Mikroiniekcja jednokomórkowa do analizy komunikacji komórkowej
February 26th, 2017
Opisujemy tutaj, jak wykonać mikroiniekcję pojedynczej komórki Lucyfera Żółtego, aby zobrazować komunikację komórkową poprzez połączenia szczelinowe w żywych komórkach, i podajemy kilka przydatnych wskazówek. Oczekujemy, że ten artykuł pomoże każdemu ocenić stopień sprzężenia komórkowego z powodu funkcjonalnych połączeń szczelinowych. Wszystko, co tu opisano, można by w zasadzie zaadaptować do innych barwników fluorescencyjnych o masie cząsteczkowej poniżej 1000 daltonów.
Cześć, mam na imię Anael. Pracuję w Fundacji Oswaldo Cruz w Laboratorium Komunikacji Komórkowej. Badamy tutaj receptory P2 i iniekcje luk w kontekście układu odpornościowego i wątroby.
Dzisiaj przedstawię Wam mikroiniekcję komórki. Zastrzyki z luk odgrywają pewne role fizjologiczne, takie jak transmisja synaps, skurcze serca i inne. W przypadku tej techniki możemy zbadać, czy zastrzyki w lukę są funkcjonalne, czy nie.
Okej, zobaczmy podstawowe elementy zestawu do mikroiniekcji. Tutaj mamy odwrócony mikroskop fluorescencyjny, w którym zobaczymy komórki. Jest to kamera CCD do nagrywania wyników.
Mamy tutaj generator prądu, za pomocą którego wprowadzimy barwnik do ogniwa. Następnie mamy uchwyt, do którego podłączona jest mikroelektroda. I mikromanipulator, który jest podłączony do uchwytu i pozwala na ruch mikroelektrody w trzech osiach, Z, Y i X. Przed rozpoczęciem eksperymentu musimy wykonać mikroelektrodę.
Używamy tej kapilary ze szkła borokrzemianowego i tego sprzętu o nazwie polar. Tutaj mocujemy kapilarnę borokrzemianową. Ten żarnik wolframowy podgrzejemy, aby uzyskać dwie mikroelektrody.
Teraz nagrzewanie się żarnika wolframowego i fala tutaj pociągniemy w dół, aby utworzyć dwie mikroelektrody. Łatwy. Naszym pierwszym krokiem jest wypełnienie mikroelektrody barwnikiem. Jedną wskazówką jest to, że aby przeprowadzić eksperyment, musisz napełnić tylko końcówkę kilkoma mikrolitrami.
Nie trzeba wypełniać wszystkiego. Uwaga z większą ilością szczegółów. Wypełnij tylko końcówkę.
Zacznijmy eksperyment. Mamy tutaj komórki na szalce Petriego, w roztworze sodu. Srebrny przewód podłączony do generatora prądu.
Musimy teraz przymocować mikroelektrody do stopnia głównego. Tutaj w stopniu czołowym mamy kolejny srebrny przewód, również podłączony do generatora prądu. Po zamocowaniu mikroelektrody możemy umieścić ją w wannie.
Zwróć uwagę, że końcówka pipety ostrożnie dotyka wanny. Ta procedura jest wykonywana bardzo ostrożnie, aby uniknąć uderzenia końcówki w dno szalki Petriego. Po wejściu do kąpieli możemy udać się do mikroskopu, aby poszukać cienia mikropipety.
Zalecamy, abyśmy zaczęli patrzeć w soczewkę powiększającą. Gdy znajdziemy cień pipety, możemy przesunąć mikroelektrodę w kierunku celi za pomocą mikromanipulatora. Gdy znajdzie się bardzo blisko ogniwa, możemy wykonać test post, aby sprawdzić, czy mikroelektroda nie jest zatkana.
Jak zobaczymy dalej. Tutaj widzimy mikropipetę i ustawiamy mikropipetę bardzo blisko celi. Możemy zobaczyć ruch komórek w prawo i w lewo.
Następnie zmieniamy na filtr, filtr fluorescencyjny. Możemy zastosować impuls hiperpolaryzacyjny, aby sprawdzić, czy końcówka pipety nie jest zatkana. Ponieważ mikropipeta znajduje się wewnątrz komórki, możemy zastosować impuls hiperpolaryzacyjny, aby obciążyć komórkę barwnikiem.
Używamy tutaj sypkiego darmowego żółtego barwnika. Po załadowaniu komórki barwnikiem, jeśli sąsiednie komórki są połączone przez wstrzyknięcia szczelinowe, czekamy kilka minut i zobaczymy, jak sąsiednie komórki rozjaśniają się przez dyfuzję barwnika przez te wstrzyknięcia szczelinowe. W naszym eksperymencie możemy zobaczyć pięć komórek oznaczonych gwiazdkami, wykazujących fluorescencję.
