V3 Bezbarwny przepływ pracy dla praktycznej, wygodnej i niezawodnej kontroli całkowitego obciążenia białkami w Western blotting

BioRad V three Workflow zapewnia naukowcom bardziej wiarygodną ocenę ilościową i pewność w procesie Western blot. Osiąga się to poprzez uprzednie użycie bezplamistych żeli TGX do oddzielenia i wizualizacji próbek białek. Po rozdzieleniu białka są przenoszone do błony za pomocą systemu szybkiego transferu blot turbo, który umożliwia weryfikację jakości i wydajności transferu.

Po zweryfikowaniu transferu błona jest blokowana i sondowana za pomocą pierwszorzędowych i drugorzędowych przeciwciał dla białek docelowych. Wreszcie, docelowe poziomy białka są normalizowane przy użyciu pomiaru całkowitego białka bez plam jako kontroli obciążenia. Przepływ pracy V three zapewnia wygodę i przejrzystość procesu western blotting, zapewniając naukowcom pewność na każdym etapie, od separacji po transfer i ocenę ilościową.

Główną zaletą przepływu pracy V three Western w porównaniu z tradycyjnym Western blotting jest to, że technologia bez plam oferuje praktyczną, wygodną i niezawodną kontrolę całkowitego obciążenia białka w celu normalizacji docelowych sygnałów białkowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z niezawodnością metodologii kontroli obciążenia dla techniki Western blotting, które obejmują przesycenie sygnałów białkowych porządkowych i zróżnicowane poziomy ekspresji białek porządkowych w różnych warunkach eksperymentalnych. Odkryliśmy, że białka aktywowane w żelach bezbarwnych mogą być również wizualizowane na blos bez dalszego barwienia, co pozwala na ich stosowanie jako alternatywy dla konwencjonalnych barwień białka całkowitego, a także jako kontrolę obciążenia białek w domu.

W ciągu najbliższych kilku minut zademonstrujemy pełny przepływ pracy V three przy użyciu fluorescencji multipleksowej. Ta sama procedura może być również stosowana w przypadku chemiluminescencji po przygotowaniu próbek białek zgodnie z protokołem tekstowym. Używając criterion TGX bez plam dowolnego żelu prefabrykowanego KD, usuń grzebień i taśmę z dna kasety.

Umieść kasetę w aparacie żelowym i napełnij oba zbiorniki pracującymi. Załaduj wzorce białek i próbki. Następnie uruchom żel przez 20 minut przy napięciu 300 woltów.

Po zakończeniu elektroforezy użyj narzędzia do otwierania kasety z żelem na pokrywie ogniwa Criterion, aby otworzyć kasetę. Następnie nanieś kilka mililitrów wody na transluminator UV imagera Chemi Dock MP. Ostrożnie wyjmij żel z kasety i umieść go w oprogramowaniu UV Trans Illuminator Launch Image Lab i skonfiguruj nowy jednokanałowy protokół dla żeli bez plam, używając domyślnego jednominutowego czasu aktywacji żelu, wybierz odpowiedni rodzaj żelu i domyślną automatyczną optymalizację dla intensywnych pasm.

Następnie kliknij uruchom protokół. Po zakończeniu przechwytywania obrazu zwizualizuj separację i jakość próbki. Następnie natychmiast przejdź do kroku przelewu.

Aby przeprowadzić transfer białka, otwórz pakiet transferowy trans block turbo MIDI PVDF. Umieść dolny stos na środku podstawy kasety. Usuń żel z termowizora.

Wyrównaj żel na wierzchu membrany. Delikatnie użyj wałka do bibuły, aby usunąć pęcherzyki powietrza między żelem a membraną. Następnie wyrównaj górny stos na wierzchu żelu.

Po usunięciu wszelkich pęcherzyków powietrza umieść pokrywę kasety na podstawie. Mocno dociśnij pokrywę, przekręć pokrętło zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zablokować i włóż kasetę do jednej z dwóch wnęk bibuły. Na ekranie głównym wybierz protokół turbo.

Wybierz dwa mini lub jeden mini żel i naciśnij przycisk uruchamiania, aby uzyskać odpowiednią wnękę. Transfer zostanie zakończony w ciągu siedmiu minut. Wyjmij kasetę z wnęki.

Odblokuj kasetę i zdemontuj kanapkę z bibułą. Umieść żel po transferze na transluminatorze UV imagera Chemi dock MP i natychmiast umieść membranę w wodzie dejonizowanej. Skonfiguruj nowy protokół jednokanałowy dla żeli bezplamych bez czasu aktywacji.

Wybierz odpowiedni rodzaj żelu i ręcznie ustaw czas ekspozycji na czas żelu przed transferem, a następnie kliknij przycisk Uruchom protokół. Po zakończeniu przechwytywania obrazu. Sprawdź wydajność transferu, porównując intensywność pasma próbki między żelami przed i po transferze.

Wyjmij żel z tacki na próbki, ponieważ nie jest już potrzebny, i wyrzuć. Aby to zweryfikować, przenieś się do kleksa. Umieść membranę na tacy na próbkę i skonfiguruj nowy protokół jednokanałowy.

Do plam bez plam. Wybierz odpowiedni rodzaj żelu i domyślną automatyczną optymalizację dla intensywnych pasm. Następnie kliknij uruchom protokół.

