Name: Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowego przesiewania leków przeciwko Mycobacterium abscessus z wykorzystaniem szczepu podwójnego reportera i automatyzacji robotycznej. To podejście przyspiesza odkrywanie nowych terapii przeciwko opornym bakteriom.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest finansowana z portugalskich funduszy narodowych za pośrednictwem FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P, w ramach projektu PTDC/BIA-MIC/3458/2020 (DOI: 10.54499/PTDC/BIA-MIC/3458/2020) oraz stypendiów doktoranckich 2021.07335.BD dla GSO i UI/BD/150830/2021 dla CMB; FWO - Fundacja Badawcza Flandria, grant nr 1S68720N; Inicjatywa w zakresie leków innowacyjnych 2 Call 16 (IMI2-Call 16) wniosek RespiriTB pod numerem umowy 853903. Autorzy dziękują za wsparcie ze strony i3S Scientific Platform BioSciences Screening, członka krajowych infrastruktur PT-OPENSCREEN (NORTE-01-0145-FEDER-085468) i PPBI - Portugalskiej Platformy Bioobrazowania (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122).

High-Throughput Screening Assay for Mycobacterium abscessus Using Dual Reporters

<ol><li>Victoria, L., Gupta, A., Gomez, J. L., Robledo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+abscessus+complex%3A+A+review+of+recent+developments+in+an+emerging+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium abscessus complex: A review of recent developments in an emerging pathogen.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 659997(2021).</li>
<li>Luthra, S., Rominski, A., Sander, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+antibiotic-target-modifying+and+antibiotic-modifying+enzymes+in+Mycobacterium+abscessus+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of antibiotic-target-modifying and antibiotic-modifying enzymes in Mycobacterium abscessus drug resistance.</a> Front Microbiol. 9, 2179(2018).</li>
<li>Nathavitharana, R. R., Strnad, L., Lederer, P. A., Shah, M., Hurtado, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+questions+in+the+diagnosis+and+treatment+of+pulmonary+M.+abscessus+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Forum+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Top questions in the diagnosis and treatment of pulmonary M. abscessus disease.</a> Open Forum Infect Dis. 6 (7), ofz221(2019).</li>
<li>Cristancho-Rojas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Mycobacterium abscessus.</a> Clin Microbiol Infect. 30 (6), 712-717 (2024).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+repositioning%3A+Progress+and+challenges+in+drug+discovery+for+various+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Drug repositioning: Progress and challenges in drug discovery for various diseases.</a> Eur J Med Chem. 234, 114239(2022).</li>
<li>Doan, T. L., Pollastri, M., Walters, M. A., Georg, G. I. The future of drug repositioning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDoan%2C+TL+%22Annual+reports+in+medicinal+chemistry%22">Annual reports in medicinal chemistry</a>. Macor, J. E. , Academic Press. 385-401 (2011).</li>
<li>Bento, C. M., Gomes, M. S., Silva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+antibacterial+drug+screening+methods%3A+Current+prospects+for+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Evolution of antibacterial drug screening methods: Current prospects for mycobacteria.</a> Microorganisms. 9 (12), 2562(2021).</li>
<li>Attene-Ramos, M. S., Austin, C. P., Xia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Encycl+Toxicol%22%5BJournal%5D)">High throughput screening.</a> Encycl Toxicol. 3, 916-917 (2014).</li>
<li>Gupta, R., Netherton, M., Byrd, T. F., Rohde, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter-based+assays+for+high-throughput+drug+screening+against+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reporter-based assays for high-throughput drug screening against Mycobacterium abscessus.</a> Front Microbiol. 8, 2204(2017).</li>
<li>Bento Clara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+double-reporter+strains+of+Mycobacterium+abscessus+for+drug+discovery%3A+A+study+in+mScarlet%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel double-reporter strains of Mycobacterium abscessus for drug discovery: A study in mScarlet.</a> Microbiol Spectr. , e0036224(2024).</li>
<li>Kolbe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+optimization+of+chromosomally-integrated+fluorescent+Mycobacterium+tuberculosis+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and optimization of chromosomally-integrated fluorescent Mycobacterium tuberculosis reporter constructs.</a> Front Microbiol. 11, 591866(2020).</li>
<li>Lopez-Roa, P., Esteban, J., Munoz-Egea, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+review+on+the+mechanisms+of+pathogenicity+in+Mycobacterium+abscessus%2C+a+rapidly+growing+emerging+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Updated review on the mechanisms of pathogenicity in Mycobacterium abscessus, a rapidly growing emerging pathogen.</a> Microorganisms. 11 (1), 90(2022).</li>
<li>Bray, M. A., Carpenter, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBray%2C+MA+%22Advanced+assay+development+guidelines+for+image-based+high+content+screening+and+analysis+in+Assay+guidance+manual%22">Advanced assay development guidelines for image-based high content screening and analysis in Assay guidance manual</a>. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, Bethesda (MD). (2004).</li>
<li>Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CLSI+document+M07-A10%22">CLSI document M07-A10</a>. , 10th ed, Wayne, PA. (2015).</li>
<li>Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactoferricin+peptides+increase+macrophages%27+capacity+to+kill+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Lactoferricin peptides increase macrophages' capacity to kill Mycobacterium avium.</a> mSphere. 2 (4), e00301-e00317 (2017).</li>
<li>Bento, C. M., Gomes, M. S., Silva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+beyond+typical+treatments+for+atypical+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Looking beyond typical treatments for atypical mycobacteria.</a> Antibiotics (Basel). 9 (1), 18(2020).</li>
<li>Spizek, J., Rezanka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lincosamides%3A+Chemical+structure%2C+biosynthesis%2C+mechanism+of+action%2C+resistance%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Lincosamides: Chemical structure, biosynthesis, mechanism of action, resistance, and applications.</a> Biochem Pharmacol. 133, 20-28 (2017).</li>
<li>Hurst-Hess, K. R., Rudra, P., Ghosh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+protection+as+a+mechanism+of+lincosamide+resistance+in+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Ribosome protection as a mechanism of lincosamide resistance in Mycobacterium abscessus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 65 (11), e0118421(2021).</li>
