Name: Ekstrakcja i oczyszczanie białek pączkujących drożdży w celu badania funkcji, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-30T22:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji białek z drożdży pączkujących z zachowaniem ich natywnej struktury, funkcji i modyfikacji potranslacyjnych. Protokół umożliwia analizę interakcji białkowych metodą western blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Kerscher za ich wsparcie. Dziękujemy Markowi Hochstrasserowi za szczep drożdży MHY3765. Praca ta była wspierana przez grant NSF 1051970 (dla OK) oraz grant Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Travel i Monroe Scholars Program Grant (dla ES).

Oczyszczanie białek oznaczonych 6xHIS, wyrażonych w pączkujących komórkach drożdży w warunkach natywnych
1. Wzrost komórek drożdży i indukcja ekspresji białek
(zmodyfikowano z 2)
OPCJONALNIE: Użyj logarytmicznie rosnących kultur drożdży wyrażających białko będące przedmiotem zainteresowania zamiast kultur indukowanych galaktozą opisanych poniżej.
<ol>
	<li>Przekształć komórki szczepu drożdży Gal+ za pomocą plazmidu kodującego wybrane białko znakowane galaktozą 6xHIS. Na przykład zobacz listę odczynników.</li>
	<li>Zaszczepić transformanty w 5 ml odpowiednich pożywek selektywnych (np. SD-uracyl) zawierających 2% sacharozy. Inkubować w temperaturze 30 °C O/N, obracając się.</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę O/N tak, aby gęstość optyczna przy 600 nm wynosiła 0,3 (OD600 = 0,3) w 33 ml selektywnej pożywki z 2% sacharozą. Rosnąć w temperaturze 30 °C, wytrząsając (Δ150 obr./min).</li>
	<li>Gdy hodowla osiągnie OD600 = 0,8-1,5, wywołaj ekspresję pożądanego białka, dodając 17 ml 3x YEP z 6% galaktozą (przepis w tabeli 1), aby uzyskać końcowe stężenie 1x YEP z 2% galaktozą. Całkowita objętość kultury wynosi teraz 50 ml. Inkubować, wstrząsając, w temperaturze 30 °C przez dodatkowe 5-6 godzin. 
	Uwaga: objętość kultury można zmieniać. W kroku 1.3 rozcieńczyć do dwóch trzecich pożądanej objętości końcowej. W kroku 1.4 dodaj jedną trzecią końcowej objętości 3x YEP/6% galaktozy.</li>
	<li>Zmierzyć OD600 indukowanej kultury i odwirować Δ150-200 OD600 jednostek komórek przez 5 minut przy 5 000 obr./min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy z 1 ml lodowatego lodu, 1x PBS z 1x koktajlem inhibitorów proteazy i przenieść do probówki z zakrętką o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przez 1 minutę przy 15 000 obr./min w temperaturze 4 °C. Dekantacja supernatantu.</li>
	<li>Zatrzaskowo zamrozić osad komórkowy w ciekłym azocie, a następnie natychmiast poddać go lizie komórek lub przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
2. Homogenizacja komórek drożdży i ekstrakcja białek
<ol>
	<li>Do zamrożonego osadu komórkowego z poprzedniego etapu dodać 200 μl szklanych kulek przemytych kwasem i 500 μl lodowatego buforu do lizy (przepis w tabeli 1 lub użyć wybranego buforu do lizy komórek).</li>
	<li>Na krótko pipetować w górę i w dół. Nie jest wymagane całkowite ponowne zawieszenie osadu ogniwa. Utrzymuj probówki na lodzie przez cały czas. 
	Uwaga: Końcówka końcówki pipety może zostać odcięta przed pipetowaniem w górę i w dół.</li>
	<li>W temperaturze 4 °C umieść probówkę (ryby) z komórkami w młynku do perełek, zrównoważ, zablokuj i uruchom maszynę zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Uruchom ubijak do kulek zawierający rurkę (rurki) na 20 sekund z prędkością 5,5 m/s, a następnie umieść na błotnistym lodzie na 1 minutę. Powtórz w sumie 6 razy.</li>
	<li>Wyekstrahowane białka należy oczyścić przez odwirowanie przez 15 minut przy prędkości 15 000 obr./min w temperaturze 4 °C. OPCJONALNIE: usunąć drobne cząstki poprzez odwirowanie przez filtr SpinX.</li>
	<li>Przygotować próbkę ekstraktu z całych komórek (WCE) w celu potwierdzenia obecności białka będącego przedmiotem zainteresowania przez Western Blot:
	<ol>
		<li>Dodać WCE odpowiadające 2 OD600 jednostek komórek (np. 5 μl oczyszczonego ekstraktu, jeśli zebrano 200 OD600 jednostek komórek) do 800 μl 20% kwasu trichlorooctowego (TCA). Wirować do mieszania.</li>
		<li>Wirować przez 2,5 minuty przy 15 000 obr./min w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant, ale należy uważać, aby zatrzymać osad.</li>
		<li>Dodać 800 μl 2% TCA do osadu i przetrząsnąć probówkę, a następnie odwirować przez 2,5 minuty przy 15 000 obr./min w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant, ale należy uważać, aby zatrzymać osad.</li>
		<li>Dodać 100 μl buforu do próbek TCA (przepis w tabeli 1), odwirować w celu rozpuszczenia osadu. Uwaga: Jeżeli bufor próbki stanie się kwaśny (zmieni kolor na żółty) po dodaniu do osadu, należy dodawać porcje Δ10 μl zasady Tris [1M], aż próbka ponownie zmieni kolor na niebieski.</li>
		<li>Inkubować w bloku grzewczym o temperaturze 100 °C przez 2-5 minut.</li>
		<li>Ponownie odwiruj, aby całkowicie się rozpuścić, jeśli resztki osadu są nadal obecne. Granulki przygotowane tą metodą są notorycznie trudne do całkowitego rozpuszczenia. Całkowite rozpuszczenie granulek może zająć Δ10 minut wirowania.</li>
		<li>Przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Resztki pozostałego oczyszczonego WCE należy zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie wsadowe białek z homogenatów komórek drożdży
Uwaga: Ta metoda oczyszczania została zoptymalizowana do oczyszczania białek znakowanych 6xHIS na żywicy o powinowactwie do metalu Co2+.
<ol>
	<li>Równowaga żywicy
	<ol>
		<li>Dla próbki oczyszczonego WCE przygotowanej z Δ20-40 OD600 jednostek komórek, dodać 50-100 μl żywicy powinowactwa do probówki mikrowirówkowej. Białka wyekstrahowane z komórek, które nie wykazywały ekspresji pożądanego białka lub niespecyficznej żywicy, takiej jak amyloza, mogą być używane jako kontrola niespecyficznego wiązania.</li>
