Ekspresja, solubilizacja i oczyszczanie eukariotycznych transporterów boranu

Uzyskanie wystarczającej ilości białek błonowych do dalszych zastosowań pozostaje poważnym wyzwaniem technicznym. Protokół ten umożliwia oczyszczenie kilku białek transportowych błonowych do jednorodności. Kluczową zaletą tej techniki jest to, że Saccharomyces cerevisiae jest efektywnym pod względem czasu i kosztów eukariotycznym systemem ekspresji białek błonowych, który umożliwia optymalizację wielu kluczowych zmiennych eksperymentalnych.

Zacznij od zaszczepienia trzech przekształconych kolonii drożdży w 50 mililitrach kompletnej uzupełniającej pożywki selektywnej bez histydyny. Uzupełniony drożdżową zasadą azotową i 2% glukozą do inkubacji przez noc przy 190 obrotach na minutę i 30 stopniach Celsjusza. Usuń kulturę następnego dnia.

Użyj spektrofotometru, aby określić gęstość optyczną przy 600 nanometrach lub OD 600. I zaszczepić każdą z czterech dwulitrowych kolb zawierających 500 mililitrów pożywki hodowlanej do OD 600 0,01. Następnie potrząsaj kulturami z prędkością 190 obrotów na minutę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 godzin, aby komórki mogły skonsumować całą glukozę i osiągnąć wysoką gęstość.

Aby wywołać ekspresję transportera boranów, dodaj 125 mililitrów pięciu x pożywki peptonowej drożdży, uzupełnionej 10% galaktozą przy 190 obrotach na minutę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Następnie zbierz komórki drożdży przez odwirowanie i ponownie zawieś granulat w 100 mililitrach zimnej wody. Zawiruj w wirze, aby ponownie zawiesić granulki drożdży i seryjnie przenieś roztwór, aby to zrobić ze wszystkimi butelkami zawierającymi granulki.

Aby zebrać błony drożdży, najpierw dodaj 11,25 mililitra jednego molowca Tris, 0,45 mililitra 0,5 molowego EDTA i 2,25 mililitra 100 milimolowego PMSF do zawieszonych komórek. Dodaj wodę do końcowej objętości 225 mililitrów i przenieś komórki do 450-mililitrowego metalowego kanistra do ubijania kulek. Uzupełnij pozostałą objętość zimnymi szklanymi kulkami o średnicy 0,5 milimetra i zmontuj komorę perełkowania za pomocą wirnika.

Zanurz komorę w łaźni lodowej i wykonaj sześć jednominutowych impulsów, oddzielonych dwuminutowymi okresami odpoczynku, aby zapobiec przegrzaniu lizatu. Po ostatnim impulsie wyjmij membranę filtracyjną z plastikowego jednorazowego filtra górnego do butelki wkręconego w szklaną butelkę i wlej zawartość komory do perełkowania koralików na zespół, stosując próżnię. Następnie spłucz dwoma do płukania kulek, dodając do komory, wirując, a następnie dodając do kulek.

Przepłukać komorę perełkowania koralikami 225 mililitrami buforu do płukania i umyć koraliki z zawartością komory. Zebrać lizat przez odwirowanie i zdekantować supernatant do butelek z poliwęglanu w celu ultraodwirowania w celu zebrania membran. Pod koniec ultrawirowania wyrzucić supernatant i zważyć butelki z granulkami membrany przed ponownym zawieszeniem membran w około 35 mililitrach buforu do ponownego zawieszania membrany.

Dodaj zawiesiny do szklanego Douncer, a następnie odbij homogenizuj membrany i porcjuj homogenat do 50-mililitrowej stożkowej probówki do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Zważyć puste butelki wirówkowe, aby określić masę zebranych membran. W celu solubilizacji i oczyszczenia białek dodać mieszadło i 150 miligramów DDM na gram błony do zlewki na lodzie i ponownie zawiesić rozmrożone membrany do końcowej objętości 15 mililitrów buforu do ponownego zawieszania błony, uzupełnionego jednym milimolowym PMSF i 20 milimolowymi imidazolami na gram błony.

Dodać roztwór membranowy do zlewki na godzinę mieszania w łaźni lodowej. Następnie odwirowanie w celu osadzenia nierozpuszczonego materiału. W chłodni o temperaturze 4 stopni Celsjusza przefiltrować supernatant przez pięciomikrometrowy filtr strzykawkowy i użyć pompy perystaltycznej ustawionej na natężenie przepływu jednego mililitra na minutę, aby załadować próbkę do jednomililitrowej unieruchomionej kolumny powinowactwa niklu Następnie przemyć kolumnę 10 objętościami buforu płuczącego i rozcieńczyć białko w buforze elucyjnym.

