za dodaniem dodatkowych biomarkerów w celu zwiększenia swoistości diagnozy zawału serca. Niedawno wykazaliśmy, że cMyBP-C jest również potencjalnym biomarkerem dla MI9. cMyBP-C jest białkiem związanym z grubym włóknem, które ulega ekspresji w sercu, ale nie w mięśniach szkieletowych lub gładkich. Tak więc zwiększony poziom cMyBP-C w układzie krążenia jest specyficznym wskaźnikiem uszkodzenia serca13.
W tym badaniu porównaliśmy wykrywanie cMyBP-C metodą uniplex z użyciem niestandardowego testu 3-plex do pomiaru poziomu cMyBP-C, CK-MB i cTnI w surowicy pacjentów z zawałem mięśnia sercowego. W przyszłości ta charakterystyczna technika może być wykorzystywana do diagnozowania zawału mięśnia sercowego u pacjentów zgłaszających się z bólem w klatce piersiowej na izbie przyjęć.
Komisja rewizyjna instytucji (IRB) Uniwersytetu Loyola w Chicago zatwierdziła badanie do użycia niezidentyfikowanych próbek ludzkich i użycia testu immunologicznego (LU# 20392).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reodczynniki</td></tr><tr><td>MSD Read-Buffer T (4X) z surfaktantem</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>R92TC-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Acros</td><td>9005-64-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MSD Blocker Odkrycie</td> w <td>skali mezo</td><td>R93BA-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 10X</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP399-4</td><td>Filtruj przed użyciem</td></tr><tr><td>Przeciwciało C wiążące białko wiązania miozyny, monoklonalne myszy (E7), wolne od żelatyny</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-137180L</td><td>Do powlekania przeciwciało musi być wolne od</td></tr><tr> żelatyny<td colspan="4">Płytki i sprzęt</td></tr><tr><td>Multi-Array 96-dołkowa standardowa płytka</td><td>Mezo Scale Discovery</td><td>L15XA-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Prototypowa 3-pleksowa, czteropunktowa, 96-dołkowa płytka z cMyBP-C, cTnI i CK-MB</td><td>Meso Scale</td><td>Discovery N452A-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca ThermaSeal Produkty</td><td>Life Science Inc.</td><td>ST-3098</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MSD SECTOR Imager 2400A</td> Odkrycie <td></td><td>w skali mezo</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cyfrowa wytrząsarka do mikromiareczkowania MTS 2/4</td><td>IKA</td><td>3208001</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

czuła i specyficzna metoda ilościowa do oznaczania białka c wiążącego miozynę sercową w surowicy za pomocą elektrochemiluminescencyjnego testu immunologicznego

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkery stają się coraz ważniejsze w podejmowaniu decyzji klinicznych, a także w naukach podstawowych. Diagnozowanie zawału mięśnia sercowego (MI) jest w dużej mierze oparte na wykrywaniu białek specyficznych dla serca w surowicy lub osoczu pacjentów jako wskaźnika uszkodzenia mięśnia sercowego. Po niedawnym wykazaniu, że białko wiążące miozynę sercową-C (cMyBP-C) jest wykrywalne w surowicy po zawale mięśnia sercowego, zaproponowaliśmy je jako potencjalny biomarker zawału serca. Biomarkery są zwykle wykrywane za pomocą tradycyjnych testów immunoenzymatycznych związanych z kanapkami. Jednak ta technika wymaga dużej objętości próbki, ma mały zakres dynamiki i może mierzyć tylko jedno białko na raz.	
Tutaj pokazujemy multipleksowy test immunologiczny, w którym trzy białka serca mogą być mierzone jednocześnie z wysoką czułością. Pomiar cMyBP-C w uniplexie lub razem z kinazą kreatynową MB i troponiną sercową wykazał porównywalną czułość. Technika ta wykorzystuje metodę Meso Scale Discovery (MSD) polegającą na multipleksowaniu na 96-dołkowej płytce w połączeniu z elektrochemiluminescencją w celu detekcji. Chociaż wymagane są tylko małe objętości próbek, uzyskuje się wysoką czułość i duży zakres dynamiki. Korzystając z tej techniki, zmierzyliśmy poziom cMyBP-C, kinazy kreatynowej MB i troponiny sercowej I w próbkach surowicy od 16 osób z zawałem mięśnia sercowego i porównaliśmy wyniki z 16 osobami kontrolnymi. Byliśmy w stanie wykryć wszystkie trzy markery w tych próbkach i stwierdziliśmy, że wszystkie trzy biomarkery są zwiększone po zawale mięśnia sercowego. Technika ta jest zatem odpowiednia do czułego wykrywania biomarkerów serca w próbkach surowicy.

