Ultra-High-Speed Western Blot przy użyciu technologii wzmacniającej immunoreakcję
26 września 2020
Technika ultra-szybkiego western blottingu jest rozwijana poprzez poprawę kinetyki wiązania antygen-przeciwciało poprzez technologię cyklicznego drenowania i uzupełniania (CDR) w połączeniu ze środkiem wzmacniającym immunoreakcję.
Western blotting jest uznaną metodą, która wykrywa antygeny na przeniesionej błonie i jest powszechnie stosowana w badaniach biomedycznych, ale ukończenie całej procedury zajmuje godziny lub dni. Korzystając z połączenia technologii wzmacniającej odporność z cyklicznym drenażem i uzupełnianiem, po uzyskaniu błony blokowej, całą procedurę można wykonać w ciągu zaledwie 20 minut bez poświęcania wrażliwości. Ponieważ Western blotting jest powszechny w wielu różnych obszarach badawczych, ma szerokie zastosowanie w celu przyspieszenia badań.
Skuteczne zastosowanie tego protokołu opiera się na optymalizacji rozcieńczania przeciwciał odczynnikiem wzmacniającym immunoreakcję i czasie inkubacji. Rozpocząć od inkubacji membran PVDF w odpowiednich blokujących przez jedną godzinę z mieszaniem w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji błon przygotuj 10% środek wzmacniający reakcję immunologiczną jeden roztwór lub IRE1 z wodą destylowaną i dobrze go zwiruj, a następnie rozcieńczyć pierwotne przeciwciało 10% IRE1, delikatnie i dokładnie je mieszając.
Podnieś membranę PVDF pęsetą i na krótko spuść roztwór blokujący. Włożyć membranę do stożkowej rurki z przeciwciałem pierwotnym, upewniając się, że cała membrana przylega do ścianki rurki i że strona membrany, która pierwotnie miała kontakt z żelem, jest skierowana do wewnątrz. Szczelnie zakryj rurkę.
Włóż rurkę do szklanej butelki do piekarnika do hybrydyzacji i włącz piekarnik. Inkubować membranę z rotacją sześciu obrotów na minutę przez co najmniej pięć minut. Zatrzymaj obrót i ostrożnie usuń membranę PVDF z rurki za pomocą pęsety.
Umieść membranę w pojemniku z 50 mililitrami PBST i wypłucz ją, a następnie przepłucz w pojemniku z wodą destylowaną, aż nie pojawią się pęcherzyki, które usuną większość przeciwciała. Przenieś membranę do wirówki do sałatek, która zawiera 250 mililitrów PBST. Umieść koszyk sitka w wirówce i upewnij się, że pokrywka została dobrze założona, a następnie aktywuj wirówkę i uruchom ją na 20 do 30 sekund.
Wylej roztwór i krótko przepłucz wnętrze wirówki wodą destylowaną. Dodaj 250 mililitrów PBST do przędzarki i powtórz wirowanie, a następnie inkubuj błonę z przeciwciałami drugorzędowymi i przemyj ją ponownie, jak opisano w rękopisie tekstowym. Umieść kawałek półprzezroczystej elastycznej folii na płaskiej powierzchni.
Wymieszaj dwa składniki substratu chemiluminescencyjnego w pięciomililitrowej probówce i natychmiast przenieś 1,5 mililitra zmieszanego podłoża na półprzezroczystą folię. Umieść membranę PVDF na roztworze i przenieś resztę roztworu substratu na membranę. Inkubować membranę PVDF z mieszanym substratem przez jedną minutę.
Podnieś membranę PVDF pęsetą i krótko spuść roztwór podłoża. Umieść membranę między parą przezroczystych folii i zobrazuj ją w trybie chemiluminescencyjnym. Ilości antygenu i przeciwciała niezbędne odpowiednio do chemiluminescencyjnego wykrywania Western blot są pokazane tutaj.
