Name: Ekspresja, solubilizacja i oczyszczanie eukariotycznych transporterów boranu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T15:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj metodę ekspresji, solubilizacji i oczyszczania eukariotycznych transporterów boranu z wykorzystaniem drożdży Saccharomyces cerevisiae. Protokół obejmuje chromatografię afinityczną i ocenę zespołu multimerowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez fundusze startowe w Davidson College.

1. Przygotowanie pożywek i ważnych
<ol>
	<li>Przygotuj 500 ml 40% galaktozy, dodając 200 g galaktozy i wody dejonizowanej do całkowitej objętości 500 ml. Użyj płyty grzejnej lub kuchenki mikrofalowej, aby zwiększyć szybkość przedostawania się galaktozy do roztworu. Sterylny filtr z próżniowym aparatem filtracyjnym składającym się z pokrywy filtra 0,2 μm przymocowanej do sterylnej szklanej butelki. 
	UWAGA: Wszystkie roztwory pożywek są przygotowywane przy użyciu wody dejonizowanej.</li>
	<li>Przygotuj 500 ml 40% glukozy, dodając 200 g glukozy i wody do całkowitej objętości 500 ml. Autoklaw do sterylizacji.</li>
	<li>Do każdej z czterech kolb o pojemności 2 litrów dodać 0,4 g kompletnej mieszanki suplementu bez histydyny (CSM-His), 3,35 g drożdżowej zasady azotowej z siarczanem amonu (YNB + azot) i 475 ml wody. Autoklaw. Dodaj 25 ml 40% glukozy, aby uzyskać końcowe stężenie glukozy 2%.</li>
	<li>Dodaj do szklanej butelki 50 g peptonu i 25 g ekstraktu drożdżowego oraz wodę do 375 ml. Autoklaw. Dodaj 125 ml 40% galaktozy, aby uzyskać 5x roztwór peptonu drożdżowego (YP) zawierający 10% galaktozy.</li>
	<li>Dodać do kolby o pojemności 250 ml 0,04 g CSM-His, 0,335 g YNB + azot i wodę do 47,5 ml. Autoklaw. Dodaj 2,5 ml 40% glukozy, aby uzyskać 50 ml CSM-His + YNB + 2% glukozy.</li>
	<li>Przygotuj 1 l 1M Tris pH 7,0, mieszając 121,14 g zasady Tris z 800 ml wody. Dodawać stężony kwas solny, aż pH osiągnie 7,0. Dodać wodę do końcowej objętości 1 l i przepuścić przez filtr 0,2 μm.</li>
	<li>Przygotować 500 ml 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) o pH 8,0, mieszając 73,06 g EDTA z 400 ml wody. Dodawać granulki wodorotlenku sodu, aż EDTA się rozpuści, a pH osiągnie 8,0. Dodać wodę do końcowej objętości 500 ml i przepuścić przez filtr 0,2 μm.</li>
	<li>Przygotować 100 ml 100 mM fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF), mieszając 1,74 g PMSF z 200-procentowym etanolem. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotuj 225 ml 2x buforu do płukania kulek składającego się z 50 mM Tris pH 7,0, 1,4 M NaCl, 20% glicerolu i 1 mM EDTA pH 8,0.</li>
	<li>Przygotować 100 ml buforu do chromatografii wykluczającej wielkość (bufor S200) składającego się z 20 mM hydratu kwasu 4-morfolinoetanosulfonowego (MES) o pH 6,5, 100 mM NaCl, 2% glicerolu i 0,03% n-dodecylo-beta-D-maltopiranozydu (DDM).</li>
	<li>Przygotuj 100 ml membranowego buforu do reprodukcji składającego się z 50 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl i 10% glicerolu.</li>
	<li>Przygotuj 10 ml 3x barwnika ładującego SDS-PAGE, mieszając 3 ml 20% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 3 ml glicerolu, 2,4 ml 1M Tris pH 6,8, 0,03 g błękitu bromofenolowego i 1,6 ml 2-merkaptoetanolu.</li>
</ol>
2. Nadekspresja transportera boranów u S. cerevisiae
<ol>
	<li>Zaszczepić trzy przekształcone kolonie drożdży w 50 ml pożywki CSM-His + YNB + 2% glukozy i wstrząsnąć przez noc z prędkością 190 obr./min w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Następnego dnia użyć spektrofotometru, aby określić gęstość optyczną przy długości fali 600 nm (OD600) i zaszczepić do OD600 0,01 każda z czterech kolb 2-litrowych, z których każda zawiera 500 ml pożywki CSM-His + YNB + 2% glukozy.</li>
	<li>Wstrząsać z prędkością 190 obr./min w temperaturze 30 °C przez 30 godzin, aby komórki mogły skonsumować całą glukozę i osiągnąć wysoką gęstość. 
	UWAGA: Dłuższy czas wzrostu skutkuje większą wydajnością komórek, większą wydajnością zebranych błon i ostatecznie większą wydajnością oczyszczonego białka.</li>
	<li>Indukuj ekspresję, dodając 125 ml 5x pożywki YP uzupełnionej 10% galaktozą, aby uzyskać końcowe stężenie indukcyjne 2% galaktozy. Wytrząsać przy 190 obr./min w temperaturze 30 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Zbieraj komórki, wirując w temperaturze 4 000 x g przez 15 minut. Ponownie zawiesić komórki w 100 ml zimnej wody. 
	UWAGA: W tym momencie komórki mogą być zamrażane w temperaturze -80 °C na czas nieokreślony lub przygotowanie może być kontynuowane do lizy komórek i zbierania błony. Zazwyczaj pobieramy 40-45 g komórek.</li>
</ol>
3. Zbieranie błon drożdżowych
<ol>
	<li>Dodaj do reprodukcji komórek 11,25 ml 1M Tris pH 7,0, 0,45 ml 0,5 M EDTA i 2,25 ml 100 mM PMSF, z których dwa ostatnie działają jako inhibitory proteazy. Dodać wodę do końcowej objętości 225 ml, co spowoduje powstanie buforu do reprodukcji komórek o wartości 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA i 1 mM PMSF. 
	UWAGA: Jeśli używasz zamrożonych komórek, pozwól im dokładnie się rozmrozić, około 1 godziny w temperaturze pokojowej, ponieważ jeśli pozostaną częściowo zamrożone, będą odporne na lizę przez ubijanie kulek.</li>
	<li>Dodaj zawiesinę komórek do metalowego kanistra o pojemności 450 ml w celu ubijania kulek. Uzupełnij pozostałą objętość zimnymi szklanymi koralikami o średnicy 0,5 mm.</li>
	<li>Zamontuj komorę do ubijania koralików z wirnikiem i zanurz się w łaźni lodowej. Wykonaj sześć 1-minutowych impulsów, oddzielonych 2-minutowymi okresami odpoczynku, aby zapobiec przegrzaniu lizatu.</li>
	<li>Zamontuj próżniowe urządzenie filtracyjne za pomocą plastikowego jednorazowego filtra górnego do butelki wkręconego w szklaną butelkę. Usuń membranę filtracyjną, ponieważ pozostałe plastikowe urządzenie może wychwycić kulki, przepuszczając lizat. Oddziel kulki od lizatu, wylewając zawartość komory ubijania kulek na zespół, jednocześnie stosując próżnię.</li>
	<li>Umyj komorę ubijania kulek 225 ml 2x buforu do płukania, który zawiera 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1,4 M NaCl i 20% glicerolu. Wylej zawartość komory na koraliki, aby je umyć. 
