Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

Ropień prątkowy jest wysoce oporny na antybiotyki, porównywalny tylko z gruźlicą wielolekooporną bez zatwierdzonego leczenia. Nasze badania koncentrują się na opracowaniu skalowalnego protokołu badań przesiewowych leków z wykorzystaniem szczepów podwójnie reporterowych i technologii i3S. Podejście to ma na celu zwiększenie wydajności testów, przyspieszenie odkrywania skutecznych, mniej toksycznych leków i usprawnienie potencjalnych metod leczenia ropnia prątków.

Opracowywanie leków na infekcje M abscessus opiera się na tradycyjnych, czasochłonnych metodach, takich jak jednostki tworzące kolonie, które są pracochłonne, mają niską przepustowość i są podatne na stronniczość człowieka. Ze względu na wysoką odporność bakterii znajduje się mniej przewodów. W związku z tym, aby znaleźć nowe metody leczenia, niezbędne są wysokoprzepustowe badania przesiewowe tysięcy związków.

Jednak tradycyjne metody sprawiają, że jest to niepraktyczne. Nasz protokół wykorzystuje opracowany przez nas podwójnie zgłoszony szczep ropnia prątków, emitujący zarówno luminescencję, jak i fluorescencję. Pozwala naukowcom ocenić skuteczność terapeutyczną związku bez dodawania dodatkowych regionów lub kroków, zwiększając szybkość i odtwarzalność.

Ponadto platforma przesiewowa i3S biosciences wykorzystuje zrobotyzowaną automatyzację do wysokowydajnych testów przesiewowych, obsługując 105 mikropłytek bez interwencji człowieka, zwiększając skuteczność przy jednoczesnym zmniejszeniu błędów. Protokół ten umożliwia szybsze i bardziej powtarzalne badania przesiewowe leków przeciwko ropniu prątków, pomagając w identyfikacji nowych tropów. Może ujawnić kluczowe cele bakteryjne lub złożone grupy funkcyjne, zapewniając wgląd zarówno w udanych, jak i odrzuconych kandydatów.

Takie podejście usprawnia proces opracowywania leków, ukierunkowując przyszłe badania i przyspieszając identyfikację potencjalnych czynników przeciwko ropniu prątków. Aby uzyskać makrofagi ze szpiku kostnego dorosłej myszy typu dzikiego, umieść komórki szpiku kostnego w 96 dobrze obrobionej optycznie płaskiej płytce dolnej zawierającej DMEM, uzupełnionej 10% FBS i 10% LCCM. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 7% dwutlenkiem węgla przez 10 dni.

Po różnicowaniu odpipetować 75 mikrolitrów zawiesiny mikrobakterii abscessus do studzienek zawierających makrofagi. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 7% dwutlenkiem węgla przez cztery godziny. Za pomocą dozownika odczynników do mikropłytek wyposażonego w małą kasetę dodaj 110 mikrolitrów DMEM, uzupełnionych o 10% FBS i 10% LCCM do związków lub kolumn kontrolnych rozpuszczalników.

Dozować dodatkowe 104 mikrolitry DMEM, uzupełnione 10% FBS i 10% LCCM do kolumn zawierających najwyższe stężenie związku lub rozpuszczalnika. Teraz odpipetuj 5,9 mikrolitra związków lub rozpuszczalnika do wyznaczonych dołków w kolumnach. Za pomocą wielokanałowej mikropipety wykonaj dwa seryjne rozcieńczenia dla każdego związku i rozpuszczalnika.

Po ostatnim rozcieńczeniu wyrzucić nadmiar 110 mikrolitrów pożywki z ostatniego dołka. Dodaj 110 mikrolitrów DMEM, uzupełnionych 10% FBS i 10% LCCM do wszystkich kolumn, z wyjątkiem ślepych studzienek. Przygotować roztwór klarytromycyny w stężeniu dwóch mikrogramów na mililitr w DMEM.

Po inkubacji należy wyjąć z inkubatora 96-dołkową płytkę zawierającą zakażone makrofagi. Za pomocą myjki do płytek umyj komórki trzykrotnie 200 mikrolitrami roztworu do mycia infekcji. Przenieś 200 mikrolitrów związków na płytkę zawierającą zakażone makrofagi.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów uzupełnionej pożywki do hodowli komórkowych i roztworu klarytromycyny do odpowiednich dołków. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 7% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. Po inkubacji przemyć zakażone komórki trzykrotnie po 200 mikrolitrami roztworu do przemywania związków.

Za pomocą wielokanałowej mikropipety dozować 200 mikrolitrów roztworu utrwalającego do wszystkich studzienek i inkubować przez 10 minut. Po umyciu komórek przenieś 200 mikrolitrów roztworu przepuszczalnego do wszystkich studzienek i inkubuj przez 15 minut. Następnie odessać przepuszczalny roztwór przed dodaniem 100 mikrolitrów roztworu barwiącego do wszystkich studzienek.

Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć komórki trzykrotnie 200 mikrolitrami roztworu myjącego związku. Aby przesiać płytkę za pomocą systemu obrazowania o wysokiej zawartości, wybierz typ płytki jako płytkę 96 mikromiareczkowania, obiektyw jako 20 x z 0,4 liczbą i tryb konfokalny.

Następnie wybierz DAPI, maskę komórkową, głęboką czerwień i kanał wiśniowy M, aby przechwycić odpowiednio barwione jądra, cytoplazmę i sygnał bakterii. Wybierz dołki płyty i odpowiednie pola każdej studni do analizy. Następnie kliknij test i zrób zdjęcie, aby sprawdzić ustawienia.

Na koniec skonfiguruj robota do obsługi sprzętu, aby zautomatyzować akwizycję obrazu w ciągu nocy. To ramię robota wymienia płytki w systemie obrazowania o wysokiej zawartości bez interwencji człowieka Związki daunorubicyny, doksorubicyny, biosteronu, epirubicyny, ammonianu pyrwinu były toksyczne dla makrofagów zakażonych prątkami, prowadząc do mniej niż 85% żywotności komórek. Związki moksalaktam i besifloksacyna miały mniej niż 50% żywotność prątków przy 13,3 mikromolu, ale nie wykazały znaczącej różnicy w porównaniu z kontrolą DMSO.

Związek cefdinir, gatifloksacyna i moksyfloksacyna były silne przeciwko wewnątrzkomórkowym prątkom w 13,3 mikromolach, przy czym najbardziej aktywny był związek embonian pyrwinu. Związki roksytromycyny, klarytromycyny i ryfabutyny wykazały ekstremalną siłę działania przeciwko prątkom wewnątrzkomórkowym, przy czym klarytromycyna zmniejszała żywotność prątków do mniej niż 10% we wszystkich stężeniach.