Generowanie chimer poduszeczek tłuszczowych węzłów chłonnych do badania pochodzenia komórek zrębu węzłów chłonnych

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie chimery poduszeczki tłuszczowej węzłów chłonnych w celu oceny udziału tkanki tłuszczowej w tworzeniu zrębu węzłów chłonnych. Osiąga się to najpierw poprzez wyizolowanie węzłów chłonnych od nowonarodzonych myszy i poduszek tłuszczowych od zarodków myszy w 18,5 dniu. Węzeł chłonny jest usuwany z embrionalnej poduszeczki tłuszczowej i zastępowany węzłem chłonnym noworodka.

Chimera poduszeczki tłuszczowej węzła chłonnego jest montowana przez ponowne skojarzenie, a następnie wyhodowanie jednego węzła chłonnego nowonarodzonego z jedną embrionalną poduszeczką tłuszczową in vitro. Chimera jest następnie szczepiona pod torebką nerkową myszy żywiciela. Trzy tygodnie po przeszczepie pobiera się nerkę i pobiera chimerę.

Ostatecznie udział komórek pochodzących z poduszeczki tłuszczowej w zrębie węzłów chłonnych można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopowej analizy immunofluorescencyjnej. Tak więc po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy szukaliśmy sposobu na ocenę, czy komórki z poduszeczki tłuszczowej przyczyniają się do tworzenia węzłów chłonnych w celu wyizolowania nowonarodzonych pachwinowych węzłów chłonnych. Po przecięciu głowy użyj nożyczek, aby otworzyć ciało zwierzęcia od góry klatki piersiowej do dołu brzucha.

Po ostrożnym usunięciu wszystkich wnętrzności z jamy brzusznej, umieść ciało na 90-milimetrowej szalce Petriego zawierającej pożywkę RF 10. Umieść szalkę w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych, a następnie przenieś ciało na nową, sterylną 90-milimetrową szalkę Petriego zawierającą świeży RF 10. Następnie ostrożnie odłącz otrzewną od skóry w okolicy pachwinowej i zlokalizuj pachwinowe węzły chłonne znajdujące się na przecięciu trzech naczyń krwionośnych w poduszce tłuszczowej.

Ostrożnie usuń węzły chłonne, upewniając się, że cała tkanka tłuszczowa została usunięta. Następnie umieść węzły chłonne na 50-milimetrowej szalce Petriego zawierającej pożywkę RF 10 na lodzie, aby wyizolować pachwinowe poduszeczki tłuszczowe z zarodków w 18,5 dniu. Po usunięciu wnętrzności, jak właśnie pokazano, umyj ciała w sterylnym PBS, aby wyeliminować wszelkie ślady krwi.

Przenieś oczyszczone ciała na świeżą 90-milimetrową szalkę Petriego, a następnie odłącz otrzewną, zlokalizuj pachwinowy węzeł chłonny i usuń go, jak właśnie pokazano. Wyrzuć wyizolowaną tkankę. Uważaj, aby usunąć cały węzeł chłonny, aby uniknąć zanieczyszczenia chimery poduszeczki tłuszczowej.

Następnie usuń pachwinową poduszeczkę tłuszczową i umieść ją na 50-milimetrowej szalce Petriego zawierającej pożywkę RF 10 na lodzie. Aby skonfigurować system hodowli narządów in vitro, najpierw pokrój trochę Vulcana pod folią na kawałki o powierzchni od jednego do 1,5 centymetra kwadratowego. Następnie gotuj gąbki przez dwie godziny, a filtry przez 20 minut w wodzie destylowanej i pozwól im wyschnąć przez kilka godzin w kapturze do hodowli komórkowych.

Gdy materiały wyschną, umieść po jednej gąbce na 50-milimetrowej szalce Petriego zawierającej dwa mililitry podłoża. Zanurz każdą gąbkę w pożywce, aby zwilżyć obie strony, a następnie umieść jeden filtr na system hodowli narządów in vitro na granicy faz ciekłego powietrza. Następnie ostrożnie ponownie powiąż jedną embrionalną poduszeczkę tłuszczową z jednym węzłem chłonnym noworodka bezpośrednio na górze każdego filtra.

Przenieś szalki Petriego do prostokątnego plastikowego pudełka z wodą na dnie i otworami w pokrywce. Przyklej pokrywkę do pudełka, pozostawiając otwarte otwory. Następnie umieść pudełko w inkubatorze do hodowli komórkowych CO2 o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5%.

Pozwól pudełku zrównoważyć się przez dwie godziny, a następnie uszczelnij otwory w pokrywie taśmą. Inkubuj tkanki przez co najmniej dwa dni, aby węzły chłonne mogły przyczepić się do poduszek tłuszczowych przed przeniesieniem pod torebkę nerkową, trzy do czterech tygodni po przeszczepie. Odizoluj każdy węzeł chłonny, chimerę poduszeczki tłuszczowej w każdej nerce i wypreparuj węzły chłonne.

Następnie dla każdego węzła chłonnego użyj małych nożyczek, aby wykonać pojedyncze nacięcie w tkance, aby wspomóc trawienie enzymatyczne. Następnie umieść po jednym węźle chłonnym w pojedynczych 1,5-mililitrowych probówkach einor zawierających 600 mikrolitrów buforu wytrawiającego. Inkubuj probówki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza na mieszającym bloku termicznym, pipetując w górę i w dół co 10 minut, aby pomóc w dysocjacji tkanki.

Następnie dodaj sześć mikrolitrów EDTA do probówek i kilkakrotnie zintensytuj zawiesinę komórek, aby zakończyć dysocjację. Komórki można następnie wybarwić pożądanymi przeciwciałami i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej w celu zachowania wzmocnionej ekspresji białka żółtej fluorescencji lub EYFP. Napraw węzły chłonne na trzy do czterech godzin.

Następnie dla każdego węzła chłonnego umieść pojedynczą kroplę zimnego związku OCT na małym kawałku folii aluminiowej. Unikając pęcherzyków powietrza, ostrożnie umieść jeden węzeł chłonny w środku każdej kropli, a następnie umieść folię na suchym lodzie, aby zamrozić tkanki. Węzły chłonne można następnie pokroić, wybarwić i przeanalizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

P dokładna izolacja węzła chłonnego pozwala na dalszą analizę potomstwa komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej EYFP. Sekcje kriogeniczne i analiza immunofluorescencyjna węzła chłonnego ujawniają, że komórki pochodzące z tkanki tłuszczowej EYFP dodatnie migrują do węzła chłonnego, gdzie przyczyniają się do przepływu sieci komórek zrębu GP 38 dodatnich E RTR z siedmioma dodatnimi węzłami chłonnymi Analiza cytometryczna potwierdza, że ważna frakcja komórek zrębu węzłów chłonnych pochodzi z lokalnych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z dodatnim EYFP, przyczyniając się do 30% CD 45 ujemnych G 38 dodatnich CD 31 FIBROBLASTÓW frakcja i 10% CD 45 ujemna GP 38 ujemna CD 31 dodatnia frakcja komórek śródbłonka krwi do 80% CD 45, ujemna frakcja fibroblastyczna CD 38 ujemna G 38 może pochodzić z komórek prekursorowych tkanki tłuszczowej, co wskazuje na kluczową rolę, jaką odgrywa tkanka tłuszczowa w podtrzymywaniu wzrostu zrębu węzłów chłonnych. Tak więc kiedyś opanował tę technikę z badaczem w dziedzinie organogenezy limfoidalnej, aby zbadać rolę różnych cząsteczek zaangażowanych w uraz limfoidalny.