Name: V3 Bezbarwny przepływ pracy dla praktycznej, wygodnej i niezawodnej kontroli całkowitego obciążenia białkami w Western blotting (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Poznaj metodę V3 Western blotting z wykorzystaniem żeli stain-free do niezawodnej normalizacji białek całkowitych. Technika ta zapewnia wygodną i przejrzystą kontrolę obciążenia próbek bez konieczności stosowania białek housekeeping.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Wolf-Dieter Stalz, Dr. Arnaud Remy, Dr. Anton Posch, Dr. Patricia Piatti, Tom Davies, Kris Simonyi i Jeff Durban za ich krytyczną recenzję i redakcję tego manuskryptu. Autorzy dziękują również Allison Schwartz za wsparcie techniczne.

1. Przygotowanie próbki białka
(Opisana jest typowa procedura ekstrakcji białek z hodowli komórkowej)
<ol>
	<li>Umieść naczynie do hodowli komórek HeLa w lodzie i umyj komórki lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanym Tris (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl).</li>
	<li>Odessać TBS, a następnie dodać 1 ml na 100 mm lodowatego buforu RIPA na 100 mm (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% deoksycholanu sodu, 0,1% SDS) uzupełnionego inhibitorami fosfatazy i proteazy.</li>
	<li>Zeskrob przylegające komórki z naczynia za pomocą zimnego plastikowego skrobaka do komórek; delikatnie przenieś zawiesinę komórek do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Utrzymywać stałe mieszanie przez 30 minut w temperaturze 4 °C na rotatorze.</li>
	<li>Wirować z prędkością 16 000 x g przez 20 minut w wirówce schłodzonej o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij probówkę z wirówki i umieść na lodzie. Przenieść supernatant do świeżej probówki trzymanej na lodzie i wyrzucić osad.</li>
	<li>Usuń niewielką objętość (10-20 μl) lizatu, aby przeprowadzić test białka. Określić stężenie białka dla każdej próbki za pomocą zestawu do oznaczania RC DC.</li>
	<li>W razie potrzeby należy podzielić próbki białka na porcje do długotrwałego przechowywania w temperaturze -20 °C. Powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania powodują degradację białek i należy ich unikać.</li>
	<li>Weź około 20 μg każdej próbki, dodaj równą objętość 2x buforu do próbek Laemmli (4% SDS, 10% 2-merkaptoetanol, 20% glicerol, 0,004% błękitu bromofenolowego, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8).</li>
	<li>Podgrzewać każdy lizat komórkowy w buforze próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Wirować przy 16 000 x g w mikrowirówce przez 1 min.</li>
</ol>
2. Elektroforeza żelowa z żelami bez plam (~30 min)
<ol>
	<li>Weź Criterion TGX Any KD bez plam żel do prefabrykatów (żel w formacie midi), usuń grzebień i taśmę z dna kasety.</li>
	<li>Umieść kasetę w komórce Criterion i napełnij zintegrowaną górną komorę buforową 60 ml buforu bieżącego (25 mM Tris, 190 mM glicyny, 0,1% SDS, pH 8,3). Przepłukać studzienki bieżącym buforem.</li>
	<li>Napełnić każdą połowę dolnego zbiornika buforowego 400 ml buforem bieżącym do oznaczonej linii napełniania.</li>
	<li>Załadować próbki białek i odpowiednie markery białkowe.</li>
	<li>Umieść pokrywę na zbiorniku, wyrównując oznaczone kolorami wtyki bananowe z odpowiednimi gniazdami na pokrywie.</li>
	<li>Uruchom żel na ~30 min przy 200 V lub 20 min przy 300 V.</li>
</ol>
3. Obrazowanie żelu bez plam za pomocą systemu Chemidoc MP do sprawdzenia jakości separacji białek (~5 min)
<ol>
	<li>Wyjmij kasetę z żelem z ogniwa. Użyj narzędzia do otwierania kasety z żelem w pokrywie Criterion Cell, aby otworzyć kasetę i uwolnić żel.</li>
	<li>Nałóż kilka mililitrów wody na środek tacki na próbki UV imagera ChemiDoc MP. Ostrożnie wyjmij żel z kasety i umieść go na tacy.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie Image Lab i przechwyć obraz żelu bez plam (rysunek 1A) z następującymi ustawieniami: 
	Zastosowanie: żel bezplamiący 
	Czas aktywacji żelu: 1 min 
	Obszar obrazowania: żel kryterialny 
	Czas naświetlania obrazu: automatycznie optymalizowany dla najbardziej intensywnych pasm</li>
	<li>Wyjmij żel z tacki na próbkę i natychmiast przejdź do etapu przenoszenia.</li>
</ol>
4. Transfer białka za pomocą systemu Trans-Blot Turbo (~10 min)
<ol>
	<li>Otwórz zestaw transferowy Trans-Blot Turbo Midi PVDF; umieść dolny stos (który zawiera membranę) na podstawie kasety transferowej.</li>
	<li>Umieść żel na wierzchu membrany, umieść górny stos na żelu i rozwałkuj bąbelki.</li>
	<li>Umieść pokrywę na podstawie kasety i obróć pokrętło, aby ją zablokować.</li>
	<li>Włóż kasetę do wnęki bibuły.</li>
	<li>Rozpocznij transfer, wybierając zaprogramowany program Turbo i wybierając rozmiar żelu Criterion (midi), a następnie naciśnij RUN. Typowy bieg trwa tylko 7 minut.</li>
	<li>Po zakończeniu przenoszenia zdemontuj kanapkę z bibułą i umieść zarówno blot, jak i żel w pojemniku z wodą dejonizowaną.</li>
</ol>
5. Obrazowanie żelu i plam bez plam za pomocą systemu Chemidoc MP w celu sprawdzenia wydajności i jakości transferu białek (~5 min)
<ol>
	<li>Umieść żel po transferze na tacę na próbki w imagerze ChemiDoc MP.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie Image Lab i uchwyć obraz żelu po transferze bez plam (rysunek 1B) z następującymi ustawieniami: 
	Zastosowanie: żel bezplamiący 
	Czas aktywacji żelu: brak 
	Obszar obrazowania: żel kryterialny 
	Czas naświetlania obrazu: taki sam jak czas naświetlania obrazu żelu przed transferem</li>
	<li>Wyjmij żel z tacki na próbkę, a następnie zobrazuj plamę (Rysunek 1C) z następującymi ustawieniami. Utrzymuj plamę mokrą z kilkoma kroplami wody lub TBST podczas obrazowania. 
	Zastosowanie: blot bezplamny 
	Obszar obrazowania: żel kryterialny 
	Czas naświetlania obrazu: automatycznie optymalizowany dla najbardziej intensywnych pasm</li>
	<li>Wyjmij membranę bibułkową z tacki na próbki i umieść ją w pojemniku z TBST (0,1% Tween 20 w TBS).</li>
</ol>
6. Inkubacja przeciwciał
<ol>
	<li>Zablokować, umieszczając blot w roztworze 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w TBST w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Inkubować blot przez noc w temperaturze 4 °C w roztworze zawierającym mysie przeciwciało pierwszorzędowe wzniesione przeciwko pierwszemu białku docelowemu i pierwszorzędowe przeciwciało królika podniesione przeciwko drugiemu białku docelowemu.</li>
	<li>Wylej roztwór zawierający przeciwciało pierwszorzędowe. Następnie umyj blot, mieszając w 20 ml TBST przez 5 minut. Powtórz 4 razy, w sumie 5 prań.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w roztworze przeciwciała drugorzędowego zawierającym sprzężone przeciwciało anty-myszy Kozy Dylight 650 i sprzężone przeciwciało Kozy anty-królika Dylight 549.</li>
	<li>Wylej roztwór zawierający przeciwciało pierwszorzędowe. Następnie umyj blot, mieszając w 20 ml TBST przez 5 minut. Powtórz 4 razy, w sumie 5 prań.</li>
</ol>
7. Obrazowanie i analiza danych za pomocą oprogramowania Image Lab - Całkowita normalizacja białek (~5 min)
<ol>
	<li>Uzyskaj multipleksujący obraz fluorescencyjny plamy (rysunek 1E), otwierając nowy protokół wielokanałowy, konfiguruj trzy kanały fluorescencyjne i uruchamiaj protokół. 
	Kanał 1: 
	Zastosowanie: blot Dylight 650 
	Obszar obrazowania: żel kryterialny 
	Czas naświetlania obrazu: automatycznie optymalizowany dla najbardziej intensywnych pasm 
	Kanał 2: 
	Zastosowanie: blot Dylight 549 
	Obszar obrazowania: żel kryterialny 
	Czas naświetlania obrazu: automatycznie optymalizowany dla najbardziej intensywnych pasm 
	Kanał 3: 
	Zastosowanie: blot bezplamny 
	Obszar obrazowania: żel criterion Czas naświetlania obrazu: automatycznie zoptymalizowany dla najbardziej intensywnych pasm</li>
	<li>Kliknij ikonę Normalizacja w oknie Narzędzie analizy, a następnie kliknij przycisk Tak, aby wykryć pasy ruchu i pasma.</li>
	<li>Wybierz i użyj "Narzędzia pasów i pasów", aby w razie potrzeby dostosować pasy i pasy.</li>
	<li>Wybierz obraz bez plam jako kanał normalizacji.</li>
	<li>Wybierz MW Analysis Tools i przypisz standardowe pasy MW, zaznaczając pola poniżej nich.</li>
	<li>Aby wyświetlić znormalizowane woluminy, kliknij tabelę analizy na pasku narzędzi. Wszystkie obliczenia zostaną wykonane automatycznie przez oprogramowanie, w tym współczynnik normalizacji i znormalizowane objętości. Docelowe wartości intensywności pasma białkowego są teraz dostosowywane do zmian obciążenia białkiem. Pozwoli to na dokładne porównania docelowych białek między próbkami.</li>
</ol>

