Czuła i specyficzna metoda ilościowa do oznaczania białka C wiążącego miozynę sercową w surowicy za pomocą elektrochemiluminescencyjnego testu immunologicznego

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesne ilościowe określenie białka C wiążącego miozynę sercową i sercowej troponiny I w próbkach surowicy. Osiąga się to poprzez uprzednie pokrycie 96-dołkowej płytki przeciwciałem C wiążącym miozynę serca w teście plex lub przy użyciu wstępnie zakodowanego testu threeplex. W drugim etapie powlekane płytki są inkubowane za pomocą kalibratorów i próbek surowicy.

Następnie w ostatnim etapie dodawane są znakowane przeciwciała detekcyjne, wytwarzany jest sygnał chemiluminescencyjny, który jest wykrywany przez czytnik płytek. Ostatecznie poziomy baczących białek sercowych obecnych w próbkach surowicy można określić za pomocą pojedynczych lub multipleksowych testów immunologicznych. Dzień przed eksperymentem pipetować 30 mikrolitrów mysiego monoklonalnego przeciwciała anty sercowego wiążącego miozynę C bez żelatyny do dolnego rogu każdej studzienki 96-dołkowej płytki standardowej do odkrycia skali miso

Następnie postukaj w boki płytki, aby rozprowadzić roztwór przeciwciała na dnie każdej studzienki. Po zamknięciu inkubować płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza bez wstrząsania. Następnego ranka strzepnij roztwór nad zlewem, a następnie na stos ręczników papierowych.

Następnie dodaj 150 mikrolitrów 1% blokera A w PBS do każdej studzienki, aby zablokować niespecyficzne wiązanie. Inkubować szczelnie zamkniętą płytkę przez godzinę w temperaturze pokojowej, wytrząsając z prędkością 700 obr./min podczas etapu blokowania, rozcieńczyć rekombinowany fragment białka C wiążącego miozynę serca do początkowego stężenia 2000 nanogramów na mililitr w 1% blokerze A w PBS. Następnie należy seryjnie rozcieńczyć ten roztwór pięciokrotnie, co daje w sumie siedem wzorców.

Teraz usuń roztwór blokujący, jak pokazano, a następnie umyj płytkę trzykrotnie 150 mikrolitrami 0,05% tween 20 w PBS. Po trzecim praniu energicznie przesuń talerz nad zlewem, a następnie mocno poklep talerz o warstwę ręczników papierowych, aż całkowicie wyschnie. Następnie odpipetować 25 mikrolitrów każdego wzorca i pobrać próbkę do odpowiednich studzienek.

Następnie, podczas gdy szczelnie zamknięta płytka inkubuje się na wytrząsarce przez godzinę w temperaturze pokojowej, rozcieńczyć specjalnie wykonane przeciwciało wykrywające białko C wiążące miozynę sercową, znakowane sul oag do jednego mikrograma na mililitr w 1% blokerze A w PBS. Po dokładnym umyciu płytki, jak właśnie pokazano, dodać 25 mikrolitrów roztworu przeciwciała detekcyjnego do każdej studzienki, a następnie inkubować szczelnie zapieczętowaną płytkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, wstrząsając w okresie inkubacji, uruchomić płytkę demonstracyjną z diodami LED, aby zapewnić prawidłowe działanie kamery, a oprogramowanie rozcieńczyć bufor Reida również w tym czasie. Po dokładnym umyciu płytki, jak pokazano wcześniej, użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 150 mikrolitrów buforu Reida do każdej studzienki, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, a następnie natychmiast zeskanuj płytkę w kamerze sektorowej przed rozpoczęciem testu trójpoziomowego.