Podstawowe zasady i schemat postępowania w analizie 3-pleksowej przedstawiono na Rysunku 1, a cały przebieg procesu opisano w Tabeli 1. Analizy unipleksowe opierają się na tej samej zasadzie, z wyjątkiem tego, że całe dno dołka jest pokryte jednym przeciwciałem wychwytującym. Detekcja sygnału odbywa się za pomocą ECL, w którym sygnał elektryczny jest przykładany do dna dołka. Inicjuje to z kolei lokalną emisję światła w wyniku reakcji chemicznej buforu odczytowego z etykietą SULFO-TAG na...

Pomiar biomarkerów w złożonych próbkach biologicznych coraz częściej pomaga w podejmowaniu decyzji klinicznych. Opisujemy wysoce czułą metodę jednoczesnego pomiaru białka C wiążącego miozynę sercową, kinazy kreatynowej MB i troponiny sercowej I w próbkach surowicy od osób z zawałem mięśnia sercowego i zdrowych osób z grupy kontrolnej.

Czuła i specyficzna metoda ilościowa do oznaczania białka C wiążącego miozynę sercową w surowicy za pomocą elektrochemiluminescencyjnego testu immunologicznego

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest jednoczesne oznaczanie ilościowe białka wiążącego miozynę C serca oraz troponiny I serca w próbkach surowicy. Jest to realizowane poprzez uprzednie pokrycie płytki 96-dołkowej przeciwciałem przeciwko białku wiążącemu miozynę C serca dla analizy pleksowej lub poprzez zastosowanie gotowego zestawu do analizy trójpoleksowej. W drugim kroku pokryte płytki inkubuje się z kalibratorami i próbkami surowicy.W ostatnim kroku dodawane są znakowane przeciwciała detekcyjne, w wyniku czego powstaje sygnał chemiluminescencyjny wykrywany przez czytnik płytek. Ostatecznie poziomy białek sercowych w próbkach surowicy można oznaczyć za pomocą pojedynczych lub multipleksowych analiz immunoenzymatycznych. Dzień przed eksperymentem należy nanieść 30 µL przeciwciał monoklonalnych mysich przeciwko białku wiążącemu myosinę sercową C (bez żelatyny) w dolny róg każdej studni standardowej płytki 96-dołkowej Meso Scale Discovery.Następnie opukać boki płytki, aby rozprowadzić roztwór przeciwciał po dnie każdej studni. Po uszczelnieniu inkubować płytkę przez noc w temperaturze four degrees Celsius bez wytrząsania. Następnego ranka wylać roztwór do zlewu, a następnie na stos ręczników papierowych.Następnie do każdej dołki dodaj 150 µL 1%blocker A w PBS, aby zablokować niespecyficzne wiązanie. Inkubuj szczelnie zamkniętą płytkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, wstrząsając z prędkością 700 RPM podczas etapu blokowania; rozcieńcz rekombinowany fragment białka wiążącego miozynę sercową C do stężenia początkowego 2000 ng/mL w 1%blocker A w PBS. Następnie wykonaj rozcieńczenia seryjne tego roztworu w czynniku pięć, aby przygotować łącznie siedem standardów.Teraz usuń roztwór blokujący w sposób zaprezentowany przed chwilą, a następnie przemyj płytkę trzykrotnie 150 µL 0,05% tween 20 w PBS. Po trzecim przemyciu energicznie odwróć płytkę nad zlewem, aby usunąć nadmiar płynu, a następnie mocno osusz ją, dociskając do warstwy ręczników papierowych, aż będzie całkowicie sucha. Następnie pipetuj 25 µL każdego standardu i próbki do odpowiednich dołków.Następnie, podczas inkubacji zamkniętej płytki na wytrząsarce przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, rozcień dedykowany przeciwciało detekcyjne przeciwko białku wiążącemu miozynę serca C znakowane sul oag do stężenia 1 µg/mL w 1% blocker A w PBS. Po starannym przemyciu płytki, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, dodaj 25 µL roztworu przeciwciała detekcyjnego do każdego dołka, a następnie inkubuj zamkniętą płytkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy jednoczesnym wytrząsaniu. W czasie inkubacji przeprowadź test płytki demonstracyjnej z diodami LED, aby upewnić się co do prawidłowego działania obrazownika sector oraz oprogramowania; w tym czasie rozcieńcz również Reid Buffer. Po ponownym