		<li>Przepłukać żywicę 5x 1 ml buforu do płukania: odwrócić od góry do dołu, aż żywica zostanie ponownie zawieszona, a następnie wirować przez 1 minutę z prędkością 5 000 obr./min w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant. 
		Uwaga: w przypadku ekstrakcji i oczyszczania tego samego dnia, równoważenie żywicy można przeprowadzić przed ekstrakcją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wiązanie białek w celu oczyszczenia powinowactwa
	<ol>
		<li>Dodać 100-200 μl oczyszczonego lizatu (Δ20-40 OD600 jednostek) do 50-100 μl przemytych kulek i doprowadzić całkowitą objętość do 1 ml za pomocą buforu do lizy.</li>
		<li>Inkubować z nutacją lub kołysaniem w temperaturze 4 °C przez 2-5 godzin.</li>
		<li>Wirować przez 1 minutę z prędkością 5 000 obr./min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>W razie potrzeby należy zachować próbkę pozostałego supernatantu do późniejszej analizy niezwiązanych białek. Osad TCA wytrąca się zgodnie z opisem powyżej dla WCE (krok 2.6).</li>
		<li>Przemyć żywicę z białkami związanymi 5x 1 ml buforu do płukania, a następnie wirować przez 1 minutę z prędkością 5 000 obr./min w temperaturze 4 °C. Podczas mycia próbki należy przechowywać w chłodnym miejscu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elucja związanych białek
	<ol>
		<li>Dodać 150 μl buforu elucyjnego do żywicy, nutować w temperaturze 4 °C przez 5 minut, wirować przez 1 minutę przy 5 000 obr./min w temperaturze 4 °C i zachować supernatant w nowej probówce. OPCJONALNIE: Powtórz 2x i elucjacje w puli.</li>
		<li>Przygotować eluowaną próbkę do Western blot: Do 25 μl eluowanych białek dodać 25 μl buforu próbki 2x dodecylosiarczanu litu (LDS) z 2 μl β-merkaptoetanolu (BME) i inkubować w bloku grzewczym o temperaturze 100 °C przez 2 min. 
		Uwaga: Można również użyć standardowego 2-krotnego bufora do próbek Laemmli.</li>
		<li>Szybkie zamrażanie nadmiaru eluowanego białka w ciekłym azocie. 
		OPCJONALNIE: usunąć pozostałe białka z żywicy o równej objętości 2x buforu próbki LDS w temperaturze 65 °C przez 5 minut, usunąć białka eluowane LDS do nowej probówki, a następnie dodać 2 μl BME do eluowanych białek, a nie do żywicy. Ta kolejność ma na celu zapobieżenie usunięciu jakichkolwiek jonów lub przeciwciał, które są sprzężone z kulkami.</li>
		<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Western Blot i sondę z odpowiednimi przeciwciałami w celu wizualizacji białek.
	<ol>
		<li>Załadować 10-20 μl (Δ1-3 OD600 jednostek) każdej próbki i 3-10 μl drabinki białkowej do wybranego żelu SDS-PAGE. Żele rutynowo stosowane w tym protokole zawierają 4-12% Bis-Tris i 8% Tris-Glycine.</li>
		<li>Uruchom żel pod napięciem 200 V przez 50 min.</li>
		<li>Przenieść białka z żelu do membrany PVDF przez półsuchy transfer pod napięciem 19 V przez 20-30 minut (przepis w Tabeli 1).</li>
		<li>Błona blokowa w 4% mleku/1x Tris buforowana sól fizjologiczna-TWEEN (TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C (przepis w tabeli 1).</li>
		<li>Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko białku znakowanemu epitopem w 4% mleku/1x TBST przez 1-3 godziny w temperaturze RT lub O/N w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyj membranę 3x po 5 minut za pomocą 1x TBST.</li>
		<li>Inkubować błonę z odpowiednim wtórnym przeciwciałem sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) przez 1-3 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj membranę 3x po 15 min w dużej objętości 1x TBST.</li>
		<li>Przykryj membranę podłożem ECL i zawiń w folię saran.</li>
		<li>Wystaw błonę na film i rozwiń, aby uwidocznić białka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li>
<li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li>
<li>Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+and+In+Vitro+Analyses+of+Regulation+of+the+Pheromone-Responsive+prgQ+Promoter+by+the+PrgX+Pheromone+Receptor+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein.</a> J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).</li>
<li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li>
<li>Hannich, J. T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li>
<li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li>
<li>Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li>
<li>Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeutscher%2C+MP+%22Guide+to+protein+purification%22">Guide to protein purification</a>. , (1990).</li>
<li>Puig, O., Caspary, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tandem+Affinity+Purification+%28TAP%29+Method%3A+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li>
<li>Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+125-kd+membrane+glycoprotein+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+attached+to+the+lipid+bilayer+through+an+inositol-containing+phospholipid%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid.</a> EMBO J. 7 (7), 2233(1988).</li>
<li>Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2%2B+ion%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li>
<li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li>
<li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74(2011).</li>
<li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten koncentruje się na przygotowaniu nienaruszonych, natywnych i zmodyfikowanych potranslacyjnie białek z pączkujących komórek drożdży do dalszych zastosowań. Przed przystąpieniem do stosowania tego protokołu należy ustalić, czy białko będące przedmiotem zainteresowania można łatwo wykryć w ekstraktach białkowych przygotowanych w warunkach denaturacji12. Jeśli przeciwciała poliklonalne nie są dostępne, korzystne może być oznaczenie epitopem białka będącego przedmiotem zainteresowania, tak aby białko f...

