Kwantyfikacja i profilowanie wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą przestrajalnego rezystancyjnego wykrywania impulsów

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie i zwymiarowanie profilu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą przestrajalnego rezystancyjnego wykrywania impulsów. Standardowym podejściem jest porównanie aktualnych pomiarów blokady wykonanych z oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z tymi wykonanymi z wzorców kulek polistyrenowych. Drugim podejściem do charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jest nakłuwanie próbki kulkami polistyrenowymi, które są używane podczas pracy ze złożonymi próbkami, takimi jak nieoczyszczone pęcherzyki zewnątrzkomórkowe.

W pożywce do hodowli komórkowych uzyskane dane charakteryzują wielkość i liczbę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, niezależnie od tego, czy są one oczyszczone, czy nieoczyszczone. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak western blotting lub cytometria przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych związanych z kulkami lateksowymi, jest to, że metoda ta charakteryzuje cząstki bezpośrednio w płynach biologicznych bez konieczności fizycznej izolacji lub znakowania. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, będą miały trudności, ponieważ pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niejednorodne.

Podczas próby wykrycia mniejszych pęcherzyków, większe pęcherzyki mogą zatkać nanopory. Dodaliśmy do protokołu kilka praktycznych wskazówek i sztuczek, aby szybko powrócić do warunków roboczych. Staraliśmy się zmniejszyć produkcję pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i potrzebowaliśmy metody ilościowego określenia stężenia pęcherzyków w hodowli komórkowej. Sieć Snet.

Poszukując metod charakteryzowania nanocząstek, natknęliśmy się na TRPS i zmodyfikowaliśmy jego protokoły, aby były bardziej odpowiednie do charakterystyki sles i hodowli komórkowych. S supernatanty i inne płyny biologiczne Rozpocznij od podłączenia przyrządu TRPS do komputera z zainstalowanym na nim oprogramowaniem pakietu sterowania. Pamiętaj, aby zminimalizować zakłócenia elektryczne, jak omówiono w protokole tekstowym.

Teraz wybierz rozmiar Nanopore. NP 100 jest najlepszym wyborem dla pęcherzyków o wielkości od 70 do 200 nanometrów, podczas gdy NP 150 może być używany do pęcherzyków o wielkości od 85 do 300 nanometrów. NP 200 lepiej nadaje się do pomiaru pęcherzyków o wielkości od 100 do 400 nanometrów.

Następnie wybierz uzupełniające cząstki kalibracyjne polistyrenu dla NP 100 i NP 150, wybierz cząstki kalibracyjne CPC 100 dla NP 200. Użyj cząstek kalibracyjnych CPC 200. Wiruj cząstki kalibracyjne przez 30 sekund.

Jeśli są one nadal zagregowane, należy zastosować sonikację, a następnie rozcieńczyć cząstki kalibracyjne w PBS do stężenia docelowego. W zależności od wielkości nanoporów ostateczna objętość musi wynosić co najmniej 40 mikrolitrów. Teraz zwilż dolną komórkę płynu instrumentu, nakładając 78 mikrolitrów PBS i natychmiast ją usuwając.

Zmniejsza to ryzyko tworzenia się pęcherzyków pod nanoporami. Następnie umieść Nanopore w ramionach instrumentu. Zmierz odległość między dwoma przeciwległymi ramionami za pomocą suwmiarki cyfrowej.

Wprowadź tę wartość do oprogramowania w polu o nazwie rozciąganie, a po wprowadzeniu kliknij kalibruj rozciąganie za pomocą bocznego pokrętła, które kontroluje odległość między przeciwnymi ramionami. Rozciągnij nanopory do 47 milimetrów. Po rozciągnięciu do odpowiedniego rozmiaru ponownie nałóż 78 mikrolitrów PBS na dolną komórkę płynu.

Rozpocznij proces kalibracji, umieszczając górną komórkę płynu na nanoporach i mocując klatkę ekranującą. Następnie dodaj 40 mikrolitrów rozcieńczonych cząstek kalibracyjnych do górnej komory płynu. Teraz zastosuj co najmniej 0,8 kilopaskali nadciśnienia.

Korzystając z modułu zmiennego ciśnienia lub VPM, wybierz dodatnie napięcie i kliknij włącz. Następnie powoli zmniejszaj rozciągnięcie, jednocześnie analizując blokadę. Zdarzenia spowodowane przez cząstki kalibracyjne.

Wraz ze zmniejszaniem się rozciągnięcia wysokość blokady będzie się stopniowo zwiększać, a tym samym poprawi się stosunek sygnału do szumu. Zwiększenie napięcia może również zwiększyć wysokość blokady, ale może również generować więcej szumów RMS. Przestań zmniejszać rozciągnięcie, gdy obserwowane blokady odpowiednio przekraczają poziomy tła, jak zaznaczono na panelu śledzenia sygnału.

Po drugie, obserwuj szybkość cząstek. Ma to jednak mniej rygorystyczną granicę. Szybkość cząstek powinna wynosić co najmniej 100 na minutę.

Jeśli jednak szybkość cząstek jest większa niż 2000 na minutę, rozcieńczyć próbkę i ponownie skalibrować przyrząd. Tak wysoka szybkość może prowadzić do niedokładnych pomiarów w tej demonstracji. Scharakteryzowano wcześniej oczyszczone pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z linii komórkowej guza mózgu.

Zacznij od załadowania cząstek kalibracyjnych do górnej prasy do ogniw płynu. Włącz, a następnie wywieraj nacisk za pomocą VPM i zapisz tutaj co najmniej 500 cząstek danych. Wywierany jest nacisk 0,8 kilopaskala.

