Name: Generowanie chimer poduszeczek tłuszczowych węzłów chłonnych do badania pochodzenia komórek zrębu węzłów chłonnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj generowanie chimer poduszeczek tłuszczowych węzłów chłonnych w myszach, aby badać pochodzenie komórek zrębu. Ta metoda pozwala ocenić wkład tkanki tłuszczowej w rozwój układu odpornościowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni personelowi Jednostki Usług Biomedycznych Uniwersytetu w Birmingham za opiekę nad naszymi koloniami zwierząt. Prace te były wspierane przez zintegrowany projekt INFLACARE dla JC realizowany w ramach 7PR UE.

Myszy były hodowane i utrzymywane w warunkach SPF w Jednostce Usług Biomedycznych na Uniwersytecie w Birmingham, zgodnie z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych i lokalnej komisji etyki. Wszystkie procedury opisane w niniejszym protokole są objęte licencją projektu zatwierdzoną zarówno przez lokalną komisję etyczną, jak i Ministerstwo Spraw Wewnętrznych.
1. Izolacja noworodków
<ol>
	<li>Poświęć nowonarodzone myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Przekrój głowę i otwórz ciało nożyczkami od góry okolicy klatki piersiowej do dołu okolicy brzusznej i ostrożnie usuń wszystkie wnętrzności (serce, płuca, wątrobę, jelito, nerki, pęcherz moczowy) z jamy brzusznej.</li>
	<li>Przenieść ciało na 90-milimetrową szalkę Petriego zawierającą pożywkę RF10 (pożywka RPMI1640 uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy). Począwszy od tego etapu, tkanki będą przechowywane w sterylnych warunkach i przenoszone w kapturze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Przenieść ciało na nową szalkę Petriego o średnicy 90 mm zawierającą RF10.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie oderwij otrzewną od skóry w okolicy pachwinowej. LN pachwinowy znajduje się na przecięciu trzech naczyń krwionośnych w poduszce tłuszczowej.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij LN. Upewnij się, że cała tkanka tłuszczowa została usunięta. Przenieść LN na płytkę Petriego o średnicy 50 mm zawierającą pożywkę RF10. Trzymaj chusteczki na lodzie, kontynuując procedurę.</li>
</ol>
2. Izolacja poduszek tłuszczowych E18.5
<ol>
	<li>Aby wygenerować zarodki myszy w 18,5 dniu ciąży (E18,5), zaplanuj ciążę w czasie, umieszczając samicę i samca myszy w klatce na noc. Oddziel myszy rano i sprawdź, czy nie ma czopów pochwowych (dzień ciąży E0,5).
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji zatkane samice w 18,5 dniu ciąży przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
		<li>Usuń zarodki i umieść je na szalce Petriego o średnicy 90 mm zawierającej RF10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Począwszy od tego etapu, tkanki powinny być przenoszone przy użyciu sterylnej techniki w kapturze do hodowli tkankowej. Pod mikroskopem preparacyjnym przekrój głowę, otwórz zarodki nożyczkami od okolicy klatki piersiowej do dna jamy brzusznej i ostrożnie usuń wszystkie wnętrzności (serce, płuca, wątrobę, jelito, nerki, pęcherz moczowy) z jamy ciała.</li>
	<li>Oczyść ciało ze wszystkich pozostałych tkanek trzewnych i umyj je w PBS, aby wyeliminować wszelkie ślady krwi, które mogłyby utrudnić sekcję.</li>
	<li>Przenieść czyste ciała na świeżą szalkę Petriego o średnicy 90 mm zawierającą RF10.</li>
	<li>Ostrożnie odłącz otrzewną od skóry w okolicy pachwinowej. LN pachwinowy znajduje się na przecięciu trzech naczyń krwionośnych w poduszce tłuszczowej.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij LN i wyrzuć go. Bardzo ważne jest całkowite usunięcie LN, aby upewnić się, że poduszeczka tłuszczowa używana do chimer nie jest zanieczyszczona żadnymi limfoidalnymi komórkami zrębu.</li>
	<li>Usunąć pachwinową poduszkę tłuszczową i przenieść ją na płytkę Petriego o średnicy 50 mm zawierającą pożywkę RF10. Trzymaj chusteczki na lodzie, kontynuując procedurę.</li>
</ol>
3. Generacja Chimery LN-fat Pad
<ol>
	<li>Przygotowanie systemu do hodowli narządów in vitro 15.
	<ol>
		<li>Przygotowanie gąbek i filtrów: Można to zrobić z wyprzedzeniem, a gąbki i filtry przechowywać w sterylnej postaci na szalce Petriego w okapie hodowlanym.
		<ol>
			<li>Pokrój Vulkan Underwrap na 1-1,5 cm2 kawałki</li>
			<li>Gotuj biszkopty przez 2 godziny w wodzie destylowanej.</li>
			<li>Pozostaw gąbki do wyschnięcia na kilka godzin w kapturze do hodowli komórkowych.</li>
			<li>Gotuj filtry przez 20 minut.</li>
			<li>Pozostaw filtry do wyschnięcia na kilka godzin w kapturze do hodowli komórkowych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj pożywkę DMEM uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, 10 mM HEPES, 1x MEM Nieistotny roztwór aminokwasów, 50 mM 2-merkaptoetanolu, 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy.</li>
