Name: Ultra-High-Speed Western Blot przy użyciu technologii wzmacniającej immunoreakcję (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Poznaj technikę ultra-szybkiego western blotu z wykorzystaniem technologii CDR i czynnika wzmacniającego immunoreakcję. Cały proces trwa zaledwie 20 minut bez utraty czułości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Division of Intramural Research, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health. S.H. był wspierany przez Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program, a H.N. i K.Y. byli wspierani przez Valor and V Drug Overseas Training Scholarship.

1. SDS-PAGE i przenieść na membranę PVDF
<ol>
	<li>Wykonaj SDS-PAGE, aby oddzielić białka na podstawie względnej wielkości. 
	UWAGA: Każdy komercyjny lub domowy system żelowy jest w porządku. Prosimy o postępowanie zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Przenieść oddzielone białka z żelu na membranę PVDF. 
	UWAGA: Odpowiednie są popularne metody transferu (transfer półsuchy lub mokry). Prosimy o postępowanie zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
2. Blokowanie membran PVDF
<ol>
	<li>Inkubować błony w odpowiednich blokujących przez 1 godzinę z mieszaniem w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: W zależności od przeciwciała pierwotnego i systemu detekcji należy dobrać odpowiedni bufor blokujący. Na przykład najbardziej typowymi blokerami są BSA, odtłuszczone mleko w proszku, kazeina i komercyjne polimery syntetyczne. Najczęściej używanymi są PBS i/lub TBS z 0,1% Tween20. Ten etap blokowania można wykonać przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Inkubacja z pierwotnym przeciwciałem
<ol>
	<li>Przygotować 10% roztwór czynnika wzmacniającego odczyn immunologiczny-1 (IRE-1) z wodą destylowaną. Dobrze wirować.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe z 10% IRE-1. Wymieszaj go delikatnie i dokładnie.</li>
	<li>W przypadku stosowania większej membrany (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm) dodaj 8 ml roztworu przeciwciała do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. W przypadku stosowania mniejszej membrany (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm) dodaj 3 ml roztworu przeciwciała do 14 ml okrągłodennej probówki polipropylenowej (tabela materiałów).</li>
	<li>Podnieś membranę PVDF pęsetą i krótko spuść roztwór blokujący. Włóż membranę PVDF do tej rurki palcami w rękawiczkach i upewnij się, że cała membrana przylega do ścianki rurki. Po włożeniu membrany PVDF do probówki, skieruj ją do wewnątrz "stroną białkową" membrany, która pierwotnie stykała się z żelem. Zamknij szczelnie nakrętkę.</li>
	<li>Włóż probówkę o pojemności 50 ml do szklanej butelki do pieca do hybrydyzacji. 
	UWAGA: Gdy do tej inkubacji używane są probówki o pojemności 14 ml, włóż probówkę o pojemności 14 ml do probówki o pojemności 50 ml, używając pary plastikowych uchwytów pierścieniowych, aby utrzymać rurkę wewnętrzną w środku probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Włącz piekarnik do hybrydyzacji.</li>
	<li>Inkubować błonę z obrotem 6 obr./min przez co najmniej 5 min. 
	UWAGA: Upewnij się, że membrana cały czas przylega do ścianki i że (wewnętrzna) rurka jest pozioma, aby równomiernie pokryć membranę roztworem przeciwciała. Skalibrować rozcieńczenie przeciwciała i czas inkubacji przed właściwym eksperymentem.</li>
</ol>
4. Mycie membrany
<ol>
	<li>Zatrzymaj obrót.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij membranę PVDF z probówki za pomocą pęsety i umieść membranę w pojemniku z 50 ml PBS-T.</li>
	<li>Krótko przepłukać membranę PBS-T.</li>
	<li>Przepłucz membranę w pojemniku wodą destylowaną, aż nie pojawią się bąbelki. Ma to na celu usunięcie większości przeciwciał.</li>
	<li>Przenieś membranę PVDF z pojemnika do wirówki do sałatek, która zawiera 250 ml PBS-T.</li>
	<li>Umieść kosz sitka w wirówce. Upewnij się, że pokrywka została dobrze założona.</li>
	<li>Aktywuj kołpak i uruchom go na około 20-30 s.</li>
	<li>Wylej roztwór i krótko przepłucz wnętrze wirówki wodą destylowaną.</li>
	<li>Ponownie dodaj 250 ml PBS-T do wirówki.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.6 i 4.7.</li>
</ol>
5. Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym
<ol>
	<li>Przygotować 10% roztwór czynnika wzmacniającego odczyn immunologiczny-2 (IRE-2) z wodą destylowaną. Dobrze wirować.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe z 10% IRE-2. Wymieszaj go delikatnie i dokładnie.</li>
	<li>Wybrać objętość roztworu przeciwciała i probówki, jak podano w kroku 3.3.</li>
	<li>Podnieś membranę PVDF pęsetą i krótko spuść roztwór. Włóż membranę PVDF do rurki, jak podano w kroku 3.4.</li>
	<li>Włóż probówkę o pojemności 50 ml do szklanej butelki do pieca do hybrydyzacji.</li>
	<li>Włącz piekarnik do hybrydyzacji.</li>
	<li>Inkubować membranę z obrotem 6 obr./min przez co najmniej 5 minut. Upewnij się, że membrana przylega do ścianki przez cały czas i że (wewnętrzna) rurka jest pozioma, aby równomiernie pokryć membranę roztworem przeciwciała. 