<ol><li>Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+total+protein+stains+as+loading+controls%3A+an+alternative+to+high-abundance+single-protein+controls+in+semi-quantitative+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting.</a> J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).</li>
<li>Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+four+housekeeping+proteins+in+elderly+patients+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Transm%22%5BJournal%5D)">Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia.</a> J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).</li>
<li>Castaño, Z., Kypta, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Housekeeping+Proteins%3A+Limitations+as+References+During+Neuronal+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Neurosci.+J%22%5BJournal%5D)">Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation.</a> Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).</li>
<li>Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li>
<li>Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+plasma+membrane+Ca-ATPase+and+stromal+interacting+molecule+1+expression+levels+for+Ca2%2B+signaling+in+dystrophic+mdx+mouse+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).</li>
<li>Dittmer, A., Dittmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-actin+is+not+a+reliable+loading+control+in+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis.</a> Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).</li>
<li>Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+carnosine+on+contractile+apparatus+Ca2%2B+sensitivity+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+release+in+human+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers.</a> J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).</li>
<li>Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+expression+and+function+of+erythropoietin+receptors+in+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol.+Dial.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li>
<li>Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Housekeeping+proteins%3A+a+preliminary+study+illustrating+some+limitations+as+useful+references+in+protein+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies.</a> Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).</li>
<li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Housekeeping+genes%3B+expression+levels+may+change+with+density+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).</li>
<li>Gürtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stain-Free+Technology+as+Normalization+Tool+in+Western+Blot+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis.</a> Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).</li>
<li>Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+SYPRO+Ruby-+and+Flamingo-stained+polyacrylamide+gels+to+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis.</a> Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).</li>
<li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).</li>
<li>Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kowalczykowski+SC+BRCA2+is+epistatic+to+the+RAD51+paralogs+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage.</a> DNA Repair. , (2013).</li>
<li>Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+reference+proteins+in+human+placenta%3A+general+protein+stains+are+the+benchmark%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark.</a> Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).</li>
<li>Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+temperature%2C+oxidative+stress%2C+and+phosphorylation+on+binding+of+heat+shock+proteins+in+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).</li>
<li>Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Novel+Oligomerization+Disrupting+Mutation+in+CRY%CE%91A+Associated+with+Congenital+Cataract+in+a+South+Australian%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRYΑA Associated with Congenital Cataract in a South Australian.</a> , (2012).</li>
<li>Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+rice+reference+proteins+for+western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of rice reference proteins for western blotting.</a> J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).</li>
<li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li>
<li>Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+varies+with+age+in+glycolytic+muscles+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).</li>
<li>Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-glutathionylation+of+troponin+I+%28fast%29+increases+contractile+apparatus+Ca2%2B+sensitivity+in+fast-twitch+muscle+fibres+of+rats+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans.</a> J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).</li>
<li>Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).</li>
<li>Neill, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+Data+are+not+created+Equal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">All Data are not created Equal.</a> J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).</li>
<li>Pérez-Pérez, R., López, J. A., García-Santos, E., Camafeita, E., Gómez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fernández-Real, J. M., Peral, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+suitable+reference+proteins+for+expression+studies+in+human+adipose+tissue+with+relevance+to+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li>
<li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+Pitfalls+of+Internal+Controls%3A+Validation+of+Reference+Genes+for+Analysis+by+qRT-PCR+and+Western+Blot+throughout+Rat+Retinal+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li>
<li>Romero-Calvo, I., Ocón, B., Martínez-Moya, P., Suárez, M. D., Zarzuelo, A., Martínez-Augustin, O., de Medina, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Ponceau+staining+as+a+loading+control+alternative+to+actin+in+Western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots.</a> Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).</li>
<li>Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+GAPDH+regulation+in+tumor-cells+of+different+origin+under+hypoxic+conditions+in-vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro.</a> BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).</li>
<li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots.</a> Exp. Anim. 60 (2), 193-196 (2011).</li>
<li>Welinder, C., Ekblad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+staining+as+loading+control+in+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Coomassie staining as loading control in Western blot analysis.</a> J. Proteome Res. 10 (3), 1416-1419 (2011).</li>
<li>You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+soybean+trypsin+inhibitor+as+an+external+loading+control+for+Western+blot+analysis+of+tear+proteins%3A+application+to+corneal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease.</a> Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).</li>
</ol>

