Ekstrakcja i oczyszczanie białek pączkujących drożdży w celu badania funkcji, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych

Ogólnym celem tej procedury jest ekstrakcja białek drożdży przy jednoczesnym zachowaniu natywnych struktur, oddziaływań funkcjonalnych oraz modyfikacji potranslacyjnych. Osiąga się to poprzez uprzednią hodowlę komórek w celu indukcji ekspresji białka zainteresowania. Następnie zebrane komórki drożdży są homogenizowane w odpowiednim buforze w celu ekstrakcji białek.

Następnie białka docelowe są oczyszczane z klarownego ekstraktu z całych komórek przy użyciu żywicy powinowactwa. Ostatnim etapem procedury jest elucja oczyszczonych białek z żywicy powinowactwa w celu ich dalszej analizy lub zastosowań w kolejnych etapach procesu. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące modyfikacje i oddziaływania białek na podstawie analizy western blot.

Procedurę zaprezentuje Eva's Ky, absolwentka William and Mary, która przez ostatnie dwa lata pracowała jako studentka-badacz w moim laboratorium. Główną zaletą rozbijania kuleczkowego w porównaniu z innymi istniejącymi metodami jest szybkie przetwarzanie i lizy wielu próbek w warunkach zachowujących funkcje białek, ich oddziaływania oraz modyfikacje potranslacyjne. Aby rozpocząć, należy przeprowadzić transformację komórek szczepu drożdży gal-dodatniego plazmidem kodującym wybrane białko z tagiem 6xHis, indukowane galaktozą; zaszczepić transformanty w 5 ml odpowiedniego podłoża selektywnego, takiego jak SD bez uracylu, zawierającego 2% sacharozy i inkubować w temperaturze 30 °C przez noc z rotacją. Następnego dnia kulturę z nocnej inkubacji należy rozcieńczyć w podłożu selektywnym z 2% sacharozą do końcowej objętości 33 ml, tak aby gęstość optyczna przy 600 nm wynosiła 0,3; hodować w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 30 °C przy 150 RPM.

Gdy kultura osiągnie OD 600 w zakresie od 0,8 do 1,5, należy indukować ekspresję pożądanego białka poprzez dodanie 17 mililitrów 3x XYEP z 6% galaktozą, aby uzyskać końcowe stężenie 1x XYEP z 2% galaktozą, i inkubować w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 30 °C przez dodatkowe pięć do sześciu godzin. Po pomiarze OD 600 indukowanej kultury, odwiruj około 150 do 200 jednostek OD 600 komórek przez pięć minut przy 5 000 RPM w temperaturze 4 °C, a następnie użyj jednego mililitra lodowatego 1x XPBS z 1x koktajlem inhibitorów proteaz, aby resuspenderć osad komórkowy i przenieś go do probówki wirówkowej z nakrętką o pojemności dwóch mililitrów; odwiruj komórki przez jedną minutę przy 15 000 RPM w temperaturze 4 °C. Po zlaniu supernatantu, zamroź szybko osad komórkowy w ciekłym azocie.

Dodaj 200 µL szklanych kulek przemytych kwasem oraz 500 µL lodowatego buforu lizującego. Przez cały czas trzymaj probówki w lodzie. Używając końcówki do pipety z odciętym końcem, wykonaj krótkie pipetowanie w górę i w dół w temperaturze 4 °C.

Umieść probówki z komórkami w uchwycie młyna perłowego i uruchom urządzenie zgodnie z instrukcją producenta na 20 sekund przy prędkości 5,5 m/s. Następnie umieść probówki w kruszonej lodzie na jedną minutę. Powtórz tę procedurę łącznie sześć razy, aby uwolnić białka, a następnie wiruj próbki przez 15 minut przy 15 000 RPM w temperaturze 4 °C.

Następnie, aby przygotować próbkę ekstraktu z całych komórek (WCE) do analizy western blot, dodaj WCE odpowiadający dwóm jednostkom OD 600 komórek do 800 µL 20% kwasu trichlorooctowego (TCA) i wymieszaj za pomocą wstrząsarki vortex. Aby oczyścić próbkę klarownego WCE, przenieś od 50 do 100 µL żywicy powinowactwa do nowej probówki do mikrowirówki, a następnie przemyj i zrównoważ żywicę, dodając 1 mL buforu do przemywania i odwracając probówkę góra-dół, aż żywica zostanie ponownie zawieszona. Po wirowaniu przez jedną minutę przy 5 000 RPM i 4 °C, odessaj nadsącz. Aby związać białko do oczyszczania powinowactwem, dodaj od 100 do 200 µL oczyszczonego lizatu do przemytych kulek i użyj buforu do lizy, aby doprowadzić całkowitą objętość do 1 mL.

