Name: Mikroiniekcja jednokomórkowa do analizy komunikacji komórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Poznaj technikę mikroiniekcji jednokomórkowej z użyciem Lucifer Yellow do wizualizacji komunikacji międzykomórkowej przez złącza szczelinowe w żywych komórkach. Ta metoda pozwala ocenić stopień sprzężenia komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dedykują ten artykuł na cześć prof. Gilberto Oliveira-Castro, który wprowadził badania nad komunikacją międzykomórkową za pomocą połączeń szczelinowych w Brazylii. Praca ta została sfinansowana przez Capes, CNPQ i Faperj.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Utrzymuj posiew linii komórek nabłonka grasicy (IT76M1) lub komórki, która ma być badana w inkubatorze (37°C/5% CO2 ).</li>
	<li>Umyj komórki PBS 1x (powtórz tę pozycję 3x).</li>
	<li>Dodaj trypsynę do komórek na 5 minut.</li>
	<li>Dodać pożywkę (dwukrotność objętości trypsyny dodanej w ppkt 1.3) z 10% FBS (płodową surowicą bydlęcą) do komórek z trypsyną i odwirować (800 x g przez 5 min).</li>
	<li>Policz komórki w hemocytometrze.</li>
	<li>Dostosuj gęstość komórek w zależności od typu ogniwa, ponieważ komórki muszą być ze sobą w bliskim kontakcie, aby umożliwić sprzężenie. Uwaga: W naszym przypadku użyliśmy 3 x 105 komórek na szalkę Petriego o średnicy 35 mm.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikropipet
<ol>
	<li>Wyciągnąć mikropipetę zgodnie z opisem ze szklanej mikropipety kapilarnej (o średnicy 1,5 mm) do końcowej średnicy 0,2 μm, aby uzyskać rezystancję końcową około 30 MΩ17,18. 
	UWAGA: Alternatywnie można zakupić pipety iniekcyjne. Rezystancja zależy od wielkości komórki, na przykład mikroelektroda o wyższej rezystancji byłaby konieczna dla komórek groniastych trzustki, na przykład (100-150 MΩ)19. Częstym problemem, który może wystąpić, jest wytrącanie się roztworu Lucifer Yellow, który może następnie zatkać mikropipetę i może wymagać wcześniejszej filtracji lub odwirowania. Przed wstrzyknięciem mikropipetę należy przeanalizować pod mikroskopem w celu wykrycia, czy występuje przeszkoda lub jakiekolwiek zakłócenia13. Mikropipetę można przetestować, wstrzykując LY za pomocą końcówki mikropipety do roztworu soli fizjologicznej.</li>
</ol>
3. Testowanie mikropipety
<ol>
	<li>Przygotować roztwór Lucifer Yellow (5%) w 150 mmol/L LiCI i załadować mikropipetę za pomocą strzykawki lub przez zasypkę (włożyć do niej roztwór LY).</li>
	<li>Umieścić mikropipetę na szalce Petriego o średnicy 35 mm z kuwetami IT76M1 na stacji roboczej do mikroiniekcji i zanurzyć końcówkę szklanej mikropipety w pożywce komórkowej. Skoncentruj się na mikropipecie i wykonaj test płynięcia barwnika, stosując impuls.</li>
</ol>
4. Jednokomórkowy Lucyfer Żółty Mikroiniekcja
<ol>
	<li>Ustaw ostrość mikroskopu tuż nad warstwą komórkową przy dużym powiększeniu (40X), a następnie powoli opuść pipetę do komórek za pomocą mikromanipulatora.</li>
	<li>Nakłuj komórkę docelową, gdy końcówka jest wystarczająco blisko, aby dotknąć błony komórkowej, i zastosuj mały impuls hiperpolaryzacyjny, aby wprowadzić LY do komórki. Przyłożone napięcie będzie zależało od ładunku netto barwnika, który ma zostać wstrzyknięty. Alternatywnie, niektóre inne barwniki mogą być użyte w tej technice, jak pokazano w tabeli 1. 
	Uwaga: W zasadzie można użyć dowolnego barwnika hydrofilowego o MW mniejszym niż 1KDa. Jednak szybkość przenoszenia może się różnić w zależności od wagi i hydrofilowości. Dodatkowo należy ocenić niespecyficzny transfer użytego barwnika. </li>
	<li>Uchwyć obrazy komórek 3 minuty po wstrzyknięciu barwnika lub nakręć mały film za pomocą mikroskopii poklatkowej (30 kl./s). 
	UWAGA: Podobne podejście można zaobserwować w Hitomi et al (2015)20. Aby uniknąć komunikacji przez mosty międzykomórkowe (niepełna mitoza), zaleca się jednoczesne wstrzyknięcie dekstranu rodaminy (od 2 do 10 KDa), który nie przechodzi przez połączenia szczelinowe, ale przechodzi przez mosty międzykomórkowe i niektóre typy nanotubul, jak pokazano na rycinie 2.</li>
</ol>