Autorzy, Anton Posch, Jonathan Kohn, Kenneth Oh, Matt Hammond i Ning Liu są pracownikami Bio-Rad Laboratories, Inc.

Opisany powyżej protokół V3 stain-free służy do multipleksowania fluorescencyjnego western blottingu. Może być również stosowany w western blotting przy użyciu detekcji chemiluminescencyjnej. W multipleksowym protokole fluorescencyjnym western blot obrazy plam bez plam są rejestrowane w dwóch punktach czasowych: 1) zaraz po transferze białka; 2) na etapie obrazowania fluorescencyjnego multipleksu po inkubacji przeciwciał. Pierwszy obraz bez plam jest używany do obliczenia wydajności nanoszenia, a drugi obraz bez plam jest używany jako kontrola obciążenia. W przypadku zastosowania metody chemiluminescencyjnej nie jest możliwe wykonanie obrazu multipleksowego dla sygnałów białka wolnego od barwienia i docelowego, ponieważ sygnał chemiluminescencyjny pojawi się również w kanale wolnym od barwienia. W takim przypadku zalecamy użycie obrazu bez plam wykonanego zaraz po etapie transferu białka do kontroli obciążenia i analizy normalizacji.
Zachodni przepływ pracy V3 zapewnia następujące unikalne korzyści w porównaniu z tradycyjnym przepływem pracy western blot, który wykorzystuje białka czyszczące jako elementy sterujące ładowaniem:
Po pierwsze, przepływ pracy V3 zapewnia praktyczną, wygodną i bardziej niezawodną kontrolę ładowania w celu walidacji zmian poziomu białka będącego przedmiotem zainteresowania. Protokół V3 wykorzystuje kontrolę całkowitego obciążenia białka w celu normalizacji poziomu białka będącego przedmiotem zainteresowania mierzonego w każdej próbce. Pozwala to uniknąć dwóch pułapek związanych z używaniem białek porządkowych jako kontroli obciążenia: nasyconej immunodetekcji i niespójnych poziomów ekspresji białek porządkowych wśród próbek w określonych warunkach eksperymentalnych. Etapy usuwania i ponownego sondowania przeciwciałami skierowanymi przeciwko porządkowaniu nie są już konieczne. Korzystając z technologii bezplamowej, nie ma potrzeby barwienia i usuwania plam za pomocą barwników, takich jak Coomassie lub Sypro Ruby, w celu pomiaru całkowitego białka. Uzyskanie obrazu blot zajmuje tylko kilka sekund, a całkowita normalizacja białek zajmuje około 5 minut.
Po drugie, przepływ pracy V3 pozwala naukowcom przejąć lepszą kontrolę nad zachodnią procedurą, ponieważ sprawia, że procedura jest bardziej przejrzysta i wprowadza kilka punktów kontrolnych do kontroli jakości. Za pomocą technologii bezplamistej naukowcy mogą wizualizować próbki białek zarówno na żelu, jak i na bklecie. Naukowcy mogą ocenić integralność próbki białka (zdegradowaną lub nie), jakość separacji (wytrącona lub nie), wydajność transferu i jakość transferu (równomierny transfer lub nie). Te punkty kontrolne pomagają badaniom zakończyć eksperyment w przypadku zauważenia dużych wad w procesie i uniknąć marnowania czasu na słabe próbki i plamy. Technologia ta pomaga również naukowcom ocenić, czy po usunięciu błony dochodzi do znacznej utraty białka i czy plama nadaje się do ponownego zbadania innego celu 4.
Oto kilka wskazówek, jak zapewnić dobre środowisko i jakość danych przy użyciu zachodniego przepływu pracy w wersji 3.
<ol>
	<li>Zobrazuj żel natychmiast po przebiegu żelu. Nie należy moczyć żelu w żadnym buforze przed pierwszym obrazowaniem w procedurze, ponieważ może to zmyć plamę.</li>
	<li>Użyj tego samego obszaru obrazowania, aby uzyskać wszystkie obrazy w protokole. Umożliwi to oprogramowaniu nakładanie obrazów w celu analizy danych, takich jak całkowita normalizacja białek.</li>
	<li>Utrzymuj stały czas naświetlania podczas obrazowania żeli przed transferem i po transferze. Umożliwi to oprogramowaniu ilościowy pomiar wydajności transferu.</li>
	<li>Utrzymuj membranę mokrą z kilkoma kroplami wody lub TBST podczas uzyskiwania obrazu plamy. Pozwoli to uniknąć ewentualnych problemów z zabrudzonym tłem podczas wykrywania białka docelowego.</li>
	<li>Użyj niskofluorescencyjnej membrany PVDF do multipleksowania fluorescencyjnego western blot.</li>
</ol>
Ważne jest, aby pamiętać, że cząsteczka wolna od plam po aktywacji UV jest nieodwracalnie związana z pozostałościami tryptofanu. Ta nieodwracalna modyfikacja może potencjalnie wpływać na rozpoznawanie antygenu podczas stosowania przeciwciał monoklonalnych, jeśli epitop zawiera tryptofan. Jest mało prawdopodobne, aby miało to wpływ na przeciwciała poliklonalne, ponieważ rozpoznają one wiele epitopów na antygenie. Niezwiązane, wolne od plam cząsteczki są łatwo zmywane z żelu i membrany, a zatem nie zakłócają interakcji przeciwciało-antygen.
Podsumowując, zachodni przepływ pracy V3 sprawia, że proces western blot jest szybszy, bardziej przejrzysty, ilościowy i bardziej niezawodny. Naukowcy mogą teraz łatwo zastosować całkowitą kontrolę obciążenia białkami w eksperymencie western blot, aby ich dane były bardziej wiarygodne. Przepływ pracy V3 bez plam został przyjęty przez wiele laboratoriów, a ich publikacje wykazały, że czasopisma akceptują dane wolne od plam jako kontrolę ładowania w western blot22,17,7,8,5,23,18,15.