	UWAGA: Skalibruj czas inkubacji przed właściwym eksperymentem. Gdy przeciwciało drugorzędowe jest fluorescencyjnie sprzężone, inkubację należy przeprowadzić w ciemności.</li>
</ol>
6. Mycie membrany
<ol>
	<li>Wykonaj kroki od 4.1 do 4.10.</li>
</ol>
7. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Detekcja chemiluminescencyjna
	<ol>
		<li>Umieść kawałek elastycznej folii do półprzeszczepu (10 cm x 15 cm) na płaskiej powierzchni.</li>
		<li>Wymieszaj 2 składniki substratu chemiluminescencyjnego w probówce o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Natychmiast przenieś 1,5 ml zmieszanego substratu na elastyczną folię do półprzeszczepu i umieść na niej membranę PVDF. Następnie przenieś resztę roztworu substratu na membranę.</li>
		<li>Inkubować membranę PVDF z wymieszanym substratem na półprzezroczystej elastycznej folii przez 1 minutę.</li>
		<li>Podnieś membranę PVDF pęsetą i krótko spuść roztwór podłoża.</li>
		<li>Umieść membranę między parą przezroczystych folii.</li>
		<li>Uzyskaj obraz w trybie chemiluminescencyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Detekcja fluorescencyjna
	<ol>
		<li>Podnieś membranę PVDF pęsetą i krótko spuść roztwór.</li>
		<li>Umieść membranę między parą przezroczystych folii.</li>
		<li>Zrób zdjęcie w trybie fluorescencyjnym. 
		UWAGA: Kroki 7.1 i 7.2 należy wykonywać w bliskiej odległości od urządzenia do obrazowania, aby zapewnić maksymalną czułość.</li>
		<li>Gdy sygnał tła jest wysoki, wykonaj etap mycia w pojemniku z 80-100 ml PBS-T: 10 min płukania 3 razy dla przeciwciała pierwszorzędowego i 5 min płukania 6 razy dla przeciwciała drugorzędowego. 
		UWAGA: Zarówno pierwszorzędowe, jak i drugorzędowe przeciwciała rozcieńczone 10% roztworami IRE mogą być używane do 8-10 razy bez utraty czułości6. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>MacPhee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+for+improving+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacol+Toxicology+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations for improving Western blot analysis.</a> Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).</li>
<li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+critical+factors+for+quantitative+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting.</a> Science Signaling. 8 (371), (2015).</li>
<li>Schuck, P., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mass+transport+limitation+and+surface+heterogeneity+in+the+biophysical+characterization+of+macromolecular+binding+processes+by+SPR+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing.</a> Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).</li>
<li>Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eliminating+Size-Associated+Diffusion+Constraints+for+Rapid+On-Surface+Bioassays+with+Nanoparticle+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes.</a> Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).</li>
<li>Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html">http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html</a> (2020).</li>
<li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+but+not+Obsolete%3A+An+Enhanced+High+Speed+Immunoblot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot.</a> Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+Procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Western+blotting%22%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).</li>
<li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+and+analysis%3A+next+generation+Western+blotting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li>
<li>Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+analysis+of+EGF+receptor+signaling+dynamics+with+microwestern+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays.</a> Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).</li>
<li>Treindl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bead-based+western+for+high-throughput+cellular+signal+transduction+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses.</a> Nature Communications. 7, 12852(2016).</li>
<li>Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+western+blot+assay+by+rotational+cyclic+draining+and+replenishing+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure.</a> Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).</li>
<li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+other+notable+protein+detection+methods+on+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A brief review of other notable protein detection methods on blots.</a> Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).</li>
<li>Nagase, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+Sensitive+Detection+of+Glycosaminoglycan+Chains+with+Immunoblots%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots.</a> Glycobiology. , (2020).</li>
</ol>

Autorzy zadeklarowali brak sprzecznych interesów bezpośrednio związanych z treścią niniejszego artykułu.