Niesamowita moc genetyki drożdży jest legendarna, ale przygotowanie i analiza natywnych białek z pączkujących drożdży, Saccharomyces cerevisiae, jest często najeżona problemami. To ostatnie wynika ze znacznej wytrzymałości mechanicznej i elastyczności ściany komórkowej drożdży1. Opisano różne sposoby enzymatycznego, chemicznego, mechanicznego i ciśnieniowego rozbijania komórek drożdży w celu uzyskania ekstraktu białkowego z całych komórek 2-6. Techniki te różnią się znacznie pod względem skuteczności w celu uzyskania reprezentatywnych dla komórek, natywnych ekstraktów białkowych, które można wykorzystać do późniejszych analiz lub etapów oczyszczania. Na przykład ściana komórkowa drożdży może zostać usunięta za pomocą enzymów litycznych (np. Zymolyazy), a powstałe sferoblasty mogą zostać zakłócone przez ścinanie, detergenty lub lizę osmotyczną w celu uwolnienia białek. Podejście to zostało z powodzeniem zastosowane jako punkt wyjścia dla wielu frakcjonowań subkomórkowych, ale wymaga długich inkubacji, które nie są zgodne ze stabilnością niektórych białek7.
Zastrzeżone odczynniki do lizy drożdży (takie jak detergenty) do chemicznej ekstrakcji białek komórek drożdży są dostępne na rynku, ale skuteczność tych odczynników w ekstrakcji białek i ich wpływ na późniejszą charakterystykę biochemiczną białek nie zawsze jest jasna8. Homogenizatory wysokociśnieniowe, często nazywane prasami francuskimi, skutecznie rozbijają komórki drożdży, najpierw poddając je działaniu wysokiego ciśnienia, a następnie wytłaczając przez mały otwór w komorze ciśnieniowej. Technika ta pozwala uzyskać wysokiej jakości ekstrakty, ale sprzęt jest bardzo drogi i może nie być odpowiedni dla małych ilości komórek lub wielu próbek9. W związku z tym mechaniczne rozbijanie komórek drożdży w młynie perełkowym jest często metodą z wyboru w przypadku natywnych preparatów białkowychdrożdży 10. Technika ta polega na mechanicznym rozbiciu ściany komórkowej drożdży za pomocą mytych kwasem kulek szklanych, co można przeprowadzić za pomocą różnych wytrząsarek, wirowników lub młynów perełkowych. Warto zauważyć, że metoda ta może być stosowana do jednoczesnego przetwarzania wielu mniejszych próbek (1 ml komórek lub mniej). Obecnie na rynku dostępnych jest wiele różnych koralików lub matryc do rozbijania prawie każdego rodzaju komórek w probówkach o pojemności 2 ml. Biorąc pod uwagę inne techniki i sprzęt, młyn perełkowy ma tę dodatkową zaletę, że rozerwanie komórek drożdży następuje bardzo szybko, co pomaga zachować modyfikacje potranslacyjne, takie jak sumoilacja, zwłaszcza gdy stosuje się odpowiednie z inhibitorami proteazy i / lub proteasomów oraz kontrolowana jest temperatura ekstraktów.
Ten protokół skupia się na szybkiej, efektywnej i niezawodnej ekstrakcji endogennych i nadmiernie eksprymowanych białek w łagodnych warunkach, a ostatecznym celem jest zachowanie funkcji białek, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych. Pożywki wzrostowe, kompozycje do lizy komórek i ustawienia młyna perełkowego są zoptymalizowane pod kątem utrzymania interakcji białek i modyfikacji potranslacyjnych, takich jak sumoilacja i ubikwitylacja.