Western blot jest bardzo przydatną techniką9, jednak istnieją dwa główne wyzwania związane z western blotting: długi i pracochłonny proces oraz jakość danych. Tradycyjny protokół wymaga około 2 dni. Obejmuje wiele etapów, w tym przygotowanie próbki, odlewanie żelu, elektroforezę i transfer białek, blokowanie błony, a następnie inkubację przeciwciał, obrazowanie i dość często stripping, ponowne sondowanie i wreszcie analizę danych. W całym tym procesie nie ma niezawodnych i elastycznych narzędzi do sterowania procesem. W związku z tym błędy mogą być wprowadzane na każdym kroku, a błędy te mogą potencjalnie generować artefakty danych; Dlatego kontrola załadunku jest niezbędna w Western Blotting w celu zidentyfikowania i skorygowania błędów. Kontrola obciążenia odbywa się zwykle poprzez sprawdzenie poziomu białka odniesienia w każdej próbce, aby sprawdzić, czy jest ono równomiernie przedstawione. Ludzie często używają białek porządkowych, takich jak β-aktyna, β-tubulina, GAPDH, jako kontrola ładowania.
Jakość danych western blot zależy od niezawodnej kontroli obciążenia. Istnieją jednak dwie uzasadnione obawy związane z używaniem białek porządkowych do kontroli obciążenia: 1) immunodetekcja oparta na przeciwciałach pasm białkowych porządkowych jest często nasycona i dlatego nie można rozróżnić różnic w obciążeniu między próbkami30; 2) poziom ekspresji białka czyszczącego może się różnić w próbkach w pewnych warunkach eksperymentalnych, na przykład traktowanie siRNA, śmierć komórki, różnicowanie komórek itp.11,28,3,6,10,21. Z powodu tych obaw czasopisma naukowe wymagają obecnie, aby "do porównań ilościowych stosować odpowiednie odczynniki, kontrole i metody obrazowania z liniowymi zakresami sygnałów" (Nature guideline). Podobnie redaktorzy z Journal of Clinical Investigation proszą o bardziej wiarygodną kontrolę załadunku24. Z tych powodów białko do sprzątania musi zostać zatwierdzone, aby można je było wykorzystać do kontroli załadunku. Po pierwsze, należy upewnić się, że jest mierzony w liniowym zakresie dynamicznym metody immunodetekcji14,29. Po drugie, należy upewnić się, że jest ona wyrażona spójnie we wszystkich próbkach26,31,25,19,20.
Alternatywnym rozwiązaniem dla niezawodnej kontroli obciążenia jest użycie pomiaru całkowitej ilości białka z blot. Niektórzy badacze zabarwili bloty całkowitymi barwnikami białkowymi, takimi jak Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S i technologia bez barwienia, aby zmierzyć całkowity sygnał białkowy na każdym pasie jako kontrolę obciążenia16,20,13,27,1,4,12. Całkowita kontrola ładowania białka pozwala uniknąć pułapek związanych z białkami do sprzątania. Po pierwsze, jest to prawdziwe odzwierciedlenie ilości białka załadowanego dla każdej próbki. Po drugie, całkowite barwienie białka wykazuje doskonały liniowy zakres dynamiczny w typowym zakresie obciążenia dla analizy western blot (10-50 μg białka złożonego lizatu komórkowego) i dokładnie różnicuje różnicę obciążenia między próbkami12.
Technologia bez plam to nowatorska metoda barwienia białek całkowitych, w której unikalny związek jest mieszany z roztworem żelu akrylowo-amidowego i równomiernie rozprowadzany w odlewanym żelu. Po zakończeniu elektroforezy żel jest wystawiany na działanie światła UV przez minimum 1 minutę, aby związek barwiący zareagował z resztą tryptofanu w białku. Białka stają się pobudliwe pod wpływem światła UV, dając silny sygnał fluorescencyjny, który można zwizualizować i określić ilościowo w obrazie bez plam, takim jak system ChemiDoc MP. Sam bezplamy związek nie pochłania jednak światła UV, co skutkuje niskim tłem obrazu żelu. Modyfikacja reszt tryptofanu jest nieodwracalna, a białka można uwidocznić nie tylko w żelu, ale także na blot w dowolnym momencie po transferze białka.
Technologia bez plam jest stosowana w V3 Western Workflow (Rysunek 1), aby rozwiązać główne problemy dotyczące tradycyjnego przepływu pracy, szczególnie problemy z używaniem białek do zarządzania obciążeniem. Korzystając z tego przepływu pracy, można: 1) uruchomić żel w około 20-30 minut, 2) sprawdzić integralność próbki i jakość separacji białek w ciągu 5 minut po przebiegu żelu; 3) przenieś białka w ciągu 3-10 minut; 4) sprawdzić ilościowo wydajność transferu; i 5) co najważniejsze, zwaliduj zmiany poziomu białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą kontroli całkowitego obciążenia białka.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silne>ODCZYNNIKI</mocne></td></tr><tr><td>4-20% Kryterium TGX Bezplamy Prefabrykowany żel</td><td>Bio-Rad</td><td>567-8093</td><td>Wybierz rozmiar i procent żelu, które spełniają konkretną potrzebę w eksperymencie</td></tr><tr><td>Zestawy transferowe Trans-Blot Turbo Midi PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4157</td><td>Wybierz PVDF lub nitrocelulozę i dopasuj rozmiar membrany do żelu rozmiar</td></tr><tr><td>Klarowność Western Podłoże ECL, 500 ml </td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Criterion Cell </td><td>Bio-Rad</td><td>165-6100</td><td></td></tr> System <tr><td>rozrusznika Trans-Blot Turbo Transfer </td><td>Bio-Rad</td><td>170-4155</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP System </td><td>Bio-Rad</td><td>170-8280</td><td></td></tr></tbody></table>