		<li>Dodać 2 ml pożywki na szalce Petriego o średnicy 50 mm.</li>
		<li>Ułóż jedną biszkopt na dnie szalki Petriego. Zwilż obie strony gąbki, zanurzając je w podłożu.</li>
		<li>Umieść jeden filtr na gąbce. Filtr jest umieszczony na granicy faz ciecz-powietrze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie ponownie powiąż jednego nowonarodzonego LN z jedną embrionalną poduszką tłuszczową.</li>
	<li>Umieść chimerę LN-fat pad na wierzchu filtra.</li>
	<li>Przenieś szalkę Petriego do prostokątnego plastikowego pudełka z kilkoma otworami w pokrywie i zawierającym wodę na dnie, aby zapewnić wilgotność.</li>
	<li>Uszczelnij pokrywę do pudełka taśmą. Pozostaw dwa otwory w pokrywie otwarte.</li>
	<li>Przenieść pudełko do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 . Pozwól pudełku zrównoważyć się przez 2 godziny, zanim uszczelnisz otwory w pokrywie taśmą.</li>
	<li>Inkubować tkanki przez co najmniej 2 dni, aby LN mógł przyczepić się do poduszeczki tłuszczowej i mógł zostać przeniesiony pod torebkę nerkową.</li>
</ol>
4. Przeniesienie chimery poduszeczki tłuszczowej LN pod torebkę nerkową myszy gospodarzy
<ol>
	<li>Zbierz chimery poduszeczek tłuszczowych LN z filtra i przenieś je pod torebkę nerkową myszy gospodarza. Sposób transferu torebki nerkowej został już opisany 16.</li>
</ol>
5. Izolacja przenoszonych LN
<ol>
	<li>Po 3-4 tygodniach pod torebką nerkową chimery poduszeczek tłuszczowych LN są gotowe do zbioru. Poddaj myszy eutanazji gospodarza zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.</li>
	<li>Usuń nerkę z myszy gospodarza.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym wyizoluj chimerę poduszeczki tłuszczowej LN i wypreparuj LN.</li>
</ol>
6. Trawienie enzymatyczne przenoszonych LN do analizy cytometrycznej przepływowej
<ol>
	<li>Wykonaj jedno nacięcie w LN małymi nożyczkami, aby enzymy mogły przeniknąć do narządu i ułatwić trawienie.</li>
	<li>Umieścić jeden LN w 1,5 ml Eppendorf zawierającym 600 μl buforu wytrawiającego (RPMI 1% FCS, 2,5 mg/ml Kolagenaza D, 100 μg/ml DNazy I).</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C na mieszającym bloku termicznym. Pipetuj w górę i w dół, aby pomóc w dysocjacji tkanek co 10 minut.</li>
	<li>Dodaj 6 μl EDTA 0,5 M do probówki i pipetuj w górę iw dół, aby zakończyć dysocjację tkanek.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 490 x g.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w roztworze barwiącym (PBS, 0,1% BSA, 5% surowicy szczura i 5% surowicy myszy) zawierającej kombinację przeciwciał pierwszorzędowych.</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut na lodzie.</li>
	<li>Umyć dwukrotnie w PBS</li>
	<li>W razie potrzeby inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez 20 minut.</li>
	<li>Umyć 2x w PBS.</li>
	<li>Analiza na cytometrze przepływowym.</li>
</ol>
7. Analiza przeniesionych LN za pomocą immunofluorescencji
<ol>
	<li>Utrwalanie w celu konserwacji EYFP podczas procesu zamrażania i kriosekcji: Umieść LN w roztworze PBS, 4% PFA i 10% sacharozy i pozostaw na 3-4 godziny.</li>
	<li>Umieść jedną małą kroplę zimnego związku OCT na małym kawałku folii aluminiowej. Unikaj pęcherzyków powietrza. Ostrożnie umieść LN bez płynu w środku kropli.</li>
	<li>Zamrozić narząd, umieszczając folię aluminiową na suchym lodzie.</li>
	<li>Wytnij odcinki o grubości 8-10 μm na dodatkowych szkiełkach samoprzylepnych za pomocą kriostatu. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 2 godziny przed przechowywaniem ich w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Procedury barwienia mogą się różnić w zależności od zastosowanych przeciwciał pierwotnych i mogą być zoptymalizowane na podstawie poniższego protokołu. Wybarwić skrawki roztworem barwiącym (PBS, 1% BSA) zawierającym kombinację przeciwciał pierwszorzędowych.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Prać dwukrotnie w PBS przez 5 minut</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę.</li>
	<li>Prać dwa razy w PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Zamontuj slajdy w nośniku montażowym zawierającym DAPI.</li>
	<li>Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego.</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+contributions+to+the+homeostasis+and+functionality+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stromal cell contributions to the homeostasis and functionality of the immune system.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 618-629 (2009).</li>
