Ekstrakcja i oczyszczanie białek pączkujących drożdży w celu badania funkcji, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych

Ogólnym celem tej procedury jest ekstrakcja białek drożdży przy jednoczesnym zachowaniu natywnych interakcji funkcji struktury i modyfikacji potranslacyjnych. Osiąga się to poprzez pierwsze rosnące komórki w celu wywołania ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Następnie zebrane komórki drożdży są homogenizowane w odpowiednim buforze w celu ekstrakcji białek.

Następnie interesujące białka są oczyszczane z oczyszczonego ekstraktu z całych komórek przy użyciu powinowactwa do żywicy. Ostatnim etapem procedury jest wymykanie się oczyszczonym białkom z żywicy powinowactwa do dalszej analizy lub dalszych zastosowań. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują modyfikacje i interakcje oczyszczania białek w oparciu o analizę western blot.

Procedurę zademonstruje Eva's Ky, absolwentka Williama i Mary, która spędziła ostatnie kilka lat jako badacz na studiach licencjackich w moim laboratorium. Główną przewagą perełkowania perełkowego w porównaniu z innymi istniejącymi metodami jest szybkie przetwarzanie i liza wielu próbek w warunkach, które zachowują interakcje funkcji białek i modyfikacje potranslacyjne. Aby rozpocząć transformację komórek gal-dodatniego szczepu drożdży z plazmidem kodującym galaktozę indukowaną szóstką, jego oznaczone białko z wyboru zaszczepia transformanty w pięciu mililitrach odpowiedniego selektywnego podłoża, takiego jak rozpuszczalnik SD, zawierający 2% sacharozy i inkubuje w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc z rotacją następnego dnia, rozcieńczyć nocną kulturę w selektywnej pożywce z 2% sacharozą do końcowej objętości 33 mililitrów, tak aby gęstość optyczna wynosiła 600 nanometry mierzą 0,3, rosną w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 150 obr./min.

Gdy kultura osiągnie OD 600 od 0,8 do 1,5, wywołaj ekspresję pożądanego białka, dodając 17 mililitrów trzech XYEP z 6% galaktozą, aby uzyskać końcowe stężenie jednego XYEP z 2% galaktozą, umieszczoną w inkubatorze wstrząsającym w temperaturze 30 stopni Celsjusza na dodatkowe pięć do sześciu godzin. Po zmierzeniu OD 600 indukowanej hodowli odwirować około 150 do 200 OD 600 jednostek komórek przez pięć minut przy 5 000 obr./min w czterech stopniach Celsjusza, a następnie użyć jednego mililitra lodowatego jednego XPBS z jednym x koktajlem inhibitora proteazy, aby ponownie zawiesić podniebienie komórkowe i przenieść je do dwumililitrowej probówki z nakrętką, odwirować komórki przez jedną minutę w 15, 000 obr./min i cztery stopnie Celsjusza. Po dekantacji supernatantu zatrzaskowo zamrozić osad komórkowy w ciekłym azocie do zamrożonego osadu komórkowego.

Dodaj 200 mikrolitrów szklanych kulek przemytych kwasem i 500 mikrolitrów lodowatego buforu do lizy. Utrzymywanie rurek na lodzie przez cały czas. Użyj końcówki pipety z odciętym końcem, aby krótko pipetować w górę i w dół w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Umieść rurki komórek w blokadzie balansu młynka perełkowego i uruchom maszynę zgodnie z instrukcjami producenta przez 20 sekund z prędkością 5.5 metra na sekundę. Następnie umieść probówki na błotnistym lodzie na jedną minutę. Powtórz w sumie sześć razy, aby oczyścić wyekstrahowane białka, odwirować przez 15 minut przy 15 000 obr./min w czterech stopniach Celsjusza.

Następnie, aby przygotować próbkę ekstraktu z całych komórek lub WCE dla western blot i WCE odpowiadającego dwóm OD 600 jednostek komórek na 800 mikrolitrów 20% kwasu trichlorooctowego lub wiru TCA do wymieszania. Aby oczyścić próbkę klarownego WCE w ilości od 50 do 100 mikrolitrów żywicy o powinowactwie do nowej probówki z mikrowirówką, przemyj i zrównoważ żywicę, dodając jeden mililitr buforu do przemywania i odwróć górę nad dołem, aż żywica zostanie ponownie zawieszona. Po wirowaniu przez jedną minutę z prędkością 5 000 obr./min i w czterech stopniach Celsjusza, odessać supernatant w celu związania białka w celu oczyszczenia powinowactwa przy 100 do 200 mikrolitrach oczyszczonego lizatu do przemytych kulek i użyć buforu do lizy, aby doprowadzić całkowitą objętość do jednego mililitra.