Western blot jest szeroko stosowaną techniką analityczną do wykrywania określonych białek, która została opracowana ~40 lat temu 7,8. Od tego czasu technika ta nadal ewoluowała, a kolejne innowacje poprawiły czułość, szybkość i ilościowość techniki 2,9,10,11,12,13. Pr...

Western blot (znany również jako immunoblot) jest potężną i fundamentalną techniką w szerokim zakresie dyscyplin naukowych i klinicznych. Technika ta służy do badania obecności, względnej obfitości, względnej masy cząsteczkowej i modyfikacji potranslacyjnych białek1. W połączeniu z cyfrową analizą obrazu, metoda ta może niezawodnie analizować obfitość białek i modyfikacje białek2. Chociaż western blot jest wykonywany rutynowo, jest to metoda czasochłonna i pracochłonna. Wymagane są długie inkubacje przeciwciała z błonami. W tym miejscu opisujemy modyfikację metody inkubacji, która pokonuje to ograniczenie bez poświęcania czułości.
Podczas inkubacji błony, przeciwciała unoszą się w roztworze, podczas gdy antygeny są unieruchomione na membranie. Ze względu na ich wysokie powinowactwo szybkość wiązania przeciwciał z antygenem jest szybsza niż dyfuzja przeciwciał z roztworu masowego do błony. W ten sposób powstaje "warstwa zubożona" o niskim stężeniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Może minąć wiele godzin, zanim bardziej odległe przeciwciała dotrą do błony poprzez dyfuzję bierną, która jest głównym czynnikiem odpowiedzialnym za długi czas inkubacji w tej technice. Efekt ten nazywa się ograniczeniem transportu masowego (MTL)3. Zaproponowano, że powtarzające się opróżnianie i uzupełnianie roztworu zawierającego przeciwciała może zakłócić warstwę zubożającą i przezwyciężyć MTL4. Tutaj opracowaliśmy unikalną technikę, która wdraża tę cykliczną koncepcję drenażu i uzupełniania (CDR) w celu zmniejszenia efektu MTL w tradycyjnym protokole western blotting i znacznego skrócenia wymaganego okresu inkubacji.
Aby utrzymać czułość wykrywania przy krótkim czasie inkubacji, użyliśmy technologii wzmacniającej immunoreakcję, która przyspiesza reakcję antygen-przeciwciało, poprawiając tym samym stosunek sygnału do szumu5. Wiele dostępnych na rynku środków wzmacniających reakcję immunologiczną (IRE) składa się z 2 składników (roztwór 1 i 2, patrz tabela materiałów). Zastrzeżony skład lub mechanizm działania IRE nie został ujawniony, ale wcześniej odkryliśmy, że IRE zmniejszył stałą dysocjacji między antygenem a przeciwciałem w testach wiązania fazy stałej, co wskazuje, że zwiększone powinowactwo jest, przynajmniej częściowo, odpowiedzialne za wzmacniający efekt IRE6. Połączenie CDR z IRE daje ultraszybki protokół western blotting, który skraca cały czas zabiegu bez poświęcania czułości.

