Korekcja dryfu próbki po konfokalnym obrazowaniu poklatkowym 4D

Mikroskopia poklatkowa umożliwia wizualizację procesów rozwoju, wzrostu lub dryfu próbki, które zachodzą na tym obrazie. Akwizycja może spowodować niemożność śledzenia lub śledzenia ruchów komórek, zgodnie z następującym protokołem. Używamy oprogramowania do przetwarzania obrazowania typu open source, aby skorygować dryf trójwymiarowy w czasie.

Uchwycenie serii przekrojów optycznych w różnych płaszczyznach ogniskowych pozwala na wygenerowanie trójwymiarowego modelu próbki. Można to rozszerzyć na cztery wymiary, tworząc poklatkową serię zestawów danych 3D. W długoterminowych eksperymentach poklatkowych często obserwuje się ruch próbki.

Może to być spowodowane poślizgiem dokładności w etapie sterowania sprzętem i pozycjami ogniskowej, podczas gdy w innych przypadkach dryfator w wyniku ruchów wywołanych wzrostem próbki lub elastycznością w mediach montażowych istnieją metody kompensacji, aby ograniczyć te ruchy dzięki wielu ulepszeniom sprzętowych systemów ogniskowania i zwiększonej sztywności medium montażowego. Jednak w wielu przypadkach podejścia te nie mogą być stosowane ze względu na konfigurację obrazowania wymaganą do zapewnienia odpowiednich warunków do utrzymania i wzrostu próbek. Do dryfu próbek opracowaliśmy wtyczkę do wykorzystania platformy przetwarzania obrazowania typu open source z Fidżi.

Nasza poprawna wtyczka dryfu 3D jest w stanie utworzyć rejestrację korelacji fazowej, aby skorygować ruch, który występuje jako rola lub dryf próbki w trójwymiarowych eksperymentach poklatkowych w eksperymentach wielokanałowych. Prawidłowa wtyczka dryfu 3D wykorzystuje jeden kanał do określenia wymaganej korekty. Ta korekta jest następnie stosowana do wszelkich dodatkowych kanałów, co skutkuje rejestracją zestawu danych The four D.

Darmowy pakiet internetowy o otwartym kodzie źródłowym. Fiji to widelec dystrybucyjny, program Image J, który zawiera preinstalowane wtyczki do wykonywania wielu procesów na danych zebranych z eksperymentów mikroskopowych. Fiji zapewnia łatwiejszą architekturę wtyczek i jest dołączane do domyślnej instalacji.

Kopia poprawnej wtyczki trzy EG, której użyjemy do tej analizy po zakończeniu instalacji Otwórz Fidżi. Fidżi obsługuje import szerokiej gamy zastrzeżonych formatów obrazów mikroskopowych. Można to osiągnąć poprzez przeciąganie i upuszczanie lub za pośrednictwem użytkowników, Otwarte środowisko mikroskopowe.

Wtyczka do importowania formatów biograficznych. Jeśli zestaw danych przekracza rozmiar pamięci zainstalowanej w systemie, otwórz plik obrazu jako stos wirtualny z opcją zarządzania pamięcią. Zestaw danych, którego użyjemy w tej analizie, został wygenerowany z trójwymiarowego eksperymentu szeregów czasowych transgenicznego danio pręgowanego z ACTA, GFP, w którym GFP ulega ekspresji w mięśniach szkieletowych.

Aby uwidocznić jądra, ta transgeniczna linia została wstrzyknięta do nukleo lokalizującego wiśnię M, aby lepiej reprezentować te podłogi fluoru, możemy zmienić tabele wyszukiwania dla każdego z tych kanałów za pomocą narzędzia kanału kolorowego. W trakcie zebranych szeregów czasowych wydaje się, że próbka ryby z zamkiem błyskawicznym dryfowała w polu widzenia. Poprawiła ten dryf, otworzyła poprawną wtyczkę driftu 3D w podmenu rejestracji wtyczek zainstalowanych na Fidżi.

Znaczniki sprzedawcy, które są albo szeroko wyrażone w próbce, albo nie biorą udziału w wydarzeniach marketingowych podczas pozyskiwania obrazu, stanowią najlepsze źródło korekcji dryfu. W tym przykładzie, ACTA, fluorescencja GFP w kanale pierwszym. Jeśli pamięć w systemie jest ograniczona, wybierz opcję stosu wirtualnego i zezwól na uruchomienie wtyczki Correct 3D drift.

Poprawiony zestaw danych będzie miał większy rozmiar płótna w porównaniu z oryginałem. Dostosowanie do ruchu próbki. Generowanie maksymalnych obrazów projekcyjnych przekrojów optycznych pozwala na porównanie dryftu, który został usunięty z korygowanej próbki.

Projekcja maksymalnej intensywności usuwa wymiar z zestawu danych, ale jest to przydatne podejście do szybkiego zbadania wyników korekcji dryfu. Tutaj widzimy maksymalne obrazy projekcji dla każdego punktu wiązania w ich poprawionych i nieskorygowanych zestawach danych. Kiedy ten eksperyment poklatkowy jest wyświetlany jako pojedynczy obraz, widoczny jest dryf, który może wystąpić nawet w krótkim eksperymencie poklatkowym.

Poprawki wprowadzone przez zarejestrowanie dryfu jednego kanału próbki są również stosowane do wszystkich innych kanałów zawartych w tym stosie obrazów. Procedura korekcji dryfu w przypadku ograniczonej pamięci w systemie została nieznacznie zmieniona. Wybierz opcję Używany stos wirtualny zarówno w formacie zakupu, menu importu, jak i w odpowiednim menu podręcznym wtyczki dryfu 3D.

Po wybraniu tej opcji zostaniesz poproszony o wybranie lokalizacji, do której wtyczka może eksportować poszczególne pliki obrazów dla każdego wycinka kanału i punktu czasowego eksperymentu poklatkowego. Wygenerowany stos wirtualny zawiera taką samą poprawkę dryfu, jak w naszym poprzednim przykładzie. Jeśli otworzymy wybraną lokalizację zapisu, zobaczymy wynikowe indywidualne pliki sekwencji obrazów Wygenerowane.

Aby otworzyć tę kolekcję plików, użyj narzędzia do importowania sekwencji obrazów. Wynikowy plik nie będzie oddzielał kanałów, sekcji optycznych ani punktów czasowych. Aby zobrazować te cechy, przekonwertuj stos na hiperstos przy użyciu danych z pliku dziennika, wprowadź liczbę kanałów, wycinki optyczne i punkty wiązania zebrane w, Możemy ponownie zmienić tabele przeglądowe, aby dostosować kolor wyświetlany w naszym eksperymencie poklatkowym.

Niniejszy Protokół koryguje dryft występujący między punktami czasowymi, dryf, który występuje w trakcie przechwytywania pojedynczego punktu czasowego, nie może być skorygowany przez ten Protokół. Zalecamy, aby parametry używane do pozyskiwania obrazu skracały czas potrzebny na przechwycenie każdego punktu czasowego. Możliwość skorygowania dryfu w oprogramowaniu do przetwarzania końcowego pozwala na analizę i pomiar ruchów komórek, które w przeciwnym razie byłyby możliwe dzięki dryfowi próbki.