Name: Korekcja dryfu próbki po konfokalnym obrazowaniu poklatkowym 4D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-12T22:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Poznaj metodę korekcji trójwymiarowego dryfu próbki w mikroskopii poklatkowej 4D przy użyciu otwartego oprogramowania Fiji. Technika ta umożliwia dokładne śledzenie ruchów komórkowych w badaniach rozwojowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Gaby Martins i organizatorom warsztatów EMBO2010 Developmental Imaging w , gdzie rozpoczęła się ta praca, a także wszystkim współtwórcom projektów Fiji i ImageJ.

1. Eksperymenty z obrazowaniem poklatkowym 4D
Ustawienia używane do pozyskiwania obrazów będą się różnić w zależności od używanego sprzętu. Zdolność mikroskopii konfokalnej do optycznego przekroju próbki zależy od wielu czynników: długości fali wzbudzenia, wielkości otworka, apertury numerycznej obiektywu, współczynnika załamania światła próbki i ośrodka, w którym próbka jest osadzona. Wybrany rozmiar otworka konfokalnego określi grubość zebranego przekroju optycznego. Mniejszy otwór stworzy cieńszy przekrój optyczny, zwiększając rozdzielczość osi z, ale zmniejszając ilość przechwytywanego światła. Większy otwór zwiększy grubość przekroju optycznego, zmniejszając rozdzielczość osi z, ale zwiększając ilość przechwytywanego światła.
Dodatkowe czynniki, które należy wziąć pod uwagę podczas zbierania danych 4D przed korektą, obejmują:
<ol>
	<li>Zoptymalizuj szybkość skanowania, aby usunąć lub ograniczyć dryft podczas przechwytywania pojedynczego punktu czasowego. W związku z tym czas potrzebny na zebranie obrazu powinien stanowić niewielki ułamek odstępu między punktami czasowymi.</li>
	<li>Idealnie powtarzające się struktury lub siatki nie nadają się jako struktury do rejestracji, ponieważ nie jest możliwe określenie wymaganej korekty. Losowo rozmieszczone koraliki lub nierówne struktury pozwolą na jednoznaczną rejestrację.</li>
	<li>Jeśli spodziewany jest dryf, zwiększ obszar skanowania oraz górny i dolny limit ostrości, aby upewnić się, że obszar zainteresowania pozostanie w stosie obrazów.</li>
	<li>Oprócz zapewnienia odpowiedniej rozdzielczości przestrzennej w celu rozpoznania interesujących struktur, należy ustawić częstotliwość próbkowania, aby zapewnić rozdzielczość czasową dla badanych zdarzeń dynamicznych. 
	Uwaga: Czas między punktami czasowymi obrazu powinien zatem wynosić co najmniej połowę odstępu czasu między regularnie powtarzającymi się zdarzeniami i skracać się w przypadku zdarzeń nieregularnych.</li>
</ol>
2. Otwieranie zestawu danych konfokalnych
Pakiet open source Fiji jest dystrybucją programu ImageJ, który zawiera preinstalowane wtyczki do wykonywania licznych procesów na danych zebranych z eksperymentów mikroskopowych. Oprogramowanie zapewnia łatwiejszą architekturę aktualizacji wtyczek i zawiera kopię wtyczki Correct 3D drift używanej dla tego protokołu. Oprogramowanie obsługuje import szerokiej gamy zastrzeżonych formatów obrazów mikroskopowych za pomocą wtyczki importu Bio-Formats Open Microscopy Environment.
<ol>
	<li>Zainstaluj program Fidżi (http://fiji.sc/Downloads).</li>
	<li>Załaduj pozyskany zestaw danych za pomocą wtyczki LOCI Bio-Formats Importer.</li>
	<li>Jeśli zestaw danych jest większy niż pamięć przydzielona programowi, wybierz opcję "Użyj stosu wirtualnego" w sekcji Zarządzanie pamięcią.</li>
</ol>
3. Korygowanie dryfu obiektu 3D w przetwarzaniu końcowym
Podczas długiego eksperymentu poklatkowego próbka może się poruszać, nawet gdy jest osadzona. Aby skorygować dowolny ruch i umożliwić analizę zobrazowanych zdarzeń migracji, można przeprowadzić przetwarzanie końcowe obrazów. Cała obróbka obrazu po przetworzeniu musi być jasno opisana w metodologii wszelkich analiz wynikających z tej pracy.
<ol>
	<li>Po załadowaniu zestawu danych uruchom wtyczkę Correct 3D drift</li>.
	<li>Jeśli istnieje wiele kanałów obrazu, wybierz kanał, który ma być używany do rejestrowania obrazów. Idealnie byłoby, gdyby reprezentowało to strukturę statyczną w próbie, a nie jakiekolwiek elementy migrujące lub ruchome. Jeśli jednak nie jest to możliwe, należy wybrać kanał o najmniejszym ruchu.</li>
	<li>Jeśli dostępna pamięć RAM w systemie używanym do tej analizy jest mniejsza niż dwukrotny rozmiar oryginalnego zestawu danych, wybierz opcję Użyj stosu wirtualnego. Spowoduje to zapisanie zarejestrowanego hyperstacka jako sekwencji obrazów, zamiast zapisywania pliku w pamięci RAM.
	<ol>
		<li>Wybierz folder, w którym wtyczka ma wyprowadzać pojedyncze pliki poprawionych obrazów. Dla każdego kanału w każdej pozycji z zostanie utworzony osobny plik obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wtyczka przeprowadzi następnie analizę korelacji fazowej parami między każdym punktem czasowym, aby określić wymaganą poprawkę, która jest następnie stosowana do zestawu danych.</li>
</ol>