<table><tbody><tr><td>14 ml probówka PP o okrągłym dnie i wysokiej przejrzystości, z podziałką, z</td><td></td> folią przezroczystą Snap Cap Falcon <td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Apollo do drukarek laserowych</td><td>Nie</td><td></td> dotyczy <td>Nie dotyczy Wszystkie rodzaje folii przezroczystej do drukarek laserowych są w porządku.</td></tr><tr><td>Azure Imaging System 600</td><td>Azure Biosystems</td><td>Azure 600</td><td>Każdy rodzaj systemu pozyskiwania obrazów jest odpowiedni do wykrywania chemiluminescencyjnego i/lub fluorescencyjnego.</td></tr><tr><td>Może uzyskać sygnał Roztwór wzmacniający reakcję immunologiczną</td><td>TOYOBO</td><td>NKB-101</td><td></td></tr><tr><td>GŹDZIK Natychmiastowy beztłuszczowy suchy</td><td>goździk</td> mleka <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ECL anty-mysie IgG, peroksydaza chrzanowa związana z F (ab ')2 fragment z owiec</td><td>GE Healthcare</td><td>NA9310V</td><td></td></tr><tr><td>ECL anty-króliczą IgG, F (ab ') połączony z peroksydazą chrzanową2 fragment od osiołka</td><td>GE Healthcare</td><td>NA9340V</td><td></td></tr><tr><td>HYBAID Micro-4</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Każdy piec do hybrydyzacji jest w porządku, o ile rurki są równomiernie obracane w pozycji poziomej.</td></tr><tr><td>Membrana PVDF Immobilon-P, 0,45 &mikro; m wielkość porów</td><td>Millipore Sigma</td><td>IPVH304F0</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Goat anty-mysie przeciwciało wtórne IgG</td><td>LICOR</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Kozia przeciwciało anty-królicze IgG Przeciwciało wtórne</td><td>LICOR</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescencyjny substrat</td><td>seracare</td><td>5430-0049</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-&szlig; aktynowe</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td><td>LICOR</td><td>927-40100</td><td>Blocking Buffer do detekcji fluorescencyjnej</td></tr><tr><td>OXO Salad Spinner</td><td>OXO</td><td>32480V2B</td><td>Każda wirówka do sałatek jest w porządku, o ile membrany PVDF są energicznie płukane bez rozdzierania.</td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca Parafilm</td><td>Bemis</td><td>Parafilm M PM996</td><td>półprzezroczysta elastyczna folia</td></tr><tr><td>Polietylenowe płaskie nakrętki do stożkowych dolnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Pierścienie do trzymania probówki 14 ml w środku probówki 50 ml</td><td>NIE DOTYCZY</td><td></td><td>Przygotowane w warsztacie mechanicznym</td></tr><tr><td>Królik anty-6X Jego tag przeciwciało</td><td>Abcam</td><td>ab9108</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

ultra-high-speed western blot przy użyciu technologii wzmacniającej immunoreakcję

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Western blot (znany również jako immunoblot) to kanoniczna metoda badań biomedycznych. Jest powszechnie stosowany do określania względnej wielkości i obfitości określonych białek, a także potranslacyjnych modyfikacji białek. Ta technika ma bogatą historię i pozostaje w powszechnym użyciu ze względu na swoją prostotę. Jednak procedura western blotting słynie z tego, że trwa godziny, a nawet dni, a krytycznym wąskim gardłem jest długi czas inkubacji, który ogranicza jej przepustowość. Te etapy inkubacji są wymagane ze względu na powolną dyfuzję przeciwciał z roztworu masowego do unieruchomionych antygenów na błonie: stężenie przeciwciał w pobliżu błony jest znacznie niższe niż stężenie objętościowe. W tym miejscu przedstawiamy innowację, która radykalnie skraca te interwały inkubacji poprzez poprawę wiązania antygenu poprzez cykliczne opróżnianie i uzupełnianie (CDR) roztworu przeciwciała. Wykorzystaliśmy również technologię wzmacniającą reakcję immunologiczną, aby zachować czułość testu. Połączenie metody CDR z komercyjnym środkiem wzmacniającym reakcję immunologiczną wzmocniło sygnał wyjściowy i znacznie skróciło czas inkubacji przeciwciał. Powstały w ten sposób ultraszybki western blot można uzyskać w ciągu 20 minut bez utraty czułości. Metodę tę można zastosować do western blot przy użyciu zarówno detekcji chemiluminescencyjnej, jak i fluorescencyjnej. Ten prosty protokół pozwala naukowcom lepiej zbadać analizę ekspresji białek w wielu próbkach.

Niniejszy przykład ilustruje skuteczność metody CDR wraz z technologią wzmacniającą odpowiedź immunologiczną w technice western blot. Inkubację statyczną przeprowadzono na półprzezroczystej, elastycznej folii, na której membrany PVDF inkubowano z roztworem przeciwciał, natomiast inkubację CDR przeprowadzono w piecu do hybrydyzacji poprzez rotowanie probówek zawierających membrany i roztwór przeciwciał (Film). Rysunek 2 przedstawia ilości antygenu i przeciwciał, odpowiednio, niezbędne do dete...

Technika ultra-szybkiego western blottingu jest rozwijana poprzez poprawę kinetyki wiązania antygen-przeciwciało poprzez technologię cyklicznego drenowania i uzupełniania (CDR) w połączeniu ze środkiem wzmacniającym immunoreakcję.