<li>Kang, J. K., Kang, H. K., Hyun, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+effects+of+spiramycin+in+lps-activated+raw+264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory effects of spiramycin in lps-activated raw 264.7 macrophages.</a> Molecules. 27 (10), 3202(2022).</li>
<li>Zimmermann, P., Ziesenitz, V. C., Curtis, N., Ritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunomodulatory+effects+of+macrolides-a+systematic+review+of+the+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunomodulatory effects of macrolides-a systematic review of the underlying mechanisms.</a> Front Immunol. 9, 302(2018).</li>
<li>Pradhan, S., Madke, B., Kabra, P., Singh, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+immunomodulatory+effects+of+antibiotics+and+their+use+in+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of antibiotics and their use in dermatology.</a> Indian J Dermatol. 61 (5), 469-481 (2016).</li>
<li>Volochnyuk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+commercially+available+compounds+for+hts%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Evolution of commercially available compounds for hts.</a> Drug Discov Today. 24 (2), 390-402 (2019).</li>
<li>Sritharan, S., Sivalingam, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+review+on+time-tested+anticancer+drug+doxorubicin%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">A comprehensive review on time-tested anticancer drug doxorubicin.</a> Life Sci. 278, 119527(2021).</li>
<li>Arwanih, E. Y., Louisa, M., Rinaldi, I., Wanandi, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+mechanism+of+acute+myeloid+leukemia+cells+against+daunorubicin+and+cytarabine%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Resistance mechanism of acute myeloid leukemia cells against daunorubicin and cytarabine: A literature review.</a> Cureus. 14 (12), e33165(2022).</li>
<li>Khasraw, M., Bell, R., Dang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epirubicin%3A+Is+it+like+doxorubicin+in+breast+cancer%3F+A+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Breast%22%5BJournal%5D)">Epirubicin: Is it like doxorubicin in breast cancer? A clinical review.</a> Breast. 21 (2), 142-149 (2012).</li>
<li>Schultz, C. W., Nevler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrvinium+pamoate%3A+Past%2C+present%2C+and+future+as+an+anti-cancer+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Pyrvinium pamoate: Past, present, and future as an anti-cancer drug.</a> Biomedicines. 10 (12), 3249(2022).</li>
<li>Bailly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+thiopeptide+thiostrepton.+An+update+of+its+mode+of+action%2C+pharmacological+properties+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The bacterial thiopeptide thiostrepton. An update of its mode of action, pharmacological properties and applications.</a> Eur J Pharmacol. 914, 174661(2022).</li>
<li>Kwok, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiostrepton+selectively+targets+breast+cancer+cells+through+inhibition+of+forkhead+box+m1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Thiostrepton selectively targets breast cancer cells through inhibition of forkhead box m1 expression.</a> Mol Cancer Ther. 7 (7), 2022-2032 (2008).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiostrepton%3A+A+novel+therapeutic+drug+candidate+for+Mycobacterium+abscessus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Thiostrepton: A novel therapeutic drug candidate for Mycobacterium abscessus infection.</a> Molecules. 24 (24), 4511(2019).</li>
<li>Perry, C. M., Scott, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cefdinir%3A+A+review+of+its+use+in+the+management+of+mild-to-moderate+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Cefdinir: A review of its use in the management of mild-to-moderate bacterial infections.</a> Drugs. 64 (13), 1433-1464 (2004).</li>
<li>Ramon-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+clinically+approved+cephalosporins+for+tuberculosis+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Repurposing clinically approved cephalosporins for tuberculosis therapy.</a> Sci Rep. 6, 34293(2016).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+abscessus+l%2Cd-transpeptidases+are+susceptible+to+inactivation+by+carbapenems+and+cephalosporins+but+not+penicillins%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium abscessus l,d-transpeptidases are susceptible to inactivation by carbapenems and cephalosporins but not penicillins.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (10), e00866-e00917 (2017).</li>
<li>Alvirez-Freites, E. J., Carter, J. L., Cynamon, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+activities+of+gatifloxacin+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo activities of gatifloxacin against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1022-1025 (2002).</li>
<li>Braback, M., Riesbeck, K., Forsgren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibilities+of+Mycobacterium+marinum+to+gatifloxacin%2C+gemifloxacin%2C+levofloxacin%2C+linezolid%2C+moxifloxacin%2C+telithromycin%2C+and+quinupristin-dalfopristin+%28synercid%29+compared+to+its+susceptibilities+to+reference+macrolides+and+quinolones%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Susceptibilities of Mycobacterium marinum to gatifloxacin, gemifloxacin, levofloxacin, linezolid, moxifloxacin, telithromycin, and quinupristin-dalfopristin (synercid) compared to its susceptibilities to reference macrolides and quinolones.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1114-1116 (2002).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół ten opisuje proces badań przesiewowych leków przeciwko Mab przy użyciu szczepów opracowanych we własnym zakresie 10. Korzystając z robotyki zajmującej się obsługą cieczy, zautomatyzowanej mikroskopii i analizy oraz podwójnych szczepów reporterowych, żywotność bakterii jest szybko oceniana za pomocą luminescencji lub fluorescencji bez dodawania odczynników lub wykonywania dodatkowych czynności. Takie podejście skraca czas i zmniejsza zmienność między testami, co jest istotną zaletą przy rozważaniu celu testów HTS.
Podczas badań przesiewowych tysięcy związków musi być łatwo zidentyfikowany skuteczny lek. W tym celu współczynnik Z' jest często używany do pomiaru statystycznej wielkości efektu, wnioskując o wydajności testu. Jeśli współczynnik Z' > 0,5, badane warunki są optymalne do rozróżnienia między populacjami leczonymi i nieleczonymi13. W testowanych warunkach uzyskano czynniki Z > 0,6 (ryc. 2), statystycznie udowadniając, że można je zastosować w kampanii przesiewowej. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia skuteczności badań przesiewowych.