v3 bezbarwny przepływ pracy dla praktycznej, wygodnej i niezawodnej kontroli całkowitego obciążenia białkami w western blotting

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

Western blot jest bardzo użyteczną i powszechnie stosowaną techniką laboratoryjną, ale jej wykonanie jest wyzwaniem. Przepływ pracy jest często określany jako "skrzynka", ponieważ eksperymentator nie wie, czy został wykonany pomyślnie, aż do ostatniego z kilku kroków. Co więcej, jakość danych Western Blot jest czasami kwestionowana ze względu na brak skutecznych narzędzi kontroli jakości w całym procesie western blot. W tym miejscu opisujemy zachodni przepływ pracy V3, który wykorzystuje technologię bez plam w celu rozwiązania głównych problemów związanych z tradycyjnym protokołem western blot. Ten przepływ pracy pozwala naukowcom: 1) uruchomić żel w około 20-30 minut; 2) wizualizacja jakości separacji próbki w ciągu 5 minut po przebiegu żelu; 3) do przenoszenia białek w ciągu 3-10 minut; 4) ilościowa weryfikacja efektywności transferu; A co najważniejsze, 5) walidacja zmian poziomu białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu całkowitej kontroli obciążenia białkiem. To nowatorskie podejście eliminuje potrzebę usuwania i ponownego sondowania blot w poszukiwaniu białek porządkowych, takich jak β-aktyna, β-tubulina, GAPADH itp. Przepływ pracy bez plam V3 sprawia, że proces western blot jest szybszy, przejrzysty, bardziej ilościowy i niezawodny.