Ultra-High-Speed Western Blot przy użyciu technologii wzmacniającej immunoreakcję

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Western blotting jest uznaną metodą, która wykrywa antygeny na przeniesionej błonie i jest powszechnie stosowana w badaniach biomedycznych, ale ukończenie całej procedury zajmuje godziny lub dni. Korzystając z połączenia technologii wzmacniającej odporność z cyklicznym drenażem i uzupełnianiem, po uzyskaniu błony blokowej, całą procedurę można wykonać w ciągu zaledwie 20 minut bez poświęcania wrażliwości. Ponieważ Western blotting jest powszechny w wielu różnych obszarach badawczych, ma szerokie zastosowanie w celu przyspieszenia badań.Skuteczne zastosowanie tego protokołu opiera się na optymalizacji rozcieńczania przeciwciał odczynnikiem wzmacniającym immunoreakcję i czasie inkubacji. Rozpocząć od inkubacji membran PVDF w odpowiednich blokujących przez jedną godzinę z mieszaniem w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji błon przygotuj 10% środek wzmacniający reakcję immunologiczną jeden roztwór lub IRE1 z wodą destylowaną i dobrze go zwiruj, a następnie rozcieńczyć pierwotne przeciwciało 10% IRE1, delikatnie i dokładnie je mieszając.Podnieś membranę PVDF pęsetą i na krótko spuść roztwór blokujący. Włożyć membranę do stożkowej rurki z przeciwciałem pierwotnym, upewniając się, że cała membrana przylega do ścianki rurki i że strona membrany, która pierwotnie miała kontakt z żelem, jest skierowana do wewnątrz. Szczelnie zakryj rurkę.Włóż rurkę do szklanej butelki do piekarnika do hybrydyzacji i włącz piekarnik. Inkubować membranę z rotacją sześciu obrotów na minutę przez co najmniej pięć minut. Zatrzymaj obrót i ostrożnie usuń membranę PVDF z rurki za pomocą pęsety.Umieść membranę w pojemniku z 50 mililitrami PBST i wypłucz ją, a następnie przepłucz w pojemniku z wodą destylowaną, aż nie pojawią się pęcherzyki, które usuną większość przeciwciała. Przenieś membranę do wirówki do sałatek, która zawiera 250 mililitrów PBST. Umieść koszyk sitka w wirówce i upewnij się, że pokrywka została dobrze założona, a następnie aktywuj wirówkę i uruchom ją na 20 do 30 sekund.Wylej roztwór i krótko przepłucz wnętrze wirówki wodą destylowaną. Dodaj 250 mililitrów PBST do przędzarki i powtórz wirowanie, a następnie inkubuj błonę z przeciwciałami drugorzędowymi i przemyj ją ponownie, jak opisano w rękopisie tekstowym. Umieść kawałek półprzezroczystej elastycznej folii na płaskiej powierzchni.Wymieszaj dwa składniki substratu chemiluminescencyjnego w pięciomililitrowej probówce i natychmiast przenieś 1,5 mililitra zmieszanego podłoża na półprzezroczystą folię. Umieść membranę PVDF na roztworze i przenieś resztę roztworu substratu na membranę. Inkubować membranę PVDF z mieszanym substratem przez jedną minutę.Podnieś membranę PVDF pęsetą i krótko spuść roztwór podłoża. Umieść membranę między parą przezroczystych folii i zobrazuj ją w trybie chemiluminescencyjnym. Ilości antygenu i przeciwciała niezbędne odpowiednio do chemiluminescencyjnego wykrywania Western blot są pokazane tutaj.Zarówno w inkubacjach statycznych, jak i CDR, zastosowanie roztworów IRE zwiększyło czułość. Podobnie, minimalne stężenie przeciwciała anty-6s His Tag zostało obniżone ze 100 do 50 nanogramów na mililitr w warunkach statycznych i ze 100 do 12,5 nanogramów na mililitr w warunkach CDR. Inkubacja CDR trwająca 5 lub 10 minut radykalnie obniżyła granicę wykrywalności w porównaniu z inkubacją statyczną.Co więcej, połączenie CDR z IRE wykazało wyższą czułość na Western blot, nawet w bardzo krótkim okresie inkubacji. Skuteczne zastosowanie tej metody do Western blot z detekcją fluorescencyjną jest pokazane tutaj. Detekcja fluorescencyjna, w przeciwieństwie do detekcji chemiluminescencyjnej, ma unikalną zdolność do wykrywania wielu celów na tej samej plamie w tym samym czasie bez usuwania i ponownego sondowania przeciwciał.Znakowana przez niego fosfataza alkaliczna i beta-aktyna w lizatach komórkowych były jednocześnie wykrywane przy użyciu dwukolorowego fluoroforu. Inkubacja CDR z IRE nie tylko przyspieszyła wykrywanie, ale także zwiększyła czułość. Podczas inkubacji membrana powinna pozostać przymocowana do ścianki rurki.Rurkę należy obrócić poziomo, tak aby roztwór w sposób ciągły przemywał się po powierzchni membrany. Protokół ten znacznie przyspieszył naszą produktywność badawczą, która w dużym stopniu zależy od procedur Western blot.