Zarówno w inkubacjach statycznych, jak i CDR, zastosowanie roztworów IRE zwiększyło czułość. Podobnie, minimalne stężenie przeciwciała anty-6s His Tag zostało obniżone ze 100 do 50 nanogramów na mililitr w warunkach statycznych i ze 100 do 12,5 nanogramów na mililitr w warunkach CDR. Inkubacja CDR trwająca 5 lub 10 minut radykalnie obniżyła granicę wykrywalności w porównaniu z inkubacją statyczną.
Co więcej, połączenie CDR z IRE wykazało wyższą czułość na Western blot, nawet w bardzo krótkim okresie inkubacji. Skuteczne zastosowanie tej metody do Western blot z detekcją fluorescencyjną jest pokazane tutaj. Detekcja fluorescencyjna, w przeciwieństwie do detekcji chemiluminescencyjnej, ma unikalną zdolność do wykrywania wielu celów na tej samej plamie w tym samym czasie bez usuwania i ponownego sondowania przeciwciał.
Znakowana przez niego fosfataza alkaliczna i beta-aktyna w lizatach komórkowych były jednocześnie wykrywane przy użyciu dwukolorowego fluoroforu. Inkubacja CDR z IRE nie tylko przyspieszyła wykrywanie, ale także zwiększyła czułość. Podczas inkubacji membrana powinna pozostać przymocowana do ścianki rurki.
Rurkę należy obrócić poziomo, tak aby roztwór w sposób ciągły przemywał się po powierzchni membrany. Protokół ten znacznie przyspieszył naszą produktywność badawczą, która w dużym stopniu zależy od procedur Western blot.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia technikę ultra-szybkiego western blottingu, która znacząco skraca czas potrzebny na przeprowadzenie tej procedury. Dzięki zastosowaniu technologii cyklicznego odsysania i uzupełniania (CDR) wraz z czynnikiem wzmacniającym immunoreakcję, cały proces może zostać ukończony w zaledwie 20 minut, bez utraty czułości analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania biomedyczne
- Techniki Western blotting
- Technologia wzmacniania odpowiedzi immunologicznej
Wstęp
- Western blotting jest powszechnie stosowaną metodą wykrywania antygenów.
- Tradycyjne procedury western blottingu mogą trwać wiele godzin, a nawet dni.
- Zwiększenie szybkości tej techniki może poprawić efektywność badań.
- Badanie koncentruje się na optymalizacji rozcieńczenia przeciwciał oraz czasów inkubacji.
Cel badania
- Opracowanie szybszego protokołu western blottingu.
- Zachowanie czułości przy jednoczesnym skróceniu czasu trwania procedury.
- Wykazanie szerokiej możliwości zastosowania tej techniki w różnych obszarach badawczych.
Zastosowane metody
- Zastosowanie technologii cyklicznego drenażu i uzupełniania (CDR).
- Wprowadzenie czynnika wzmacniającego immunoreakcję (IRE1).
- Blokowanie membran PVDF w odpowiednich buforach.
- Optymalizacja rozcieńczenia przeciwciał i czasów inkubacji.
Główne wyniki
- Cała procedura western blotting może zostać zakończona w 20 minut.
- W trakcie całego procesu zachowana jest wysoka czułość.
- Pomyślna optymalizacja prowadzi do skutecznej detekcji antygenu.
- Metoda wykazuje potencjał do szerokiego zastosowania w różnych dziedzinach badawczych.
Wnioski
- Opracowana technika znacznie przyspiesza analizę western blot.
- Połączenie technologii CDR z czynnikami wzmacniającymi odpowiedź immunologiczną jest skuteczne.