<table><tbody><tr><td>Omni Bead Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td></td></tr><tr><td>Szczep drożdży ORF w BG1805</td><td>ThermoScientific</td><td>YSC3869</td><td>Szczep drożdży GAL+, który może być stosowany do indukcji i ekstrakcji</td></tr><tr><td>pYES2.1 Wektor TOPO</td><td>Life Technologies</td><td>K4150-01</td><td>Szczep drożdży GAL+, który może być stosowany do indukcji i ekstrakcji; zawiera jednorazowy koktajl V5/6xHIS</td></tr><tr><td>tag Halt Protease Inhibitor ( 100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1860932</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml Probówka z listwą z nakrętką na uwięzi</td><td>BioExpress</td><td>C-3369-3</td><td>Upewnij się, że tubka prawidłowo pasuje do rowka koralików</td></tr><tr><td>Koraliki szklane, myte kwasem, 425-600 &mikro; m (sito 30-40 US)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Filtry probówkowe wirówki Corning Costar Spin-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8161</td><td>Służy do dodatkowego filtrowania oczyszczonego lizatu</td></tr><tr><td>Żywica powinowactwa do metalu TALON</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>Do oczyszczania białek oznaczonych 6xHIS</td></tr><tr><td>Bufor do próbek NuPAGE LDS (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Do przygotowania i/lub elucji próbek przed SDS-PAGE i Western Blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td>Prefabrykowane żele często używane do SDS-PAGE przed Western Blotting</td></tr><tr><td>Simply Blue</td><td>Life Technologies</td><td>#LC6060</td><td>Białkowe barwienie żelowe</td></tr><tr><td>Bufor do lizy ssaków</td><td>Promega</td><td>G9381</td><td>Alternatywny komercyjny bufor do lizy</td></tr><tr><td>Anty-V5 agaroza</td><td>Sigma</td><td>A7345</td><td>Metoda immunoprecypitacji</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Milipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS żele</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-myc</td><td>Covance</td><td>mms-150R</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>drugorzędowe</td><td>Abcam</td><td>ab97040</td><td>Kozi pAb do mysiej IgG (HRP)</td></tr></tbody></table>