Po zakończeniu przechwytywania obrazu sprawdź transfer do membrany. Usuń błonę blot z oświetlacza UV trans i umieść ją w buforze blokującym do western blotting. Po inkubacji błony w temperaturze pokojowej przez godzinę, należy ją inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami mysimi i króliczymi przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia.

Wylej roztwór przeciwciała i użyj 50 mililitrów TBST do przemywania bleksu przez pięć minut. Inkubować blot z fluorescencyjnymi sprzężonymi, anty muse i anty króliczymi przeciwciałami drugorzędowymi przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie użyj TBST, aby umyć blot pięć razy przez pięć minut każdy.

Aby zobrazować plamę, umieść ją na oświetlaczu UV trans imagera Chemi doc MP w oprogramowaniu laboratorium obrazowego. Skonfiguruj nowy protokół wielokanałowy. Skonfiguruj kanał pierwszy, wybierając dite six 50 pod aplikacjami blot i użyj domyślnej automatycznej optymalizacji dla intensywnych pasm.

Powtórz te kroki, aby skonfigurować kanały drugi i trzeci odpowiednio dla DITE 5, 49 i plam bez plam. Wybierz odpowiedni typ żelu i kliknij przycisk Uruchom protokół. Aby zdefiniować pasy ruchu, wybierz pas obrazu plam bez plam i pasma.

Następnie automatyczny wykrywacz pasa ruchu w celu dokładnej oceny ilościowej. Upewnij się, że profile tła na każdym torze pobierania próbek są podobne, dostosowując rozmiar tarczy tocznej do 70. Potwierdź jednorodność tła, skanując wszystkie profile pasów ruchu, aby zdefiniować pasma zarówno w kanałach dite six 50, jak i 5 49.

Użyj narzędzia do wyszukiwania pasm, aby wykryć pasma przy użyciu domyślnych ustawień czułości. Aby wyznaczyć kanał normalizacji, wróć do przybornika analizy. Kliknij Normalizacja i wybierz plamy bez plam, upewniając się, że wybrane jest całkowite białko pasa.

Aby przypisać powrót do standardowych pasów masy cząsteczkowej do przybornika analizy, kliknij Narzędzia do analizy MW i zaznacz pole wyboru pod odpowiednim pasem. Na koniec, aby wyświetlić znormalizowane intensywności pasm białkowych, kliknij tabelę analizy na pasku narzędzi. Oprogramowanie automatycznie wygeneruje tabelę zawierającą intensywność głośności, współczynniki normalizacji i znormalizowane objętości.

Znormalizowane woluminy powinny być używane do analizy danych i raportowania. Tabelę można wyeksportować. W celu dalszej analizy zademonstrowaliśmy kompletny przebieg pracy z V trzy Western blot.

Teraz pokażemy Ci reprezentatywne wyniki z prawdziwego eksperymentu. Lizaty hodowli komórkowych kontrolnych i napromieniowanych limfoblastów analizowano przy użyciu przepływu pracy V three Western blot. Sygnał białka całkowitego bez barwienia jest wyświetlany na niebiesko.

Białko docelowe M CM siedem jest pokazane na czerwono, a zwalidowana kontrola obciążenia białka porządkowego GA DH jest pokazana na zielono. GA DH został zatwierdzony jako odpowiednia kontrola obciążenia poprzez ocenę jego liniowości przy użyciu warunków eksperymentalnych opisanych w tym filmie. Wolne od barwienia sygnały białka całkowitego dla każdego pasa na plamie mierzono za pomocą oprogramowania do laboratorium obrazowego.

Intensywność sygnału MCM siedem została znormalizowana przy użyciu zarówno białka całkowitego, jak i sygnałów GA DH. Objętości siedmiu prążków białkowych MCM znormalizowanych obiema metodami wykazały o 25% zmniejszone poziomy ekspresji w napromieniowanych próbkach w porównaniu z próbkami kontrolnymi przed dokładną normalizacją. Białko porządkowe wymaga walidacji potwierdzającej jego liniowy zakres i spójne poziomy ekspresji wśród próbek bez walidacji.

Kontrole obciążenia białkami w gospodarstwie domowym nie gwarantują dokładnej normalizacji. Natomiast normalizacja białka całkowitego nie wymaga walidacji. W ten sposób wolny od barwników sygnał białka całkowitego uzyskany przez przepływ pracy V trzy zapewnia praktyczną, wygodną i bardziej niezawodną kontrolę obciążenia podczas próby tej procedury.

Należy pamiętać, że technologia stainless pozwala na fluorescencyjną wizualizację próbek białek poprzez kowalencyjną modyfikację dostępnych reszt tryptofanu wywołaną promieniowaniem UV. Tylko w rzadkich przypadkach modyfikacja ta znacząco wpłynie na dalsze zastosowania, takie jak detekcja immunologiczna lub spektrometria mas. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić przepływ pracy V 3 Western i normalizację białka całkowitego bez plam.

Chociaż zademonstrowaliśmy ten przepływ pracy dla multipleksowego fluorescencyjnego Western blot, technologia bezbarwna może być również stosowana do całkowitej normalizacji białek za pomocą luminescencyjnych plam zachodnich.