	UWAGA: Przemywanie daje końcową objętość ~ 450 ml zlizowanych komórek i znacznie zwiększa wydajność zebranej błony. Końcowe stężenia to 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10% glicerolu i 700 mM NaCl, a głównym celem podniesienia stężenia soli jest pomoc w dysocjacji białek błony obwodowej.</li>
	<li>Odwiruj lizat komórkowy przez 15 minut przy 15 000 x g. Wlać supernatant do butelek z poliwęglanu i wirować przez 1 godzinę przy 135 000 x g w ultrawirówce w celu zebrania membran. 
	UWAGA: Jeśli ultrawirówka nie jest dostępna, membrany można zbierać, wirując przez 3 godziny przy 53 000 x g, przy sile osiągalnej w wirówkach podłogowych.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad i zważyć butelki z granulkami membrany. Zawiesić granulki membrany w około 35 ml buforze do zawieszania membrany zawierającym 50 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl i 10% glicerolu i dodać do szklanego dodajnika. Zważyć puste probówki wirówkowe, aby określić masę zebranych membran. 
	UWAGA: W przypadku wydajnego zbioru membran masa membran będzie równa około 20% masy komórek użytych do tego zbioru membranowego. Protokół ten daje typową wydajność komórek na poziomie 40-45 g, a zatem spodziewamy się również wydajności 8-9 g błon.</li>
	<li>Odbić homogenizować membrany i podzielić na stożkowe probówki o pojemności 50 ml, które mogą być teraz przechowywane przez czas nieokreślony w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: W tym eksperymencie zazwyczaj wykonuje się dwie podwielokrotności, aby umożliwić przeprowadzenie dwóch oddzielnych oczyszczań białka z jednego oryginalnego preparatu komórkowego.</li>
</ol>
4. Solubilizacja i oczyszczanie białka
<ol>
	<li>Do zlewki dodać mieszadło i 150 mg n-dodecylo-β-D-d-maltopyranozydu (DDM) na g używanej błony. Utrzymuj białko na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez cały czas. 
	UWAGA: DDM jest higroskopijny i powinien być przechowywany w szklanym słoiku ze środkiem osuszającym w temperaturze -20 °C, gdy nie jest używany. Typowe jest również stosowanie od 4 do 5 g błon w oczyszczaniu, aby uzyskać znaczną ilość czystego białka.</li>
	<li>Rozmrozić membrany i doprowadzić do końcowej objętości 15 ml na g błony w membranowym buforze do rezawieszania uzupełnionym 1 mM PMSF i 20 mM imidazolem o pH 8,0. Dodać błony do zlewki z DDM i mieszać przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Stężenie DDM wyniesie 1% w/v, ale w przypadku solubilizacji białek błonowych bardziej krytyczne jest zwracanie uwagi na masę detergentu dodanego na g błony.</li>
	<li>Wirować przez 25 minut w temperaturze 135 000 x g w temperaturze 4 °C, aby uzyskać nierozpuszczony materiał. Przefiltrować supernatant przez filtr strzykawkowy 5 μm.</li>
	<li>Załadować próbkę za pomocą pompy perystaltycznej ustawionej na natężenie przepływu 1 ml/min na 1 ml unieruchomionej kolumny powinowactwa do niklu o zrównoważonym 20 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, 10% glicerolu, 20 mM imidazolu pH 8,0 i 0,05% DDM, 
	UWAGA: W przypadku białek o niższej ekspresji zaobserwowano poprawę czystości i wydajności przy użyciu 1 ml zamiast 5 ml kolumny oraz niklu zamiast jonów kobaltu do chromatografii powinowactwa.</li>
	<li>Przepłukać kolumnę 10 objętościami buforu płuczącego zawierającego 20 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, 10% glicerolu, 80 mM imidazolu o pH 8,0 i 0,05% DDM. 
	UWAGA: Stężenie imidazolu, które można stosować podczas prania dla białka znakowanego 10-His, jest wyższe niż się powszechnie uważa i skutkuje poprawą czystości.</li>
	<li>Eluować białko w buforze zawierającym 20 mM Tris pH 7,0, 200 mM NaCl, 10% glicerolu, 300 mM imidazol o pH 8,0 i 0,05% DDM. Zebrać eluat w dziesięciu frakcjach o pojemności 1 ml i uruchomić na 4-20% żelu Tris-glycine SDS-PAGE wraz z rozpuszczonym lizatem i frakcjami płuczącymi.</li>
	<li>Puluj frakcje szczytowe, zwykle około 5-6 ml, i zagęszczaj do objętości 500 μl lub mniejszej w koncentratorze odciętym 50 kDa w wirówce stołowej schłodzonej w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: 500 μL to typowa maksymalna objętość wstrzykiwana do kolumn chromatografii wykluczającej wielkość (SEC). W tym momencie białko może być przechowywane przez czas nieokreślony w temperaturze -80 °C lub kontynuowane do SEC.</li>
	<li>Przefiltrować białko przez filtr kolumny wirowej 0,2 μm i wstrzyknąć do kolumny wykluczającej wielkość (np. Superdex-200) zrównoważonej w buforze S200: 20 mM Mes pH 6,5, 100 mM NaCl, 2% glicerolu i 0,03% DDM, 
	UWAGA: W kolejnym teście sieciowania aldehydu glutarowego środek buforujący nie może zawierać pierwszorzędowej aminy. SEC to okazja do wymiany w razie potrzeby, tak jak ma to miejsce w przypadku wymiany Tris na Mes.</li>
	<li>Uruchom frakcje szczytowe na 4-20% żelu Tris-glycine SDS-PAGE. Zabarwić żel, zebrać czyste frakcje pikowe i skoncentrować w koncentratorze odcinającym 50 kDa w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie białka, mierząc absorbancję przy długości fali 280 nm i przechowywać przez czas nieokreślony w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Test sieciowania aldehydu glutarowego
<ol>
	<li>Przygotuj 10 μl reakcji, mieszając 3 μl 0,5 mg/ml białka w buforze S200, 5 μl buforu S200, 1 μl wody lub 20% dodecylosiarczanu sodu (SDS), a następnie 1 μl 1,5% aldehydu glutarowego. 
	UWAGA: Da to 1x reakcję 0,15 mg / ml białka i 0,15% aldehydu glutarowego. Próbki zawierające poddanie analizie wstępnej SDS są ważnymi kontrolami ujemnymi i powinny być mieszane i inkubowane w temperaturze pokojowej przez 5 minut przed dodaniem aldehydu glutarowego.</li>
	<li>Inkubować reakcję przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zakończ reakcję, dodając 5 μl 3x barwnika ładującego żel SDS-PAGE, który zawiera nadmiar buforu Tris, który wygasza aldehyd glutarowy.</li>
	<li>Załaduj wszystkie 15 μl na 4-20% żel Tris-glycine SDS-PAGE, który załaduje 1,5 μg białka na linię. Uruchom żel pod napięciem 200 V przez 30 minut. Zabarwić i określić zakres sieciowania dimerów na podstawie dowodów na pasmo, które biegnie dwa razy większe niż zdenaturowany monomer. 
	UWAGA: Najpierw można przeprowadzić miareczkowanie aldehydu glutarowego i przebieg czasowy, aby znaleźć najlepsze warunki dla transportera homomerycznego.</li>
</ol>