ekstrakcja i oczyszczanie białek pączkujących drożdży w celu badania funkcji, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenizacja przez ubijanie koralików to szybki i skuteczny sposób na uwolnienie DNA, RNA, białek i metabolitów z pączkujących komórek drożdży, które są niezwykle trudne do zakłócenia. W tym miejscu opisujemy zastosowanie homogenizatora perełkowego do ekstrakcji białek do zoptymalizowanych pod kątem utrzymania funkcji, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych białek. Komórki rosnące logarytmicznie wyrażające białko będące przedmiotem zainteresowania są hodowane w płynnym pożywce z wyboru. Pożywki wzrostowe mogą być uzupełnione odczynnikami w celu indukowania ekspresji białek z indukowalnych promotorów (np. galaktozy), synchronizacji etapu cyklu komórkowego (np. nokodazol) lub hamowania funkcji proteasomu (np. MG132). Komórki są następnie granulowane i ponownie zawieszane w odpowiednim buforze zawierającym inhibitory proteazy i/lub fosfatazy i są natychmiast przetwarzane lub zamrażane w ciekłym azocie do późniejszego wykorzystania. Homogenizacja odbywa się w sześciu cyklach po 20 sekund ubijania kulek (5,5 m/s), po których następuje jednominutowa inkubacja na lodzie. Powstały homogenat jest oczyszczany przez wirowanie, a małe cząstki można usunąć przez filtrację. Otrzymany oczyszczony ekstrakt z całych komórek (WCE) wytrąca się przy użyciu 20% TCA w celu bezpośredniej analizy całkowitych białek za pomocą SDS-PAGE, a następnie Western blot. Ekstrakty nadają się również do oczyszczania powinowactwa określonych białek, wykrywania modyfikacji potranslacyjnych lub analizy białek współoczyszczających. Podobnie jak w przypadku większości protokołów oczyszczania białek, niektóre enzymy i białka mogą wymagać unikalnych warunków lub kompozycji buforowych do ich oczyszczania, a inne mogą być niestabilne lub nierozpuszczalne w określonych warunkach. W tym drugim przypadku przedstawiony protokół może stanowić użyteczny punkt wyjścia do empirycznego określenia najlepszej strategii ubijania kulek w celu ekstrakcji i oczyszczania białek. Pokazujemy ekstrakcję i oczyszczanie znakowanej epitopem ligazy SUMO E3, Siz1, białka regulowanego cyklem komórkowym, które ulega zarówno sumoilacji, jak i fosforylacji, a także podjednostki ligazy ubikwityny ukierunkowanej na SUMO, Slx5.

Nasze reprezentatywne wyniki wykazują, że opisany protokół rozbijania kuleczkami oraz ekstrakcji białek jest użyteczny do powtarzalnego przygotowania białek dla szerokiej gamy zastosowań analitycznych (podsumowano w Tabeli 2). Elektroforeza SDS-PAGE z następującym barwieniem Coomassie ekstraktów z całych komórek (WCE) pokazuje, że szeroki zakres białek (~12 do &gt;250 kDa) może być powtarzalnie ekstrahowany z komórek drożdży (Rysunek 1A). Wyraźne prążki w różnych zakresach mas cząsteczko...