<ol><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for Microscopy.</a> BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+transactions+on+image+processing+%3A+a+publication+of+the+IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Kuglin, C. D., Hines, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phase+correlation+image+alignment+method%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE%2C+International+Conference+on+Cybernetics+and+Society%22%5BJournal%5D)">The phase correlation image alignment method.</a> Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+motility+and+actin+cytoskeleton+of+individual+neurons+and+neural+crest+cells+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+VIs.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos.</a> J VIs. Exp. (36), (2010).</li>
<li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+extrusion+from+the+epidermis+of+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).</li>
<li>Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Nguyen-Chi, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+Cell+Fate+Determination+within+the+Adaxial+Cell+Equivalence+Group+of+the+Zebrafish+Myotome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome.</a> PLoS Genetics. 8 (10), (2012).</li>
<li>Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+Myoblast+city+homologues+Dock1+and+Dock5+and+the+adaptor+proteins+Crk+and+Crk-like+in+zebrafish+myoblast+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion.</a> Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).</li>
<li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Nasza zdolność do korzystania z oprogramowania do przetwarzania końcowego w celu skorygowania dryfu próbki zestawów danych pochodzących z rozszerzonych eksperymentów mikroskopii poklatkowej jest ograniczona przez wiele czynników. Zdolność do odróżnienia dryfu od ruchu migracyjnego próbki zależy od zastosowanych markerów komórkowych. Markery komórkowe, które albo ulegają szerokiej ekspresji w próbce, albo nie biorą udziału w zdarzeniach migracyjnych podczas akwizycji obrazu, stanowią najlepsze źródło korekcji dryfu. Wtycz...