<ol><li>Bennett, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions%3A+new+tools%2C+new+answers%2C+new+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Gap junctions: new tools, new answers, new questions.</a> Neuron. 6 (3), 305-320 (1991).</li>
<li>Orellana, J. A., Martinez, A. D., Retamal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+channels+and+hemichannels+in+the+CNS%3A+Regulation+by+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Gap junction channels and hemichannels in the CNS: Regulation by signaling molecules.</a> Neuropharmacology. , (2013).</li>
<li>Peracchia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+correlates+of+gap+junction+permeation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Structural correlates of gap junction permeation.</a> Int Rev Cytol. 66, 81-146 (1980).</li>
<li>Loewenstein, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+intercellular+communication+and+the+control+of+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Junctional intercellular communication and the control of growth.</a> Biochim Biophys Acta. 560 (1), 1-65 (1979).</li>
<li>Alves, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+gap+junctions+in+thymic+epithelial+cells+are+formed+by+connexin+43%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional gap junctions in thymic epithelial cells are formed by connexin 43.</a> Eur.J Immunol. 25 (2), 431-437 (1995).</li>
<li>Alves, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+there+functional+gap+junctions+or+junctional+hemichannels+in+macrophages%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Are there functional gap junctions or junctional hemichannels in macrophages?</a> Blood. 88 (1), 328-334 (1996).</li>
<li>Fonseca, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+connexin+30.3+and+43+in+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+letters%22%5BJournal%5D)">Characterization of connexin 30.3 and 43 in thymocytes.</a> Immunology letters. 94 (1-2), 65-75 (2004).</li>
<li>Nihei, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulatory+effects+of+cAMP+and+PKC+activation+on+gap+junctional+intercellular+communication+among+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulatory effects of cAMP and PKC activation on gap junctional intercellular communication among thymic epithelial cells.</a> BMC Cell Biol. 11, 3(2010).</li>
<li>Czyz, J., Szpak, K., Madeja, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+connexins+in+prostate+cancer+promotion+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">The role of connexins in prostate cancer promotion and progression.</a> Nat Rev Urol. 9 (5), 274-282 (2012).</li>
<li>El-Saghir, J. A., El-Habre, E. T., El-Sabban, M. E., Talhouk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexins%3A+a+junctional+crossroad+to+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Connexins: a junctional crossroad to breast cancer.</a> Int J Dev Biol. 55 (7-9), 773-780 (2011).</li>
<li>Cea, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin-+and+pannexin-based+channels+in+normal+skeletal+muscles+and+their+possible+role+in+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Connexin- and pannexin-based channels in normal skeletal muscles and their possible role in muscle atrophy.</a> J Membr Biol. 245 (8), 423-436 (2012).</li>
<li>Cotrina, M. L., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+connexins+in+demyelinating+diseases%3A+therapeutic+potential+of+glial+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Brain connexins in demyelinating diseases: therapeutic potential of glial targets.</a> Brain Res. 1487, 61-68 (2012).</li>