Inkubować z rotacją lub na wytrząsarce w temperaturze 4°C przez od dwóch do pięciu godzin. Wykorzystać ciekły azot do szybkiego zamrażania alikwotów pozostałego klarownego WCE i przechowywać w temperaturze -80°C do czasu dalszego użycia, podczas gdy roztwór lizatu inkubowany jest na lodzie jako próbka do Western blot WCE. Po wirowaniu przez dwie i pół minuty przy 15 000 RPM w temperaturze 4°C, zlać nadsącz, dbając o zachowanie osadu, dodać 800 µL 2% TCA do osadu i wymieszać próbkę na wortexie przed powtórzeniem wirowania przez dwie i pół minuty.

Po ostrożnym zlaniu supernatantu, dodać 100 µL buforu do próbek TCA i wymieszać w wstrząsarce Vortex, aby rozpuścić osad przed inkubacją próbki. Próbkę inkubować w bloku grzejnym o temperaturze 100 °C przez dwie do pięciu minut, a następnie powtórzyć tę czynność drugi raz, aby całkowicie rozpuścić wszelkie pozostałości osadu, który może być trudny do rozpuszczenia; przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Po inkubacji próbki z kuleczkami do lizy, po wirowaniu przy 5 000 RPM w temperaturze 4 °C przez jedną minutę, użyć buforu do przemywania, aby przemyć żywicę pięć razy w celu elucji białek.

Dodaj 150 µL buforu elucyjnego do żywicy, inkubuj w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Wiruj przez jedną minutę przy 5 000 RPM w temperaturze 4 °C i przenieś supernatant do nowej probówki. Na koniec, aby przygotować próbkę do western blot, dodaj 25 µL dwukrotnego buforu do próbek SDS z 2 µL BME do 25 µL próbki białka UD.

Jak pokazano na tej rycinie, z komórek drożdży można w sposób powtarzalny wyekstrahować szeroki zakres białek. Wyraźne prążki w różnych zakresach mas cząsteczkowych świadczą o wysokiej jakości ekstraktów białkowych. Jakość ekstraktów można potwierdzić za pomocą techniki western blotting w odniesieniu do specyficznych białek z tagiem epitopowym.

Oto reprezentatywny wynik dla Sumo Ligazy z pięcioma znacznikami, nadekspresyjnej w obecności galaktozy; migruje ona na poziomie około 120 kilodaltonów. Zazwyczaj białka częściowo zdegradowane przemieszczają się jako wiele fragmentów poniżej oczekiwanej masy, jednak w tym przypadku obserwuje się wyłącznie pełnowymiarowe białko. Ponadto, addukty o wysokiej masie cząsteczkowej danego białka mogą wskazywać na modyfikacje potranslacyjne.

Na przykład tutaj można zobaczyć nadekspresyjną laktozą sumo-relaktywne S1 delta 4 40 oraz pełną długość SIS1. Jak wykazano w tym Western blot, modyfikacje mogą być również zachowane w endogennie ekspresowanym S1. Ta figura pokazuje, że dwie białka wzbogacone w jądrze, SLX5 i CS1 delta 4 40, zostały pomyślnie oczyszczone z naszego ws.

Warto zauważyć, że białko z sześcioma znacznikami histydyny można oczyścić za pomocą chromatografii powinowactwa z W'S, zarówno w warunkach natywnych, jak i denaturujących. W przeciwieństwie do nich, SLX 5G ST oraz CS one delta four 40 ha nie posiadają epitopu sześciu histydyn, lecz w warunkach natywnych nadal oddziałują z żywicą powinowactwa metalicznego w sposób wrażliwy na obecność jonów metali. Przypuszczamy, że CIS one, a w mniejszym stopniu SLX five, są w stanie wiązać się z żywicą powinowactwa metalicznego za pomocą swojej domeny pierścieniowej koordynującej metale.

Choć według naszej wiedzy to konkretne zjawisko nie zostało jeszcze opisane, opisano podobną sytuację, w której podjednostka B toksyny cholery wiąże się z żywicą powinowactwa Nicola w sposób pośredniczony przez jej naturalne reszty histydyny. Obserwacja ta sugeruje, że białka w WCER są, przynajmniej częściowo, naturalnie sfałdowane na potrzeby badania funkcji białek. Ważne jest wykazanie, że kompleksy białkowe pozostają nienaruszone w ekstraktach z całych komórek.

Reprezentatywne dane wykazały, że CS one delta four 40, SLX five oraz P GK one – białko cytozolowe służące jako kontrola załadunku – były obecne w WS cis one. Delta four 40 została oczyszczona z tych ekstraktów w oparciu o jej wrodzoną zdolność do wiązania się z żywicami powinowactwa metalicznego. Ponadto, w przypadku koekspresji SLX five i SIS one w komórkach drożdży, poziomy SLX five w EITs wzrosły, co sugeruje możliwość interakcji SLX five z SIS one.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak hodować i przetwarzać komórki drożdżowe w celu ekstrakcji, oczyszczania i wizualizacji białek drożdżowych w warunkach natywnych.