Obrazowanie konfokalne jest szeroko stosowane w biologii komórkowej i rozwojowej do śledzenia ruchów komórek i zmian w morfologii. Uchwycenie serii przekrojów optycznych w różnych płaszczyznach ogniskowych pozwala na wygenerowanie trójwymiarowego (3D) modelu próbki, który można następnie rozszerzyć do czterowymiarowego (4D) poprzez utworzenie serii poklatkowych zestawów danych 3D. Generowanie zestawów danych 4D pozwala na szczegółowy pomiar ruchów i zachowań komórek. W długoterminowych eksperymentach poklatkowych często obserwuje się ruch próbki. Może to być spowodowane niewielkimi niedokładnościami w sprzęcie, stoliku sterującym i pozycjach ogniskowych. Podczas gdy w innych przypadkach dryft jest wynikiem ruchów wywołanych wzrostem próbki lub elastycznością w podłożu mocującym próbkę. Istnieją metody kompensacji lub ograniczenia tych ruchów, w tym ulepszenia sprzętowych systemów ustawiania ostrości i zwiększona sztywność medium montażowego. Jednak w wielu przypadkach podejścia te nie mogą być stosowane ze względu na ustawienia obrazowania wymagane do zapewnienia odpowiednich warunków do utrzymania i wzrostu próbek. Istnieją rozwiązania programowe typu open source do korekcji ruchu w 2D w czasie, poprzez użycie wtyczek StackReg i TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 w ImageJ lub Fiji, ale nie można ich zastosować do zestawów danych 4D.
Aby skorygować dryf próbki, opracowaliśmy wtyczkę (Correct 3D Drift) do korzystania z platformy przetwarzania obrazowania o otwartym kodzie źródłowym, Fiji 1. Nasza wtyczka jest w stanie przeprowadzić rejestrację korelacji fazowej w celu skorygowania ruchu, który występuje w wyniku dryfu próbki w trójwymiarowych eksperymentach poklatkowych. Korelacja fazowa 6 to wydajna obliczeniowo metoda określania translacji między obrazami. Opisana tutaj wtyczka wykorzystuje bibliotekę korelacji fazowych opracowaną przez Preibisch et al.Rozdział 7. W eksperymentach wielokanałowych wtyczka wykorzystuje jeden kanał do określenia wymaganej korekcji. Ta korekta jest następnie stosowana do wszelkich dodatkowych kanałów, co skutkuje rejestracją zestawu danych 4D.  
W systemie modeli danio pręgowanego możliwe jest wykonywanie zdjęć poklatkowych przez okres wielu godzin, a nawet kilku dni 8. Powszechną metodą dosiadowywania danio pręgowanego jest osadzenie znieczulonego żywego zarodka w agarozie o niskiej temperaturze topnienia (0,8-1,5%), ograniczając jego ruch 9-11. Podczas gdy ruch jest ograniczony, wzrost próbki nadal następuje, co powoduje, że komórki w polu widzenia zmieniają pozycję. Aby śledzić ruch komórek w zarodku, należy najpierw skorygować ruch całej próbki. Protokół ten został opracowany z próbkami danio pręgowanego i został wykorzystany do obrazowania rozwoju somitów12, ale może być zastosowany do dowolnego zestawu danych konfokalnych 4D.

<table><tbody><tr><td>3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian (trikaina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze żelowania</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Kleszcze</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>0208-4-PO</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa pipeta z podziałką 3 ml</td><td>Samco</td><td>212</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenowa pipeta</td><td></td><td></td> <td>transferowa</td></tr><tr><td>9cm bakteryjne szalki Petriego</td><td>Greiner Bio One</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Rurki fluorowane etylenowo-propylenowe (FEP)</td><td>Bola</td><td>S1815-04</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Zeiss LSM-710</td> Obiektyw planapochromatyczny <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>W 20x/1.0 DIC Obiektyw</td><td>Zeiss</td><td>421452-9600-000</td><td></td></tr></tbody></table>

korekcja dryfu próbki po konfokalnym obrazowaniu poklatkowym 4d

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

Generowanie czterowymiarowych (4D) zestawów danych konfokalnych; składających się z sekwencji obrazów 3D w czasie; stanowi doskonałą metodologię do uchwycenia zachowań komórkowych związanych z procesami rozwojowymi. Zdolność do śledzenia i śledzenia ruchów komórek jest ograniczona przez ruchy próbki, które występują z powodu dryfu próbki lub, w niektórych przypadkach, wzrostu podczas akwizycji obrazu. Śledzenie komórek w zestawach danych, na które ma wpływ dryf i/lub wzrost, uwzględni te ruchy w dowolnej analizie położenia komórek. Może to prowadzić do pozornego przemieszczania się struktur statycznych w próbce. W związku z tym przed przystąpieniem do śledzenia komórek należy skorygować wszelkie odchylenia próbki. Korzystając z dystrybucji 1 ImageJ 2,3 na Fidżi o otwartym kodzie źródłowym i wbudowanych narzędzi LOCI 4, opracowaliśmy wtyczkę Correct 3D drift, aby usunąć błędne ruchy próbki w zestawach danych konfokalnych. Protokół ten skutecznie kompensuje translację próbki lub zmiany w pozycji ogniskowej, wykorzystując korelację fazową do rejestracji każdego punktu czasowego czterowymiarowych zestawów danych konfokalnych, zachowując jednocześnie możliwość wizualizacji i pomiaru ruchów komórek w przedłużonych eksperymentach poklatkowych.