starannym przemyciu płytki, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 150 µL Reid Buffer do każdego dołka, uważając, by nie powstały pęcherzyki powietrza, a następnie niezwłocznie przeskanuj płytkę w obrazowniku sector przed rozpoczęciem analizy threeplex.Pozostawić płytkę 96-dołkową do analizy threeplex oraz roztwory rozcieńczalnika do osiągnięcia temperatury pokojowej. Następnie do płytki dodać 25 µL 1% blokera A w PBS, upewniając się, że roztwór całkowicie pokrywa dno dołka, a następnie inkubować szczelnie zamkniętą płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut podczas wstrząsania. W tym czasie rozcieńczyć rekombinowane białko wiążące miozynę sercową C, CK-MB oraz troponinę I serca wspólnie w 1% blokerze A w PBS, aby przygotować standard zawierający 2000 ng/mL białka wiążącego miozynę sercową C, 100 ng/mL CKMB oraz 25 ng/mL troponiny serca.Następnie wykonuję rozcieńczenia szeregowe tej mieszaniny z czynnikiem pięć do końcowej objętości co najmniej 100 µL dla każdego standardu; próbki rozcieńczam dwukrotnie w 1% roztworze blocker A w PBS. Następnie do 25 µL buforu blokującego, który znajduje się już w dołkach płytki trzypleksowej, dodaję dwa powtórzenia techniczne o objętości 25 µL dla standardów oraz próbek, włączając próbę ślepą składającą się z samego rozcieńczalnika. Po inkubowaniu zamkniętej płytki podczas wstrząsania, rozcieńczam trzy przeciwciała detekcyjne SUL oag razem do końcowego stężenia 1 µg/mL każdego z nich w 1% roztworze blocker A i PBS po dwóch godzinach. Płytkę przemywam w sposób zaprezentowany przed chwilą, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej dodaję 25 µL roztworu przeciwciał detekcyjnych do każdego dołka.Uszczelnioną płytkę inkubujemy przez jedną godzinę, wytrząsając ją z prędkością 700 RPM przez cały okres inkubacji. Należy przeprowadzić analizę płytki demonstracyjnej i rozcieńczyć bufor Reid zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Następnie, po przemyciu płytki roztworem 0,05% tween 20 w PBS, przy użyciu pipety wielokanałowej należy dodać 150 µL buforu Reid do każdego dołka, unikając powstawania pęcherzyków powietrza, a następnie niezwłocznie zeskanować płytkę w obrazowniku sektorowym.Na tej rycinie krzywa wzorcowa dla białka wiążącego miozynę sercową C w teście plex jest porównana z krzywą wzorcową dla białka wiążącego miozynę sercową C w teście three plex. Oba testy wykazują bardzo wysoką czułość i szeroki zakres dynamiczny. Obszar detekcji testu, zarówno dla plex, jak i three plex, zaznaczono kolorem szarym.Krzywe wzorcowe dla białka wiążącego miozynę C w sercu są podobne. Dolna granica detekcji, dolna granica oznaczalności oraz górna granica oznaczalności są porównywalne w obu testach: plex i threeplex. Wykresy te przedstawiają krzywe wzorcowe dla troponiny I serca oraz CKMB na płytce threeplex.Oba kalibratory wykazały wysoką czułość oraz szeroki zakres dynamiczny. Obszar detekcji testu przedstawiono w kolorze szarym. Reaktywność krzyżową przeciwciał detekcyjnych z dwoma pozostałymi kalibratorami badano poprzez inkubację poszczególnych krzywych wzorcowych wszystkich trzech kalibratorów z pojedynczymi przeciwciałami detekcyjnymi; stwierdzono jedynie niewielką reaktywność krzyżową między kalibratorem CKMB a przeciwciałami detekcyjnymi troponiny I serca i białka wiążącego miozynę C serca.Choć nie zaobserwowano reakcji krzyżowej między pozostałymi kalibratorami a przeciwciałami detekcyjnymi, co potwierdziło przydatność testu do wykrywania uszkodzeń serca, poziomy w surowicy u 16 osób z zawałem mięśnia sercowego porównano z grupą kontrolną, wykorzystując płytkę trzyplex do oznaczenia poziomów w surowicy białka wiążącego miozynę serca C-C-K-M-B oraz troponiny sercowej I. Stwierdzono, że poziomy wszystkich trzech biomarkerów były podwyższone u pacjentów z zawałem mięśnia sercowego w porównaniu z grupą kontrolną.