1. Ocena integralności próbki, jakości rozdzielenia białek oraz wydajności transferu na podstawie obrazów żeli bezbarwnych (stain-free).
Ekstrakt białkowy z komórek HeLa rozdzielono przy 300 V przez 20 min na 18-dołkowym żelu Criterion AnyKD TGX stain-free. Próbki białek naniesiono 3x w czterech różnych ilościach (ścieżki 1-3, 40 μg; ścieżki 4-6, 30 μg; ścieżki 7-9, 20 μg; ścieżki 10-12, 10 μg). Żel aktywowano światłem UV przez 1 min. Rycina 2A przedstawia obraz żelu uzyskany bezpośrednio po rozdzieleniu białek. Na tym obrazie można wizualnie ocenić integralność próbek białkowych (np. degradację) oraz jakość rozdzielenia (np. precypitację białek). Następnie białka przeniesiono przez 7 min na membranę nitrocelulozową przy użyciu systemu Trans-Blot Turbo. Rycina 2B przedstawia obraz stain-free żelu po transferze. Oba obrazy uzyskano przy tym samym czasie ekspozycji (6,8 sec). Do pomiaru wydajności transferu wybrano ścieżki 3 i 12. Za pomocą narzędzia do pomiaru objętości w oprogramowaniu Image Lab narysowano prostokątne ramki (niebieskie), obejmujące ścieżki 3 i 12 na obu obrazach żelu. Obliczenia oparte na wartościach objętości z tych ramek wykazały, że wydajność transferu dla obu ścieżek wyniosła 80% (Rycina 2C). W tym doświadczeniu żel AnyKD TGX wybrano do badania docelowych białek o małej i średniej wielkości i nie był on optymalizowany pod kątem transferu dużych białek. Optymalizacja wydajności transferu wymagałaby zastosowania żelu o niższym stężeniu (np. 4-20%) i/lub dostosowania czasu transferu w celu ułatwienia przenoszenia dużych białek. 2. Kontrola załadunku całkowitego białka metodą stain-free jest wiarygodną alternatywą dla kontroli załadunku białek referencyjnych (housekeeping) w western blottingu w celu kwantyfikacji niewielkich zmian w poziomie badanego białka.
MCM-7 jest czynnikiem licencjonującym replikację DNA, którego poziom w liniach komórkowych limfoblastoidalnych (LCL) spada o 20-50% po naświetlaniu. W tym eksperymencie lizaty (po 30 μg każdego) z czterech kultur linii komórkowych limfoblastoidalnych (LCL) – kontrolnych oraz poddanych naświetlaniu – rozdzielono na 12-dołkowym żelu Criterion AnyKD TGX stain-free. Żel aktywowano przez 1 min pod światłem UV, a następnie przeniesiono za pomocą systemu Trans-Blot Turbo na membranę PVDF w celu przeprowadzenia immunoblottingu. Białko referencyjne GAPDH (zielone) wykryto za pomocą przeciwciała króliczego (Cell Signaling Technology, USA, 1:2,500) oraz koniugowanego z Dylight 549 przeciwciała koziego anty-króliczego (Rockland, USA, 1:20,000). Analizowane białko MCM-7 (czerwone) wykryto przy użyciu przeciwciała mysiego (Abcam, USA, 1:1,000) oraz koniugowanego z Dylight 649 przeciwciała koziego anty-mysiego (Rockland, 1:10,000).
Rycina 3A przedstawia wielokolorowy obraz fluorescencyjny białek całkowitych (niebieski), MCM-7 (czerwony) i GAPDH (zielony) wykrytych w czterech kontrolnych i napromieniowanych próbkach LCL. Rycina 3B to obraz bezbarwnika (stain-free) z tego samego transferu, ukazujący wzorce białek całkowitych w każdej próbce (30 μg). Oprogramowanie Image lab wyznaczyło ścieżki próbek (niebieskie ramki) w celu pomiaru objętości pasm MCM-7, GAPDH i białek całkowitych w każdej ścieżce. Poziomy MCM-7 znormalizowano względem pomiaru całkowitej ilości białka metodą stain-free lub względem GAPDH. Znormalizowane poziomy białka MCM-7 poddano analizie statystycznej, a średnią objętość pasma białka MCM-7 oraz odchylenie standardowe (n=4) przedstawiono na wykresie (Rycina 3C). Obie metody normalizacji wykazały niewielki spadek (około 25%) poziomu białka MCM-7 po napromieniowaniu. Dane z normalizacją do białek całkowitych wykazały mniejsze odchylenie standardowe niż dane z użyciem GAPDH jako kontroli załadunku.
<img alt="Schemat przepływu pracy elektroforezy; obrazowanie żelu TGX, transfer białek, inkubacja z przeciwciałami, wyniki danych." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przepływ pracy V3 Western. Przepływ pracy V3 przedstawiono w lewej kolumnie w 4 krokach. Główne instrumenty i odczynniki użyte w tym procesie są pokazane na każdym etapie. Uwzględniono również szacowany czas trwania każdego kroku. Prawa kolumna pokazuje, że w przepływie pracy V3 można wygenerować minimum 4 obrazy. Opisano zastosowanie każdego zestawu danych. Obrazy stain-free żelu przed transferem, żelu po transferze oraz membrany (A, B, C) nie mogą być łatwo uzyskane przy użyciu tradycyjnych technik western blotting; obrazy i dane te dostarczają ważnych informacji i punktów kontrolnych w trakcie procedury, co zwiększa kontrolę naukowca oraz powtarzalność przepływu pracy western blot. Sygnały białka docelowego mogą zostać zarejestrowane albo na obrazie membrany chemiluminescencyjnej (D), jeśli w detekcji zastosowano przeciwciało wtórne sprzężone z HRP, albo na obrazie membrany fluorescencyjnej (E), jeśli przeprowadzono multipleksowy western blotting fluorescencyjny w celu jednoczesnego wykrycia więcej niż jednego białka docelowego na tej samej membranie. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Obrazy żeli stain-free przed i po transferze; wydajność transferu białek; dane ilościowe." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Obrazy żeli stain-free przed i po transferze w procedurze V3 western w celu oceny integralności próbek, jakości rozdziału oraz wydajności transferu. (A) Obraz żelu stain-free przed transferem. (B) Obraz żelu stain-free po transferze. (C) Pomiar wydajności transferu białek.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Schemat fluorescencyjnego western blotu, blot bezbarwny, analiza poziomu białka MCM-7, efekty napromieniowania." fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Porównanie pomiaru całkowitego białka metodą stain-free z immunodetekcją GAPDH jako kontroli załadunku do normalizacji poziomu badanego białka. (A) Obraz fluorescencyjnego western blotu. (B) Obraz blotu stain-free. (C) Znormalizowane poziomy białka MCM-7. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>

V3 to procedura western blot z użyciem żeli bez plam. Technologia bezbarwna pozwala naukowcom na wizualizację jakości separacji białek, weryfikację wydajności transferu, a co najważniejsze, walidację zmiany w białku będącym przedmiotem zainteresowania przy użyciu całkowitej kwantyfikacji białka jako niezawodnej kontroli obciążenia.

V3 Bezbarwny przepływ pracy dla praktycznej, wygodnej i niezawodnej kontroli całkowitego obciążenia białkami w Western blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