W rozwijającym się danio pręgowanym komórki mięśni szybkich łączą się w wielojądrowe włókna od 19 godziny po zapłodnieniu (stadium 20 somitów) 13. Aby zwizualizować ruch jąder i fuzję komórek mięśniowych, przeprowadziliśmy konfokalne obrazowanie 4D w czasie rzeczywistym (time-lapse), wykorzystując linię transgeniczną wykazującą ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod kontrolą promotora α-aktyny szkieletowej w celu znakowania wszystkich komórek mięśniowych 14, oraz wstrzykując RNA kodu...

Mikroskopia poklatkowa pozwala na wizualizację procesów rozwojowych. Wzrost lub dryf próbek podczas akwizycji obrazu zmniejsza zdolność do dokładnego śledzenia i mierzenia ruchów komórek podczas rozwoju. Opisujemy zastosowanie oprogramowania do przetwarzania obrazów typu open source w celu skorygowania trójwymiarowego dryfu próbki w czasie.

Korekcja dryfu próbki po konfokalnym obrazowaniu poklatkowym 4D

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Mikroskopia TimeLapse umożliwia wizualizację procesów rozwoju, wzrostu lub dryfu próbki zachodzących w czasie obrazowania. Akwizycja może prowadzić do niemożności śledzenia ruchów komórek, dlatego w poniższym protokole wykorzystujemy oprogramowanie do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym, aby skorygować trójwymiarowy dryf w czasie.Rejestrowanie serii przekrojów optycznych w różnych płaszczyznach ogniskowania pozwala na wygenerowanie trójwymiarowego modelu próbki. Można to rozszerzyć do czterech wymiarów poprzez utworzenie serii danych 3D w technice time-lapse. W długoterminowych eksperymentach time-lapse często obserwuje się przemieszczanie się próbki.Może to być spowodowane niedokładnością przesuwania w sprzęcie sterującym etapem oraz pozycjami ogniskowymi, podczas gdy w innych przypadkach dryf wynika z ruchów indukowanych przez wzrost próbki lub elastyczność w obrębie metod mediów montażowych; istnieją metody kompensacji w celu ograniczenia tych ruchów dzięki licznym ulepszeniom sprzętowych systemów ogniskowania oraz zwiększonej sztywności medium montażowego. Jednakże podejścia te nie mogą być zastosowane w wielu przypadkach ze względu na konfigurację obrazowania wymaganą do zapewnienia odpowiednich warunków dla utrzymania i wzrostu próbek do korekty. W celu przeciwdziałania dryfowi próbek opracowaliśmy wtyczkę wykorzystującą otwartoźródłową platformę przetwarzania obrazów Fiji.Nasz plugin do korekcji dryfu 3D umożliwia rejestrację korelacji fazowej w celu skorygowania ruchów występujących jako obrót lub dryf próbki w trójwymiarowych eksperymentach time-lapse w badaniach wielokanałowych. Plugin do korekcji dryfu 3D wykorzystuje jeden kanał do wyznaczenia wymaganej korekty. Korekcja ta jest następnie stosowana do wszystkich pozostałych kanałów, co skutkuje rejestracją zbioru danych 4D.Darmowy pakiet internetowy o otwartym kodzie źródłowym. Fiji jest rozgałęzieniem dystrybucyjnym programu Image J, który zawiera zainstalowane wstępnie wtyczki umożliwiające wykonywanie licznych procesów na danych zebranych z eksperymentów mikroskopowych. Fiji zapewnia łatwiejszą architekturę wtyczek i jest dołączony do domyślnej instalacji.Kopia odpowiedniego wtyku three EG, którego użyjemy do tej analizy, gdy instalacja zostanie zakończona. Otwórz program Fiji. Fiji obsługuje import szerokiej gamy zastrzeżonych formatów obrazów mikroskopowych. Można to osiągnąć poprzez przeciągnięcie i upuszczenie lub za pomocą środowiska Open microscopy environment.Wtyczka do importu formatów Bio. Jeśli zestaw danych przekracza rozmiar pamięci zainstalowanej w systemie, otwórz plik obrazu jako wirtualny stos i