<ol><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).</li>
<li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li>
<li>Andréll, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Overexpression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Molecular Membrane Biology. 30 (1), 52-63 (2013).</li>
<li>Lyons, J. A., Shahsavar, A., Paulsen, P. A., Pedersen, B. P., Nissen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+strategies+for+structural+studies+of+eukaryotic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression strategies for structural studies of eukaryotic membrane proteins.</a> Current Opinion in Structural Biology. 38, 137-144 (2016).</li>
<li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li>
<li>Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+the+major+polypeptides+of+the+human+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane.</a> Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).</li>
<li>Thurtle-Schmidt, B. H., Stroud, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Bor1+supports+an+elevator+transport+mechanism+for+SLC4+anion+exchangers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structure of Bor1 supports an elevator transport mechanism for SLC4 anion exchangers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10542-10546 (2016).</li>
<li>Coudray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+SLC4+transporter+Bor1p+in+an+inward-facing+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the SLC4 transporter Bor1p in an inward-facing conformation.</a> Protein Science. 26 (1), 130-145 (2016).</li>
<li>Arakawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+anion+exchanger+domain+of+human+erythrocyte+band+3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the anion exchanger domain of human erythrocyte band 3.</a> Science. 350 (6261), 680-684 (2015).</li>
<li>Huynh, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoEM+structure+of+the+human+SLC4A4+sodium-coupled+acid-base+transporter+NBCe1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CryoEM structure of the human SLC4A4 sodium-coupled acid-base transporter NBCe1.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Zhao, R., Reithmeier, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+the+anion+transporter+homologue+YNL275w+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of the anion transporter homologue YNL275w in Saccharomyces cerevisiae.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 281 (1), 33-45 (2001).</li>
<li>Takano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+boron+transporter+for+xylem+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis boron transporter for xylem loading.</a> Nature. 420, 337-340 (2002).</li>
<li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specificity+of+the+expression+of+Os+BOR1%2C+a+rice+efflux+boron+transporter+gene%2C+is+regulated+in+response+to+boron+availability+for+efficient+boron+uptake+and+xylem+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-type specificity of the expression of Os BOR1, a rice efflux boron transporter gene, is regulated in response to boron availability for efficient boron uptake and xylem loading.</a> Plant Cell. 19 (8), 2624-2635 (2007).</li>
<li>Hays, F. A., Roe-Zurz, Z., Stroud, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+purification+of+integral+membrane+proteins+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Overexpression and purification of integral membrane proteins in yeast.</a> Methods in Enzymology. 470, Issue C (2010).</li>
<li>Chang, Y. -N., Geertsma, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+class+of+seven+transmembrane+segment+inverted+repeat+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The novel class of seven transmembrane segment inverted repeat carriers.</a> Biological Chemistry. 398 (2), 165-174 (2017).</li>
<li>Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+function+and+structure+of+a+monomeric+ClC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Design, function and structure of a monomeric ClC transporter.</a> Nature. 468 (7325), 844-847 (2010).</li>
<li>Last, N. B., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Monomerization+of+a+ClC-Type+Fluoride+Transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional Monomerization of a ClC-Type Fluoride Transporter.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (22), 3607-3612 (2015).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimeric+structure+of+the+uracil%3Aproton+symporter+UraA+provides+mechanistic+insights+into+the+SLC4%2F23%2F26+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Dimeric structure of the uracil:proton symporter UraA provides mechanistic insights into the SLC4/23/26 transporters.</a> Cell Research. 27 (8), 1020-1033 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj udostępniliśmy szczegółowe protokoły, które skutkują oczyszczeniem do jednorodności trzech różnych eukariotycznych transporterów boranu. Przedstawione tutaj protokoły pochodzą z innych protokołów ekspresji integralnych białek błonowych w S. cerevisiae 1,14, a nasze optymalizacje skutkują zarówno poprawą czystości, jak i lepszą wydajnością. Zoptymalizowane tutaj parametry obejmują objętość i czas wzrostu kultur komórkowych, procedury lizy z wybijaniem kulek, skład buforu podczas lizy komórek i oczyszczania białek, ilość użytego detergentu na gramową membranę, identyfikację jonów metali w oczyszczaniu powinowactwa, objętość kolumny powinowactwa oraz wdrożenie testu sieciowania w celu oceny przydatności homologu i detergentu poprzez ocenę stanu multimerycznego transporterów oligomerycznych. Protokoły są skuteczne dla wielu homologów SLC4 z gatunków roślin i grzybów. Ograniczeniem wszystkich strategii oczyszczania integralnych białek błonowych jest to, że nie istnieje uniwersalna metoda oczyszczania białek błonowych, która gwarantowałaby działanie. Możliwe, że nasze protokoły mają większe szanse na sukces w przypadku białek bliższych identyczności sekwencji i strukturze transporterów SLC4, a zatem członkowie rodzin SLC4, SLC23 i SLC26 mogą być obiecującymi celami15. Podobnie, im bardziej ewolucyjnie odległy od transporterów boranowych może być transporter membranowy, tym bardziej prawdopodobne jest, że protokół będzie musiał być inny, na przykład poprzez zmianę systemu odciągania, detergentu lub innych kluczowych parametrów4.
Protokół wykorzystuje najczęściej stosowany znacznik powinowactwa w oczyszczaniu białek, znacznik His. Pomimo obecności zanieczyszczeń w początkowych eluowanych frakcjach, kombinacje powinowactwa do niklu, intensywnego mycia i późniejszego oczyszczania SEC dają w wyniku wysoce oczyszczone białko. Znacznik 10-His-Go pozwala na bardziej rygorystyczne płukanie imidazolem, a tym samym może usunąć więcej białek wiążących tło, niż można usunąć w praniu dozwolonym przez znaczniki 8-His- lub 6-His. Nasze selekcje czystych frakcji są błędne po konserwatywnej stronie najbardziej czystych frakcji żelowych, które odpowiadają pikowym frakcjom SEC. Końcowa wydajność białka może być zwiększona poprzez łączenie i zagęszczanie większej liczby frakcji, aczkolwiek z kompromisem w postaci nieco mniej czystego białka. Przedstawione tu metody umożliwiły oczyszczenie AtBor1 w ilościach, które doprowadziły do określenia jego struktury krystalicznej7, przy czym różnice w oczyszczaniu polegały na odcięciu znacznika Hisa i wymianie transportera na inny detergent w celu poprawy dyfrakcji kryształów7.
Nasz protokół porusza ważne kwestie związane z wyborem homologów i detergentu używanego do ich rozpuszczania i oczyszczania. DDM jest powszechnym pierwszym wyborem dla detergentów, ponieważ jest stosunkowo łagodny, często skutecznie rozpuszcza się i był stosowany w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych szerokiej gamy białek błonowych. Przy określaniu, czy detergent jest złym wyborem dla błony, powszechną metodą oceny jest to, czy białko daje pojedynczy pik monodyspersyjny na chromatogramie SEC, a nie duży pik w objętości pustej przestrzeni lub zakres pików polidyspersyjnych, które wskazują na nieprawidłowo sfałdowane lub niestabilne białko. Bardziej subtelną kwestią jest nasze oczyszczanie ScBor1. Oczyszcza się w dużych ilościach i wygląda korzystnie i monodyspersyjnie na chromatogramie SEC, co sugeruje, że może być atrakcyjnym celem do badań strukturalnych. Jednak nasz test sieciowania ujawnia, że po oczyszczeniu jest to monomer. Chociaż możliwe jest, że ScBor1 może natywnie istnieć jako monomer w komórce, badania wskazują, że transportery SLC4 i ich homologi prawdopodobnie są dimerami 7,8,9,10. Opracowanie testu sieciowania nastąpiło po skrystalizacji i rozwiązaniu struktury AtBor1. Gdybyśmy jednak byli w stanie ocenić ScBor1 w porównaniu z AtBor1 za pomocą testu sieciowania, cenny czas i wysiłki badawcze można by przekierować na poszukiwanie AtBor1 zamiast ScBor1, z których ten ostatni ostatecznie nie odniósł sukcesu w eksperymentach z krystalizacją i dyfrakcją. Test ten może zatem pomóc naukowcom w rozróżnieniu między homologami lub detergentami, które należy stosować podczas prowadzenia badań strukturalnych, w celu ustalenia priorytetów warunków, w których białko utrzymuje podejrzewaną natywną konformację. Dodatkowo test można wykorzystać do zbadania, które aminokwasy są krytyczne dla multimeryzacji, w celu znalezienia podstawień aminokwasów, które destabilizują granicę faz multimeryzacji i prowadzą do obligujących monomerów. Takie podejście zostało wykorzystane do zbadania funkcjonalnego znaczenia montażu homomerycznego w transporterach membranowych 16,17,18.
Ogólną zaletą naszej metody jest to, że wykazano, że drożdże umożliwiają ekspresję wielu trudnych białek błonowych o różnych funkcjach1. Ponadto jego niski koszt i czas wzrostu sprzyjają jego dostępności dla wielu wysiłków badawczych, które mogą być mniej zdolne do wykorzystania strategii ekspresji wymagających hodowli tkankowej lub drogich pożywek wzrostowych. Przedstawione tutaj procedury są stosunkowo niedrogie i można je wykonać w ciągu jednego tygodnia, co podkreśla wykonalność tego podejścia. Wdrożenie tych protokołów może pomóc w umożliwieniu badań strukturalnych i funkcjonalnych innych trudnych białek błonowych.