- Ten postęp może ułatwić szybsze uzyskiwanie wyników badań.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Western blotting pozostaje fundamentalną techniką w walidacji celów i analizie biomarkerów, jednak długie okresy inkubacji stanowią wąskie gardło w wysokoprzepustowych procesach odkrywania. Ta ultraszybka metoda skraca czas analizy z wielu godzin do 20 minut, zachowując jednocześnie czułość, co umożliwia szybką analizę ekspresji białek w wielu próbkach. Podejście to wspiera szybsze testowanie hipotez i identyfikację wiodących związków poprzez zwiększenie przepustowości analizy bez obniżania jakości danych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia szybką weryfikację hipotez terapeutycznych dzięki przyspieszonej detekcji białek.
- Wartość operacyjna: Skraca czas analizy każdego blotu, co pozwala na równoległe badanie większej liczby celów podczas wczesnej walidacji celu.
- Wartość prognostyczna: Zachowuje czułość analizy, wspierając wiarygodną ocenę zaangażowania celu i modulacji szlaków.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych, powtarzalnych wyników ekspresji białek, odpowiednich do standaryzacji analizy.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z detekcją chemiluminescencyjną i fluorescencyjną umożliwia multipleksowanie oraz elastyczny wybór metody odczytu.
- Skalowalność: Format cyklicznego odprowadzania i uzupełniania cieczy pozwala na adaptację do zautomatyzowanych lub półzautomatyzowanych procesów roboczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia spójną analizę białek od etapu odkrycia po modele przedkliniczne z zastosowaniem tej samej szybkej metody detekcji.
- Dostosowanie biomarkerów: Wspiera ocenę modyfikacji potranslacyjnych i izoform białek istotnych dla mechanizmów chorobowych.
- Minimalizacja ryzyka: Przyspiesza walidację biomarkerów docelowych, zmniejszając niepewność przy podejmowaniu decyzji dotyczących etapów przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od przesiewowego badania wiązania z celem terapeutycznym po optymalizację związku wiodącego, gdzie szybka kwantyfikacja białek umożliwia iteracyjne cykle projektowania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie szybkiego i powtarzalnego pomiaru poziomu białek w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Screening: Generuje zestandaryzowane, ilościowe wyniki, które pozwalają na porównanie wiązania przeciwciał w różnych warunkach i próbkach.
- Analityka: Zapewnia wysokie granice czułości wykrywania (np. obniżone wymagania dotyczące stężenia przeciwciał), co poprawia stosunek sygnału do szumu w analizie rzadkich celów.
- Badania translacyjne: Umożliwia spójne monitorowanie białek w różnych typach próbek, wspierając walidację biomarkerów w systemach istotnych dla przebiegu chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi technikę o charakterze platformowym, którą dzięki szerokiej kompatybilności można stosować w wielu projektach i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu dzięki szybkiemu i powtarzalnemu wykrywaniu białek.
- Wartość operacyjna: Poprawia przepustowość laboratorium i efektywność odczynników poprzez skrócenie czasów inkubacji i zmniejszenie zużycia przeciwciał.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji go/no-go w wyborze celu poprzez przyspieszenie cykli generowania danych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając terminowe dane dotyczące walidacji celu niezbędne do decyzji inwestycyjnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest znajomość technik cyklicznego osuszania i uzupełniania oraz obchodzenia się z odczynnikami zwiększającymi immunoreaktywność.
- Wymagany jest standardowy sprzęt do western blotu, w tym piec do hybrydyzacji, wirówka do membran (typu „salad spinner”) oraz systemy detekcji dla odczytów chemiluminescencyjnych lub fluorescencyjnych.
- Wymagana jest optymalizacja rozcieńczeń przeciwciał i czasów inkubacji podczas wprowadzania odczynnika zwiększającego immunoreaktywność.
- Wymagane jest przeszkolenie w celu zapewnienia prawidłowego obchodzenia się z membraną podczas etapów osuszania i wirowania, aby zachować integralność sygnału.
- Metoda najlepiej sprawdza się w laboratoriach często wykonujących western bloty, gdzie oszczędność czasu kumuluje się przy analizie wielu celów i warunków.