<li>Roozendaal, R., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-immune cell interactions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 23-43 (2011).</li>
<li>Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stromal+and+haematopoietic+antigen-presenting+cells+that+reside+in+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 813-825 (2010).</li>
<li>Katakai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizer-like+reticular+stromal+cell+layer+common+to+adult+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Organizer-like reticular stromal cell layer common to adult secondary lymphoid organs.</a> J. Immunol. 181, 6189-6200 (2008).</li>
<li>Link, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+in+lymph+nodes+regulate+the+homeostasis+of+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells.</a> Nat. Immunol. 8, 1255-1265 (2007).</li>
<li>Benezech, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+stromal+organizer+cells+during+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of stromal organizer cells during lymph node development.</a> J. Immunol. 184, 4521-4530 (2010).</li>
<li>Cupedo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presumptive+lymph+node+organizers+are+differentially+represented+in+developing+mesenteric+and+peripheral+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Presumptive lymph node organizers are differentially represented in developing mesenteric and peripheral nodes.</a> J. Immunol. 173, 2968-2975 (2004).</li>
<li>Avan de Pavert, S., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+development+of+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">New insights into the development of lymphoid tissues.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 664-674 (2010).</li>
<li>Vondenhoff, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTbetaR+signaling+induces+cytokine+expression+and+up-regulates+lymphangiogenic+factors+in+lymph+node+anlagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">LTbetaR signaling induces cytokine expression and up-regulates lymphangiogenic factors in lymph node anlagen.</a> J. Immunol. 182, 5439-5445 (2009).</li>
<li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes Dev. 13, 2412-2424 (1999).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peripheral+lymph+node+genesis+by+the+tumor+necrosis+factor+family+member+TRANCE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of peripheral lymph node genesis by the tumor necrosis factor family member TRANCE.</a> J. Exp. Med. 192, 1467-1478 (2000).</li>
<li>Carragher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stroma-derived+defect+in+NF-kappaB2-%2F-+mice+causes+impaired+lymph+node+development+and+lymphocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A stroma-derived defect in NF-kappaB2-/- mice causes impaired lymph node development and lymphocyte recruitment.</a> J. Immunol. 173, 2271-2279 (2004).</li>
<li>White, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+a-dependent+and+-independent+signals+regulate+stromal+organizer+cell+homeostasis+during+lymph+node+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin a-dependent and -independent signals regulate stromal organizer cell homeostasis during lymph node organogenesis.</a> Blood. 110, 1950-1959 (2007).</li>
<li>Benezech, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin-beta+receptor+signaling+through+NF-kappaB2-RelB+pathway+reprograms+adipocyte+precursors+as+lymph+node+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin-beta receptor signaling through NF-kappaB2-RelB pathway reprograms adipocyte precursors as lymph node stromal cells.</a> Immunity. 37, 721-734 (2012).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+pancreatic+islets+into+the+kidney+capsule+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice.</a> J. Vis. Exp. (9), e404(2007).</li>
<li>Krautler, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+dendritic+cells+emerge+from+ubiquitous+perivascular+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Follicular dendritic cells emerge from ubiquitous perivascular precursors.</a> Cell. 150, 194-206 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule przedstawiono metodę oznaczania i ilościowego określania udziału komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej w rozwoju LN oraz dwie techniki pozwalające na analizę ich potomstwa. Rozwarstwianie embrionalnych poduszeczek tłuszczowych i noworodków LN jest delikatne i wymaga umiejętności manualnych zdobytych przez wiele ćwiczeń przed wygenerowaniem właściwej chimery LN - poduszeczki tłuszczowej. Aby kontrolować jakość rozwarstwień, można przeprowadzić analizę cytometryczną przepływową na poduszeczkach tłuszczowych...