Przygotowanie wysokiej jakości ekstraktów z komórek drożdży jest niezbędnym pierwszym krokiem w analizie pojedynczych białek lub całych proteomów. Tutaj opisujemy szybki, wydajny i niezawodny protokół homogenizacji pączkujących komórek drożdży, który został zoptymalizowany w celu zachowania funkcji białek, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych.

Ekstrakcja i oczyszczanie białek pączkujących drożdży w celu badania funkcji, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Ogólnym celem tej procedury jest ekstrakcja białek drożdży przy jednoczesnym zachowaniu natywnych struktur, oddziaływań funkcjonalnych oraz modyfikacji potranslacyjnych. Osiąga się to poprzez uprzednią hodowlę komórek w celu indukcji ekspresji białka zainteresowania. Następnie zebrane komórki drożdży są homogenizowane w odpowiednim buforze w celu ekstrakcji białek.Następnie białka docelowe są oczyszczane z klarownego ekstraktu z całych komórek przy użyciu żywicy powinowactwa. Ostatnim etapem procedury jest elucja oczyszczonych białek z żywicy powinowactwa w celu ich dalszej analizy lub zastosowań w kolejnych etapach procesu. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące modyfikacje i oddziaływania białek na podstawie analizy western blot.Procedurę zaprezentuje Eva's Ky, absolwentka William and Mary, która przez ostatnie dwa lata pracowała jako studentka-badacz w moim laboratorium. Główną zaletą rozbijania kuleczkowego w porównaniu z innymi istniejącymi metodami jest szybkie przetwarzanie i lizy wielu próbek w warunkach zachowujących funkcje białek, ich oddziaływania oraz modyfikacje potranslacyjne. Aby rozpocząć, należy przeprowadzić transformację komórek szczepu drożdży gal-dodatniego plazmidem kodującym wybrane białko z tagiem 6xHis, indukowane galaktozą; zaszczepić transformanty w 5 ml odpowiedniego podłoża selektywnego, takiego jak SD bez uracylu, zawierającego 2% sacharozy i inkubować w temperaturze 30 °C przez noc z rotacją. Następnego dnia kulturę z nocnej inkubacji należy rozcieńczyć w podłożu selektywnym z 2% sacharozą do końcowej objętości 33 ml, tak aby gęstość optyczna przy 600 nm wynosiła 0,3; hodować w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 30 °C przy 150 RPM.Gdy kultura osiągnie OD 600 w zakresie od 0,8 do 1,5, należy indukować ekspresję pożądanego białka poprzez dodanie 17 mililitrów 3x XYEP z 6% galaktozą, aby uzyskać końcowe stężenie 1x XYEP z 2% galaktozą, i inkubować w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 30 °C przez dodatkowe pięć do sześciu godzin. Po pomiarze OD 600 indukowanej kultury, odwiruj około 150 do 200 jednostek OD 600 komórek przez pięć minut przy 5 000 RPM w temperaturze 4 °C, a następnie użyj jednego mililitra lodowatego 1x XPBS z 1x koktajlem inhibitorów proteaz, aby resuspenderć osad komórkowy i przenieś go do probówki wirówkowej z nakrętką o pojemności dwóch mililitrów; odwiruj komórki przez jedną minutę przy 15 000 RPM w temperaturze 4 °C. Po zlaniu supernatantu, zamroź szybko osad komórkowy w ciekłym azocie.Dodaj 200 µL szklanych kulek przemytych kwasem oraz 500 µL lodowatego buforu lizującego. Przez cały czas trzymaj probówki w lodzie. Używając końcówki do pipety z odciętym końcem, wykonaj krótkie pipetowanie w górę i w dół w temperaturze 4 °C.Umieść probówki z komórkami w uchwycie młyna perłowego i uruchom urządzenie zgodnie z instrukcją producenta na 20 sekund przy prędkości 5,5 m/s. Następnie umieść probówki w kruszonej lodzie na jedną minutę. Powtórz tę procedurę łącznie sześć razy, aby uwolnić białka, a następnie wiruj próbki przez 15 minut przy 15 000 RPM w temperaturze 4 °C.Następnie, aby przygotować próbkę ekstraktu z całych komórek (WCE) do analizy western blot, dodaj WCE odpowiadający dwóm jednostkom OD 600 komórek do 800 µL 20% kwasu trichlorooctowego (TCA) i wymieszaj za pomocą wstrząsarki vortex. Aby oczyścić próbkę klarownego WCE, przenieś od 50 do 100 µL żywicy powinowactwa do nowej probówki do mikrowirówki, a następnie przemyj i zrównoważ żywicę, dodając 1 mL buforu do przemywania i odwracając probówkę góra-dół, aż żywica zostanie ponownie zawieszona. Po wirowaniu przez jedną minutę przy 5 000 RPM i 4 °C, odessaj nadsącz. Aby związać białko do oczyszczania powinowactwem, dodaj od 100 do 200 µL oczyszczonego lizatu do przemytych kulek i użyj buforu do lizy, aby doprowadzić