<li>Park, H. an-A., R, S., Khanna, S. avita, Sen, C. handan K. Current Technologies in Single-Cell Microinjection and Application to Study Signal Transduction. <a target="_blank" href="NULL">Methods in Redox Signaling</a>. , Chapter 10 (2010).</li>
<li>Abbaci, M., Barberi-Heyob, M., Blondel, W., Guillemin, F., Didelon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+commonly+used+methods+to+assay+the+molecular+permeability+of+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication.</a> Biotechniques. 45 (1), 33-52 (2008).</li>
<li>Stewart, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connections+between+cells+as+revealed+by+dye-coupling+with+a+highly+fluorescent+naphthalimide+tracer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional connections between cells as revealed by dye-coupling with a highly fluorescent naphthalimide tracer.</a> Cell. 14 (3), 741-759 (1978).</li>
<li>Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+function+of+connexin+channels+in+primary+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Probing the function of connexin channels in primary tissues.</a> Methods. 20 (2), 232-244 (2000).</li>
<li>Klaunig, J. E., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Assessment of gap junctional intercellular communication.</a> Curr Protoc Toxicol. , Chapter 2 Unit2 17 (2009).</li>
<li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lucifer+yellow+-+an+angel+rather+than+the+devil%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Lucifer yellow - an angel rather than the devil.</a> J Cell Mol Med. 16 (1), 22-31 (2012).</li>
<li>Orci, L., Biochemistry, C. <a target="_blank" href="https://www.semanticscholar.org/paper/Blockage-of-cell-to-cell-communication-within-Meda-Bruzzone/a0b97324cebc9eb0534d850954a20ab1c56cbf94">Blockage of Cell-to-Cell Communication within Pancreatic Acini Is Associated with Increased Basal Release of Amylase Materials and Methods Preparation of Acini.</a> Cell. 103 (August), 475-483 (1986).</li>
<li>Hitomi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+connexin+function+enhances+self-renewal+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Differential connexin function enhances self-renewal in glioblastoma.</a> Cell Rep. 11 (7), 1031-1042 (2015).</li>
<li>Nihei, O. K., Campos de Carvalho,, C, A., Spray, D. C., Savino, W., Alves, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+form+of+cellular+communication+among+thymic+epithelial+cells%3A+intercellular+calcium+wave+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel form of cellular communication among thymic epithelial cells: intercellular calcium wave propagation.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 285 (5), C1304-C1313 (2003).</li>
<li>Kanno, Y., Loewenstein, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+Diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intercellular Diffusion.</a> Science. 143 (3609), 959-960 (1964).</li>
<li>Alves, L. A., Nihei, O. K., Fonseca, P. C., Carvalho, A. C., Savino, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+modulation+by+extracellular+signaling+molecules%3A+the+thymus+model%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Gap junction modulation by extracellular signaling molecules: the thymus model.</a> Braz J Med Biol Res. 33 (4), 457-465 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