ultra-high-speed-western-blot-using-immunoreaction-enhancing

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy artykuł techniczny opisuje standardową procedurę western-blottingu z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego systemu elektroforezy Mini-Gel NuPAGE firmy Invitrogen.

Western blotting z wykorzystaniem żeli Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Immunoblotting (western blotting) to szybka i czuła metoda detekcji i charakterystyki białek, która wykorzystuje specyficzność rozpoznawania antygen-przeciwciało. Niniejsze wideo przedstawia protokoły rozdziału białek, transferu białek na membrany, immunodetekcji oraz wizualizacji z wykorzystaniem substratów chromogennych lub chemiluminescencyjnych.

Analiza immunoblottingowa

Western blotting to technika analityczna stosowana do wykrywania specyficznych białek w danej próbce homogenatu lub ekstraktu tkankowego.

Western blotting: od przygotowania próbki do detekcji

Ten film opisuje oparte na chemiluminescencji western blot immunoprecypitowanych lizatów. Technika ta pomaga określić przetwarzanie i aktywację białek. Wykryty sygnał chemiluminescencyjny jest proporcjonalny do poziomu przetworzenia białka podczas jego aktywacji.

Chemiluminescencyjny test Western Blot do przetwarzania białek

V3 to procedura western blot z użyciem żeli bez plam. Technologia bezbarwna pozwala naukowcom na wizualizację jakości separacji białek, weryfikację wydajności transferu, a co najważniejsze, walidację zmiany w białku będącym przedmiotem zainteresowania przy użyciu całkowitej kwantyfikacji białka jako niezawodnej kontroli obciążenia.

V3 Bezbarwny przepływ pracy dla praktycznej, wygodnej i niezawodnej kontroli całkowitego obciążenia białkami w Western blotting

Ten protokół bada najnowsze osiągnięcia w przeprowadzaniu analiz Western blot. Te nowatorskie modyfikacje wykorzystują system żelowy Bis-Tris z 35-minutowym czasem trwania elektroforezy, 7-minutowy system suchego transferu blottingu oraz wykrywanie i obrazowanie białek fluorescencyjnych w podczerwieni, które generują wyższą rozdzielczość, jakość, czułość i lepszą dokładność danych zachodnich.

Najszybszy western w mieście: współczesna wariacja na temat klasycznej analizy Western Blot

Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół fluorescencyjnych testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (fEMSA) przy użyciu oczyszczonych białek SOX-2 wraz z sondami DNA znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni jako studium przypadku, aby rozwiązać ważne pytanie biologiczne.

Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni

Ogniskowanie izoelektryczne kapilarne to oparta na przeciwciałach, ultraczuła, wysokoprzepustowa technika, umożliwiająca szczegółową charakterystykę białek i ich izoform z bardzo małych próbek biologicznych. Poniżej opisano protokół wykrywania i oznaczania ilościowego określonych białek i ich izoform w sposób zautomatyzowany i zrobotyzowany.

Wysoce czułe i ilościowe wykrywanie białek i ich izoform metodą kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Standardowy protokół Western blotting został zoptymalizowany do analizy zaledwie 500 hematopoetycznych komórek macierzystych lub progenitorowych. Optymalizacja polega na ostrożnym obchodzeniu się z próbką komórki, ograniczaniu transferów między probówkami i bezpośredniej lizie komórek w buforze próbki Laemmli.

Protokół Western Blotting dla małej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych

Poznaj technikę ultra-szybkiego western blotu z wykorzystaniem technologii CDR i czynnika wzmacniającego immunoreakcję. Cały proces trwa zaledwie 20 minut bez utraty czułości.

Ultra-High-Speed Western Blot przy użyciu technologii wzmacniającej immunoreakcję

Przeglądaj więcej filmów