Trudność w uzyskaniu wystarczającej ilości oczyszczonego białka błonowego pozostaje krytycznym wąskim gardłem w dążeniu do badań strukturalnych i funkcjonalnych receptorów, kanałów jonowych i transporterów. Istnieje wiele protokołów dla umiarkowanie wysokich przepustowości potoków do badań przesiewowych i znajdowania potencjalnych białek błonowych, które ulegają ekspresji wystarczająco dobrej, aby umożliwić późniejsze badania in vitro1,2,3,4. Zazwyczaj białka są znakowane N- lub C-końcowym zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), a poziomy ekspresji są monitorowane albo za pomocą fluorescencji w żelu, albo za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar wykrywania fluorescencji (FSEC)5. Takie podejścia umożliwiają klasyfikację kandydatów na białka błonowe na białka o wysokiej ekspresji, białka o umiarkowanej lub niskiej ekspresji lub białka, które wyrażają się słabo lub wcale. Podejście to sprawdza się, gdy projekt eksperymentalny polega na badaniu dużej liczby genów kandydujących z zamiarem wybrania białka, które wykazuje najlepszą ekspresję. Jednak w niektórych przypadkach podejście eksperymentalne opiera się na badaniu określonego białka błonowego, co może być trudne, gdy poziomy ekspresji tego białka są w umiarkowanym lub niskim zakresie. Dodatkowo, czasami w takich przypadkach, poziomy ekspresji mogą być tylko minimalnie zwiększone przez zmianę konstruktu poprzez skrócenie, mutacje termostabilizujące lub optymalizację kodonów. Dlatego czasami konieczna jest optymalizacja ekspresji białek błonowych i protokołów oczyszczania dla białek błonowych, które wyrażają się tylko umiarkowanie dobrze.
Rodzina transporterów SLC4 obejmuje transporter wodorowęglanowy Anion Exchanger 1 (znany również jako Band 3), najobficiej występujące białko błonowe w czerwonych krwinkach6, oraz kluczowy czynnik oddychania komórkowego. Rodzina SLC4 jest homologiczna z transporterami boranu, które mają kluczowe znaczenie w roślinach i wykazano, że wykazują podobną strukturę do wymieniacza anionowego 1, a także do transporterów SLC4 sprzężonych z sodem7,8,9,10. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowane protokoły ekspresji i oczyszczania białek przy użyciu S. cerevisiae do oczyszczania trzech różnych transporterów boranu znajdujących się w drożdżach i roślinach. Szczegółowo przedstawiamy kluczowe kroki, które podjęliśmy, aby zoptymalizować wydajność i skuteczność oczyszczania do jednorodności. Dodatkowo informujemy o chemicznym teście sieciowania przy użyciu aldehydu glutarowego w celu monitorowania multimerycznego składania tych transporterów w kontekście oczyszczonego kompleksu białkowo-detergentowo-lipidowego. Eksperyment sieciowania może pomóc w ocenie przydatności homologu i detergentu poprzez ocenę stanu multimerycznego transporterów oligomerycznych po oczyszczeniu.
Ten protokół zakłada, że pożądany transporter został sklonowany do plazmidu pochodzącego z 2 μ pod indukowalną kontrolą promotora GAL1 do ekspresji w S. cerevisiae. Do tych procedur wykorzystano DNA kodujące pełnowymiarowe transportery boranu typu dzikiego Saccharomyces cerevisiae Bor1 (ScBor1)11, Arabidopsis thaliana Bor1 (AtBor1)12 i Oryza sativa Bor3 (OsBor3)13. Do końca C w każdym konstrukcie dołączony jest znacznik 10-His i miejsce rozszczepienia trombiny umieszczone między transporterem a znacznikiem 10-His, aby umożliwić jego usunięcie w razie potrzeby. Protokół zakłada również, że plazmid został już przekształcony w szczep ekspresyjny DSY-5 S. cerevisiae na kompletnych uzupełniających pożywkach selektywnych (CSM) pozbawionych histydyny.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 4-morfolinoetanosulfonowy hydrat (MES)</td><td>Acros</td><td>172591000</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; kta Pure 25 L FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa Koncentrator MWCO</td><td>Milipore</td><td>UFC905024</td><td>do zagęszczania frakcji kolumny niklowej</td></tr><tr><td>Koncentrator MWCO Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa Koncentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC805024</td><td>do zagęszczania frakcji S200</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD Diagnostyka</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy Bacto</td><td>BD Diagnostyka</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>Szklana kolba Erlenmeyera, 2L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS44442L</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Filtr butelkowy</td><td>Nalgene</td><td>595-4520</td><td>membrana jest usuwana i używana do filtrowania kulek szklanych</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Kompletna mieszanka suplementów bez histydyny</td><td>Sunrise Science</td><td>1006-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Galaktoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD016</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik żelowy System</td> <td>SDS-PAGEBio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Szklany kulkowy rozbijacz komórek</td><td>BioSpec</td><td>1107900</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane, 0,5 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079105&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>16019</td><td>wysyłany jako 8% roztwór pod azotem</td></tr><tr><td>Kolumna Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap IMAC FF, 1 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0921-02</td><td>naładowany niklem</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Acros</td><td>12202</td><td></td></tr><tr><td>Błyskawiczna niebieska plama żelowa</td><td>Wirnik Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>JA-10</td><td>Rotor Beckman</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>JA-14 Rotor</td><td>Beckman</td><td>339247</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 1,5 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>3451</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka, chłodzona</td><td>Fisher</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Żele tris-glicynowe, 4-20%</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna Minipuls 3</td><td>Gilson</td><td>F155005</td><td>służy do ładowania lizatu na kolumnę powinowactwa</td></tr><tr><td>n-dodecylo-beta-D-maltopiranozyd (DDM)</td><td>Inalco</td><td>1758-1350</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny siarczan niklu(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227676</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do wytrząsania orbitalnego z regulacją temperatury</td><td>Nowy Brunszwik</td><td>C24</td><td></td></tr><tr><td>p423 Plazmid GAL1 z wkładką</td><td></td><td></td> transportera boranu <td>dostępny u autorów</td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td>Acros</td><td>215740050</td><td></td></tr><tr><td>Probówki ultrawirówkowe z poliwęglanu</td><td>Beckman</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Butelki polipropylenowe, 250 ml</td><td>Beckman</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Butelki polipropylenowe, 500 ml</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standardy kalejdoskopu białkowego 355607 Precision Plus</td><td>Bio-Rad</td><td>1610375</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae szczep DSY-5</td><td></td><td></td><td>dostępny u autorów</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna wirowa z 0,2 i mikro; m filtr, 0,5 ml</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV0S</td><td>do filtrowania białka przed wstrzyknięciem na kolumnę S200</td></tr><tr><td>Sterylne probówki Falcon, 15 ml</td><td>Lab Depot</td><td>TLD431696</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki Falcon, 50 ml</td><td>Lab Depot</td><td>TLD431698</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Superdex 200 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>używana do oczyszczania SEC</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy, 5&mikro; m</td><td>Pall</td><td>4650</td><td>do filtrowania lizatu przed załadowaniem kolumny powinowactwa</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik typu 70 Ti</td><td>Beckman</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman</td><td>L8-70M</td><td></td></tr><tr><td>YNB+Azot bez aminokwasów</td><td>Sunrise Science</td><td>1501-500</td><td></td></tr></tbody></table>