W celu sprawdzenia obecności funkcjonalnego połączenia szczelinowego międzykomórkowego wymagane jest zastosowanie znaczników, które są nieprzepuszczalne dla błony, chociaż przepuszczalne przez kanały międzykomórkowe16. Fluoresceina, pierwszy barwnik fluorescencyjny, który zaobserwował sprzężenie komórka-komórka22, jest przepuszczalny między błonami niezłącznymi3 i dlatego został zastąpiony przez żółty barwnik Lucyfera15. Obecn...

Połączenia szczelinowe to kanały międzykomórkowe, które umożliwiają komunikację między sąsiednimi komórkami1. Ta komunikacja łączy dwie lub więcej sąsiednich komórek, z których każda przyczynia się do połączenia lub półkanału, tworząc kanał międzykomórkowy. W komórkach ssaków połączenie składa się z sześciu koneksyn, monomerów z czterema domenami transbłonowymi oraz zakończeniem C i N w cytoplazmie2. Połączenia szczelinowe nie tylko umożliwiają przepływ jonów, drugich przekaźników i małych metabolitów, ale także przyczyniają się do wielu form komunikacji komórkowej w wielu procesach fizjologicznych, takich jak transmisja synaptyczna, skurcze serca, wzrost i różnicowanie komórek3,4,5,6,7,8. Ponadto połączenia szczelinowe są związane z wieloma chorobami, w tym rakiem9,10, atrofią mięśni11, niektórymi chorobami genetycznymi i chorobami demielinizacyjnymi12.
Ten typ przesłuchu międzykomórkowego może być oceniany za pomocą kilku metod13,14,15,16. W tym artykule pokazujemy, jak wykonać mikroiniekcję Lucyfera Yellow w jednej komórce, aby uwidocznić komunikację komórkową poprzez połączenia szczelinowe w żywych komórkach. Omawiamy, jak przygotować komórki i mikropipetę, użycie mikromanipulatora i wstrzyknięcie żółtego barwnika Lucyfer do linii komórek nabłonka grasicy. Zwykle ta eksperymentalna procedura może być analizowana przez średnią komórek połączonych z komórką obciążoną barwnikiem. Ponadto metoda ta może być stosowana z innymi barwnikami fluorescencyjnymi o masie cząsteczkowej poniżej granicy połączeń szczelinowych, która wynosi około 1000 daltonów.

<table><tbody><tr><td>Lucyfer żółty</td><td>Sigma</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek litu</td><td>Sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>PBS tabletki</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R4130</td><td></td></tr><tr><td>Surowica płodowa bydlęca</td><td>Cultilab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>stół z izolacją wibracyjną&nbsp;</td><td>Newport</td><td>VH3036W-OPT</td><td>Stół z izolacją wibracyjną jest potrzebny do ochrony eksperymentów przed wibracjami i uniknięcia uszkodzenia komórek</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MMO-203</td><td>To urządzenie umożliwia precyzyjną regulację mikropipety, która jest potrzebna do mikroiniekcji komórek.</td></tr><tr><td>Generator prądu&nbsp;</td><td>Digitimer</td><td>DS2</td><td>Aby wytworzyć przepływ barwnika przez mikropipetę, prąd poniżej jednego nanoampera był podawany za pomocą generatora prądu z elektrodą wewnątrz mikropipety lub wzmacniacza, który ma obwód kompensacji pojemności (stary elektrometr) lub funkcję wtrysku prądu nowych wzmacniaczy patch clamp, a przewód uziemiający zanurzono w czaszy płytki. Alternatywnie barwnik może być wstrzykiwany za pomocą mikrowtryskiwacza pneumatycznego, zgodnie z zaleceniami fabrycznymi. &nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja jednokomórkowa do analizy komunikacji komórkowej

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Połączenia szczelinowe to kanały międzykomórkowe, które umożliwiają komunikację sąsiednich komórek. Komunikacja ta zależy od udziału półkanału przez każdą sąsiednią komórkę w celu utworzenia węzła szczelinowego. W komórkach ssaków półkanał jest utworzony przez sześć połączeń, monomerów z czterema domenami transbłonowymi i zakończeniem C i N w cytoplazmie. Połączenia szczelinowe umożliwiają wymianę jonów, drugich przekaźników i małych metabolitów. Ponadto odgrywają ważną rolę w wielu formach komunikacji komórkowej w procesach fizjologicznych, takich jak przekaźnictwo synaptyczne, skurcze serca, wzrost i różnicowanie komórek. Szczegółowo opisujemy, jak wykonać mikroiniekcję pojedynczej komórki Lucyfera Żółtego, aby uwidocznić komunikację komórkową poprzez połączenia szczelinowe w żywych komórkach. Oczekuje się, że w funkcjonalnych połączeniach szczelinowych barwnik będzie dyfundował z załadowanej komórki do połączonych komórek. Jest to bardzo przydatna technika do badania połączeń szczelinowych, ponieważ można ocenić dyfuzję fluorescencji w czasie rzeczywistym. Omawiamy, jak przygotować komórki i mikropipetę, jak używać mikromanipulatora i wstrzykiwać niskocząsteczkowy barwnik fluorescencyjny do linii komórek nabłonkowych.