skorzystaj z opcji zarządzania pamięcią. Zestaw danych wykorzystany w tej analizie został wygenerowany z trójwymiarowego eksperymentu z szeregiem czasowym z użyciem transgenicznych rybek zebrafish ACTA1:GFP, w których białko GFP jest ekspresowane w mięśniach szkieletowych.Aby zwizualizować jądra komórkowe, do tej linii transgenicznej wstrzyknięto mCherry lokalizujące się w jądrze; aby lepiej przedstawić te fluorescencje, możemy zmienić tabele wyszukiwania (lookup tables) dla każdego z tych kanałów w narzędziu kanałów kolorów. W trakcie rejestrowanej serii czasowej próbka ryby zebry przesunęła się w polu widzenia. Aby skorygować ten dryf, otwarto wtyczkę Correct 3D Drift w podmenu rejestracji (registration) zainstalowanych wtyczek w programie Fiji.Markery, które są szeroko wyrażone w próbce lub nie uczestniczą w procesach znakowania podczas akwizycji obrazu, stanowią najlepsze źródło do korekcji dryfu. W tym przykładzie jest to ACTA w kanale pierwszym, fluorescencja GFP. Jeśli pamięć w Twoim systemie jest ograniczona, wybierz opcję wirtualnego stosu (virtual stack) i uruchom wtyczkę Correct 3D drift.Skorygowany zestaw danych będzie posiadał większy rozmiar obszaru roboczego w porównaniu z oryginałem, aby uwzględnić przemieszczenie próbki. Wygenerowanie maksymalnych obrazów projekcyjnych przekrojów optycznych pozwala na porównanie usuniętego dryfu w skorygowanej próbce.Maksymalna Projekcja Intensywności usuwa jeden wymiar z zestawu danych, stanowiąc przydatne podejście do szybkiej oceny wyników korekcji dryftu. Tutaj widzimy obrazy z projekcji maksymalnej dla każdego punktu wiążącego w skorygowanych i nieskorygowanych zestawach danych. Gdy ten eksperyment time-lapse zostanie rzutowany jako pojedynczy obraz, widoczna staje się skala dryftu, który może wystąpić nawet podczas krótkiego badania time-lapse.Korekty wprowadzone poprzez rejestrację dryfu jednego kanału próbki są stosowane również do wszystkich pozostałych kanałów zawartych w tym stosie obrazów. Procedura korekcji dryfu w przypadku ograniczonej pamięci systemu jest nieco zmieniona. Wybierz opcję „used virtual stack” zarówno w menu importu formatu, jak i w oknie programu Correct 3D drift.Po wybraniu tej opcji zostaną Państwo poproszeni o wskazanie lokalizacji, w której wtyczka może wyeksportować poszczególne pliki obrazów dla każdego kanału, przekroju i punktu czasowego w eksperymencie time-lapse. Wygenerowany wirtualny stos zawiera tę samą korekcję dryfu, co w naszym poprzednim przykładzie. Po otwarciu wybranej lokalizacji zapisu zobaczymy wygenerowane poszczególne pliki sekwencji obrazów.Aby otworzyć ten zbiór plików, należy użyć narzędzia do importu sekwencji obrazów. Powstały plik nie będzie posiadał rozdzielonych kanałów, przekrojów optycznych ani punktów czasowych. Aby zwizualizować te cechy, należy przekonwertować stos na hiperstos (hyperstack), korzystając z danych z pliku dziennika, wpisując liczbę kanałów, przekrojów optycznych oraz punktów czasowych zapisanych w pliku. Możemy ponownie zmienić tablice mapowania kolorów (lookup tables), aby dostosować wyświetlane kolory w naszym eksperymencie time-lapse.Niniejszy protokół pozwala na korekcję dryftu występującego pomiędzy punktami czasowymi; dryftu występującego podczas rejestracji pojedynczego punktu czasowego nie można skorygować za pomocą tego protokołu. Zalecamy dobranie parametrów akwizycji obrazu w taki sposób, aby skrócić czas rejestracji każdego punktu czasowego. Możliwość korekty dryftu w oprogramowaniu do postprocessingu pozwala na analizę i pomiar ruchów komórek, które w przeciwnym razie zostałyby przesłonięte przez dryft próbki.