Pozwól, aby 96-dołkowa płytka z trójpleksem i roztwory rozcieńczalnika osiągnęły równowagę do temperatury pokojowej. Następnie dodaj 25 mikrolitrów 1% blokera A w PBS do płytki, upewniając się, że cała studzienka jest pokryta roztworem i inkubować zapieczętowaną płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, wstrząsając. W międzyczasie rozcieńczyć rekombinowane białko wiążące miozynę sercową C-C-K-M-B i sercową troponinę I razem w 1% blokerze A w PBS, aby stworzyć standard zawierający 2000 nanogramów na mililitr białka wiążącego miozynę sercową C, 100 nanogramów na mililitr CKMB i 25 nanogramów na mililitr troponiny sercowej.

Następnie seryjnie rozcieńczam tę mieszaninę pięciokrotnie do końcowej objętości co najmniej 100 mikrolitrów dla każdej standardowej rozcieńczonej próbki dwa razy z 1% blokerem A w PBS. Następnie dodać 2 25 mikrolitrowe powtórzenia techniczne wzorców, jak również próbki do 25 mikrolitrów buforu blokującego już obecnego w studzienkach płytki z trzech pleksów, dodać ślepą próbę rozcieńczalnika dopiero po inkubacji szczelnie zamkniętej płytki podczas wytrząsania, rozcieńczyć trzy przeciwciała wykrywające SUL oag razem do końcowego stężenia jednego mikrograma na mililitr każdy w 1% blokerze roztworu A i PBS po dwóch godzinach. Umyj płytkę, jak pokazano, a następnie użyj pipety wielokanałowej, aby dodać do każdej z nich 25 mikrolitrów roztworu przeciwciała wykrywającego.

Dobrze inkubować zapieczętowaną płytkę przez godzinę, wytrząsając z prędkością 700 obr./min w okresie inkubacji. Uruchom płytkę demonstracyjną i rozcieńcz bufor Reida, jak pokazano powyżej. Następnie, po umyciu płytki za pomocą 0,05% tween 20 w PBS, użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 150 mikrolitrów buforu Reida do każdej studzienki, unikając pęcherzyków powietrza i natychmiast zeskanuj płytkę w imagerze sektorów.

Na tym rysunku standardowa krzywa białka C wiążącego miozynę sercową w teście plex jest porównywana z krzywą białka C wiążącego miozynę sercową w teście trzech pleksów. Oba testy charakteryzują się bardzo wysoką czułością i wysokim zakresem dynamiki. Obszar wykrywania testu jest wyświetlany w kolorze szarym, zarówno w trybie plex, jak i three plex.

Krzywe standardowe białka C wiążącego miozynę serca są podobne. Dolna granica wykrywalności, dolna granica oznaczalności i górna granica poziomów oznaczalności są porównywalne zarówno w testach plex, jak i threeplex. Wykresy te pokazują standardowe krzywe troponiny sercowej I i CKMB płytki trójpleksowej.

Oba kalibratory wykazały się wysoką czułością i dużym zakresem dynamiki. Obszar wykrywania testu jest wyświetlany w kolorze szarym. Reaktywność krzyżową przeciwciał detekcyjnych z pozostałymi dwoma kalibratorami badano poprzez inkubację indywidualnych krzywych wzorcowych wszystkich trzech kalibratorów z pojedynczymi przeciwciałami wykrywającymi, zaobserwowano tylko niewielką reaktywność krzyżową między kalibratorem CKMB a przeciwciałami wykrywającymi troponinę I i miozynę sercową.

Chociaż nie zaobserwowano reaktywności krzyżowej między innymi kalibratorami i przeciwciałami wykrywającymi jako dowód na możliwość zastosowania testu do wykrywania uszkodzenia serca, poziomy w surowicy 16 osób z zawałem mięśnia sercowego porównano z grupą kontrolną przy użyciu trzech poziomów białka wiążącego miozynę sercową C-C-K-M-B i troponiny sercowej w surowicy na trzech płytkach pleksowych. Stwierdzono, że wszystkie trzy biomarkery były zwiększone u pacjentów z zawałem mięśnia sercowego w porównaniu z grupą kontrolną.