Iniekcja do węzłów chłonnych biodegradowalnych cząstek polimeru

Ogólnym celem tej procedury jest zdeponowanie cząstek biomateriału szczepionki w węzłach chłonnych przy użyciu techniki bezpośredniego wstrzyknięcia. Najpierw zsyntetyzuj stabilizowane lipidami cząstki polimeru metodą podwójnej emulsji. Następnie umyj cząstki i zmierz właściwości materiału, takie jak rozmiar, ładunek, obciążenie lub stabilność.

Następnie podaj barwnik znacznikowy u podstawy ogona myszy, aby umożliwić wizualizację po drenażu barwnika do węzła chłonnego. Ostatnim krokiem jest zidentyfikowanie węzła chłonnego znakowanego D i wstrzyknięcie niewielkiej objętości cząstek polimeru w to miejsce. Histologia, immunofluorescencja i mikroskopia konfokalna mogą być stosowane do potwierdzenia obecności i rozmieszczenia cząstek w pachwinowych węzłach chłonnych.

Połączenie bezpośredniego wstrzykiwania węzłów chłonnych z biomateriałami do szczepienia umożliwia ścisłą kontrolę nad kombinacjami i dawkami składników szczepionki w mikrośrodowisku węzłów chłonnych oraz pozwala na kontrolowane uwalnianie ładunku w tych tkankach. Wszystkie szczepionki muszą dotrzeć do węzłów chłonnych, aby były skuteczne. Tak więc określenie, w jaki sposób biomateriały i włączone sygnały immunologiczne wpływają na sygnalizację lokalnych węzłów chłonnych, jest ważne, aby powiązać te zdarzenia z ogólnoustrojową odpowiedzią immunologiczną.

Wiedza ta pomoże nam lepiej zrozumieć, jak funkcjonują szczepionki z biomateriałów podawane tradycyjnymi drogami. Chociaż dostarczanie biomateriałów do węzłów chłonnych służy jako narzędzie do badania wpływu biomateriałów na organizację węzłów chłonnych, platforma ta zapewnia również możliwość opracowania nowych szczepionek terapeutycznych i immunoterapii ukierunkowanych na raka i zaburzenia autoimmunologiczne. W przypadku mikrocząstek sonicate, faza organiczna zawierająca lipid polimerowy i inny nierozpuszczalny w wodzie ładunek na lodzie o mocy 12 watów.

Aby utworzyć emulsję wodno-olejową, dodaj 500 mikrolitrów destylowanego H2O lub H2O zawierającego jeden miligram białka peptydowego lub innego rozpuszczalnego w wodzie ładunku. Kontynuuj cudzołóstwo przez 30 sekund. Delikatnie kołysząc fiolką w górę i w dół na boki wokół końcówki atora, aby zapewnić pełną emulgację.

Teraz przygotuj emulsję wody i oleju w wodzie, wlewając emulsję wodno-olejową do 40 mililitrów H2O homogenizowanego przez trzy minuty przy 16 000 obr./min. Następnie dodaj mieszadło magnetyczne i mieszaj wodę i olej w emulsji wodnej przez noc, aby usunąć nadmiar rozpuszczalnika po nocnym usunięciu rozpuszczalnika. Wlej emulsję przez sitko do komórek nylonowych o grubości 40 mikronów do wirówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów na pięć minut, zdekantuj supernatant, ponownie zawieś osad cząstek w jednym mililitrze wody i przenieś zawieszone cząstki do 1,5 mililitrowej mikrorurki wirówkowej.

Zebrać cząstki przez pięciominutowe wirowanie. Zmierz wielkość cząstek za pomocą dyfrakcji laserowej lub rozpraszania światła. Ona objętość wody dodanej do komórki frakcyjnej jest na poziomie wystarczającym do wyrównania i wygaszenia Pipeta 10 mikrolitrów zawiesiny cząstek do komórki frakcyjnej.

Zamknij drzwiczki komory analizatora wielkości cząstek. Następnie zmierz wielkość cząstek dla PLGA. Użyj współczynnika załamania światła 1,60.

Użyj interfejsu oprogramowania, aby obliczyć średnicę cząstek na podstawie liczb na jeden dzień przed wstrzyknięciem. Znieczulij mysz zgodnie z protokołem dla zwierząt zatwierdzonym przez IACUC. Oceń głębokość znieczulenia za pomocą palca u nogi.

Testy odruchów szczypania i monitoruj oddech, aby zapewnić częstość oddechów od 100 do 120 oddechów na minutę. Ogolić włosy u nasady ogona i tylnej ćwiartki. Usuń sierść z brzusznej strony zwierzęcia i bocznie dookoła do strony grzbietowej, tuż nad stawem tylnej nogi.