sample-drift-correction-following-4d-confocal-time-lapse-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Korekta dryfu próbki po 4D konfokalnym obrazowaniu time-lapse

Opisujemy przygotowanie trzech próbek testowych i jak można je wykorzystać do optymalizacji i oceny wydajności mikroskopów STORM. Na tych przykładach pokazujemy, jak pozyskiwać surowe dane, a następnie przetwarzać je w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości w komórkach o rozdzielczości około 30-50 nm.

Próbki testowe do optymalizacji mikroskopii superrozdzielczej STORM

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Przedstawiamy protokół zastosowania interferometrycznej mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej (iPALM), 3-wymiarowej metody mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w super rozdzielczości, do obrazowania cytoszkieletu aktynowego w przylegających komórkach ssaków. Takie podejście umożliwia opartą na świetle wizualizację cech strukturalnych w nanoskali, które w przeciwnym razie pozostałyby nierozwiązane przez konwencjonalną mikroskopię optyczną z ograniczoną dyfrakcją.

Trójwymiarowa mikroskopia superrozdzielcza włókien F-aktyny za pomocą interferometrycznej mikroskopii lokalizacji aktywowanej światłem (iPALM)

Ogólnym celem tej metodologii jest zapewnienie optymalnych warunków eksperymentalnych od przygotowania próbki do akwizycji i rekonstrukcji obrazu, aby umożliwić wykonanie dwukolorowych obrazów 2D dSTORM mikrotubul i pośrednich włókien w stałych komórkach...

Obrazowanie pośrednich włókien i mikrotubul za pomocą 2-wymiarowej bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Ten protokół opisuje zastosowania immobilizacji próbki za pomocą skrzepów fibryny, ograniczając dryf i umożliwiając dodawanie i wymywanie odczynników podczas obrazowania na żywo. Próbki przenosi się do kropli pożywki zawierającej fibrynogen na powierzchni szkiełka nakrywkowego, po czym indukuje się polimeryzację przez dodanie trombiny.

Zastosowania immobilizacji tkanek Drosophila ze skrzepami fibryny do obrazowania na żywo

Tutaj opisujemy narzędzia i metody obliczeniowe, które umożliwiają wizualizację i analizę trzy- i czterowymiarowych danych obrazowych zarodków myszy w kontekście osiowego wydłużania i segmentacji, uzyskanych przez optyczną tomografię projekcyjną in toto oraz przez obrazowanie na żywo i barwienie immunofluorescencyjne w całości za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Ta praca przedstawia przebieg pracy dla śledzenia pozycji atomowej w obrazowaniu transmisyjnej mikroskopii elektronowej o rozdzielczości atomowej. Ten przepływ pracy jest wykonywany za pomocą aplikacji Matlab typu open source (EASY-STEM).

Pikometr-Precyzyjne śledzenie pozycji atomowej za pomocą mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy metodę badania morfogenezy neurytów w pourodzeniowych eksplantatach siatkówki myszy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Opisujemy podejście do rzadkiego znakowania i pozyskiwania typów komórek siatkówki i ich drobnych procesów przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adeno, które wyrażają białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę w sposób zależny od Cre.

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Poznaj metodę korekcji trójwymiarowego dryfu próbki w mikroskopii poklatkowej 4D przy użyciu otwartego oprogramowania Fiji. Technika ta umożliwia dokładne śledzenie ruchów komórkowych w badaniach rozwojowych.

Korekcja dryfu próbki po konfokalnym obrazowaniu poklatkowym 4D

Przeglądaj więcej filmów