całkowitą objętość do 1 mL.Inkubować z rotacją lub na wytrząsarce w temperaturze 4°C przez od dwóch do pięciu godzin. Wykorzystać ciekły azot do szybkiego zamrażania alikwotów pozostałego klarownego WCE i przechowywać w temperaturze -80°C do czasu dalszego użycia, podczas gdy roztwór lizatu inkubowany jest na lodzie jako próbka do Western blot WCE. Po wirowaniu przez dwie i pół minuty przy 15 000 RPM w temperaturze 4°C, zlać nadsącz, dbając o zachowanie osadu, dodać 800 µL 2% TCA do osadu i wymieszać próbkę na wortexie przed powtórzeniem wirowania przez dwie i pół minuty.Po ostrożnym zlaniu supernatantu, dodać 100 µL buforu do próbek TCA i wymieszać w wstrząsarce Vortex, aby rozpuścić osad przed inkubacją próbki. Próbkę inkubować w bloku grzejnym o temperaturze 100 °C przez dwie do pięciu minut, a następnie powtórzyć tę czynność drugi raz, aby całkowicie rozpuścić wszelkie pozostałości osadu, który może być trudny do rozpuszczenia; przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Po inkubacji próbki z kuleczkami do lizy, po wirowaniu przy 5 000 RPM w temperaturze 4 °C przez jedną minutę, użyć buforu do przemywania, aby przemyć żywicę pięć razy w celu elucji białek.Dodaj 150 µL buforu elucyjnego do żywicy, inkubuj w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Wiruj przez jedną minutę przy 5 000 RPM w temperaturze 4 °C i przenieś supernatant do nowej probówki. Na koniec, aby przygotować próbkę do western blot, dodaj 25 µL dwukrotnego buforu do próbek SDS z 2 µL BME do 25 µL próbki białka UD.Jak pokazano na tej rycinie, z komórek drożdży można w sposób powtarzalny wyekstrahować szeroki zakres białek. Wyraźne prążki w różnych zakresach mas cząsteczkowych świadczą o wysokiej jakości ekstraktów białkowych. Jakość ekstraktów można potwierdzić za pomocą techniki western blotting w odniesieniu do specyficznych białek z tagiem epitopowym.Oto reprezentatywny wynik dla Sumo Ligazy z pięcioma znacznikami, nadekspresyjnej w obecności galaktozy; migruje ona na poziomie około 120 kilodaltonów. Zazwyczaj białka częściowo zdegradowane przemieszczają się jako wiele fragmentów poniżej oczekiwanej masy, jednak w tym przypadku obserwuje się wyłącznie pełnowymiarowe białko. Ponadto, addukty o wysokiej masie cząsteczkowej danego białka mogą wskazywać na modyfikacje potranslacyjne.Na przykład tutaj można zobaczyć nadekspresyjną laktozą sumo-relaktywne S1 delta 4 40 oraz pełną długość SIS1. Jak wykazano w tym Western blot, modyfikacje mogą być również zachowane w endogennie ekspresowanym S1. Ta figura pokazuje, że dwie białka wzbogacone w jądrze, SLX5 i CS1 delta 4 40, zostały pomyślnie oczyszczone z naszego ws.Warto zauważyć, że białko z sześcioma znacznikami histydyny można oczyścić za pomocą chromatografii powinowactwa z W'S, zarówno w warunkach natywnych, jak i denaturujących. W przeciwieństwie do nich, SLX 5G ST oraz CS one delta four 40 ha nie posiadają epitopu sześciu histydyn, lecz w warunkach natywnych nadal oddziałują z żywicą powinowactwa metalicznego w sposób wrażliwy na obecność jonów metali. Przypuszczamy, że CIS one, a w mniejszym stopniu SLX five, są w stanie wiązać się z żywicą powinowactwa metalicznego za pomocą swojej domeny pierścieniowej koordynującej metale.Choć według naszej wiedzy to konkretne zjawisko nie zostało jeszcze opisane, opisano podobną sytuację, w której podjednostka B toksyny cholery wiąże się z żywicą powinowactwa Nicola w sposób pośredniczony przez jej naturalne reszty histydyny. Obserwacja ta sugeruje, że białka w WCER są, przynajmniej częściowo, naturalnie sfałdowane na potrzeby badania funkcji białek. Ważne jest wykazanie, że kompleksy białkowe pozostają nienaruszone w ekstraktach z całych komórek.Reprezentatywne dane wykazały, że CS one delta four 40, SLX five oraz P GK one – białko cytozolowe służące jako kontrola załadunku – były obecne w WS cis one. Delta four 40 została oczyszczona z tych ekstraktów w oparciu o jej wrodzoną zdolność do wiązania się z żywicami powinowactwa metalicznego. Ponadto, w przypadku koekspresji SLX five i SIS one w komórkach drożdży, poziomy SLX five w EITs wzrosły, co sugeruje możliwość interakcji SLX five z SIS one.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak hodować i przetwarzać komórki drożdżowe w celu ekstrakcji, oczyszczania i wizualizacji białek drożdżowych w warunkach natywnych.