ekspresja, solubilizacja i oczyszczanie eukariotycznych transporterów boranu

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Rodzina białek Solute Carrier 4 (SLC4) nazywana jest transporterami wodorowęglanów i obejmuje archetypowe białko Anion Exchanger 1 (AE1, znane również jako Band 3), najobficiej występujące białko błonowe w czerwonych krwinkach. Rodzina SLC4 jest homologiczna z transporterami boranu, które zostały scharakteryzowane w roślinach i grzybach. Istotnym wyzwaniem technicznym pozostaje ekspresja i oczyszczanie białek transportu błonowego do jednorodności w ilościach odpowiednich do badań strukturalnych lub funkcjonalnych. Tutaj opisujemy szczegółowe procedury nadekspresji transporterów boranu w Saccharomyces cerevisiae, izolacji błon drożdży, rozpuszczania białka przez detergent i oczyszczania homologów transportera boranowego z S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana i Oryza sativa. Szczegółowo opisujemy również eksperyment sieciowania aldehydu glutarowego w celu oznaczenia multimeryzacji transporterów homomerycznych. Nasze uogólnione procedury mogą być stosowane do wszystkich trzech białek i zostały zoptymalizowane pod kątem skuteczności. Wiele z opracowanych tutaj strategii można wykorzystać do badania innych trudnych białek błonowych.