a-sensitive-specific-quantitation-method-for-determination-serum

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Czuła i swoista metoda ilościowa do oznaczania białka wiążącego miozynę sercową-C w surowicy przez elektrochemiluminescencyjną metodę immunoenzymatyczną

Przedstawiono protokół wykrywania trichotecenów (mykotoksyn stanowiących zagrożenie dla zdrowia ludzi) z wykorzystaniem nowo opracowanej metody przesiewowej, opartej na konkurencyjnej metodzie immunochemicznej oraz końcowej detekcji elektrochemicznej.

Metoda ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) do wykrywania mikotoksyn

Przedstawiona metoda umożliwia wykrycie funkcjonalnych, efektywnych kardiotropowych autoprzeciwciał w osoczu pacjentów z rozstrzeniowym kardiomiopatią, niezależnie od konkretnego antygenu, poprzez analizę wpływu wyizolowanych immunoglobulin pacjenta na skracanie się komórek oraz wewnątrzkomórkowe przejścia wapniowe w izolowanych kardiomiocytach szczura.

Pomiar wpływu przeciwciał na funkcje komórkowe izolowanych kardiomiocytów

W tym filmie demonstrujemy test immunologiczny elektrochemiluminescencji do ilościowego oznaczania docelowych poziomów białka w różnych próbkach. Test ten opiera się na luminescencji wytwarzanej w reakcji elektrochemicznej. Natężenie emitowanego światła jest proporcjonalne do ilości białka docelowego w próbce.

Test elektrochemiluminescencji do ilościowego oznaczania docelowych poziomów białka w lizacie mózgu

Ten film demonstruje protokół testu immunologicznego elektroforezy kapilarnej do wykrywania biomarkera białkowego związanego ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) z płytek krwi ludzkiej. Potwierdzenie obecności białka biomarkerowego ALS uzyskuje się poprzez rozdzielenie białek płytek krwi na podstawie wielkości, a następnie detekcję chemiluminescencyjną.