W związku z tym opracowano protokół HTS w celu wykrycia aktywności przeciwdrobnoustrojowej tysięcy związków przeciwko planktonicznemu wzrostowi Mab. Ponieważ Mab jest wewnątrzkomórkowym patogenem fakultatywnym, opracowany protokół monitoruje również wewnątrzkomórkową aktywność przeciwdrobnoustrojową przeciwko temu samemu szczepowi bakteryjnemu - co jest kluczową zaletą. Ponadto można również ocenić toksyczność dla komórek gospodarza. W związku z tym opisano wieloetapowe podejście do badań przesiewowych leków przeciwko Mab, wykorzystujące różne konfiguracje eksperymentalne do oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej wraz z cytotoksycznością, zwiększając szanse na sukces. Jako dowód słuszności koncepcji, przebadano bibliotekę chemiczną zawierającą 1280 związków.
Zidentyfikowano łącznie trzydzieści trzy trafienia (ryc. 3). Spośród nich trzy istotnie zwiększyły żywotność prątków w kulturach płynnych (związki 30, 31 i 32; Rysunek 3 i Rysunek 4). Należy zauważyć, że związki te mogą zakłócać emisję luminescencji bez wpływu na żywotność bakterii. W testach przeciwko zinternalizowanym prątkom, związki te wykazały aktywność przeciwdrobnoustrojową (ryc. 6), wykazując wyższą skuteczność przeciwko Mab po internalizacji komórek gospodarza. Związki te zidentyfikowano jako troleandomycynę (30), spiramycynę (32) i linkomycynę (31; Tabela 1). Dwa pierwsze to makrolidy, klasa antybiotyków stosowanych w leczeniu zakażeń prątkami16, a drugi to linkozamid, antybiotyk o mechanizmie działania podobnym do makrolidów17. Doniesiono, że Mab jest szczególnie oporny na inny linkozamid, klindamycynę, zarówno w kulturach płynnych, jak i stałych18. Niemniej jednak właściwości immunomodulujące i przeciwzapalne zostały związane z makrolidami19,20 i linkozamidami21, co może wyjaśniać zwiększoną aktywność przeciwdrobnoustrojową przeciwko zinternalizowanym prątkom (ryc. 6).
Z pozostałych trzydziestu trafień, jedenaście zmniejsza o >90% żywotność prątków we wszystkich stężeniach (ryc. 4). Biorąc pod uwagę, że typowy test HTS ma oczekiwany współczynnik trafień ~1%22, opracowany protokół jest zgodny z tym, co zwykle obserwujemy. Niemniej jednak kilka innych związków było nadal aktywnych, a dwadzieścia osiem z nich przeszło do testu infekcji.
Spośród zidentyfikowanych związków, pięć związków uznano za toksyczne (ryc. 5) - daunorubicyna (4), doksorubicyna (5), epirubicyna (27), tiostrepton (6) i amorian pyrwinu (28; Tabela 1). Pierwsze trzy to środki przeciwnowotworowe 23,24,25, więc nic dziwnego, że są toksyczne dla komórek ssaków użytych w tym teście. Ambonian pyrwinu był stosowany przez wiele lat jako skuteczny środek przeciwrobaczy; Jednak od 2004 r. wiąże się ją również z działaniami przeciwnowotworowymi26. Wreszcie, tiostrepton jest oligopeptydem często stosowanym w medycynie weterynaryjnej, nigdy nie zatwierdzonym do stosowania u ludzi27. Aktywność tego leku przeciwko komórkom raka piersi odnotowano28. Aktywność wewnątrzmakrofagiczną tiostreptonu nie oceniano ze względu na jego toksyczność na makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (ryc. 5). Wykazano jednak, że tiostrepton jest skuteczny przy 5 μM na komórkach THP-1 zakażonych Mab29. Zgłoszone wyniki przeciwko bakteriom planktonicznym29 są podobne do tych uzyskanych w tym badaniu przesiewowym, przy czym tiostrepton jest niezwykle silny (ryc. 4).
Większość związków badanych pod kątem aktywności wewnątrzmakrofagicznej nie wykazywała potencjału terapeutycznego (ryc. 6). Wzrost wewnątrzkomórkowy bakterii znacznie różni się od kultur planktonowych. W tym ostatnim przypadku zawsze możliwy jest bezpośredni kontakt bakterii z lekami. W pierwszym przypadku, ze względu na internalizację przez komórki gospodarza, kilka błon gospodarza działa jak fizyczne bariery, które leki muszą transponować, aby dotrzeć do celu, co może pomóc wyjaśnić zmniejszoną aktywność przeciwdrobnoustrojową większości trafień. Przy najwyższym stężeniu, 13,3 μM, trzy związki wykazywały wystarczającą siłę, aby statystycznie różnić się od kontroli DMSO (ryc. 6) - cefdinir (21), gatifloksacyna (26) i moksyfloksacyna (29; Tabela 1). Podczas gdy moksyfloksacyna jest już stosowana jako lek przeciwgruźliczy drugiego rzutu16, cefdinir jest powszechnie stosowany w leczeniu kilku infekcji bakteryjnych dróg oddechowych, takich jak zapalenie płuc30. Jednak jego aktywność przeciwko M. tuberculosis31 i Mab została opisana, wykazując silne działanie synergistyczne z karbapenemym przeciwko temu ostatniemu32. Gatifloksacyna jest fluorochinolonem, a jej aktywność została zgłoszona przeciwko kilku prątkom w ciągu ostatnich 33,34. Trzy najbardziej aktywne związki w tym teście (ryc. 6) to roksytromycyna (17), klarytromycyna (22) i ryfabutyna (25; Tabela 1), które są niezwykle silne we wszystkich stężeniach. Pierwsze dwie to makrolidy, podczas gdy ryfabutyna jest ryfamycyną, przy czym obie klasy służą jako podstawa leczenia wielu zakażeń prątkami16.
To badanie przesiewowe opiera się na specjalnym i drogim sprzęcie do obsługi cieczy w celu zmniejszenia zmienności między testami. Pomimo tego, że jest niezwykle powtarzalny, płyn nie posiada bezdotykowego transferu związków, takiego jak akustyczny. W ten sposób niektóre przylegające związki mogą pozostać przyczepione do metalowych kołków między transferami, przenosząc się do kolejnych studzienek, co skutkuje fałszywie dodatnimi wynikami podczas fazy przesiewowej - tak właśnie stało się w przypadku związku 33. Właśnie dlatego walidacja badań przesiewowych ma tak kluczowe znaczenie dla ich powodzenia, zapewniając, że żadne wyniki fałszywie dodatnie nie przejdą do kolejnych etapów badań przesiewowych leków. Test infekcji wykorzystuje system obrazowania o wysokiej zawartości z trybem konfokalnym, aby uzyskać najlepszą możliwą definicję regionów bakteryjnych. Niemniej jednak nadal można go używać bez trybu konfokalnego, choć przy utracie definicji i prawdopodobnie utrudnia identyfikację regionów bakteryjnych. Protokół ten wykorzystuje proste i przyjazne dla użytkownika oprogramowanie analityczne zintegrowane z systemem obrazowania; jednak oprogramowanie typu open source może być używane zgodnie z protokołem (rysunek uzupełniający 5). Ostatecznie, pomimo tego, że nie zmienia się przeznaczenia leków w leczeniu zakażeń MAB, wyniki te są niezwykle ważne, ponieważ potwierdzają ustalony protokół, który można rozszerzyć na większe biblioteki. Co ważne, uważamy, że protokół ten można dostosować do dowolnych bakterii, pod warunkiem, że dostępne są odczyty fluorescencyjne lub luminescencyjne. W ten sposób prace te wnoszą znaczący wkład w dziedzinę odkrywania leków, dostarczając niezbędnych narzędzi do walki z jednym z największych problemów zdrowia publicznego – bakteriami opornymi na antybiotyki – a w szczególności z prawie nieuleczalnym patogenem – Mycobacterium abscessus.