Typowe żele dla frakcji eluowanych podczas chromatografii powinowactwa do niklu wykazują częściowe oczyszczenie wszystkich trzech białek (Rysunek 1A). Po prawej stronie markera znajduje się lizat, który w każdym przypadku nie wykazuje wyraźnego prążka odpowiadającego transporterowi boranu, co jest typowe dla białek, które nie ulegają silnej nadekspresji. Ścieżka płukania 80 mM wykazuje minimalną stratę białka z tagiem 10-His pomimo stosunkowo wysokiego stężenia imidazolu. Prążki odpowiadające transporterom boranu są wyraźnie widoczne we frakcjach eluowanych, a frakcje uznane za zawierające większość eluowanego białka są zagęszczane przed naniesieniem na kolumnę do filtracji żelowej S20. Na tym etapie białka są niewystarczająco oczyszczone do wielu zastosowań w kolejnych etapach, o czym świadczą dodatkowe prążki w zagęszczonej próbce przed naniesieniem na kolumnę S20 (Rysunek 1B). Jednak naniesienie próbki na kolumnę do wykluczania sterycznego ujawnia frakcje eluowane o wysokiej czystości (Rysunek 1B-C). Przedstawiono chromatogramy i odpowiadające im żele dla każdego z transporterów boranu. Pomimo umiarkowanej czystości próbek po elucji z chromatografii powinowactwa, białko po elucji z kolumny do filtracji żelowej jest wysoce czyste. Co krytyczne, chromatogramy wykazują, że każde białko migruje głównie jako pojedynczy, monodyspersyjny pik, przy niewielkiej ilości białka zatrzymanego w objętości martwej. Stabilne i prawidłowo sfałdowane białko zazwyczaj daje pik monodyspersyjny i symetryczny, podczas gdy białko niestabilne, błędnie sfałdowane lub zagregowane zazwyczaj daje albo wiele pików asymetrycznych, albo duży pik w objętości martwej. Typowa końcowa wydajność wynosi około 2 mg oczyszczonego białka na L kultury drożdży dla ScBor1 oraz około 1 mg każdego z oczyszczonych białek AtBor1 i OsBor3 na L kultury. Wartości te stanowią ilość białka oczyszczonego z jednej porcji 4-5 g membran, pochodzącej z połowy naszej pierwotnej preparacji komórkowej.
Eksperyment z sieciowaniem wykazuje, że w przypadku oczyszczonych transporterów homomerycznych można łatwo ocenić ich stopień złożenia w roztworze (Rysunek 2). Próbki poddane wstępnej obróbce SDS służą wykazaniu, że sieciowanie zależy od stanu pofałdowania w roztworze, a zatem nie zachodzi, gdy multimeryzacja zostaje zakłócona przez silny detergent. Przedstawione wyniki wskazują, że jeden z trzech transporterów boratu, ScBor1, nie ulega dimeryzacji podczas oczyszczania w DDM w tych warunkach, podczas gdy dwa pozostałe, AtBor1 i OsBor3, ulegają sieciowaniu i wykazują dimeryzację. Można zauważyć, że nie wszystkie białka mogą ulec sieciowaniu. W tym przykładzie widoczne są śladowe ilości monomeru OsBor3, podczas gdy AtBor1 ulega całkowitemu sieciowaniu. Stopień sieciowania zależy od liczby pozostałych w bliskim sąsiedztwie reszt lizyny i możliwe jest, że inne odczynniki sieciujące będą skutecznie sieciować inne białka błonowe.
<img alt="Schemat oczyszczania białka; wyniki chromatografii powinowactwa do niklu, chromatografii wykluczania cząsteczkowego (SEC), analiza żelowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59166/59166fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1Oczyszczanie trzech transporterów boranu przy użyciu chromatografii powinowactwa do niklu oraz chromatografii wykluczania molekularnego. Każdy panel pionowy (A), (B), i (C) zawiera dane dla ScBor1, AtBor1 oraz OsBor3. (A) Kolumna powinowactwa do niklu. M to drabinka markerów masy cząsteczkowej o wartościach w kDa podanych po lewej stronie. L to lizat surowy, a W to płukanie 80 mM imidazolem. Pozostałe ponumerowane ścieżki odpowiadają frakcjom o objętości 1 ml eluatowanych 30 mM imidazolem. Paski nad frakcjami wskazują, które z nich wybrano do połączenia i skoncentrowania przed naniesieniem na kolumnę. (B) P oznacza skoncentrowane białko przed wstrzyknięciem na kolumnę S20. Eluowane frakcje SEC znajdują się po prawej stronie, a nawiasy służą do dopasowania ścieżek żelu do odpowiadających im frakcji na chromatogramie w (C). Objętość martwa wynosi nieco ponad 8 mL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59166/59166fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy SDS-PAGE; prążki białkowe; identyfikacja dimerów i monomerów; markery masy cząsteczkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59166/59166fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2Analiza sieciowania służy do oceny oczyszczonych transporterów pod kątem tworzenia kompleksów multimerycznych. Po lewej stronie zaznaczono drabinę mas cząsteczkowych. Nad pozostałymi ścieżkami wskazano, jakie białko występuje w próbce oraz czy do próbki dodano glutaraldehyd lub czy przed dodaniem glutaraldehydu zastosowano wstępną obróbkę SDS. Strzałki wskazują pozycje monomeru i dimeru dla AtBor1 oraz OsBor3. ScBor1 jest białkiem mniejszym niż AtBor1 i OsBor3 i migruje zgodnie z oczekiwaniami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59166/59166fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół do ekspresji, solubilizacji i oczyszczania kilku eukariotycznych transporterów boranu o homologii do rodziny transporterów SLC4 za pomocą drożdży. Opisujemy również chemiczny test sieciowania w celu oceny oczyszczonych białek homomerycznych pod kątem składania multimerycznego. Protokoły te można dostosować do innych trudnych białek błonowych.