Procedura BioRad V three zapewnia badaczom bardziej wiarygodną kwantyfikację oraz pewność procesu Western blotting. Osiąga się to poprzez zastosowanie żeli TGX stain free w celu rozdziału i wizualizacji próbek białek. Po rozdziału białka są przenoszone na membranę przy użyciu systemu szybkiego transferu blot turbo, który umożliwia weryfikację jakości i wydajności transferu.Po zweryfikowaniu transferu membranę blokuje się i inkubuje z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi przeciwko białkom docelowym. Na koniec poziomy białek docelowych są normalizowane przy użyciu pomiaru całkowitej ilości białka metodą stain-free jako kontroli załadunku. Workflow V three zapewnia wygodę i przejrzystość procesu western blottingu, dając badaczom pewność na każdym etapie – od rozdziału, przez transfer, aż po kwantyfikację.Główną zaletą procedury V three Western w porównaniu do tradycyjnego Westernu jest fakt, że technologia stain free oferuje praktyczną, wygodną i niezawodną kontrolę całkowitego obciążenia białkiem do normalizacji sygnałów białka docelowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące niezawodności metod kontroli obciążenia w technice Western blot, które wiążą się z przesyceniem sygnałów białek referencyjnych oraz różnicami w poziomach ekspresji białek referencyjnych w zależności od warunków eksperymentalnych. Odkryliśmy, że białka aktywowane w żelach stain free mogą być również wizualizowane na membranach bez dalszego barwienia, co pozwala na ich wykorzystanie jako alternatywy dla konwencjonalnego barwienia białek całkowitych, a także dla kontroli obciążenia białkami referencyjnymi.W ciągu najbliższych kilku minut zaprezentujemy pełny schemat postępowania V three z wykorzystaniem fluorescencji multipleksowej. Ta sama procedura może być również zastosowana w przypadku chemiluminescencji po przygotowaniu próbek białek zgodnie z protokołem tekstowym. Używając żelu precast KD criterion TGX stain free, wyjmij grzebień oraz taśmę z dołu kasety.Umieść kasetę w aparaturze do elektroforezy i napełnij oba zbiorniki buforem do prowadzenia. Nanieś standardy białkowe oraz próbki. Następnie prowadź elektroforezę przez 20 minut przy napięciu 300 V.Po zakończeniu elektroforezy należy użyć narzędzia do otwierania kaset żelowych znajdującego się na pokrywie urządzenia Criterion Cell, aby otworzyć kasetę. Następnie należy nanieść kilka mililitrów wody na transluminator UV obrazownika Chemi Dock MP. Ostrożnie wyjmij żel z kasety i umieść go na transluminatorze UV. Uruchom oprogramowanie Image Lab i skonfiguruj nowy protokół jednokanałowy dla żeli bezbarwnych (stain-free), korzystając z domyślnego czasu aktywacji żelu wynoszącego jedną minutę; wybierz odpowiedni typ żelu oraz domyślną autooptymalizację dla intensywnych prążków.Następnie kliknij uruchom protokół. Po zakończeniu przechwytywania obrazu zwizualizuj rozdzielenie i jakość próbki. Następnie niezwłocznie przejdź do etapu przenoszenia.Aby przeprowadzić transfer białek, otwórz zestaw do transferu trans block turbo MIDI PVDF. Umieść dolny stos elementów w centrum podstawy kasety. Wyjmij żel z urządzenia do obrazowania.Ustaw żel na membranie. Delikatnie użyj wałka do transferu, aby usunąć pęcherzyki powietrza pomiędzy żelem a membraną. Następnie ułóż górny stos materiałów na żelu.Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza nałóż pokrywę kasety na podstawę. Mocno dociśnij pokrywę, przekręć pokrętło zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby ją zablokować, a następnie włóż kasetę do jednej z dwóch komór na papier filtracyjny. Z ekranu głównego wybierz protokół turbo.Wybierz dwa żele mini lub jeden żel mini i naciśnij przycisk start dla odpowiedniej komory. Proces transferu zakończy się w ciągu siedmiu minut. Wyjmij kasetę z komory.Otwórz kasetę i rozdziel elementy kanapki do transferu. Umieść żel po transferze na transluminatorze UV obrazera Chemi dock MP, a membranę niezwłocznie przełóż do wody dejonizowanej. Ustaw nowy protokół jednokanałowy dla żeli stain-free bez czasu aktywacji.Wybierz odpowiedni rodzaj żelu, ręcznie ustaw czas ekspozycji taki sam jak dla żelu sprzed transferu i kliknij uruchom protokół. Po zakończeniu przechwytywania obrazu zweryfikuj wydajność transferu, porównując intensywność prążków próbek pomiędzy żelami sprzed i po transferze.Wyjmij żel z tacki na próbki, ponieważ nie jest on już potrzebny, i go zutylizuj. Aby zweryfikować wynik, przejdź do transferu na błonę. Umieść membranę na tacki na próbki i skonfiguruj nowy protokół jednokanałowy.W przypadku analizy blotu bez barwienia należy wybrać odpowiedni typ żelu oraz domyślną autoptymalizację dla intensywnych prążków. Następnie należy kliknąć przycisk uruchom protokół.Po zakończeniu przechwytywania obrazu należy zweryfikować transfer na błonę. Wyjmij błonę z transiluminatora UV i umieść ją w buforze blokującym do western blottingu. Po inkubowaniu błony w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, inkubuj ją z mysimi i króliczymi przeciwciałami pierwotnymi przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia.Odlać roztwór przeciwciał i użyć 50 ml TBST do przemycia blotu przez pięć minut. Inkubować blot z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami wtórnymi przeciwko mysim i króliczym przeciwciałom przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć blot pięciokrotnie przy użyciu TBST, za każdym razem przez pięć minut.Aby zobrazować blot, należy umieścić go na transiluminatorze UV urządzenia Chemi doc MP, korzystając z oprogramowania Image Lab. Skonfiguruj nowy protokół wielokanałowy. Skonfiguruj kanał pierwszy, wybierając opcję dite six 50 w sekcji aplikacji do blotów, i użyj domyślnej autyoptymalizacji dla intensywnych pręg.Powtórz te kroki, aby skonfigurować kanał drugi dla DITE 5 49 oraz kanał trzeci dla stain free blot. Wybierz odpowiedni typ żelu i kliknij run protocol. Aby zdefiniować ścieżki, zaznacz ścieżkę i prążki na obrazie stain free blot.Następnie należy zastosować automatyczne wykrywanie ścieżek w celu dokładnej kwantyfikacji. Należy upewnić się, że profile tła w każdej ścieżce próbki są podobne, ustawiając rozmiar tarczy tocznej (rolling disc size) na 70. Jednolitość tła należy potwierdzić, przeglądając wszystkie profile ścieżek w celu zdefiniowania prążków w kanałach dite six 50 oraz 5 49.Użyj narzędzia do wykrywania prążków (band finder), aby zidentyfikować prążki przy domyślnych ustawieniach czułości. Aby wyznaczyć kanał normalizacji, wróć do skrzynki narzędzi analitycznych. Kliknij normalizację i wybierz stain free blot, upewniając się, że zaznaczono całkowitą zawartość białka w ścieżce (total lane protein).Aby przypisać ścieżki ze standardem masy cząsteczkowej, należy wrócić do skrzynki z narzędziami analitycznymi, kliknąć MW analysis tools i zaznaczyć pole wyboru pod odpowiednią ścieżką. Na koniec, aby wyświetlić znormalizowane intensywności prążków białkowych, należy kliknąć analysis table na pasku narzędzi. Oprogramowanie automatycznie wygeneruje tabelę zawierającą intensywności objętości, czynniki normalizacji oraz objętości znormalizowane.Do analizy danych i raportowania należy używać objętości znormalizowanych. Tabelę można wyeksportować. W celu przeprowadzenia dalszej analizy zaprezentowaliśmy kompletny schemat procedury Western blotting dla V three.W tej części przedstawimy reprezentatywne wyniki z rzeczywistego eksperymentu. Lizaty kontrolnych i napromieniowanych kultur komórek limfoblastów przeanalizowano przy użyciu procedury V three Western blot. Sygnał całkowitego białka w metodzie stain-free jest wyświetlony w kolorze niebieskim.Białko docelowe M CM seven pokazano na czerwono, a zwalidowaną kontrolę ładowania białka gospodarza GA DH pokazano na zielono. GA DH zostało zwalidowane jako odpowiednia kontrola ładowania poprzez ocenę jego liniowości w warunkach doświadczalnych opisanych w tym filmie. Sygnały całkowitego białka stain-free dla każdej ścieżki na blocie zostały zmierzone przy użyciu oprogramowania image lab.Intensywności sygnałów MCM7 znormalizowano przy użyciu zarówno całkowitej ilości białka, jak i sygnałów GADHs. Objętości prążków białka MCM7 znormalizowane obiema metodami wykazały 25% spadek poziomów ekspresji w próbkach napromieniowanych w stosunku do próbek kontrolnych przed przeprowadzeniem dokładnej normalizacji. Białko referencyjne wymaga walidacji potwierdzającej jego zakres liniowy oraz stałe poziomy ekspresji pomiędzy próbkami w przypadku braku walidacji.Kontrole ładowania oparte na białkach pomocniczych (housekeeping protein) nie gwarantują dokładnej normalizacji. W przeciwieństwie do nich, normalizacja całkowita białka nie wymaga walidacji. Zatem sygnał całkowitego białka uzyskiwany metodą stain-free w ramach procedury V three stanowi praktyczną, wygodną i bardziej wiarygodną kontrolę ładowania podczas wykonywania tej procedury.Należy pamiętać, że technologia stain-free umożliwia fluorescencyjną wizualizację próbek białek poprzez indukowaną promieniami UV modyfikację kowalencyjną dostępnych reszt tryptofanu. Tylko w rzadkich przypadkach modyfikacja ta ma istotny wpływ na dalsze zastosowania, takie jak detekcja immunologiczna czy spektrometria mas. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania procedury V three Western oraz normalizacji całkowitej ilości białka metodą stain-free.Chociaż zaprezentowano ten schemat postępowania dla multipleksowego fluorescencyjnego Westernu, technologię bezbarwną (stain-free) można również wykorzystać do normalizacji całkowitego białka w luminescencyjnych analizach Western blot.