Mycobacterium abscessus (Mab) to patogen oportunistyczny odpowiedzialny za infekcje płuc, szczególnie u osób z mukowiscydozą i innymi schorzeniami płuc. Infekcje wywołane przez Mab są znane z tego, że są wyjątkowo trudne do leczenia ze względu na ogromną wrodzoną oporność na leki, porównywalną do wielolekoopornej gruźlicy1. Dostępne leki są w dużej mierze nieskuteczne z powodu wysokiej nieprzepuszczalności otoczki komórkowej prątków oraz genomu kodującego szereg enzymów dezaktywujących antybiotyki2. W związku z tym leczenie obejmuje kombinację kilku leków i trwa od kilku miesięcy do kilku lat. Ten wymagający schemat wielolekowy w połączeniu z niskim stopniem przestrzegania zaleceń przez pacjentów skutkuje średnią stopą wyleczeń na poziomie od 30% do 50%3. Co więcej, w ciągu ostatnich kilku dziesięcioleci wzrosła zapadalność na infekcje płuc wywołane przez prątki nietuberkulozowe, w tym te spowodowane przez Mab1,4. W konsekwencji środowisko naukowe dąży do opracowania nowych związków do leczenia infekcji Mab.
Jedną ze strategii realizowanych w tym celu jest repozycjonowanie leków – proces identyfikacji nowych możliwości terapeutycznych dla istniejących już leków. Pozwala to ominąć największe wyzwanie towarzyszące procesowi odkrywania i opracowywania nowych leków, jakim jest czas5. Ta prosta koncepcja wykorzystuje już ustalone profile farmakokinetyczne i bezpieczeństwa wielu leków, aby obniżyć koszty opracowania i skrócić czas potrzebny na wprowadzenie leku z etapu badań laboratoryjnych do praktyki klinicznej6. W związku z tym stworzono biblioteki łączące od setek do tysięcy takich związków, co pozwala badaczom szybko przetestować możliwość repozycjonowania leków przeciwko interesującemu ich patogenowi.
Większość badań nad opracowaniem leków przeciwko Mab opiera się na tradycyjnym, uznawanym za złoty standard teście oceniającym aktywność związku in vitro przeciwko prątkom — liczeniu jednostek tworzących kolonie7. Mimo swojej dokładności, procedura ta jest niezwykle czasochłonna, co sprawia, że staje się niewykonalna przy próbie przetestowania bibliotek zawierających tysiące związków. W związku z tym w rozwój leków włączono badania wysokoprzepustowe (HTS) — solidne testy wykorzystujące robotykę i urządzenia do dozowania cieczy, które umożliwiają szybkie, równoległe przesiewanie tysięcy związków8. Zazwyczaj wykonuje się to poprzez początkowe przetestowanie pojedynczej stężenia z wykorzystaniem płytek mikrotitracyjnych w formacie 96, 384, 1536 lub 3456 dołków, co służy jako punkt wyjścia do identyfikacji trafień i ich późniejszej optymalizacji w dalszych etapach procesu w celu zastosowania klinicznego.
Testy oparte na reporterach zapewniają znaczącą przewagę w zakresie powtarzalności HTS ze względu na ich prostotę i czułość w porównaniu z innymi testami opartymi na barwnikach i absorbancji7,9. Jednakże, według naszej wiedzy, tylko w kilku badaniach zoptymalizowano wysokoprzepustowy przesiew przeciwko Mab9.
Niedawno w naszym laboratorium opracowano szczepy z podwójnym reporterem, zdolne do jednoczesnej emisji luminescencji i fluorescencji10. Mab operon_mScarlet jest jednym z takich szczepów. Wykazuje on autoluminescencję dzięki ekspresji operonu LuxABCDE, który obejmuje bakteryjną lucyferazę (poprzez ekspresję genów luxAB) oraz substrat w postaci długołańcuchowego aldehydu (poprzez ekspresję genów luxCDE). Z kolei odczyt fluorescencyjny uzyskuje się poprzez ekspresję niedawno opracowanego czerwonego białka fluorescencyjnego mScarlet, które przewyższa powszechniej stosowane białka eGFP i mCherry, zapewniając silniejszy sygnał11. Wykorzystanie tego szczepu pozwala nam oceniać żywotność bakterii w kulturze płynnej poprzez pomiar sygnału luminescencyjnego w czytniku mikroplatek, bez konieczności dodawania odczynników lub wykonywania dodatkowych kroków. W zakresie detekcji, fluorescencja wewnętrzna umożliwia wizualizację mikroskopową w komórkach żywych lub utrwalonych bez użycia barwników lub przeciwciał. Posiadanie jednego szczepu z oboma typami odczytu daje badaczom znaczącą przewagę podczas stosowania go w testach HTS – zredukowana zostaje zmienność między analizami o różnych typach odczytu, ponieważ nie ma potrzeby wymiany szczepów w zależności od charakteru badania.
W związku z tym w niniejszej pracy opracowano wysokoprzepustowy test przeciwko Mab przy użyciu wewnętrznie zmodyfikowany szczep z podwójnym reporterem (Rycina 1). Pozwoliło to na szybką ocenę in vitro aktywność 1280 leków przeznaczonych do repositioningu z wykorzystaniem biblioteki komercyjnej (patrz Tabela materiałów). Po pierwsze, aktywność oceniono w teście w kulturze płynnej z wykorzystaniem luminescencji, a po drugwie w makrofagach zainfekowanych Mab, wykorzystując sygnał fluorescencyjny, co lepiej odwzorowuje obserwowany proces infekcji in vivo12.
<img alt="Schemat procesu przesiewowego leków przeciwko M. abscessus; odczyt luminescencyjny i fluorescencyjny; przesiewanie biblioteki, test walidacyjny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1Graficzne streszczenie ustalonego protokołu. Kluczowym elementem w tym badaniu przesiewowym jest wewnętrzne opracowany szczep prątkowy z podwójnym reporterem, który jest wykorzystywany we wszystkich eksperymentach. W pierwszej kolejności, przy użyciu dozownika odczynników i bakterii planktonicznych, przeprowadza się wstępny screening poprzez testowanie związków w pojedynczym stężeniu. Zidentyfikowane trafienia (hits) są przekazywane do testu walidacyjnego, w którym badane są trzy różne stężenia. Oba eksperymenty są realizowane z odczytem luminescencyjnym. Zwalidowane trafienia są następnie poddawane testowi infekcyjnemu, w którym również testowane są trzy różne stężenia, a makrofagi pochodzące z szpiku kostnego są infekowane przy MOI 1. System obrazowania wysokoprzepustowego (high-content imaging) rejestruje fluorescencyjny sygnał bakteryjny, a oprogramowanie