Tutaj jest dobry przykład eksperymentu z mikroiniekcją w komórkach nabłonka grasicy, w A i B.In rysunkach C i D, pokazuje mikroiniekcję do obojętnej komórki grasicy luźnej wolnej żółci i innego barwnika, nieprzepuszczalnego dla iniekcji szczelinowej pokazanej we wkładce. Rysunek E i F linia komórek nabłonka grasicy mikroiniekowana luźnym wolnym żółtym i we wkładce luźnym wolnym żółtym i szczelinowym blokiem iniekcyjnym. Wyniki pokazują, że luźny, wolny żółty kolor nie rozprzestrzenił się na sąsiednie komórki.
Następnie widzimy mikroiniekcję w komórkach nabłonka grasicy, w obecności deksametazonu, a oznaczanie ilościowe w B.Deksametazon zwiększa stopień sprzężenia, jak pokazano na rysunku B.Na 100 wstrzyknięć liczba trzech lub czterech połączonych komórek była częstsza w obecności tego leku. Mam nadzieję, że mógłbym pomóc początkującym w stosowaniu tej ważnej techniki badania komunikacji komórkowej. Dzięki i pa.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje technikę pojedynczej mikroiniekcji Żółci Lucyfera w celu wizualizowania komunikacji komórkowej poprzez połączenia szczelinowe w żywych komórkach. Zawiera praktyczne wskazówki dla badaczy, aby ocenić sprzężenie komórkowe z powodu funkcjonalnych połączeń szczelinowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Komunikacja komórkowa
- Neuronauka
- Immunologia
Tło
- Połączenia szczelinowe odgrywają krytyczne role w procesach fizjologicznych.
- Są zaangażowane w transmisję synaptyczną i skurcze serca.
- Zrozumienie ich funkcjonalności jest istotne dla różnych badań biologicznych.
- Żółć Lucyfera jest fluorescencyjnym barwnikiem stosowanym do wizualizowania.
Cel badania
- Aby pokazać technikę mikroiniekcji do badania połączeń szczelinowych.
- Aby ocenić stopień sprzężenia komórkowego w żywych komórkach.
- Aby zapewnić wgląd w funkcjonalność połączeń szczelinowych.
Zastosowanie metod
- Pojedyncza mikroiniekcja Żółci Lucyfera.
- Wizualizacja komunikacji komórkowej.
- Ocena funkcjonalnych połączeń szczelinowych.
- Dostosowanie techniki dla innych fluorescencyjnych barwników.
Główne wyniki
- Udana wizualizację komunikacji komórkowej poprzez połączenia szczelinowe.
- Zdemonstrowano ocenę sprzężenia komórkowego.
- Technika ma zastosowanie do różnych fluorescencyjnych barwników o masie cząsteczkowej poniżej 1 000 Daltonów.
- Wgląd w fizjologiczne role połączeń szczelinowych.
Wnioski
- Technika mikroiniekcji jest skuteczna w badaniu połączeń szczelinowych.
- Żółć Lucyfera służy jako użyteczne narzędzie do wizualizowania.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia komunikacji komórkowej w żywych systemach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Single-cell microinjection enables direct assessment of gap junction functionality, a key mechanism in cellular communication relevant to drug target validation in neuroscience, immunology, and tissue engineering. By visualizing real-time dye diffusion, researchers can evaluate compound effects on intercellular coupling, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides quantitative, functional readouts that improve target confidence and inform go/no-go decisions in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether a target modulates gap junction-mediated communication.
- Operational Value: Enables functional validation of connexin or hemichannel targets in live cells.
- Predictive Value: Supports pathway clarification and biological de-risking through direct observation of dye transfer.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated cellular systems for compound screening by establishing baseline coupling.
- Quantitative Output: Measures diffusion kinetics as a functional readout for assay standardization.
- Scalability: Adaptable to high-content imaging platforms for multi-condition comparison.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models physiological processes like synaptic transmission and heart contraction where gap junctions are implicated.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to preclinical models by confirming functional coupling in relevant cell types.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement based on evidence of target engagement in cellular networks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to assess target effects on cellular communication before progressing to phenotypic screening or lead optimization.
- Discovery Biology: Tests hypothesis that a compound or genetic modulator alters intercellular signaling via gap junctions.
- Screening: Generates reproducible, quantitative fluorescence data to compare treatment conditions.
- Analytics: Provides measurable diffusion metrics that enable statistical comparison of coupling efficiency.
- Translational Research: Uses epithelial and immune-relevant cell lines to model tissue-level communication.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating connexin-targeting compounds across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by confirming functional target modulation in a native cellular context.
- Operational Value: Standardizes microinjection and imaging protocols for reproducible results across labs.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by identifying ineffective modulators of cellular coupling early.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of compounds demonstrating gap junction modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, fluorescence microscopy, and dye handling.
- Depends on micromanipulator stability, electrode preparation, and intracellular injection precision.
- Necessitates standardized cell preparation and bath conditions to ensure consistent results.
- Must account for cell type variability in connexin expression and baseline coupling.
- Limited to dyes under ~1,000 Da that can pass through gap junctions, as larger molecules remain cell-autonomous.
