Kwantyfikacja i profilowanie wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą przestrajalnego rezystancyjnego wykrywania impulsów

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ilościowe określenie oraz profilowanie rozmiarów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu regulowanego czujnika impulsów rezystancyjnych. Standardowe podejście polega na porównaniu pomiarów blokady prądu uzyskanych z oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pomiarami uzyskanymi z polistyrenowych kulek wzorcowych. Drugim podejściem do charakteryzacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jest dodanie do próbki polistyrenowych kulek, co stosuje się w przypadku pracy z próbkami złożonymi, takimi jak nieoczyszczone pęcherzyki zewnątrzkomórkowe.

W przypadku pożywki do hodowli komórkowych otrzymane dane charakteryzują rozmiar i liczbę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, niezależnie od tego, czy są one oczyszczone, czy nieoczyszczone. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak western blotting czy cytometria przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych związanych z kuleczkami lateksowymi, jest to, że metoda ta charakteryzuje cząsteczki bezpośrednio w płynach biologicznych bez konieczności fizycznej izolacji lub znakowania. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są heterogeniczne pod względem rozmiaru.

Podczas prób wykrywania mniejszych pęcherzyków, większe pęcherzyki mogą zapchać nanopor. W protokole dodaliśmy kilka praktycznych wskazówek i sposobów, aby szybko przywrócić warunki umożliwiające pracę. Podjęliśmy próbę ograniczenia produkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i potrzebowaliśmy metod do ilościowego oznaczenia stężenia pęcherzyków w hodowli komórkowej.Snet.

W poszukiwaniu metod charakteryzacji nanocząstek zapoznaliśmy się z techniką TRPS i zmodyfikowaliśmy jej protokoły, aby były bardziej odpowiednie do charakteryzacji supernatantsów z hodowli komórkowych oraz innych płynów biologicznych. Rozpocznij od podłączenia instrumentu TRPS do komputera z zainstalowanym oprogramowaniem EyesOn Control Suite. Należy pamiętać o zminimalizowaniu zakłóceń elektrycznych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie należy wybrać rozmiar nanoporu. NP 100 jest najlepszym wyborem dla pęcherzyków o rozmiarze od 70 do 200 nanometrów, natomiast NP 150 można stosować dla pęcherzyków o rozmiarze od 85 do 300 nanometrów. NP 200 jest lepiej dostosowany do pomiaru pęcherzyków o rozmiarze od 100 do 400 nanometrów.

Następnie należy wybrać odpowiednie polistyrenowe cząsteczki kalibracyjne dla NP 100 i NP 150 oraz wybrać cząsteczki kalibracyjne CPC 100 dla NP 200. Należy użyć cząsteczek kalibracyjnych CPC 200. Cząsteczki kalibracyjne należy mieszać w wstrząsarzu wierzchołkowym przez 30 sekund.

Jeśli cząstki nadal pozostają zagregowane, należy zastosować sonikację, a następnie rozcieńczyć cząstki kalibracyjne w PBS do pożądanej koncentracji. W zależności od rozmiaru nanoporu objętość końcowa musi wynosić co najmniej 40 µL. Teraz należy zwilżyć dolną komorę płynową instrumentu, aplikując 78 µL PBS i natychmiast go usuwając.

Zmniejsza to ryzyko powstania pęcherzyków powietrza pod nanoporem. Następnie umieść Nanopore w ramionach urządzenia. Zmierz odległość między dwoma przeciwległymi ramionami za pomocą cyfrowego suwmiarki.

Wprowadź tę wartość do oprogramowania w polu o nazwie stretch, a następnie kliknij calibrate stretch, korzystając z bocznego pokrętła sterującego odległością między przeciwległymi ramionami. Rozciągnij nanopor do 47 mm. Po osiągnięciu odpowiedniego rozmiaru, ponownie nanieś 78 µL PBS do dolnej komórki z płynem.

Proces kalibracji należy rozpocząć od umieszczenia górnej komory płynowej na nanoporze i zamocowania klatki ekranującej. Następnie do górnej komory płynowej należy dodać 40 µL rozcieńczonych cząsteczek kalibracyjnych. Teraz należy przyłożyć nadciśnienie wynoszące co najmniej 0,8 kPa.

Używając modułu zmiennego ciśnienia (VPM), wybierz dodatnie napięcie i kliknij „włącz”. Następnie powoli zmniejszaj rozciągnięcie, analizując blokadę. Zdarzenia są wywoływane przez cząsteczki kalibracyjne.

Wraz ze zmniejszaniem rozciągania wysokość blokady będzie stopniowo rosła, co doprowadzi do poprawy stosunku sygnału do szumu. Zwiększenie napięcia może również zwiększyć wysokość blokady, ale może także wygenerować większy szum RMS. Należy zaprzestać zmniejszania rozciągania, gdy obserwowane blokady odpowiednio przekroczą poziomy tła odnotowane na panelu ścieżki sygnału.

Po drugie, należy sprawdzić liczbę cząsteczek na minutę. W tym przypadku kryterium odcięcia jest jednak mniej rygorystyczne. Idealnie liczba cząsteczek powinna wynosić co najmniej 100 na minutę.

Jeśli jednak liczba cząsteczek przekracza 2000 na minutę, należy rozcieńczyć próbkę i ponownie skalibrować urządzenie. Tak wysoka wartość może prowadzić do niedokładnych pomiarów w tej demonstracji. Charakteryzowane są wcześniej oczyszczone pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z linii komórkowej guza mózgu.

Zacznij od załadowania cząsteczek kalibracyjnych do górnej prasy komory płynowej. Włącz urządzenie, a następnie przyłóż ciśnienie za pomocą VPM i zarejestruj dane dla co najmniej 500 cząsteczek. Zastosowano ciśnienie 0,8 kilopascal.