analityczne służy do oceny ładunku wewnątrzkomórkowego za pomocą formuły Mycoload. Liczba związków zmniejsza się wraz ze wzrostem złożoności testów. Stworzone za pomocą BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>Bio Optica</td><td>05-01005Q</td><td>roztwór utrwalający</td></tr><tr><td>384-dołkowa okrągłodenna mikropłytka polipropylenowa niepoddana obróbce</td><td>Corning</td><td>3658</td><td>Można użyć białych mikropłytek; można użyć polistyrenu</td></tr><tr><td>50 TS Myjka</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana uszczelniająca Breathe-Easy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>:: explorer</td><td>Revvity</td><td></td><td>equipment handling robot</td></tr><tr><td>Clarithromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3487-100MG</td><td>Rozpuszczony w DMSO do pożądanego stężenia</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/4121/PB15</td><td>Rozcieńczyć w płynnym podłożu wzrostowym do pożądanego stężenia</td></tr><tr><td>Harmony 5.1</td><td>Oprogramowanie do analizy</td><td>Revvity</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i CO2 Inkubator, 165 L</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>inkubator komórkowy</td></tr><tr><td>JANUS z 4 ramieniem końcówkowym i ramieniem MDT Ładowarka</td><td>do cieczy</td><td>Revvity</td><td></td></tr><tr><td>KB 8182</td><td>Inkubator Termaks</td><td></td><td>z mieszadłem</td></tr><tr><td>Libra S4+</td><td>Biochrom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multidrop&nbsp; Dozownik odczynników Combi</td><td>System</td> obrazowania Thermo Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>Opera Phenix Plus</td><td>Revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate</td><td>Revvity</td><td>6055302</td><td>Niezbędny do mikroskopów o wysokiej zawartości</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna (PBS) 1x</td> roztwór <td>myjący</td><td>NA NA</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteki chemiczne Prestwick&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Komercyjna biblioteka chemiczna przeznaczona do zmiany przeznaczenia leków</td></tr><tr><td>Inkubator wstrząsający 3031</td><td>GFL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VICTOR Nivo</td><td>Revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowych: </td><td></td><td></td><td>W razie potrzeby dodać 10% suplementu</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10938-025</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>LCCM</td><td>NA</td><td></td><td>NA Kondycjonowane podłoże z linii komórkowej L929, które uwalnia czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF); suplement pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu 100 mM (100X)</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Infection roztwór do mycia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td> apirogenna <td>Dostępnych jest wielu dostawców</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution 10x</td><td>Gibco</td><td>14060-040</td><td>Rozcieńczyć do 1x z wodą apirogenną</td></tr><tr><td>Roztwór przepuszczalny</td><td></td><td></td><td>PBS z 0,1% Triton X100</td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Inni dostępni dostawcy</td></tr><tr><td>Roztwór barwiący</td><td></td><td></td><td>PBS z DAPI (500 ng/mL) i HCS Far Red (10 ng/mL)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>HCS Far Red&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>H32721</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców</td></tr><tr><td>Płynna pożywka wzrostowa</mocna></td><td></td><td></td><td>W razie potrzeby dodaj 10% suplementu</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Broth</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4780</td><td>0,05% stężenia końcowego. Inni dostępni dostawcy</td></tr> <tr><td>< silny> płynny suplement pożywki: </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9702-100</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza bezwodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0450/60</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Zakażenia Mycobacterium abscessus (Mab) są trudne do leczenia ze względu na wysoką wewnętrzną oporność na leki, porównywalną do gruźlicy wielolekoopornej. Leczenie jest skrajnie nieskuteczne i opiera się na schemacie wielolekowym, co skutkuje niskim poziomem przestrzegania zaleceń przez pacjentów. W związku z tym wzywa się społeczność naukową do zidentyfikowania nowych i skutecznych leków do leczenia tych zakażeń. Jedną ze strategii stosowanych w tym celu jest zmiana przeznaczenia leków – proces identyfikacji nowych możliwości terapeutycznych dla istniejących leków na rynku, z pominięciem czasu potrzebnego na ustalenie profili farmakokinetycznych i bezpieczeństwa nowych leków. Ponieważ większość badań nad opracowywaniem leków przeciwko Mab opiera się na tradycyjnych i czasochłonnych metodach, opracowano test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom przy użyciu opracowanego we własnym zakresie szczepu Mab z podwójnym reporterem. Korzystając z robotyki zajmującej się obsługą cieczy, zautomatyzowanej mikroskopii i analizy, a także opracowanych przez nas podwójnych szczepów reporterowych, żywotność bakterii można szybko zmierzyć za pomocą dwóch różnych odczytów, luminescencji i fluorescencji, bez dodawania odczynników lub wykonywania dodatkowych czynności. Skraca to czas i zmniejsza zmienność między testami, co jest główną zaletą w przypadku badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Opisany protokół został zweryfikowany poprzez badania przesiewowe biblioteki 1280 związków. Uzyskane wyniki zostały potwierdzone w piśmiennictwie, przy skutecznej detekcji związków aktywnych. Tym samym prace te spełniły cel, jakim było dostarczenie terenowi nowego narzędzia, które pomoże w walce z tą niezwykle lekooporną bakterią.