Do każdego wstrzyknięcia barwnika użyj mikropipety, aby przenieść 10 mikrolitrów roztworu barwnika do mikrośrodkowej probówki fuge i zassać całe 10 mikrolitrów przez igłę o rozmiarze 31 do jednomililitrowej strzykawki insulinowej. Teraz wstrzyknąć 10 mikrolitrów roztworu barwnika podskórnie z każdej strony podstawy ogona w celu załadowania między wstrzyknięciami. Nałóż łagodny krem do depilacji, aby usunąć pozostałe włosy.

Pamiętaj, aby pokryć obszar między tylną nogą a brzuchem. Po trzech minutach użyj mokrej dłoni w rękawiczce z ciepłym H two oh i delikatnie wetrzyj krem do depilacji w skórę. Powtórz natychmiast, aby usunąć nadmiar depilatora.

Następnie zwilż miękką szmatkę lub ręcznik papierowy ciepłą wodą i jednym ruchem wytrzyj dolną część myszy. Umieść mysz pod lampą grzewczą, aby odzyskać siły, a następnie wróć do trzymania przez co najmniej 12 godzin. Zbadaj znieczuloną mysz, aby potwierdzić drenaż śladu lub barwnika do każdego pachwinowego węzła chłonnego.

Węzeł chłonny powinien być widoczny jako ciemna plama w pobliżu tylnego uda i brzucha. Teraz należy ponownie zawiesić cząstki w wodzie destylowanej o pożądanym stężeniu wtrysku dla każdego wstrzyknięcia. Za pomocą mikropipety przenieś 10 mikrolitrów roztworu cząstek do mikroprobówki wirówkowej.

Odessać całe 10 mikrolitrów do igły insuliny o rozmiarze 31 dołączonej do strzykawki o pojemności jednego mililitra. Pociągnij skórę napiętą wokół zabarwionego węzła chłonnego za pomocą igły pod kątem 90 stopni do skóry. Wniknąć w skórę na głębokość jednego milimetra.

Powoli wstrzykiwać całą objętość, monitorując widoczne powiększenie węzłów chłonnych. Pozwól myszy dojść do siebie pod lampą grzewczą, a następnie wróć do trzymania lub przeprowadź dodatkowe testy. Najpierw potwierdź syntezę cząstek i rozkład wielkości.

Protokół syntezy odparowania rozpuszczalnika emulsji można ocenić jakościowo poprzez oględziny końcowych emulsji. Generowane. Emulsje powinny być jednorodną zawiesiną wolną od widocznych kruszyw. Rozkład wielkości cząstek części można potwierdzić za pomocą dyfrakcji laserowej lub dynamicznego rozpraszania światła, próbki cząstek powinny wykazywać rozkład monomodalny.

Dalsza ocena jakościowa syntezy cząstek może być osiągnięta poprzez modyfikację protokołu w celu włączenia jednego lub więcej ładunków fluorescencyjnych, takich jak peptyd fluorescencyjny lub barwnik lipofilowy. Barwnik może być używany do lokalizowania i kierowania węzła chłonnego do wstrzyknięcia cząstek Podczas treningu myszy mogą zostać poddane eutanazji i sekcji zwłok po wstrzyknięciu barwnika, aby zapoznać się z lokalizacjami węzłów chłonnych. Rozmieszczenie cząstek w strefach limfocytów T i B zakażonego węzła chłonnego potwierdza mikroskopia konfokalna wyciętych i barwionych węzłów chłonnych.

Różnice we właściwościach cząstek, takich jak wielkość, można zaobserwować w węzłach chłonnych po wstrzyknięciu i obrazowaniu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej Po opanowaniu technika ta może być wykonana w ciągu dwóch dni. Synteza cząstek i przygotowanie zwierzęce zachodzą pierwszego dnia. Charakterystyka mycia cząstek i iniekcji do węzłów chłonnych odbywa się w drugiej dobie

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób ślad lub barwnik może być używany do wizualizacji i wstrzykiwania pachwinowych węzłów chłonnych myszy. Technika ta umożliwia niechirurgiczne dostarczanie nośników szczepionki z biomateriału bezpośrednio do węzła chłonnego z poziomem kontroli, który wcześniej nie był możliwy. Bezpośrednie dostarczanie biomateriałów do węzłów chłonnych pozwoli naukowcom i inżynierom oraz immunologii i opracowywaniu szczepionek na zbadanie podstawowych interakcji między biomateriałami, szczepionkami i sygnałami immunologicznymi a węzłem chłonnym, rzucając nowe światło na mechanizmy, za pomocą których materiały te stymulują i kształtują odporność.