Opcjonalnie, w celu wykonania tej operacji można przeprowadzić pomiar wielociśnieniowy: należy zwiększyć przyłożone ciśnienie i zapisać drugi plik kalibracyjny. Przyrosty ciśnienia muszą wynosić co najmniej 0,2 kilopascals. Następnie należy wyjąć próbkę z górnej komórki i przemyć komórkę trzykrotnie, używając 100 µL PBS podczas każdego płukania. Po przemyciu należy wytrzeć górną komórkę z cieczą za pomocą beztłumaczowego papieru.

Następnie dodaj próbkę eksperymentalną. Prąd bazowy musi mieścić się w granicach 3% prądu zaobserwowanego podczas pomiaru cząstek kalibracyjnych. Jeśli tak nie jest, stuknij lub przekręć nasadkę ekranującą, dociśnij tłok lub całkowicie wyjmij nanopor i przemyj go wodą DI.

Jeśli obserwowany prąd jest prawidłowy, zastosuj dokładnie takie same ciśnienia, jakie zastosowano w przypadku cząsteczek kalibracyjnych. Następnie zarejestruj co najmniej 500 cząsteczek i zapisz plik z danymi. W przypadku nagłego przerwania detekcji cząsteczek, spadku prądu bazowego lub nagłego wzrostu szumu RMS, wstrzymaj rejestrację i spróbuj udrożnić nanopor.

Podobnie jak poprzednio, pipetuj próbkę w górę i w dół. Opukaj lub przekręć osłonową nasadkę, dociśnij tłok lub całkowicie usuń nanopor i przemyj go wodą DI. Inną strategią jest zwiększenie rozciągnięcia nanoporu do 47 milimetrów i maksymalizacja ciśnienia z VPM przez około pięć minut.

Można również odłączyć NPO w oprogramowaniu. Przejdź do karty analizy danych (analyze data) i rozpocznij przetwarzanie danych, klikając prawym przyciskiem myszy opcję plików nieprzetworzonych (unprocessed files), a następnie wybierz opcję przetwarzania plików (process files). Aby powiązać pliki próbek i kalibracyjne, zaznacz pole wyboru obok danej próbki.

W kolumnie kalibracji wybierz odpowiednie pliki i zatwierdź wybór. Oprogramowanie wyświetli różne charakterystyki próbek, takie jak rozmiar, rozkład, czas trwania linii bazowej, pełna szerokość po połowie maksimum oraz analitykę stężeń.

Poniższe podejście stosuje się w przypadku próbek, takich jak płyny biologiczne, które podczas przygotowania standardową metodą powodują nadmierne zapychanie: odwiruj co najmniej 50 µL nadnadstankowi z hodowli komórkowej zawierającego pęcherzyki zewątkórkowe przez siedem minut przy 300 Gs. W ten sam sposób przygotuj kontrolę z samym medium, zarówno dla próbki, jak i dla kontroli. Przenieś 20 µL nadnadstanku do nowych probówek i dodaj 20 µL PBS oraz 10 µL rozcieńczonego roztworu polistyrenowych kulek o średnicy 335 nm w stężeniu 10 milionów kulek na mL.

Teraz przygotuj urządzenie w taki sam sposób jak wcześniej, używając NP 200 Nanopore, i zmierz próbkę kontrolną zawierającą jedynie kuleczki w medium. Po pierwsze, w celu zapewnienia dokładności, detekcja tła dla małych cząsteczek niebędących kuleczkami musi zostać zminimalizowana do poziomu poniżej 10% detekcji kuleczek. Następnie zmierz każdą próbkę raz przed wykonaniem pomiarów powtórzonych.

Pozwoli to na rozłożenie fluktuacji warunków w nanoporze na poszczególne próbki. Każdą próbkę należy zmierzyć łącznie trzy razy, kończąc proces ponownym pomiarem próbki zawierającej wyłącznie kule kalibracyjne. Później, podczas analizy danych, należy użyć programu arkusza kalkulacyjnego do obliczenia stężeń.

Przykładowe obliczenia zostały zawarte w pisemnym protokole. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe oczyszczono z supernatantu hodowli komórek U 87 M-G-E-G-F-R-V za pomocą ultrawirowania, a następnie zmierzono zgodnie z opisanym protokołem, wykorzystując kule kalibracyjne o rozmiarze 115 nanometrów. Uzyskano rozkład wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ilościowo określono również bezpośrednio z supernatantu hodowli komórek glejaka, stosując alternatywną metodę z dodatkiem standardu do próbki. Zaobserwowano dwie populacje nanocząstek. Na podstawie znanego standardu, w zestawieniu z mniejszymi pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi, oszacowano rozmiar obu populacji, co pozwoliło zidentyfikować populację pęcherzyków jako większą niż 140 nanometrów.

Mniejsze pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogłyby zostać wykryte przy użyciu otworu nanopora o mniejszej średnicy, jednak prowadziłoby to do częstszego zapychania. Po opanowaniu metody, procedura ta może zająć od jednej do czterech godzin, w zależności od liczby analizowanych próbek. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że próbki mogą wymagać wprowadzenia do protokołu korekt w zakresie przegród.

Na przykład próbki składające się z większych pęcherzyków mogą wymagać zastosowania większych nanoporów przy stosunkowo dużym rozciągnięciu; dodatkowo pomiar można ułatwić poprzez filtrowanie lub wirowanie próbek w celu usunięcia szczątków komórkowych, które mogą zablokować nanopor. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu TRPS. W zależności od próbki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych można zastosować standardowy protokół lub zmodyfikowaną metodę dodawania wzorca (spike-in).