Ekspresja, solubilizacja i oczyszczanie eukariotycznych transporterów boranu

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Uzyskanie wystarczającej ilości białek błonowych do dalszych zastosowań pozostaje poważnym wyzwaniem technicznym. Protokół ten umożliwia oczyszczenie kilku białek transportowych błonowych do jednorodności. Kluczową zaletą tej techniki jest to, że Saccharomyces cerevisiae jest efektywnym pod względem czasu i kosztów eukariotycznym systemem ekspresji białek błonowych, który umożliwia optymalizację wielu kluczowych zmiennych eksperymentalnych.Zacznij od zaszczepienia trzech przekształconych kolonii drożdży w 50 mililitrach kompletnej uzupełniającej pożywki selektywnej bez histydyny. Uzupełniony drożdżową zasadą azotową i 2% glukozą do inkubacji przez noc przy 190 obrotach na minutę i 30 stopniach Celsjusza. Usuń kulturę następnego dnia.Użyj spektrofotometru, aby określić gęstość optyczną przy 600 nanometrach lub OD 600. I zaszczepić każdą z czterech dwulitrowych kolb zawierających 500 mililitrów pożywki hodowlanej do OD 600 0,01. Następnie potrząsaj kulturami z prędkością 190 obrotów na minutę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 godzin, aby komórki mogły skonsumować całą glukozę i osiągnąć wysoką gęstość.Aby wywołać ekspresję transportera boranów, dodaj 125 mililitrów pięciu x pożywki peptonowej drożdży, uzupełnionej 10% galaktozą przy 190 obrotach na minutę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Następnie zbierz komórki drożdży przez odwirowanie i ponownie zawieś granulat w 100 mililitrach zimnej wody. Zawiruj w wirze, aby ponownie zawiesić granulki drożdży i seryjnie przenieś roztwór, aby to zrobić ze wszystkimi butelkami zawierającymi granulki.Aby zebrać błony drożdży, najpierw dodaj 11,25 mililitra jednego molowca Tris, 0,45 mililitra 0,5 molowego EDTA i 2,25 mililitra 100 milimolowego PMSF do zawieszonych komórek. Dodaj wodę do końcowej objętości 225 mililitrów i przenieś komórki do 450-mililitrowego metalowego kanistra do ubijania kulek. Uzupełnij pozostałą objętość zimnymi szklanymi kulkami o średnicy 0,5 milimetra i zmontuj komorę perełkowania za pomocą wirnika.Zanurz komorę w łaźni lodowej i wykonaj sześć jednominutowych impulsów, oddzielonych dwuminutowymi okresami odpoczynku, aby zapobiec przegrzaniu lizatu. Po ostatnim impulsie wyjmij membranę filtracyjną z plastikowego jednorazowego filtra górnego do butelki wkręconego w szklaną butelkę i wlej zawartość komory do perełkowania koralików na zespół, stosując próżnię. Następnie spłucz dwoma do płukania kulek, dodając do komory, wirując, a następnie dodając do kulek.Przepłukać komorę perełkowania koralikami 225 mililitrami buforu do płukania i umyć koraliki z zawartością komory. Zebrać lizat przez odwirowanie i zdekantować supernatant do butelek z poliwęglanu w celu ultraodwirowania w celu zebrania membran. Pod koniec ultrawirowania wyrzucić supernatant i zważyć butelki z granulkami membrany przed ponownym zawieszeniem membran w około 35 mililitrach buforu do ponownego zawieszania membrany.Dodaj zawiesiny do szklanego Douncer, a następnie odbij homogenizuj membrany i porcjuj homogenat do 50-mililitrowej stożkowej probówki do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Zważyć puste butelki wirówkowe, aby określić masę zebranych membran. W celu solubilizacji i oczyszczenia białek dodać mieszadło i 150 miligramów DDM na gram błony do zlewki na lodzie i ponownie zawiesić rozmrożone membrany do końcowej objętości 15 mililitrów buforu do ponownego zawieszania błony, uzupełnionego jednym milimolowym PMSF i 20 milimolowymi imidazolami na gram błony.Dodać roztwór membranowy do zlewki na godzinę mieszania w łaźni lodowej. Następnie odwirowanie w celu osadzenia nierozpuszczonego materiału. W chłodni o temperaturze 4 stopni Celsjusza przefiltrować supernatant przez pięciomikrometrowy filtr strzykawkowy i użyć pompy perystaltycznej ustawionej na natężenie przepływu jednego mililitra na minutę, aby załadować próbkę do jednomililitrowej unieruchomionej kolumny powinowactwa niklu Następnie przemyć kolumnę 10 objętościami buforu płuczącego i rozcieńczyć białko w buforze elucyjnym.Zbieranie eluatu w dziesięciu jednomililitrowych frakcjach. Zebrane przygotowane frakcje żelu należy uruchomić na żelu stronicowym SDS o stężeniu od czterech do 20% Tris-Glycine wraz z rozpuszczonym lizatem i frakcjami płuczącymi w temperaturze pokojowej, ciągnąc pik zebranych frakcji wymykających się do stężenia do objętości 500 mikrolitrów lub mniejszej w 50-kilogramowym koncentratorze daltonowym w wirówce stołowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przefiltrować skoncentrowane białko przez filtr z kolumną wirową o średnicy 0,2 mikrometra i wstrzyknąć filtrat do kolumny wykluczającej wielkość zrównoważoną w buforze S-200.Po uruchomieniu frakcji szczytowych na drugim żelu stronicowym od czterech do 20% Tris-Glycine SDS, zabarwić żel i zebrać czyste frakcje pikowe do zagęszczenia w 50-kilogramowym koncentratorze odcięcia daltonowego w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jak właśnie pokazano. Następnie zmierz absorbancję próbki białka o długości fali 280 nanometrów, aby określić stężenie przed przechowywaniem próbki w nieskończoność w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby wykonać test sieciowania aldehydu glutarowego, najpierw dodaj 0,5 miligrama na mililitr rozmrożonego białka w trzech mikrolitrach buforu S-200 do pięciu mikrolitrów buforu S200.Zakończyć reakcję kontroli ujemnej dodając jeden mikrolitr 20% dodecylosiarczanu sodu i jeden mikrolitr 1,5% aldehydu glutarowego. Uzupełnij próbki eksperymentalne dodatkiem jednego mikrolitra wody i jednego mikrolitra 1,5% aldehydu glutarowego. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej zakończ reakcję pięcioma mikrolitrami matrycy ładującej 3x żel SDS zawierający nadmiar buforu Tris w celu stłumienia aldehydu glutarowego i załaduj wszystkie 15 mikrolitrów roztworu na 4 do 20% żelu stronicowego Tris-Glycine SDS.Następnie uruchom żel pod napięciem 200 woltów przez 30 minut przed barwieniem, aby określić zakres sieciowania dimerów, o czym świadczy pasmo, które działa dwa razy większe niż denaturowany monomer. Zabarwić żel, potrząsając powolną wytrząsarką orbitalną z barwnikiem żelowym dodanym do żelu. W tym przypadku typowe żele dla frakcji wymykających się z chromatografii powinowactwa do niklu wykazują trzy częściowo oczyszczone białka, przy czym frakcje lizatu nie wykazują znaczącego pasma odpowiadającego transporterowi boranu, jak oczekiwano dla białek, które nie wykazują nadmiernej ekspresji.Ad milimolowy pas płukania w każdym żelu wykazuje minimalną utratę dziesięciu białek znakowanych histydyną, pomimo ich stosunkowo wysokiego stężenia emiterów. Podczas gdy prążki odpowiadające transporterom boranowym są łatwo widoczne we frakcjach wymykających się. Przed wstrzyknięciem do kolumny S200 białka są niedostatecznie oczyszczane do wielu dalszych zastosowań, na co wskazują dodatkowe pasma w każdej próbce.Jednak po ich wstrzyknięciu do kolumn wykluczających wielkość można zaobserwować ulotne frakcje o wysokiej czystości. Sieciowanie pokazuje, że oczyszczone transportery homomeryczne mogą mieć swoje złożenie w roztworze łatwe do oceny, przy czym stopień sieciowania zależy od liczby reszt lizyny znajdujących się blisko siebie. Ważne jest, aby pamiętać, że po rozpoczęciu pobierania komórek białko musi być przez cały czas utrzymywane w niskiej temperaturze. Albo na lodzie w pomieszczeniu o temperaturze czterech stopni Celsjusza, albo w skrzynce na delikatesy.Po tej procedurze białka błonowe można dalej scharakteryzować metodami biofizycznymi, biochemicznymi lub strukturalnymi, w tym krystalografią rentgenowską lub mikroskopią krioelektronową. Umożliwiając oczyszczanie miligramowych ilości jednorodnego białka, techniki te wykorzystano do określenia struktury krystalicznej transportera Arabidopsis thaliana one.