Opcjonalnie można również wykonać pomiar wielu ciśnień, aby to zrobić, zwiększyć zastosowane ciśnienie i zapisać drugi plik kalibracyjny. Przyrosty ciśnienia muszą teraz wynosić co najmniej 0,2 kilopaskala, usunąć próbkę z górnej komórki i umyć komórkę trzy razy 100 mikrolitrami PBS na pranie. Po umyciu zetrzyj górną komórkę płynu niestrzępiącym się papierem.

Następnie dodaj próbkę eksperymentalną. Prąd linii bazowej musi mieścić się w zakresie 3% prądu obserwowanego podczas pomiaru cząstek kalibracyjnych. Jeśli nie, dotknij lub przekręć nasadkę ekranującą, nałóż tłok lub całkowicie usuń nanopory i zmyj je wodą.

Jeśli obserwowany prąd jest dobry, zastosuj dokładnie takie same ciśnienia, jakie zastosowano do cząstek kalibracyjnych. Następnie zapisz co najmniej 500 cząstek i zapisz plik danych. Jeśli nastąpi nagła przerwa w wykrywaniu cząstek, spadek prądu podstawowego lub nagły wzrost szumu RMS, wstrzymaj nagrywanie i spróbuj odblokować nanopory.

Tak jak poprzednio, odpipetować próbkę w górę i w dół. Postukać lub przekręcić nasadkę ekranującą, nałożyć tłok lub całkowicie usunąć nanopory i spłukać wodą DI. Inną strategią jest zwiększenie rozciągliwości nanoporów do 47 milimetrów i maksymalizacja ciśnienia z VPM przez około pięć minut.

Ponieważ może to również UNC odłączyć NPO w oprogramowaniu. Przejdź do zakładki analizuj dane i rozpocznij przetwarzanie danych, klikając prawym przyciskiem myszy opcję nieprzetworzone pliki i wybierz opcję przetwarzania plików. Następnie, aby sparować pliki próbki i kalibracji, kliknij pole wyboru obok próbki.

W skalibrowanej kolumnie wybierz odpowiednie pliki i w porządku. Wybory. Oprogramowanie będzie wyświetlać różne cechy próbki, takie jak rozmiar, rozkład, czas trwania linii bazowej, pełna szerokość, połowa maksimów i analiza stężenia.

Poniższe podejście stosuje się do próbek, takich jak płyny biologiczne, które prowadzą do nadmiernego zatkania przy użyciu standardowej metody w przygotowaniu, odwirować co najmniej 50 mikrolitrów kultury komórkowej. Supernatant zawierający pęcherzyki zewnątrzkomórkowe przez siedem minut w temperaturze 300 Gs. Należy również przygotować samą pożywkę kontrolną w ten sam sposób zarówno dla próbki, jak i dla kontroli. Przenieść 20 mikrolitrów supernatantu do nowych probówek i dodać 20 mikrolitrów PBS i 10 mikrolitrów rozcieńczonego bulionu polistyrenowego o długości 335 nanometrów w ilości 10 milionów kulek na mililitr.

Teraz ustaw instrument jak poprzednio, używając NP 200 Nanopore i zmierz próbkę kontrolną samych kulek w pożywce. Po pierwsze, aby zapewnić dokładność, wykrywanie tła małych cząstek niebędących kulkami musi być zminimalizowane do mniej niż 10% wykrywania kulek. Teraz zmierz każdą próbkę raz przed zarejestrowaniem powtórzeń.

Spowoduje to rozprowadzenie wahań warunków nanoporowych na próbki. Każda próbka powinna być mierzona trzykrotnie we wszystkich wykończeniach poprzez ponowny pomiar próbki tylko koralika kalibracyjnego. Później. Podczas analizy danych użyj arkusza kalkulacyjnego do obliczenia stężenia.

Przykładowa kalkulacja znajduje się w pisemnym protokole. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe oczyszczono z trzykomórkowej hodowli U 87 M-G-E-G-F-R-V, supernatantu przez ultrawirowanie, a następnie zmierzono przy użyciu opisanego protokołu przy użyciu kulek kalibracyjnych 115 nanometrów. Uzyskano rozkład wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe oznaczono również ilościowo bezpośrednio z supernatantu hodowli komórek glejaka, stosując alternatywne podejście, które zwiększa próbkę za pomocą wzorca. Zaobserwowano dwie populacje nanocząstek. Mniejsze pęcherzyki zewnątrzkomórkowe i większy znany standard, oszacowanie wielkości dwóch populacji na podstawie znanego standardu, zidentyfikowały populację pęcherzyków jako większą niż 140 nanometrów.

Mniejsze pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogły zostać wykryte przy użyciu mniejszego otworu nanoporowego, ale po opanowaniu byłoby więcej zatkania. Technikę tę można wykonać w ciągu jednej do czterech godzin, w zależności od liczby analizowanych próbek. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że próbki mogą wymagać dostosowania przegrody do protokołu.

Na przykład próbki składające się z większych pęcherzyków mogą wymagać użycia większych nanoporów przy stosunkowo dużym rozciągnięciu, a pomiary można ułatwić poprzez filtrowanie naszego wirowania próbek w celu usunięcia resztek komórkowych, które mogą rejestrować nanopory. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak scharakteryzować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe za pomocą TRPS. W zależności od próbki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych można zastosować standardowy protokół lub użyć metody skorygowanego skoku.