Węzły chłonne (LN) są kluczowymi organami układu odpornościowego położonymi w strategicznych miejscach ciała, wzdłuż sieci naczyń limfatycznych. Umożliwiają one filtrację antygenów i patogenów oraz zapewniają miejsce prezentacji antygenu do limfocytów i indukcji adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych. Zrąb, który tworzy podstawową strukturę LN i koordynuje ruch różnych hematopoetycznych uczestników adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, ma kluczowe znaczenie dla funkcji tych narządów. Różne populacje komórek zrębu dostarczają niezbędnych i specyficznych wskazówek dotyczących ruchów, lokalizacji, przeżycia, proliferacji i dojrzewania składnika krwiotwórczego układu odpornościowego1-3. Dorosłe komórki zrębu LN dzielą się na trzy kategorie: komórki śródbłonka krwi, komórki śródbłonka limfatycznego i fibroblasty. Te trzy kategorie obejmują populacje niejednorodne. Populacje fibroblastyczne zawierają fibroblastyczne komórki siatkowate (FRC), pęcherzykowe komórki dendrytyczne (FDC), brzeżne komórki siatkowate (MRC), podczas gdy fibroblasty tworzące torebkę, rdzeń i inne komórki, które nie są jeszcze zidentyfikowane1-5. Pochodzenie i mechanizmy rządzące dojrzewaniem różnych populacji komórek zrębu LN są niejasne, a brak specyficznych markerów umożliwiających mapowanie losów określonych populacji komórek zrębu LN sprawia, że ich badanie jest szczególnie trudne. Jednak pełne zrozumienie ontogenezy komórek zrębu LN jest niezbędne do zrozumienia adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych, mechanizmów przyczyniających się do tolerancji i leżących u podstaw rozwoju sztucznych LN.
Do tej pory badania nad pochodzeniem i rozwojem komórek zrębu LN ograniczały się głównie do bezpośredniej oceny rozwoju LN u zarodków i noworodków u myszy dzikich i różnych szczepów myszy z nokautem6-9. Podejścia te są ograniczone przez letalność embrionalną i okołoporodową niektórych szczepów myszy przenoszących delecje w genach ważnych dla rozwoju LN. Co więcej, niektóre geny niezbędne do rozwoju tkanki limfatycznej są również zaangażowane w szeroki zakres procesów biologicznych, jak ma to miejsce w przypadku RANK10-11 lub NF-κB212. Aby rozwiązać te problemy, przeprowadzono izolację i przeszczepienie embrionalnych LN pod torebkę nerkową myszy gospodarza12-13. Technika ta pozwala na przykład na transfer genetycznie zmodyfikowanych embrionalnych LN w środowisku typu dzikiego w celu oceny rozwoju narządów oraz rekrutacji i organizacji komórek gospodarza. Jednak wzrost zarodka LN przeszczepionego pod torebką nerkową dorosłego gospodarza jest upośledzony, co ogranicza stosowanie tej techniki.
LN i złogi tłuszczu są anatomicznie ściśle powiązane i rozwijają się jednocześnie podczas embriogenezy. Niedawno wykazaliśmy, że asocjacja LN / tkanka tłuszczowa odgrywa kluczową rolę w dostarczaniu komórek progenitorowych komórek zrębu dla LN. W szczególności sygnalizacja przez LTβR kontroluje los komórek prekursorowych adipocytów poprzez blokowanie adipogenezy i zamiast tego promowanie dojrzewania w kierunku fenotypu komórek zrębu LN14. W tym miejscu opisujemy metodę opartą na generowaniu chimer poduszeczek tłuszczowych LN, które pozwalają na śledzenie komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej w rozwijającym się LN. Metoda ta będzie przydatna do określenia udziału tkanki tłuszczowej w różnych populacjach komórek zrębu LN, a w połączeniu z wykorzystaniem tkanek z genetycznie zmodyfikowanych szczepów myszy, pozwoli lepiej zrozumieć mechanizmy kontrolujące różnicowanie różnych podzbiorów komórek zrębu LN.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Sterilin Petri Szalka Appleton</td><td>Woods</td><td>SC265</td><td></td></tr><tr><td>90 mm Sterilin Petri Szalka Appleton</td><td>Woods</td><td>SC260</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka samoprzylepne</td><td>Surgipath</td><td>00202</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz CD31 eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0311</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz CD4 Alexa 647</td><td>eBioscience</td><td>51-0041</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysia CD45 PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysia IgM rodamina Red</td><td>Stratech</td><td>715-296-020-JIR</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysia podoplanina PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>127411</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysia podoplanina oczyszczona</td><td>eBioscience</td><td>14-5381</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche</td><td></td><td></td>11088858001</tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze Inox Biologie</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>Bardzo cienkie kleszcze do preparacji zarodków i noworodków</td></tr><tr><td>Roztwór EDTA 0,5 M</td><td>Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>ERTR-7</td><td>Biogenesis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Hartowane nożyczki do drobnej tęczówki proste 11 cm</td><td>FST</td><td>14090-11</td><td>Małe nożyczki do preparacji</td></tr><tr><td>Roztwór HEPES</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Filtry membranowe izoporowe 0,8 &mu; m ATTP</td><td>Millipore</td><td>ATTPO 1300</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nieistotny roztwór aminokwasów (100x)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe pudełko z pokrywką</td><td>Watkins and Doncaster</td><td>E6052</td><td>Pudełko na kanapki do hodowli narządów in vitro. Wywierć dwa otwory w pokrywie, aby umożliwić wymianę gazową w inkubatorze CO2.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Gąbki Vulkan Underwrap</td><td>Patterson Medical</td><td>004383</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>LEICA MZ95</td><td>Mikroskop preparacyjny z zoomem</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5436</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Medium montażowe z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie chimer poduszeczek tłuszczowych węzłów chłonnych do badania pochodzenia komórek zrębu węzłów chłonnych