v3-stain-free-workflow-for-practical-convenient-reliable-total

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przepływ bez plam V3 dla praktycznego, wygodnego i niezawodnego kontrolnego ładowania białka całkowitego w Western Blotting

Niniejszy artykuł techniczny opisuje standardową procedurę western-blottingu z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego systemu elektroforezy Mini-Gel NuPAGE firmy Invitrogen.

Western blotting z wykorzystaniem żeli Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Po rozdzieleniu metodami elektroforetycznymi białka w żelu można wykryć za pomocą kilku metod barwienia. W niniejszym filmie zaprezentowano barwienie białek błękitem Coomassie, barwienie srebrem, SYPRO Orange oraz SYPRO Ruby.

Barwienie białek w żelach

Western blotting to technika analityczna stosowana do wykrywania specyficznych białek w danej próbce homogenatu lub ekstraktu tkankowego.

Western blotting: od przygotowania próbki do detekcji

Film demonstruje technikę western blottingu opartą na normalizacji całkowitego białka do ilościowego określania docelowej ekspresji białka w próbce. Wykorzystując całkowite barwienie białka w próbce, przeprowadza się analizę ratiometryczną w celu określenia względnego poziomu ekspresji białka docelowego.

Ilościowe Western Blot w celu oszacowania poziomów ekspresji białka

Ten film opisuje oparte na chemiluminescencji western blot immunoprecypitowanych lizatów. Technika ta pomaga określić przetwarzanie i aktywację białek. Wykryty sygnał chemiluminescencyjny jest proporcjonalny do poziomu przetworzenia białka podczas jego aktywacji.

Chemiluminescencyjny test Western Blot do przetwarzania białek

Ten protokół bada najnowsze osiągnięcia w przeprowadzaniu analiz Western blot. Te nowatorskie modyfikacje wykorzystują system żelowy Bis-Tris z 35-minutowym czasem trwania elektroforezy, 7-minutowy system suchego transferu blottingu oraz wykrywanie i obrazowanie białek fluorescencyjnych w podczerwieni, które generują wyższą rozdzielczość, jakość, czułość i lepszą dokładność danych zachodnich.

Najszybszy western w mieście: współczesna wariacja na temat klasycznej analizy Western Blot

Postęp western blottingu za pomocą fluorescencji pozwolił na wykrycie subtelnych zmian w ekspresji białek, umożliwiając analizy ilościowe. W tym miejscu opisujemy solidną metodologię wykrywania szeregu białek w różnych gatunkach i typach tkanek. Zapewniona jest również strategia przezwyciężania typowych problemów technicznych.

Przewodnik po nowoczesnym ilościowym fluorescencyjnym Western Blotting ze strategiami rozwiązywania problemów

Ta metoda opisuje solidne i powtarzalne podejście do porównywania poziomów białek w różnych tkankach i w różnych punktach czasowych rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego podejścia western blotting.

Solidne porównanie poziomów białka w tkankach i podczas całego rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego Western blotting

Technika ultra-szybkiego western blottingu jest rozwijana poprzez poprawę kinetyki wiązania antygen-przeciwciało poprzez technologię cyklicznego drenowania i uzupełniania (CDR) w połączeniu ze środkiem wzmacniającym immunoreakcję.

Ultra-High-Speed Western Blot przy użyciu technologii wzmacniającej immunoreakcję

Zadanie chodzenia po szczeblach drabiny jest nowym testem służącym do oceny umiejętności chodzenia oraz pomiaru precyzji stawiania kończyn przednich i tylnych, kroku oraz koordynacji między конечноściami.

Zadanie chodzenia po szczeblach drabiny: system punktacji i jego praktyczne zastosowanie.

Poznaj metodę V3 Western blotting z wykorzystaniem żeli stain-free do niezawodnej normalizacji białek całkowitych. Technika ta zapewnia wygodną i przejrzystą kontrolę obciążenia próbek bez konieczności stosowania białek housekeeping.

V3 Bezbarwny przepływ pracy dla praktycznej, wygodnej i niezawodnej kontroli całkowitego obciążenia białkami w Western blotting

Przeglądaj więcej filmów