Ocena czynnika Z' 
Rysunek 2 przedstawia dane z jednego z dwóch przeprowadzonych eksperymentów w celu obliczenia czynnika Z'. Jako kontrolę pozytywną zastosowano klarytromycynę w stężeniu 4 µg/mL. W obu eksperymentach uzyskano wartości czynnika Z' wynoszące odpowiednio 0,64 i 0,62, co oznacza, że warunki oraz odczyt zastosowane w tym teście mogą zostać wykorzystane w kolejnym badaniu przesiewowym (Z' &gt; 0,5). Niemniej jednak, czynnik Z' obliczano dla wszystkich pozostałych eksperymentów (testu infekcyjnego), aby kontrolować poprawność przebiegu każdego z nich.
W ramach dowodu koncepcji zaprojektowanego testu HTS przebadano bibliotekę związków przeznaczonych do repositioningu leków. Składa się ona z 1280 różnorodnych małych cząsteczek, z których 95% to leki zatwierdzone zarówno przez FDA, jak i EMA. Cząsteczki te oferują wysoką różnorodność chemiczną i farmakologiczną.
<img alt="Wykres porównawczy względnych jednostek światła (RLU) dla próbek traktowanych i nietraktowanych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Wyniki oceny współczynnika Z'. Mab w stężeniu 2,5 x 105 CFUs/mL inkubowano z klarytromycyną w stężeniu 4 µg/mL oraz bez niej, przez 48 h w temperaturze 37 °C. Po okresie inkubacji zmierzono luminescencję w celu oceny żywotności prątków. Wykres przedstawia indywidualne wartości luminescencji traktowanych i nietraktowanych żywych prątków w jednym niezależnym doświadczeniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Przesiewanie biblioteki w celu znalezienia trafień 
Wszystkie związki przetestowano w stężeniu 6,66 µM przeciwko Mab. Ze względu na wielkość biblioteki, związki podzielono na cztery różne płytki mikrotytracyjne z 384 dołkami (Rysunek 3A-D). Wyniki znormalizowano pod kątem rozpuszczalnika oraz zweryfikowanego efektu brzeżnego.
W tym teście przesiewowym zidentyfikowano trzydzieści trzy związki aktywnie oddziałujące na badany układ, z których trzydzieści znacząco zmniejszyło emisję luminescencji, redukując żywotność prątków (Rysunek 3). Co ciekawe, trzy związki doprowadziły do wyższej emisji luminescencji, co może być związane ze zwiększonym metabolizmem lub proliferacją bakterii (Rysunek 3). Wszystkich 33 zidentyfikowanych związków, w tym trzy związki zwiększające luminescencję, poddano testowi walidacyjnemu, aby sprawdzić, czy taki profil zostanie zachowany.
<img alt="Analiza równowagi statycznej; wykres RLU; rozkład danych; średnia ±3SD; odchylenie statystyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wyniki przesiewania biblioteki. (A-D) Mab w stężeniu 2,5 x 105 CFUs/mL inkubowano z 1280 związkami w stężeniu 6,66 µM przez 48 h w temperaturze 37 °C. Po inkubacji zmierzono luminescencję w celu oceny żywotności prątków. Wykresy przedstawiają RLU z jednego niezależnego eksperymentu, wyrażone w jednostkach arbitralnych po normalizacji względem rozpuszczalnika i efektu brzegowego. Dla każdej płytki obliczono AVG RLU oraz odpowiadające mu SD, aby wyznaczyć próg (na szaro; AVG ± 3SD). Okrągłe symbole reprezentują testowany związek. Na niebiesko zaznaczono związki znajdujące się poza tym progiem, które uznano za trafienia (hits). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Test walidacji trafności 
Stężenia zastosowane w tym teście wynosiły 13,3 µM, 6,66 µM oraz 3,3 µM. Każdy związek badano w dwóch powtórzeniach w celu zwiększenia wiarygodności wyników.
Co istotne, związki 30, 31 i 32, z którymi wcześniej wiązano wyższe wartości RLU (Rysunek 3A,C), zachowały ten profil, przy czym w studzienkach traktowanych związkiem 32 uzyskano ponad 200% przeżywalności prątków (Rysunek 4).
Związki 20 i 33 uznano za nieaktywne, ponieważ przeżywalność prątków wyniosła blisko 100% we wszystkich badanych stężeniach (Rysunek 4).
Związki 9 i 21 wykazały podobną nieaktywność przy dwóch najniższych stężeniach; jednak w przeciwieństwie do związku 20, pozostały one aktywne przy najwyższym stężeniu 13,3 µM, przy czym związek 21 wykazał wyższą aktywność (Rysunek 4).
Związek 3 wykazuje również brak aktywności przy najniższym stężeniu oraz utratę aktywności przy 6,66 µM, choć w mniejszym stopniu niż związek 21 (Rycina 4). Tylko przy najniższym stężeniu związki 2, 7, 8, 10, 16, 18, 24 i 28 wykazały niższy potencjał terapeutyczny. Niemniej jednak związki 2, 10 i 28 nadal prowadzą do przeżywalności prątków na poziomie &lt;50%.
W skali globalnej pozostałe czternaście związków wykazało aktywność we wszystkich badanych stężeniach.
<img alt="Wykres żywotności prątków porównujący efekty związków; wyniki testu przeciwmikrobianego, wpływ stężenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wyniki testu walidacji trafień. Mab w stężeniu 2,5 x 105 CFUs/mL inkubowano z każdym wcześniej zidentyfikowanym trafieniem w stężeniach 13,3 µM, 6,66 µM i 3,3 µM (odpowiednio 1,3%, 0,7% i 0,3% DMSO) przez 48 h w temperaturze 37 °C. Po okresie inkubacji zmierzono luminescencję w celu oceny żywotności prątków. Wykres przedstawia procenty żywotnych prątków po traktowaniu w stosunku do prątków nietraktowanych w jednym niezależnym eksperymencie, przy czym każdy związek testowano w dubletach. Symbole okrągłe reprezentują dublety dla każdego związku. Słupki reprezentują średnią z tych dubletów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Test infekcji 
Z trzydziestu trzech przetestowanych związków wybrano dwadzieścia osiem do testu infekcji (Rycina 4). Związki 7, 8, 9, 20 i 33 nie zostały wybrane do tego badania. Związki 9, 20 i 33 pominięto ze względu na brak aktywności podczas walidacji (Rycina 4), natomiast dwa pierwsze pominięto z przyczyn technicznych. Niemniej jednak związki te zidentyfikowano jako ryfampicynę i linezolid, antybiotyki stosowane już w leczeniu infekcji Mab12. Wszystkie związki przetestowane w teście infekcji zostały zidentyfikowane i wymienione w Tabeli 1. Aktywność przeciwdrobnoustrojową związków wobec makrofagów zainfekowanych Mab oceniano, wykorzystując wewnętrzną fluorescencję bakterii jako odczyt.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Związek</td>
			<td>Nazwa</td>
			<td>Związek</td>
			<td>Nazwa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Sulfatiazol</td>
			<td>18</td>
			<td>Cefuroksym</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Cyprofloksacyna</td>
			<td>19</td>
			<td>Rifaksymina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Cefotaksym</td>
			<td>21</td>
			<td>Cefdinir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Daunorubicyna</td>
			<td>22</td>
			<td>Klarytromycyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Doksorubicyna </td>
			<td>23</td>
			<td>Besifloksacyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Tiostrepton</td>
			<td>24</td>
			<td>Lewofloksacyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>Amikacyna</td>
			<td>25</td>
			<td>Rifabutyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>Moksalaktam</td>
			<td>26</td>
			<td>Gatyfloksacyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>Sulfametizol</td>
			<td>27</td>