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Zrąb jest kluczowym elementem struktury i funkcji węzłów chłonnych. Niewiele jednak wiadomo o jego pochodzeniu, dokładnym składzie komórkowym i mechanizmach rządzących jego powstawaniem. Węzły chłonne są zawsze zamknięte w tkance tłuszczowej i niedawno wykazaliśmy znaczenie tej zależności dla powstawania zrębu węzłów chłonnych. Komórki prekursorowe adipocytów migrują do węzła chłonnego podczas jego rozwoju i po zaangażowaniu receptora Lymphotoxin-b wyłączają adipogenezę i różnicują się w limfoidalne komórki zrębu (Bénézech i wsp.14). Opierając się na potencjale zrębu limfatycznego tkanki tłuszczowej, przedstawiamy metodę wykorzystującą chimerę węzła chłonnego/poduszeczki tłuszczowej, która umożliwia śledzenie linii prekursorów komórek zrębu węzłów chłonnych. Pokazujemy, jak wyizolować węzły chłonne noworodka i zarodkową tkankę tłuszczową EYFP+ oraz wykonać chimerę poduszeczki tłuszczowej LN/EYFP+. Po przeniesieniu pod torebkę nerkową myszy gospodarza, węzeł chłonny zawiera lokalne komórki prekursorowe tkanki tłuszczowej i kończy jej tworzenie. Analizę potomstwa komórek poduszeczek tłuszczowych EYFP+ w powstałych węzłach chłonnych można przeprowadzić za pomocą analizy cytometrycznej cytometrycznej trawionych enzymatycznie węzłów chłonnych lub za pomocą analizy immunofluorescencyjnej kriosekcji węzłów chłonnych. Wykorzystując poduszeczki tłuszczowe z różnych modeli myszy z nokautem, metoda ta zapewni skuteczny sposób analizy pochodzenia różnych populacji komórek zrębu węzłów chłonnych.