Do oceny sprzężenia barwnika poprzez połączenia szczelinowe wykorzystano linię komórkową nabłonka grasicy IT-76MI, ponieważ opisano, że komórki te wykazują ekspresję funkcjonalnych połączeń szczelinowych utworzonych przez koneksynę 4321. Rycina 1 przedstawia wstrzyknięcie Lucifer Yellow do pojedynczej komórki znajdującej się pod końcówką pipety. Po kilku minutach połączone komórki stają się fluorescencyjne (gwiazdki), co wskazuje na dyfuzję fluorescencyjnego barwni...

Opisujemy tutaj, jak wykonać mikroiniekcję pojedynczej komórki Lucyfera Żółtego, aby zobrazować komunikację komórkową poprzez połączenia szczelinowe w żywych komórkach, i podajemy kilka przydatnych wskazówek. Oczekujemy, że ten artykuł pomoże każdemu ocenić stopień sprzężenia komórkowego z powodu funkcjonalnych połączeń szczelinowych. Wszystko, co tu opisano, można by w zasadzie zaadaptować do innych barwników fluorescencyjnych o masie cząsteczkowej poniżej 1000 daltonów.

Mikroiniekcja jednokomórkowa do analizy komunikacji komórkowej

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Cześć, mam na imię Anael. Pracuję w Fundacji Oswaldo Cruz w Laboratorium Komunikacji Komórkowej. Badamy tutaj receptory P2 i iniekcje luk w kontekście układu odpornościowego i wątroby.Dzisiaj przedstawię Wam mikroiniekcję komórki. Zastrzyki z luk odgrywają pewne role fizjologiczne, takie jak transmisja synaps, skurcze serca i inne. W przypadku tej techniki możemy zbadać, czy zastrzyki w lukę są funkcjonalne, czy nie.Okej, zobaczmy podstawowe elementy zestawu do mikroiniekcji. Tutaj mamy odwrócony mikroskop fluorescencyjny, w którym zobaczymy komórki. Jest to kamera CCD do nagrywania wyników.Mamy tutaj generator prądu, za pomocą którego wprowadzimy barwnik do ogniwa. Następnie mamy uchwyt, do którego podłączona jest mikroelektroda. I mikromanipulator, który jest podłączony do uchwytu i pozwala na ruch mikroelektrody w trzech osiach, Z, Y i X. Przed rozpoczęciem eksperymentu musimy wykonać mikroelektrodę.Używamy tej kapilary ze szkła borokrzemianowego i tego sprzętu o nazwie polar. Tutaj mocujemy kapilarnę borokrzemianową. Ten żarnik wolframowy podgrzejemy, aby uzyskać dwie mikroelektrody.Teraz nagrzewanie się żarnika wolframowego i fala tutaj pociągniemy w dół, aby utworzyć dwie mikroelektrody. Łatwy. Naszym pierwszym krokiem jest wypełnienie mikroelektrody barwnikiem. Jedną wskazówką jest to, że aby przeprowadzić eksperyment, musisz napełnić tylko końcówkę kilkoma mikrolitrami.Nie trzeba wypełniać wszystkiego. Uwaga z większą ilością szczegółów. Wypełnij tylko końcówkę.Zacznijmy eksperyment. Mamy tutaj komórki na szalce Petriego, w roztworze sodu. Srebrny przewód podłączony do generatora prądu.Musimy teraz przymocować mikroelektrody do stopnia głównego. Tutaj w stopniu czołowym mamy kolejny srebrny przewód, również podłączony do generatora prądu. Po zamocowaniu mikroelektrody możemy umieścić ją w wannie.Zwróć uwagę, że końcówka pipety ostrożnie dotyka wanny. Ta procedura jest wykonywana bardzo ostrożnie, aby