expression-solubilization-purification-eukaryotic-borate

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym protokole przedstawiamy ekspresję, solubilizację i oczyszczanie rekombinowanego białka błonowego MexB w formie rozpuszczalnego kompleksu białko-detergent. MexB jest błonowym transporterem oporności wielolekowej pochodzącym z oportunistycznego patogenu bakteryjnego Pseudomonas aeruginosa.

Ekspresja, solubilizacja w detergencie i oczyszczanie transportera błonowego – białka oporności wielolekowej MexB

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem mutacji termostabilizujących, oczyścić ludzki transporter serotoniny, wygenerować przeciwciała o wysokim powinowactwie i skrystalizować kompleks transporter-przeciwciało serotoniny związany z lekiem przeciwdepresyjnym S-citalopram. Protokół ten można dostosować do badania innych trudnych transporterów błonowych, receptorów i kanałów.

Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem

Oczyszczanie kanałów jonowych jest często wyzwaniem, ale gdy już zostanie osiągnięte, może potencjalnie umożliwić badania in vitro funkcji i struktur kanałów. W tym miejscu opisujemy etapowe procedury ekspresji i oczyszczania białek bestrofiny ssaków, rodziny kanałów Cl- aktywowanych przezCa2+.

Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

Tutaj prezentujemy protokoły wykorzystania systemu ekspresji białek komórek owadów i bakulowirusa do produkcji dużych ilości białek wydzielanych przez rośliny do krystalizacji białek. Wektor ekspresyjny bakulowirusa został zmodyfikowany za pomocą GP67 lub peptydu sygnałowego hemoliny owadów w celu ekspresji wydzielania białek roślinnych w komórkach owadów.

Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

Opisujemy metodę charakterystyki transporterów błonowych napędzanych protonami w preparatach pęcherzyków błonowych wytwarzanych przez heterologiczną ekspresję w E. coli i lizę komórek za pomocą prasy francuskiej.

Charakterystyka transporterów błonowych przez ekspresję heterologiczną u E. coli i wytwarzanie pęcherzyków błonowych

Tutaj prezentujemy przebieg procesu ekspresji, oczyszczania i wiązania liposomów heterodimerów SNX-BAR w drożdżach.

Ekspresja, oczyszczanie i wiązanie liposomów pączkujących heterodimerów SNX-BAR drożdży

Nanociała są ważnymi narzędziami w biologii strukturalnej i stanowią ogromny potencjał dla rozwoju terapii. Jednak wybór nanociał o właściwościach hamujących może być wyzwaniem. W tym miejscu demonstrujemy zastosowanie elektrofizjologii opartej na membranie podpartej ciałem stałym (SSM) do klasyfikacji nanociał hamujących i niehamujących ukierunkowanych na elektrogeniczne transportery błonowe.

Wybór nanociał hamujących ukierunkowanych na transporter za pomocą elektrofizjologii opartej na membranie podpartej ciałem stałym (SSM)

Badania strukturalne i biochemiczne ludzkich transporterów błonowych wymagają miligramowych ilości stabilnego, nienaruszonego i jednorodnego białka. W tym miejscu opisujemy skalowalne metody badań przesiewowych, ekspresji i oczyszczania ludzkich transporterów nośników substancji rozpuszczonych przy użyciu genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów.

Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

Ten protokół opisuje ulepszoną metodę oczyszczania SERCA, która obejmuje trehalozę disacharydową w końcowym etapie wirowania. Węglowodan ten stabilizuje białka w trudnych warunkach. Oczyszczone SERCA było aktywne katalitycznie i wykazywało wysoką czystość, dzięki czemu nadawało się do badań strukturalnych i funkcjonalnych.

Oczyszczanie siateczki sarko-endoplazmatycznej Ca2+-ATPazy z mięśni królika

Poznaj metodę ekspresji, solubilizacji i oczyszczania eukariotycznych transporterów boranu z wykorzystaniem drożdży Saccharomyces cerevisiae. Protokół obejmuje chromatografię afinityczną i ocenę zespołu multimerowego.

Ekspresja, solubilizacja i oczyszczanie eukariotycznych transporterów boranu

Przeglądaj więcej filmów