Trzy tygodnie po transplantacji chimera LN/tkanka tłuszczowa jest pobierana z nerki. Chimera przypomina teraz bardzo zwykły węzeł chłonny w jego własnej tkance tłuszczowej, a LN jest widoczny w centrum tkanki tłuszczowej (Rysunek 1). Jeśli LN nie można zidentyfikować, możliwe jest, że został on utracony podczas transplantacji do nerki. Przy ocenie roli genów potencjalnie istotnych dla rozwoju LN, odzyskane LN mogą pozostać bardzo małe i trudniejsze do znalezienia. Ma to miejsce w przypadku, gdy tkanka tł...

Opisano wytwarzanie chimer węzłów chłonnych/poduszeczek tłuszczowych do badania pochodzenia komórek zrębu węzłów chłonnych. Metoda polega na izolacji węzłów chłonnych od nowonarodzonych myszy i embrionalnych poduszeczek tłuszczowych, wytworzeniu chimerycznych poduszek tłuszczowych węzłów chłonnych i ich przeniesieniu pod torebkę nerkową myszy gospodarza.

Generowanie chimer poduszeczek tłuszczowych węzłów chłonnych do badania pochodzenia komórek zrębu węzłów chłonnych

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie chimery z tkanki tłuszczowej i węzła chłonnego w celu oceny udziału tkanki tłuszczowej w tworzeniu zrębu węzłów chłonnych. Osiąga się to najpierw poprzez wyizolowanie węzłów chłonnych od nowonarodzonych myszy oraz poduszek tłuszczowych z embrionów myszy w 18,5 dniu rozwoju. Węzeł chłonny zostaje usunięty z embrionalnej poduszki tłuszczowej i zastąpiony węzłem chłonnym nowonarodzonej myszy.Chimera z tkanki tłuszczowej i węzła chłonnego jest tworzona poprzez ponowne połączenie, a następnie hodowlę in vitro jednego noworodkowego węzła chłonnego z jedną embrionalną tkanką tłuszczową. Następnie chimerę przeszczepia się pod torebkę nerki myszy biorcy. Trzy tygodnie po transplantacji pobiera się nerkę i odzyskuje chimerę.Ostatecznie wkład komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej w zrąb węzła chłonnego można ocenić za pomocą analizy cytometrycznej i mikroskopii immunofluorescencyjnej. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy szukaliśmy sposobu na ocenę, czy komórki z tkanki tłuszczowej przyczyniają się do formowania węzłów chłonnych. Aby wyizolować pachwinowe węzły chłonne noworodka, po odcięciu głowy należy użyć nożyczek, aby otworzyć ciało zwierzęcia od górnej części klatki piersiowej do dolnej części brzucha.Po ostrożnym usunięciu wszystkich organów wewnętrznych z jamy brzusznej, umieść ciało w 90 milimetrowej płytce Petriego zawierającej medium RF 10. Umieść płytkę w sterylnej komorze do hodowli tkanek, a następnie przenieś ciało do nowej sterylnej 90 milimetrowej płytki Petriego zawierającej świeże medium RF 10. Następnie ostrożnie oddziel otrzewną od skóry w okolicy pachwinowej i zlokalizuj węzły chłonne pachwinowe znajdujące się w poduszce tłuszczowej na przecięciu trzech naczyń krwionośnych.Ostrożnie usuń węzły chłonne, upewniając się, że usunięto całą tkankę tłuszczową. Następnie umieść węzły chłonne w 50 milimetrowej szalce Petriego zawierającej medium RF 10 na lodzie, aby wyizolować poduszki tłuszczowe pachwinowe z embrionów z dnia 18.5. Po usunięciu trzewi, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, przemyj ciała w sterylnym PBS, aby usunąć wszelkie ślady krwi.Przenieś oczyszczone ciała do nowej szalki Petriego o średnicy 90 milimetrów, a następnie oddziel otrzewną, zlokalizuj węzeł chłonny pachwinowy i usuń go w sposób zaprezentowany przed chwilą. Pozbyć się wyizolowanej tkanki. Należy zadbać o usunięcie całego węzła chłonnego, aby uniknąć zanieczyszczenia chimery tkanki tłuszczowej.Następnie usunąć pachwinową tkankę tłuszczową i umieścić ją w 50 milimetrowej szalce Petri z pożywką RF 10 na lodzie. Aby przygotować system hodowli organów in vitro, najpierw pociąć Vulcan under wrap na kawałki o wielkości od 1 do 1,5 centymetra kwadratowego. Następnie gotować gąbki przez dwie godziny, a filtry