uniknąć uderzenia końcówki w dno szalki Petriego. Po wejściu do kąpieli możemy udać się do mikroskopu, aby poszukać cienia mikropipety.Zalecamy, abyśmy zaczęli patrzeć w soczewkę powiększającą. Gdy znajdziemy cień pipety, możemy przesunąć mikroelektrodę w kierunku celi za pomocą mikromanipulatora. Gdy znajdzie się bardzo blisko ogniwa, możemy wykonać test post, aby sprawdzić, czy mikroelektroda nie jest zatkana.Jak zobaczymy dalej. Tutaj widzimy mikropipetę i ustawiamy mikropipetę bardzo blisko celi. Możemy zobaczyć ruch komórek w prawo i w lewo.Następnie zmieniamy na filtr, filtr fluorescencyjny. Możemy zastosować impuls hiperpolaryzacyjny, aby sprawdzić, czy końcówka pipety nie jest zatkana. Ponieważ mikropipeta znajduje się wewnątrz komórki, możemy zastosować impuls hiperpolaryzacyjny, aby obciążyć komórkę barwnikiem.Używamy tutaj sypkiego darmowego żółtego barwnika. Po załadowaniu komórki barwnikiem, jeśli sąsiednie komórki są połączone przez wstrzyknięcia szczelinowe, czekamy kilka minut i zobaczymy, jak sąsiednie komórki rozjaśniają się przez dyfuzję barwnika przez te wstrzyknięcia szczelinowe. W naszym eksperymencie możemy zobaczyć pięć komórek oznaczonych gwiazdkami, wykazujących fluorescencję.Tutaj jest dobry przykład eksperymentu z mikroiniekcją w komórkach nabłonka grasicy, w A i B.In rysunkach C i D, pokazuje mikroiniekcję do obojętnej komórki grasicy luźnej wolnej żółci i innego barwnika, nieprzepuszczalnego dla iniekcji szczelinowej pokazanej we wkładce. Rysunek E i F linia komórek nabłonka grasicy mikroiniekowana luźnym wolnym żółtym i we wkładce luźnym wolnym żółtym i szczelinowym blokiem iniekcyjnym. Wyniki pokazują, że luźny, wolny żółty kolor nie rozprzestrzenił się na sąsiednie komórki.Następnie widzimy mikroiniekcję w komórkach nabłonka grasicy, w obecności deksametazonu, a oznaczanie ilościowe w B.Deksametazon zwiększa stopień sprzężenia, jak pokazano na rysunku B.Na 100 wstrzyknięć liczba trzech lub czterech połączonych komórek była częstsza w obecności tego leku. Mam nadzieję, że mógłbym pomóc początkującym w stosowaniu tej ważnej techniki badania komunikacji komórkowej. Dzięki i pa.

single-cell-microinjection-for-cell-communication-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Bezpośrednia injekcja cDNA do jądra komórkowego jest skuteczną techniką transfekcji komórek pomitotycznych. Metoda ta zapewnia wysoki poziom ekspresji białek heterologicznych z pojedynczych lub wielu konstruktów cDNA i umożliwia badanie funkcji białek w fizjologicznie istotnym środowisku z wykorzystaniem różnych testów na pojedynczych komórkach.

Wewnątrzjądrowa mikroiniekcja DNA do rozdzielonych neuronów dorosłych ssaków

Medaka i zebrafish są komplementarne w kontekście genetycznej analizy funkcji genomu kręgowców. Niniejszy protokół podkreśla kluczowe punkty niezbędne do skutecznego mikroiniekcji do embrionów medaka, co stanowi istotną technikę w analizach embriologicznych i genetycznych z wykorzystaniem medaka i zebrafish w warunkach laboratoryjnych.