			<td>Epirubycyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>Sulfamonometoksyna</td>
			<td>28</td>
			<td>Pamobian pirwinium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14</td>
			<td>Cefoksytyna</td>
			<td>29</td>
			<td>Moksifloksacyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>Nowobioicyna</td>
			<td>30</td>
			<td>Troleandomycyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td>Cefmetazol</td>
			<td>31</td>
			<td>Linkomycyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17</td>
			<td>Roksytromycyna</td>
			<td>32</td>
			<td>Spiramycyna</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista związków przetestowanych w badaniu infekcyjnym.Związki zwalidowane w kroku 4 zostały przetestowane w badaniu infekcyjnym (krok 5).
Pierwszym ocenianym parametrem była toksyczność związków wobec makrofagów zainfekowanych Mab. Próg ustalony w celu uznania związku za toksyczny lub nietoksyczny wynosił 85% żywych makrofagów (Rysunek 5). Z dwudziestu ośmiu badanych związków, związki 4, 5, 6, 27 i 28 uznano za toksyczne (Rysunek 5). W związku z tym pięć tych związków wykluczono z dalszej oceny aktywności wewnątrzmakrofagicznej.
<img alt="Wykres żywotności komórek; traktowanie związkami w stężeniach 13,3, 6,66, 3,3 μM; analiza danych na wykresie słupkowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Toksyczność hitów wobec makrofagów zainfekowanych Mab. Makrofagi BMM myszy BALB/c zainfekowano Mab (MOI=1) i inkubowano z każdym z wcześniej zidentyfikowanych hitów w stężeniach 13,3 µM, 6,66 µM i 3,3 µM (odpowiednio 1,3%, 0,7% i 0,3% DMSO) przez 48 h w temperaturze 37 °C przy 7% CO2. Komórki obrazowano za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu do wysokoprzepustowych analiz (high-content screening), wykorzystując liczbę jąder komórkowych (barwionych DAPI) do pomiaru żywotności komórek. Wykres przedstawia procenty żywych zainfekowanych makrofagów poddanych działaniu związków w stosunku do żywych, niezainfekowanych makrofagów z dwóch niezależnych eksperymentów. Symbole okrągłe reprezentują żywotność komórek dla każdego testu. Słupki reprezentują średnią z dwóch niezależnych eksperymentów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Aby ocenić aktywność wewnątrzmakrofagową pozostałych dwudziestu trzech związków przeciwko wewnątrzkomórkowym Mab (Ryc. 6), wykorzystano wzór Mycoload (wyjaśniony wcześniej w kroku 6) w celu uzyskania procentowej przeżywalności prątków znormowanej względem zakażonych makrofagów niepoddanych działaniu leków. Większość związków utraciła potencjał terapeutyczny przeciwko zinternalizowanym prątkom (Ryc. 6) w porównaniu z testem walidacji trafień (Ryc. 4), ponieważ liczba trafień zmniejszyła się z dwudziestu pięciu do sześciu przy najwyższym testowanym stężeniu. Co uderzające, wszystkie trzy związki, które zwiększały przeżywalność planktonicznych Mab w porównaniu z bakteriami niepoddanymi działaniu leków (30, 31 i 32; Ryc. 3 oraz Ryc. 4), wykazały aktywność przeciwprątkową wobec wewnątrzkomórkowych Mab, przy czym związki 30 i 32 wykazały istotną różnicę statystyczną w porównaniu z DMSO, nawet przy 3,3 µM w przypadku związku 32 (Ryc. 6). Prątki traktowane związkami 11 i 23 wykazały przeżywalność &lt;50% przy 13,3 µM; nie było to jednak istotnie różne od kontroli DMSO (Ryc. 6). Związki 21, 26 i 29 były wystarczająco silne przy 13,3 µM, aby wykazać istotną różnicę statystyczną, przy czym związek 29 był najbardziej aktywny (Ryc. 6). Na koniec, związki 17, 22 i 25 były niezwykle silne we wszystkich testowanych stężeniach przeciwko zinternalizowanym prątkom. Zidentyfikowano je odpowiednio jako roksytromycynę, klarytromycynę i ryfabutynę (Tabela 1). Z trzech związków klarytromycyna była najsilniej działająca przeciwko Mab, a przeżywalność prątków nigdy nie przekroczyła 10%, przy wartości p &lt;0,0001 we wszystkich testowanych stężeniach w porównaniu z DMSO (Ryc. 6).
<img alt="Wykres słupkowy porównujący stężenia związków i procentowy ładunek mikobakteryjny (mycoload), zaznaczono istotność statystyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Aktywność wewnątrzmakrofagiczna hitów przeciwko makrofagom zainfekowanym Mab. BMM myszy BALB/c zostały zainfekowane Mab (MOI=1) i inkubowane z każdym z wcześniej zidentyfikowanych hitów w stężeniach 13,3, 6,66 oraz 3,3 µM (odpowiednio 1,3, 0,7 i 0,3% DMSO) przez 48 h w temperaturze 37 °C przy 7% CO2. Komórki obrazowano za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu do przesiewania wysokotreściowego (HCS), a sygnał fluorescencyjny wykorzystano do obliczenia Mycoload (patrz krok 6). Wykres przedstawia procentowy ładunek mikobakteryjny (Mycoload) w zainfekowanych makrofagach poddanych działaniu związków w stosunku do nieleczonych makrofagów zainfekowanych w dwóch niezależnych eksperymentach. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem porównań wielokrotnych Dunnetta; *, p &lt; 0,05; **, p &lt; 0,01; ***, p &lt; 0,001; ****, p &lt; 0,0001 w porównaniu do DMSO (kontroli rozpuszczalnika). Gwiazdki odpowiadają kodowi kolorystycznemu dla każdego stężenia zgodnie z legendą wykresu. Symbole okrągłe reprezentują Mycoload dla każdego pomiaru. Słupki reprezentują średnią z dwóch niezależnych eksperymentów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Przykład układu płytki 384-dołkowej użytej do oceny czynnika Z'. Biały – dołki pustych prób (tylko płynna pożywka wzrostowa); żółty – kontrola pozytywna (bakterie traktowane antybiotykiem); czerwony – kontrola negatywna (bakterie nietraktowane). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 2: Przykład układu płytki 384-dołkowej stosowanej podczas przesiewania biblioteki. Biały – dołki puste (tylko płynna pożywka wzrostowa); zielony – kontrola rozpuszczalnika; czerwony – kontrola negatywna (bakterie niepoddane działaniu związku); niebieski – związki do przesiewania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 3: Przykład układu płytki 384-dołkowej stosowanej do walidacji trafień. Biały – dołki puste (tylko ciekła pożywka wzrostowa); zielony – kontrola rozpuszczalnika (w duplikacie); czerwony – kontrola negatywna (bakterie niepoddane działaniu związku); niebieski – związki do przesiewania (w duplikacie). Bladsze kolory reprezentują rozcieńczenia seryjne 1:2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 4: Przykład układu płytki 96-dołkowej stosowanej w teście infekcji. Kolor biały – dołki puste (woda w celu zapobiegania parowaniu); czerwony – kontrola negatywna (makrofagi nieleczone); żółty – kontrola pozytywna (makrofagi leczone antybiotykiem); zielony – kontrola rozpuszczalnika; niebieski – testowane związki. Bladsze kolory oznaczają rozcieńczenia seryjne 1:2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%204.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 5: Protokół analizy obrazów. W niniejszej pracy zastosowano szczegółowy protokół analizy obrazów, który może zostać dostosowany do oprogramowania otwartoźródłowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%205.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