Test immunologiczny elektroforezy kapilarnej do wykrywania biomarkerów białkowych

Ten artykuł opisuje protokół, który ocenia zmiany wrażliwości miofilamentu Ca2+ podczas skurczu w izolowanych miocytach serca szczura. Wraz z elektrofizjologią serca, skurczowymi/rozkurczowymi poziomami cytozolu Ca2+ i skurczem/rozluźnieniem, pomiar ten jest niezbędny do wzmocnienia mechanizmów pośredniczących w sprzężeniu pobudzenia-skurczu serca w zdrowych i chorych sercach.

Ocena wrażliwości miofilamentu ca2+ leżącej u podstaw sprzężenia wzbudzenia-skurczu serca

Ta praca opisuje metodę litografii nanoimprintingowej do wytwarzania wysokiej jakości matryc czujnikowych, które działają na zasadzie niezwykłej transmisji optycznej. Bioczujnik jest tani, solidny, łatwy w użyciu i może wykrywać troponinę sercową I w surowicy w klinicznie istotnych stężeniach (odcięcie 99. percentyla ∼10-400 pg/ml, w zależności od testu).

Wykorzystanie nadzwyczajnej transmisji optycznej do ilościowego oznaczania biomarkerów serca w ludzkiej surowicy

Ogniskowanie izoelektryczne kapilarne to oparta na przeciwciałach, ultraczuła, wysokoprzepustowa technika, umożliwiająca szczegółową charakterystykę białek i ich izoform z bardzo małych próbek biologicznych. Poniżej opisano protokół wykrywania i oznaczania ilościowego określonych białek i ich izoform w sposób zautomatyzowany i zrobotyzowany.

Wysoce czułe i ilościowe wykrywanie białek i ich izoform metodą kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego

Tutaj przedstawiliśmy metody wykrywania autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych za pomocą testów elektrochemiluminescencyjnych (ECL). Protokół, stosowany do przewidywania cukrzycy typu 1, może być rozszerzony o wykrywanie autoprzeciwciał przeciwko innym chorobom autoimmunologicznym.

Testy elektrochemiluminescencyjne dla autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych

Test immunologiczny elektrochemiluminescencji (ECLIA) to nowatorskie podejście do ilościowego wykrywania endogennych i egzogennie stosowanych wariantów białka MeCP2, które daje wysoce ilościowe, dokładne i powtarzalne pomiary z niskim błędem wewnątrz- i międzytestowym w szerokim zakresie roboczym. W tym miejscu opisano protokół dla MeCP2-ECLIA w formacie 96-dołkowym.

Test oparty na elektrochemiluminescencji dla wariantów białka MeCP2

Protokół ten mierzy stężenia cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP) w tkankach stałych za pomocą konkurencyjnego testu immunoenzymatycznego (ELISA). Protokół opisuje, w jaki sposób przetwarzać tkankę stałą, przeprowadzać konkurencyjny test ELISA, przeliczać absorbancję na stężenia cGMP w pikomolach na mililitr i obliczać końcowe stężenia jako nanomole cGMP na gram tkanki.

Pomiar cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP) w tkankach stałych przy użyciu konkurencyjnego testu immunoenzymatycznego (ELISA)

Poznaj czułą metodę ilościową do oznaczania białka C wiążącego miozynę sercową w surowicy za pomocą testu immunologicznego z elektrochemiluminescencją. Technika ta umożliwia wykrywanie zawału mięśnia sercowego z wysoką specyficznością.

Czuła i specyficzna metoda ilościowa do oznaczania białka C wiążącego miozynę sercową w surowicy za pomocą elektrochemiluminescencyjnego testu immunologicznego (Wideo) | JoVE Journal

Czuła i specyficzna metoda ilościowa do oznaczania białka C wiążącego miozynę sercową w surowicy za pomocą elektrochemiluminescencyjnego testu immunologicznego

Przeglądaj więcej filmów