Zbieranie eluatu w dziesięciu jednomililitrowych frakcjach. Zebrane przygotowane frakcje żelu należy uruchomić na żelu stronicowym SDS o stężeniu od czterech do 20% Tris-Glycine wraz z rozpuszczonym lizatem i frakcjami płuczącymi w temperaturze pokojowej, ciągnąc pik zebranych frakcji wymykających się do stężenia do objętości 500 mikrolitrów lub mniejszej w 50-kilogramowym koncentratorze daltonowym w wirówce stołowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przefiltrować skoncentrowane białko przez filtr z kolumną wirową o średnicy 0,2 mikrometra i wstrzyknąć filtrat do kolumny wykluczającej wielkość zrównoważoną w buforze S-200.

Po uruchomieniu frakcji szczytowych na drugim żelu stronicowym od czterech do 20% Tris-Glycine SDS, zabarwić żel i zebrać czyste frakcje pikowe do zagęszczenia w 50-kilogramowym koncentratorze odcięcia daltonowego w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jak właśnie pokazano. Następnie zmierz absorbancję próbki białka o długości fali 280 nanometrów, aby określić stężenie przed przechowywaniem próbki w nieskończoność w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby wykonać test sieciowania aldehydu glutarowego, najpierw dodaj 0,5 miligrama na mililitr rozmrożonego białka w trzech mikrolitrach buforu S-200 do pięciu mikrolitrów buforu S200.

Zakończyć reakcję kontroli ujemnej dodając jeden mikrolitr 20% dodecylosiarczanu sodu i jeden mikrolitr 1,5% aldehydu glutarowego. Uzupełnij próbki eksperymentalne dodatkiem jednego mikrolitra wody i jednego mikrolitra 1,5% aldehydu glutarowego. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej zakończ reakcję pięcioma mikrolitrami matrycy ładującej 3x żel SDS zawierający nadmiar buforu Tris w celu stłumienia aldehydu glutarowego i załaduj wszystkie 15 mikrolitrów roztworu na 4 do 20% żelu stronicowego Tris-Glycine SDS.

Następnie uruchom żel pod napięciem 200 woltów przez 30 minut przed barwieniem, aby określić zakres sieciowania dimerów, o czym świadczy pasmo, które działa dwa razy większe niż denaturowany monomer. Zabarwić żel, potrząsając powolną wytrząsarką orbitalną z barwnikiem żelowym dodanym do żelu. W tym przypadku typowe żele dla frakcji wymykających się z chromatografii powinowactwa do niklu wykazują trzy częściowo oczyszczone białka, przy czym frakcje lizatu nie wykazują znaczącego pasma odpowiadającego transporterowi boranu, jak oczekiwano dla białek, które nie wykazują nadmiernej ekspresji.

Ad milimolowy pas płukania w każdym żelu wykazuje minimalną utratę dziesięciu białek znakowanych histydyną, pomimo ich stosunkowo wysokiego stężenia emiterów. Podczas gdy prążki odpowiadające transporterom boranowym są łatwo widoczne we frakcjach wymykających się. Przed wstrzyknięciem do kolumny S200 białka są niedostatecznie oczyszczane do wielu dalszych zastosowań, na co wskazują dodatkowe pasma w każdej próbce.

Jednak po ich wstrzyknięciu do kolumn wykluczających wielkość można zaobserwować ulotne frakcje o wysokiej czystości. Sieciowanie pokazuje, że oczyszczone transportery homomeryczne mogą mieć swoje złożenie w roztworze łatwe do oceny, przy czym stopień sieciowania zależy od liczby reszt lizyny znajdujących się blisko siebie. Ważne jest, aby pamiętać, że po rozpoczęciu pobierania komórek białko musi być przez cały czas utrzymywane w niskiej temperaturze. Albo na lodzie w pomieszczeniu o temperaturze czterech stopni Celsjusza, albo w skrzynce na delikatesy.

Po tej procedurze białka błonowe można dalej scharakteryzować metodami biofizycznymi, biochemicznymi lub strukturalnymi, w tym krystalografią rentgenowską lub mikroskopią krioelektronową. Umożliwiając oczyszczanie miligramowych ilości jednorodnego białka, techniki te wykorzystano do określenia struktury krystalicznej transportera Arabidopsis thaliana one.