To badanie opracowało test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych przeciwko Mycobacterium abscessus z niedawno stworzonym podwójnym szczepem reporterowym, wykorzystując fluorescencję i luminescencję do szybkiej oceny żywotności bakterii. Protokół ten będzie istotny dla naukowców dążących do badań przesiewowych nowych leków przeciwko tej lekoopornej bakterii.

Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

Ropień prątkowy jest wysoce oporny na antybiotyki, porównywalny tylko z gruźlicą wielolekooporną bez zatwierdzonego leczenia. Nasze badania koncentrują się na opracowaniu skalowalnego protokołu badań przesiewowych leków z wykorzystaniem szczepów podwójnie reporterowych i technologii i3S. Podejście to ma na celu zwiększenie wydajności testów, przyspieszenie odkrywania skutecznych, mniej toksycznych leków i usprawnienie potencjalnych metod leczenia ropnia prątków.Opracowywanie leków na infekcje M abscessus opiera się na tradycyjnych, czasochłonnych metodach, takich jak jednostki tworzące kolonie, które są pracochłonne, mają niską przepustowość i są podatne na stronniczość człowieka. Ze względu na wysoką odporność bakterii znajduje się mniej przewodów. W związku z tym, aby znaleźć nowe metody leczenia, niezbędne są wysokoprzepustowe badania przesiewowe tysięcy związków.Jednak tradycyjne metody sprawiają, że jest to niepraktyczne. Nasz protokół wykorzystuje opracowany przez nas podwójnie zgłoszony szczep ropnia prątków, emitujący zarówno luminescencję, jak i fluorescencję. Pozwala naukowcom ocenić skuteczność terapeutyczną związku bez dodawania dodatkowych regionów lub kroków, zwiększając szybkość i odtwarzalność.Ponadto platforma przesiewowa i3S biosciences wykorzystuje zrobotyzowaną automatyzację do wysokowydajnych testów przesiewowych, obsługując 105 mikropłytek bez interwencji człowieka, zwiększając skuteczność przy jednoczesnym zmniejszeniu błędów. Protokół ten umożliwia szybsze i bardziej powtarzalne badania przesiewowe leków przeciwko ropniu prątków, pomagając w identyfikacji nowych tropów. Może ujawnić kluczowe cele bakteryjne lub złożone grupy funkcyjne, zapewniając wgląd zarówno w udanych, jak i odrzuconych kandydatów.Takie podejście usprawnia proces opracowywania leków, ukierunkowując przyszłe badania i przyspieszając identyfikację potencjalnych czynników przeciwko ropniu prątków. Aby uzyskać makrofagi ze szpiku kostnego dorosłej myszy typu dzikiego, umieść komórki szpiku kostnego w 96 dobrze obrobionej optycznie płaskiej płytce dolnej zawierającej DMEM, uzupełnionej 10% FBS i 10% LCCM. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 7% dwutlenkiem węgla przez 10 dni.Po różnicowaniu odpipetować 75 mikrolitrów zawiesiny mikrobakterii abscessus do studzienek zawierających makrofagi. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 7% dwutlenkiem węgla przez cztery godziny. Za pomocą dozownika odczynników do mikropłytek wyposażonego w małą kasetę dodaj 110 mikrolitrów DMEM, uzupełnionych o 10% FBS i 10% LCCM do związków lub kolumn kontrolnych rozpuszczalników.Dozować dodatkowe 104 mikrolitry DMEM, uzupełnione 10% FBS i 10% LCCM do kolumn zawierających najwyższe stężenie związku lub rozpuszczalnika. Teraz odpipetuj 5,9 mikrolitra związków lub rozpuszczalnika do wyznaczonych dołków w kolumnach. Za pomocą wielokanałowej mikropipety wykonaj dwa seryjne rozcieńczenia dla każdego związku i rozpuszczalnika.Po ostatnim rozcieńczeniu wyrzucić nadmiar 110 mikrolitrów pożywki z ostatniego dołka. Dodaj 110 mikrolitrów DMEM, uzupełnionych 10% FBS i 10% LCCM do wszystkich kolumn, z wyjątkiem ślepych studzienek. Przygotować roztwór klarytromycyny w stężeniu dwóch mikrogramów na mililitr w DMEM.Po inkubacji należy wyjąć z inkubatora 96-dołkową płytkę zawierającą zakażone makrofagi. Za pomocą myjki do płytek umyj komórki trzykrotnie 200 mikrolitrami roztworu do mycia infekcji. Przenieś 200 mikrolitrów związków na płytkę zawierającą zakażone makrofagi.Następnie dodaj 200 mikrolitrów uzupełnionej pożywki do hodowli komórkowych i roztworu klarytromycyny do odpowiednich dołków. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 7% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. Po inkubacji przemyć zakażone komórki trzykrotnie po 200 mikrolitrami roztworu do przemywania związków.Za pomocą wielokanałowej mikropipety dozować 200 mikrolitrów roztworu utrwalającego do wszystkich studzienek i inkubować przez 10 minut. Po umyciu komórek przenieś 200 mikrolitrów roztworu przepuszczalnego do wszystkich studzienek i inkubuj przez 15 minut. Następnie odessać przepuszczalny roztwór przed dodaniem 100 mikrolitrów roztworu barwiącego do wszystkich studzienek.Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć komórki trzykrotnie 200 mikrolitrami roztworu myjącego związku. Aby przesiać płytkę za pomocą systemu obrazowania o wysokiej zawartości, wybierz typ płytki jako płytkę 96 mikromiareczkowania, obiektyw jako 20 x z 0,4 liczbą i tryb konfokalny.Następnie wybierz DAPI, maskę komórkową, głęboką czerwień i kanał wiśniowy M, aby przechwycić odpowiednio barwione jądra, cytoplazmę i sygnał bakterii. Wybierz dołki płyty i odpowiednie pola każdej studni do analizy. Następnie kliknij test i zrób zdjęcie, aby sprawdzić ustawienia.Na koniec skonfiguruj robota do obsługi sprzętu, aby zautomatyzować akwizycję obrazu w ciągu nocy. To ramię robota wymienia płytki w systemie obrazowania o wysokiej zawartości bez interwencji człowieka Związki daunorubicyny, doksorubicyny, biosteronu, epirubicyny, ammonianu pyrwinu były toksyczne dla makrofagów zakażonych prątkami, prowadząc do mniej niż 85% żywotności komórek. Związki moksalaktam i besifloksacyna miały mniej niż 50% żywotność prątków przy 13,3 mikromolu, ale nie wykazały znaczącej różnicy w porównaniu z kontrolą DMSO.Związek cefdinir, gatifloksacyna i moksyfloksacyna były silne przeciwko wewnątrzkomórkowym prątkom w 13,3 mikromolach, przy czym najbardziej aktywny był związek embonian pyrwinu. Związki roksytromycyny, klarytromycyny i ryfabutyny wykazały ekstremalną siłę działania przeciwko prątkom wewnątrzkomórkowym, przy czym klarytromycyna zmniejszała żywotność prątków do mniej niż 10% we wszystkich stężeniach.

assay-development-for-high-throughput-drug-screening-against

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film pokazuje test do oceny skuteczności leków przeciwko zakażeniu Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  Generowany jest model infekcji in vitro zawierający agregaty Mtb/makrofagów, który naśladuje infekcję in vivo. Po wprowadzeniu odpowiednich antybiotyków ich skuteczność jest testowana za pomocą testu resuzaryny w celu monitorowania przeżywalności bakterii przy rosnących stężeniach leku.

Test do oceny skuteczności leku przeciwko modelowi zakażenia Mycobacterium tuberculosis

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Nowe modele i testy, które poprawiłyby wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych nowej generacji, są wysoce pożądane. Tutaj opisujemy szybki, niedrogi i zgodny z BSL-2 test do oceny skuteczności leku przeciwko Mycobacterium tuberculosis, który można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Trzy testy, w tym test oparty na działaniu cytopatycznym (CPE), test dawka-odpowiedź i test czasu dodania (ToA) zostały opracowane, zoptymalizowane, zatwierdzone i wykorzystane do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka (BTV), a także do określenia możliwego mechanizmu działania (MoA) dla nowo zidentyfikowanych leków przeciwwirusowych.

Testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka

Testy in vitro do pomiaru replikacji wirusa zostały znacznie ulepszone dzięki rozwojowi rekombinowanych wirusów RNA wyrażających lucyferazy lub inne enzymy zdolne do bioluminescencji. W tym miejscu szczegółowo opisujemy wysokoprzepustową linię badań przesiewowych, która łączy takie rekombinowane szczepy wirusów odry i chikungunya w celu wyizolowania leków przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania z bibliotek chemicznych.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania

Tutaj opisujemy cytotoksyczność komórkową i testy zakaźności w pojedynczej rundzie, które pozwalają na szybkie i dokładne badanie przesiewowe związków w celu określenia ich cytotoksyczności komórkowej (CC50) i wartości IC50 przeciwko WT i lekoopornemu HIV-1.

Szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy test qRT-PCR do analizy sygnatur ekspresji IFN typu I i III. Test dyskryminuje różnice w pojedynczej parze zasad między bardzo podobnymi transkryptami tych genów. Dzięki montażowi wsadowemu i zrobotyzowanemu pipetowaniu testy są spójne i powtarzalne.

Wysokoprzepustowy ilościowy test RT-PCR w czasie rzeczywistym do określania profili ekspresji podtypów interferonu typu I i III

Poznaj metodę wysokoprzepustowego przesiewania leków przeciwko Mycobacterium abscessus z wykorzystaniem szczepu podwójnego reportera i automatyzacji robotycznej. To podejście przyspiesza odkrywanie nowych terapii przeciwko opornym bakteriom.

Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

Przeglądaj więcej filmów