Generowanie chimer poduszeczek tłuszczowych węzłów chłonnych do badania pochodzenia komórek zrębu węzłów chłonnych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie chimery z tkanki tłuszczowej i węzła chłonnego w celu oceny udziału tkanki tłuszczowej w tworzeniu zrębu węzłów chłonnych. Osiąga się to najpierw poprzez wyizolowanie węzłów chłonnych od nowonarodzonych myszy oraz poduszek tłuszczowych z embrionów myszy w 18,5 dniu rozwoju. Węzeł chłonny zostaje usunięty z embrionalnej poduszki tłuszczowej i zastąpiony węzłem chłonnym nowonarodzonej myszy.

Chimera z tkanki tłuszczowej i węzła chłonnego jest tworzona poprzez ponowne połączenie, a następnie hodowlę in vitro jednego noworodkowego węzła chłonnego z jedną embrionalną tkanką tłuszczową. Następnie chimerę przeszczepia się pod torebkę nerki myszy biorcy. Trzy tygodnie po transplantacji pobiera się nerkę i odzyskuje chimerę.

Ostatecznie wkład komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej w zrąb węzła chłonnego można ocenić za pomocą analizy cytometrycznej i mikroskopii immunofluorescencyjnej. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy szukaliśmy sposobu na ocenę, czy komórki z tkanki tłuszczowej przyczyniają się do formowania węzłów chłonnych. Aby wyizolować pachwinowe węzły chłonne noworodka, po odcięciu głowy należy użyć nożyczek, aby otworzyć ciało zwierzęcia od górnej części klatki piersiowej do dolnej części brzucha.

Po ostrożnym usunięciu wszystkich organów wewnętrznych z jamy brzusznej, umieść ciało w 90 milimetrowej płytce Petriego zawierającej medium RF 10. Umieść płytkę w sterylnej komorze do hodowli tkanek, a następnie przenieś ciało do nowej sterylnej 90 milimetrowej płytki Petriego zawierającej świeże medium RF 10. Następnie ostrożnie oddziel otrzewną od skóry w okolicy pachwinowej i zlokalizuj węzły chłonne pachwinowe znajdujące się w poduszce tłuszczowej na przecięciu trzech naczyń krwionośnych.

Ostrożnie usuń węzły chłonne, upewniając się, że usunięto całą tkankę tłuszczową. Następnie umieść węzły chłonne w 50 milimetrowej szalce Petriego zawierającej medium RF 10 na lodzie, aby wyizolować poduszki tłuszczowe pachwinowe z embrionów z dnia 18.5. Po usunięciu trzewi, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, przemyj ciała w sterylnym PBS, aby usunąć wszelkie ślady krwi.

Przenieś oczyszczone ciała do nowej szalki Petriego o średnicy 90 milimetrów, a następnie oddziel otrzewną, zlokalizuj węzeł chłonny pachwinowy i usuń go w sposób zaprezentowany przed chwilą. Pozbyć się wyizolowanej tkanki. Należy zadbać o usunięcie całego węzła chłonnego, aby uniknąć zanieczyszczenia chimery tkanki tłuszczowej.

Następnie usunąć pachwinową tkankę tłuszczową i umieścić ją w 50 milimetrowej szalce Petri z pożywką RF 10 na lodzie. Aby przygotować system hodowli organów in vitro, najpierw pociąć Vulcan under wrap na kawałki o wielkości od 1 do 1,5 centymetra kwadratowego. Następnie gotować gąbki przez dwie godziny, a filtry przez 20 minut w wodzie destylowanej, a potem pozostawić je do wyschnięcia przez kilka godzin w komorze do hodowli komórek.

Po wyschnięciu materiałów, umieść po jednej gąbce w szalce Petriego o średnicy 50 milimetrów zawierającej dwa mililitry pożywki. Zanurz każdą gąbkę w pożywce, aby zwilżyć obie jej strony, a następnie umieść po jednym filtrze w każdym systemie hodowli organów in vitro na granicy fazy ciekłej i powietrznej. Następnie ostrożnie połącz jedną embrionalną tkankę tłuszczową z jednym węzłem chłonnym noworodka bezpośrednio na górnej powierzchni każdego filtra.

Przenieś szalki Petriego do prostokątnego plastikowego pojemnika z wodą na dnie i otworami w pokrywie. Przyklej pokrywę do pojemnika taśmą, pozostawiając otwory odsłonięte. Następnie umieść pojemnik w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.

Pozostaw pojemnik na dwie godziny w celu wyrównania parametrów, a następnie zaklej otwory w pokrywie taśmą. Inkubuj tkanki przez co najmniej dwa dni, aby węzły chłonne przytwierdziły się do poduszek tłuszczowych przed przeniesieniem ich pod torebkę nerki, trzy do czterech tygodni po transplantacji. Wyizoluj każdą chimerę węzła chłonnego i poduszki tłuszczowej z każdej nerki, a następnie wypreparuj węzły chłonne.

Następnie w każdym węźle chłonnym, za pomocą małych nożyczek, wykonaj pojedyncze nacięcie w tkance, aby wspomóc trawienie enzymatyczne. Następnie umieść każdy węzeł chłonny w oddzielnej probówce typu eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającej 600 µL buforu do trawienia. Inkubuj probówki przez 30 minut w temperaturze 37 °C w bloku termicznym z funkcją mieszania, pipetując w górę i w dół co 10 minut, aby ułatwić dysocjację tkanki.

Następnie do probówek należy dodać 6 µL EDTA i kilka razy pipetować zawiesinę komórkową, aby dokończyć dysocjację. Komórki można następnie barwić wybranymi przeciwciałami i analizować metodą cytometrii przepływowej w celu zachowania ekspresji ulepszonego żółtego białka fluorescencyjnego (EYFP). Węzły chłonne należy utrwalać przez trzy do czterech godzin.

Następnie dla każdego węzła chłonnego nanieście jedną kroplę zimnego związku OCT na mały kawałek folii aluminiowej. Unikając pęcherzyków powietrza, ostrożnie umieśćcie jeden węzeł chłonny na środku każdej kropli, a następnie połóżcie folię na suchym lodzie, aby zamrozić tkanki. Węzły chłonne można następnie pociąć na skrawki, zabarwić i poddać analizie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Staranna izolacja węzła chłonnego umożliwia dalszą analizę potomstwa komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej wykazujących ekspresję EYFP. Przekroje mrożone oraz analiza immunofluorescencyjna węzła chłonnego wykazują, że komórki pochodzące z tkanki tłuszczowej EYFP+ migrują do węzła chłonnego, gdzie współtworzą sieć komórek stroma węzła chłonnego GP38+ ER-TR7+. Analiza cytometryczna potwierdza, że istotna frakcja komórek stroma węzła chłonnego pochodzi z lokalnych progenitorowych komórek tkanki tłuszczowej EYFP+, stanowiąc 30% frakcji fibroblastycznej CD45- GP38+ CD31- oraz 10% frakcji komórek śródbłonka naczyniowego CD45- GP38- CD31+. Aż 80% frakcji fibroblastycznej CD45- GP38+ CD31- może pochodzić z komórek prekursorowych tkanki tłuszczowej, co demonstruje kluczową rolę tkanki tłuszczowej w podtrzymywaniu wzrostu stroma węzła chłonnego. Opanowanie tej techniki pozwoli badaczowi w dziedzinie organogenezy tkanek limfatycznych na zgłębienie roli różnych cząsteczek zaangażowanych w rozwój stroma tkanek limfatycznych.