Inkubuj z mutacją lub kołysaniem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie do pięciu godzin. Użyć ciekłego azotu do natychmiastowego zamrożenia podwielokrotności pozostałego klarownego WCE i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia, podczas gdy roztwór buraka lizatu jest inkubowany w celu uzyskania próbki WCE Western blot na lodzie. Po wirowaniu przez dwie i pół minuty z prędkością 15 000 obr./min w czterech stopniach Celsjusza, zdekantować supernatant, uważając, aby zatrzymać osad, dodać 800 mikrolitrów 2% TCA do granulki i przekręcić rurkę przed powtórzeniem dwuipółminutowego wirowania.

Po starannej dekantacji supernatantu dodać 100 mikrolitrów buforu do próbki TCA i zawirować, aby rozpuścić osad przed inkubacją próbki. W bloku grzewczym o temperaturze 100 stopni Celsjusza przez dwie do pięciu minut zajmuje drugi raz, aby całkowicie rozpuścić wszelkie resztki granulki, które mogą być trudne do rozpuszczenia i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia. Po inkubacji próbki kulki lizatu, po wirowaniu z prędkością 5 000 obr./min i czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę, użyj buforu do płukania, aby przemyć żywicę pięć razy, aby wymyć białka.

Dodać 150 mikrolitrów buforu elucyjnego do roztworu żywicy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Wiruj przez minutę z prędkością 5 000 obr./min i czterema stopniami Celsjusza i zachowaj supernatant w nowej probówce. Na koniec, aby przygotować próbkę do western blot w 25 mikrolitrach dwóch x buforu próbki siarczanu litu docal z dwoma mikrolitrami BME do 25 mikrolitrów próbki białka UD.

Jak pokazano na tym rysunku, z komórek drożdży można w powtarzalny sposób wyekstrahować szeroką gamę białek. Dyskretne prążki o różnych masach cząsteczkowych wskazują na wysoką jakość ekstraktów białkowych. Jakość ekstraktów można potwierdzić za pomocą western blot dla określonych białek znakowanych epitopami.

Oto reprezentatywny wynik dla galaktozy, która uległa nadekspresji V pięć oznaczonych Ligazami Sumo to taka, która migruje z prędkością około 120 kilodaltonów. Ogólnie rzecz biorąc, częściowo zdegradowane białka przebiegałyby jako wiele fragmentów poniżej oczekiwanej masy, ale tutaj obserwuje się tylko białko o pełnej długości. Dodatkowo, dodatki o dużej masie cząsteczkowej danego białka mogą wskazywać na modyfikacje potranslacyjne.

Na przykład tutaj można zobaczyć laktozę nad ekspresją związaną z sumo S, jedną deltą, czterema 40 i SIS o pełnej długości. Jak wykazano w tym, modyfikacje Western blot mogą być również zachowane na endogennie wyrażonym S one. Rysunek ten pokazuje, że dwa białka wzbogacone jądrowo, SLX 5 i CS, jedno delta cztery 40, zostały pomyślnie oczyszczone z naszego ws.

Warto zauważyć, że białko znakowane sześcioma sykami może być oczyszczone z W'S, zarówno w warunkach natywnych, jak i denaturujących. Natomiast SLX 5G ST i CS one delta four 40 ha nie mają epitopu z sześcioma sykami, ale w warunkach natywnych nadal oddziałują z żywicą o powinowactwie do metalu w sposób wrażliwy na stary. Sugerujemy, że CIS pierwszy i w mniejszym stopniu SLX 5 są w stanie związać żywicę o powinowactwie do metalu poprzez swoją domenę pierścienia koordynującego metal.

Chociaż według naszej wiedzy to konkretne zjawisko nie zostało jeszcze zgłoszone, opisano podobną sytuację, w której podjednostka toksyny B toksyny żółciowej wiąże żywicę powinowactwa do Nicola w sposób pośredniczony przez jej naturalne reszty histaminowe. Obserwacja ta sugeruje, że białka w WCER, przynajmniej częściowo, natywnie sfałdowały się na potrzeby badania funkcji białek. Ważne jest, aby wykazać, że kompleksy białkowe pozostają nienaruszone w ekstraktach z całych komórek.

Reprezentatywne dane ujawniły, że CS jeden, delta, cztery, 40 SLX, pięć i P, GK, jeden, białko cytozolowe, które służy jako kontrola obciążenia, były obecne w WS, cis jeden. Delta four 40 została oczyszczona z tych ekstraktów w oparciu o jej nieodłączną zdolność do wiązania się z żywicami o powinowactwie do metali. Ponadto, gdy SLX 5 i SIS 1 ulegały jednoczesnej ekspresji w komórkach drożdży, poziomy SLX 5 w EIT wzrosły, co zwiększa prawdopodobieństwo, że SLX 5 może wchodzić w interakcje z SIS 1.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować i przetwarzać komórki drożdży w celu ekstrakcji, oczyszczania i wizualizacji białek drożdży w natywnych warunkach.