budding-yeast-protein-extraction-purification-for-study-function

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ekstrakcja i oczyszczanie białka drożdży pączkujących dla badania funkcji, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych

Delecja genów oraz nadekspresja białek to powszechnie stosowane metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy rozwoju fenotypu w zależności od stężenia białka na poziomie populacyjnym i pojedynczych komórek u Saccharomyces cerevisiae.

Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

Zanieczyszczenie preparatów rybosomów eukariotycznych oczyszczonych metodami tradycyjnymi współoczyszczającymi nukleazami i proteazami negatywnie wpływa na późniejsze analizy biochemiczne i strukturalne. W celu rozwiązania tego problemu zastosowano szybką i prostą metodę oczyszczania chromatograficznego, wykorzystując rybosomy drożdżowe jako system modelowy.

Chromatograficzne oczyszczanie wysoce aktywnych rybosomów drożdżowych

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Ten manuskrypt opisuje wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji białek kinetochorowych, Ndc10 i Ndc80, u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Technika oczyszczania białek pozwalająca na wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji pączkujących białek kinetochoru drożdży Ndc10 i Ndc80

Regulacja translacyjna odgrywa ważną rolę w kontroli obfitości białek. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowej analizy translacji w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae.

Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

Tutaj prezentujemy protokół do ekspresji, solubilizacji i oczyszczania kilku eukariotycznych transporterów boranu o homologii do rodziny transporterów SLC4 za pomocą drożdży. Opisujemy również chemiczny test sieciowania w celu oceny oczyszczonych białek homomerycznych pod kątem składania multimerycznego. Protokoły te można dostosować do innych trudnych białek błonowych.

Ekspresja, solubilizacja i oczyszczanie eukariotycznych transporterów boranu

Tutaj prezentujemy przebieg procesu ekspresji, oczyszczania i wiązania liposomów heterodimerów SNX-BAR w drożdżach.

Ekspresja, oczyszczanie i wiązanie liposomów pączkujących heterodimerów SNX-BAR drożdży

Pomimo ostatnich osiągnięć, wiele białek mitochondrialnych drożdży nadal pozostaje ze swoimi funkcjami zupełnie nieznanymi. Protokół ten zapewnia prostą i niezawodną metodę określania submitochondrialnej lokalizacji białek, co ma fundamentalne znaczenie dla wyjaśnienia ich funkcji molekularnych.

Ocena lokalizacji białek submitochondrialnych u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj metodę ekstrakcji białek z drożdży pączkujących z zachowaniem ich natywnej struktury, funkcji i modyfikacji potranslacyjnych. Protokół umożliwia analizę interakcji białkowych metodą western blot.

Ekstrakcja i oczyszczanie białek pączkujących drożdży w celu badania funkcji, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych

Przeglądaj więcej filmów