przez 20 minut w wodzie destylowanej, a potem pozostawić je do wyschnięcia przez kilka godzin w komorze do hodowli komórek.Po wyschnięciu materiałów, umieść po jednej gąbce w szalce Petriego o średnicy 50 milimetrów zawierającej dwa mililitry pożywki. Zanurz każdą gąbkę w pożywce, aby zwilżyć obie jej strony, a następnie umieść po jednym filtrze w każdym systemie hodowli organów in vitro na granicy fazy ciekłej i powietrznej. Następnie ostrożnie połącz jedną embrionalną tkankę tłuszczową z jednym węzłem chłonnym noworodka bezpośrednio na górnej powierzchni każdego filtra.Przenieś szalki Petriego do prostokątnego plastikowego pojemnika z wodą na dnie i otworami w pokrywie. Przyklej pokrywę do pojemnika taśmą, pozostawiając otwory odsłonięte. Następnie umieść pojemnik w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.Pozostaw pojemnik na dwie godziny w celu wyrównania parametrów, a następnie zaklej otwory w pokrywie taśmą. Inkubuj tkanki przez co najmniej dwa dni, aby węzły chłonne przytwierdziły się do poduszek tłuszczowych przed przeniesieniem ich pod torebkę nerki, trzy do czterech tygodni po transplantacji. Wyizoluj każdą chimerę węzła chłonnego i poduszki tłuszczowej z każdej nerki, a następnie wypreparuj węzły chłonne.Następnie w każdym węźle chłonnym, za pomocą małych nożyczek, wykonaj pojedyncze nacięcie w tkance, aby wspomóc trawienie enzymatyczne. Następnie umieść każdy węzeł chłonny w oddzielnej probówce typu eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającej 600 µL buforu do trawienia. Inkubuj probówki przez 30 minut w temperaturze 37 °C w bloku termicznym z funkcją mieszania, pipetując w górę i w dół co 10 minut, aby ułatwić dysocjację tkanki.Następnie do probówek należy dodać 6 µL EDTA i kilka razy pipetować zawiesinę komórkową, aby dokończyć dysocjację. Komórki można następnie barwić wybranymi przeciwciałami i analizować metodą cytometrii przepływowej w celu zachowania ekspresji ulepszonego żółtego białka fluorescencyjnego (EYFP). Węzły chłonne należy utrwalać przez trzy do czterech godzin.Następnie dla każdego węzła chłonnego nanieście jedną kroplę zimnego związku OCT na mały kawałek folii aluminiowej. Unikając pęcherzyków powietrza, ostrożnie umieśćcie jeden węzeł chłonny na środku każdej kropli, a następnie połóżcie folię na suchym lodzie, aby zamrozić tkanki. Węzły chłonne można następnie pociąć na skrawki, zabarwić i poddać analizie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Staranna izolacja węzła chłonnego umożliwia dalszą analizę potomstwa komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej wykazujących ekspresję EYFP. Przekroje mrożone oraz analiza immunofluorescencyjna węzła chłonnego wykazują, że komórki pochodzące z tkanki tłuszczowej EYFP+ migrują do węzła chłonnego, gdzie współtworzą sieć komórek stroma węzła chłonnego GP38+ ER-TR7+. Analiza cytometryczna potwierdza, że istotna frakcja komórek stroma węzła chłonnego pochodzi z lokalnych progenitorowych komórek tkanki tłuszczowej EYFP+, stanowiąc 30% frakcji fibroblastycznej CD45- GP38+ CD31- oraz 10% frakcji komórek śródbłonka naczyniowego CD45- GP38- CD31+. Aż 80% frakcji fibroblastycznej CD45- GP38+ CD31- może pochodzić z komórek prekursorowych tkanki tłuszczowej, co demonstruje kluczową rolę tkanki tłuszczowej w podtrzymywaniu wzrostu stroma węzła chłonnego. Opanowanie tej techniki pozwoli badaczowi w dziedzinie organogenezy tkanek limfatycznych na zgłębienie roli różnych cząsteczek zaangażowanych w rozwój stroma tkanek limfatycznych.

generation-lymph-node-fat-pad-chimeras-for-study-lymph-node-stromal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Generowanie chimer tłuszczowo-węzłowych dla badania pochodzenia komórek stromy węzłów chłonnych

W niniejszym filmie zaprezentowano przygotowanie kultur reaggregatów grasicy traktowanych 2-dGuo.