Mikroiniekcja embrionów ryby medaka w celu zastosowania jako modelowego organizmu genetycznego

W niniejszej pracy opisujemy test wykorzystujący mikroiniekcję w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ w celu dokładnego pomiaru kinetyki eksportu mRNA z jądra w somatycznych komórkach ssaków.

Analiza kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków za pomocą mikroiniekcji

W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę izolacji pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronalnych szczura oraz późniejszą analizę transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Metoda ta może zostać zastosowana do każdego typu komórek.

Analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Technikę CLEM dostosowano do analizy morfologii ultrastrukturalnej błon, organelli i struktur wewnątrzkomórkowych pod wpływem cząsteczek wstrzykniętych metodą mikroiniekcji. Metoda ta łączy zaawansowane techniki mikromanipulacji/mikroiniekcji, konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej oraz mikroskopii elektronowej, co pozwala na uzyskanie rozdzielczości od milimetrów do wielu nanometrów. Technika ta znajduje zastosowanie w szerokim spektrum badań.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) jako narzędzie do wizualizacji cząsteczek wprowadzonych metodą mikroiniekcji oraz ich eukariotycznych celów wewnątrzkomórkowych

Ze względu na ich duży rozmiar i stosunkowo prostą organizację, komórki pielęgniarskie Drosophila idealnie nadają się do badań obrazowania żywych komórek. Ten film opisuje metodę mikroiniekcji do dostarczania związków egzogennych do komórek, a przedstawiony protokół demonstruje procedurę z fluorescencyjnymi sondami oligonukleotydowymi zwanymi latarniami molekularnymi (MB) używanymi do wizualizacji endogennych transkryptów mRNA.

Mikroiniekcja komórek pielęgniarskich Drosophila: metoda dostarczania wewnątrzkomórkowego

W tym filmie demonstrujemy zrobotyzowaną mikroiniekcję znakowanych fluorescencyjnie polisacharydów do neuronów piramidowych w organotypowych wycinkach embrionalnego mózgu myszy za pomocą automatycznego wstrzykiwacza. Automatyczny wstrzykiwacz to platforma robologiczna, która wykorzystuje obrazy uzyskane z mikroskopu do precyzyjnego dostarczania interesujących biomolekuł do pojedynczych komórek.

Sterowana obrazem zrobotyzowana mikroiniekcja komórek: zautomatyzowana technika o wysokiej przepustowości do precyzyjnego dostarczania znakowanych fluorescencyjnie polisacharydów do pojedynczych komórek neuronalnych w organotypowych kulturach wycinków mózgu

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Mikroiniekcja jest powszechną techniką używaną do dostarczania konstruktów DNA, mRNA, oligonukleotydów antysensownych morfolino lub innych zabiegów do jaj, embrionułów i komórek różnych gatunków.

Wysokoprzepustowe mikroiniekcje zygot jeżowców

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Ten protokół demonstruje użycie platformy robotycznej do mikroiniekcji do pojedynczych nerwowych komórek macierzystych i neuronów w wycinkach mózgu. Technika ta jest wszechstronna i oferuje metodę śledzenia komórek w tkance z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Manipulacja pojedynczymi neuronalnymi komórkami macierzystymi i neuronami w wycinkach mózgu za pomocą mikroiniekcji robotycznej

Poznaj technikę mikroiniekcji jednokomórkowej z użyciem Lucifer Yellow do wizualizacji komunikacji międzykomórkowej przez złącza szczelinowe w żywych komórkach. Ta metoda pozwala ocenić stopień sprzężenia komórkowego.

Mikroiniekcja jednokomórkowa do analizy komunikacji komórkowej

Przeglądaj więcej filmów