Ultra-High-Speed Western Blot przy użyciu technologii wzmacniającej immunoreakcję

Western blotting jest uznaną metodą, która wykrywa antygeny na przeniesionej błonie i jest powszechnie stosowana w badaniach biomedycznych, ale ukończenie całej procedury zajmuje godziny lub dni. Korzystając z połączenia technologii wzmacniającej odporność z cyklicznym drenażem i uzupełnianiem, po uzyskaniu błony blokowej, całą procedurę można wykonać w ciągu zaledwie 20 minut bez poświęcania wrażliwości. Ponieważ Western blotting jest powszechny w wielu różnych obszarach badawczych, ma szerokie zastosowanie w celu przyspieszenia badań.

Skuteczne zastosowanie tego protokołu opiera się na optymalizacji rozcieńczania przeciwciał odczynnikiem wzmacniającym immunoreakcję i czasie inkubacji. Rozpocząć od inkubacji membran PVDF w odpowiednich blokujących przez jedną godzinę z mieszaniem w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji błon przygotuj 10% środek wzmacniający reakcję immunologiczną jeden roztwór lub IRE1 z wodą destylowaną i dobrze go zwiruj, a następnie rozcieńczyć pierwotne przeciwciało 10% IRE1, delikatnie i dokładnie je mieszając.

Podnieś membranę PVDF pęsetą i na krótko spuść roztwór blokujący. Włożyć membranę do stożkowej rurki z przeciwciałem pierwotnym, upewniając się, że cała membrana przylega do ścianki rurki i że strona membrany, która pierwotnie miała kontakt z żelem, jest skierowana do wewnątrz. Szczelnie zakryj rurkę.

Włóż rurkę do szklanej butelki do piekarnika do hybrydyzacji i włącz piekarnik. Inkubować membranę z rotacją sześciu obrotów na minutę przez co najmniej pięć minut. Zatrzymaj obrót i ostrożnie usuń membranę PVDF z rurki za pomocą pęsety.

Umieść membranę w pojemniku z 50 mililitrami PBST i wypłucz ją, a następnie przepłucz w pojemniku z wodą destylowaną, aż nie pojawią się pęcherzyki, które usuną większość przeciwciała. Przenieś membranę do wirówki do sałatek, która zawiera 250 mililitrów PBST. Umieść koszyk sitka w wirówce i upewnij się, że pokrywka została dobrze założona, a następnie aktywuj wirówkę i uruchom ją na 20 do 30 sekund.

Wylej roztwór i krótko przepłucz wnętrze wirówki wodą destylowaną. Dodaj 250 mililitrów PBST do przędzarki i powtórz wirowanie, a następnie inkubuj błonę z przeciwciałami drugorzędowymi i przemyj ją ponownie, jak opisano w rękopisie tekstowym. Umieść kawałek półprzezroczystej elastycznej folii na płaskiej powierzchni.

Wymieszaj dwa składniki substratu chemiluminescencyjnego w pięciomililitrowej probówce i natychmiast przenieś 1,5 mililitra zmieszanego podłoża na półprzezroczystą folię. Umieść membranę PVDF na roztworze i przenieś resztę roztworu substratu na membranę. Inkubować membranę PVDF z mieszanym substratem przez jedną minutę.

Podnieś membranę PVDF pęsetą i krótko spuść roztwór podłoża. Umieść membranę między parą przezroczystych folii i zobrazuj ją w trybie chemiluminescencyjnym. Ilości antygenu i przeciwciała niezbędne odpowiednio do chemiluminescencyjnego wykrywania Western blot są pokazane tutaj.

Zarówno w inkubacjach statycznych, jak i CDR, zastosowanie roztworów IRE zwiększyło czułość. Podobnie, minimalne stężenie przeciwciała anty-6s His Tag zostało obniżone ze 100 do 50 nanogramów na mililitr w warunkach statycznych i ze 100 do 12,5 nanogramów na mililitr w warunkach CDR. Inkubacja CDR trwająca 5 lub 10 minut radykalnie obniżyła granicę wykrywalności w porównaniu z inkubacją statyczną.

Co więcej, połączenie CDR z IRE wykazało wyższą czułość na Western blot, nawet w bardzo krótkim okresie inkubacji. Skuteczne zastosowanie tej metody do Western blot z detekcją fluorescencyjną jest pokazane tutaj. Detekcja fluorescencyjna, w przeciwieństwie do detekcji chemiluminescencyjnej, ma unikalną zdolność do wykrywania wielu celów na tej samej plamie w tym samym czasie bez usuwania i ponownego sondowania przeciwciał.

Znakowana przez niego fosfataza alkaliczna i beta-aktyna w lizatach komórkowych były jednocześnie wykrywane przy użyciu dwukolorowego fluoroforu. Inkubacja CDR z IRE nie tylko przyspieszyła wykrywanie, ale także zwiększyła czułość. Podczas inkubacji membrana powinna pozostać przymocowana do ścianki rurki.

Rurkę należy obrócić poziomo, tak aby roztwór w sposób ciągły przemywał się po powierzchni membrany. Protokół ten znacznie przyspieszył naszą produktywność badawczą, która w dużym stopniu zależy od procedur Western blot.