Reagregacja kultur grasicy

Izolacja komórek zrębu węzłów chłonnych to wieloetapowa procedura obejmująca trawienie enzymatyczne i mechaniczną dezagregację w celu uzyskania fibroblastycznych komórek siatkowatych, limfatycznych i komórek śródbłonka krwi. W opisanej procedurze krótkie trawienie jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych.

Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych

Ta praca demonstruje nowatorskie podejście do oceny proliferacji, różnicowania i potencjału tworzenia naczyń krwionośnych komórek macierzystych śródbłonka (VESCs) poprzez przeszczep poduszeczki tłuszczowej sutka, a następnie przygotowanie całej tkanki do obserwacji mikroskopowej. Przedstawiono również strategię śledzenia linii w celu zbadania zachowania VESC in vivo.

Nowatorska technika przeszczepu poduszeczki tłuszczowej sutka w celu wizualizacji wytwarzania naczyń krwionośnych śródbłonka

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Ten protokół opisuje technikę obrazowania różnych populacji komórek w drenujących węzłach chłonnych bez zmian w strukturze narządu.

Wizualizacja struktury węzłów chłonnych i lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej ex-vivo

Ten protokół opisuje generowanie mieszanych chimer mysiego szpiku kostnego ze spontanicznymi autoimmunologicznymi centrami zarodkowymi, w których autoreaktywne limfocyty zawierają fotoaktywowane białko zielonej fluorescencji (PA-GFP). Daje to możliwość powiązania lokalizacji komórkowej w tkankach z dalszymi analizami molekularnymi i funkcjonalnymi.

Badanie poszczególnych autoreaktywnych ośrodków rozrodczych metodą fotoaktywacji w mieszanym chimerycznym modelu autoimmunizacji

Ten artykuł opisuje metodę przeszczepiania komórek nabłonka sutka szczura dawcy do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami u zwierząt biorców. Metoda ta może być stosowana do badania wpływu gospodarza i/lub dawcy na rozwój nabłonka sutka i eliminuje potrzebę wstępnego oczyszczania, zwiększając w ten sposób przydatność tej techniki.

Przeszczep komórek nabłonkowych sutka szczura do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami

Ten protokół opisuje techniczne podejście do izolowania subpopulacji komórek zrębu adipogennych i włóknisto-zapalnych z mysich magazynów białej tkanki tłuszczowej (WAT) w jamie brzusznej poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub separację kulek immunomagnetycznych.

Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

Przedstawiony tutaj eksperymentalny projekt dostarcza użytecznego modelu reprodukcyjnego do badań specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+ podczas przerzutów do węzłów chłonnych (LN), co wyklucza zaburzenia limfocytów T CD8+ osób postronnych.

Model przerzutów do węzłów chłonnych drenujących do oceny dynamiki limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu podczas nowotworzenia

Ten artykuł opisuje protokół agregacji i hermetyzacji komórek śledziony w półstałej macierzy błony podstawnej. Konstrukty macierzy błony podstawnej mogą być wykorzystywane w hodowli trójwymiarowej do badania rozwoju organoidów lub do badań nad przeszczepami in vivo i regeneracją tkanek.

Agregacja komórek w kapsułkach macierzy błony podstawnej do badania tworzenia mysiej tkanki śledziony

Poznaj generowanie chimer poduszeczek tłuszczowych węzłów chłonnych w myszach, aby badać pochodzenie komórek zrębu. Ta metoda pozwala ocenić wkład tkanki tłuszczowej w rozwój układu odpornościowego.

Generowanie chimer poduszeczek tłuszczowych węzłów chłonnych do badania pochodzenia komórek zrębu węzłów chłonnych

Przeglądaj więcej filmów