Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca
8 października 2016
Ludzka tkanka serca zawiera multipotencjalne okołonaczyniowe populacje komórek prekursorowych, które mogą być odpowiednie do regeneracji mięśnia sercowego. Opisana technika pozwala na jednoczesną izolację i oczyszczenie dwóch multipotencjalnych populacji komórek zrębu związanych z natywnymi naczyniami krwionośnymi, tj. perycytów CD146+CD34- i komórek przybyszowych CD34+CD146-, z ludzkiego mięśnia sercowego.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie dwóch odrębnych populacji multipotencjalnych okołonaczyniowych komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji serca, takie jak wkład w ten proces podzbiorów populacji komórek okołonaczyniowych. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że prowadzi ona do uzyskania populacji komórek progenitorowych o zmniejszonej heterogeniczności i lepszej żywotności wybranych głównych technik adhezji ex.
Technika ta może mieć implikacje w terapii choroby niedokrwiennej serca, ponieważ wykazano, że podtypy okołonaczyniowych komórek macierzystych mają potencjał kardiomiogenny. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat roli komórek okołonaczyniowych w regeneracji serca, może być również zastosowana do badania innych aspektów chorób serca, takich jak zwłóknienie mięśnia sercowego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z żywotnym wykorzystaniem komórek w wyniku świeżości tkanek.
Aby rozpocząć tę procedurę, po usunięciu osierdzia, głównych naczyń i przedsionków, umieść próbkę w podłożu myjącym na szalce Petriego. Następnie pokrój mięsień sercowy komory na małe kawałki o wielkości około jednego milimetra sześciennego i natychmiast je przetwórz, aby uzyskać najwyższą wydajność komórek. Następnie przygotuj świeży roztwór trawiący i podgrzej go do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej.
Następnie przefiltruj zawieszone kawałki tkanek przez sitko o średnicy 100 mikronów i umyj je dwukrotnie PBS. Przenieś kawałki tkanek do sterylnego 30-mililitrowego pojemnika ze szczelnie zamkniętą pokrywką. Dodaj roztwór wytrawiający i umieść pojemnik w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza ustawionej na 120 obr./min.
Po 15 minutach odwróć pojemnik trzy razy. Następnie umieść go z powrotem w łaźni wodnej na dodatkowe 15 minut. Następnie usuń i ugasz kolagenazy pięcioma mililitrami DMEM uzupełnionymi 20% FBS.
Następnie należy rozcierać strawioną tkankę, delikatnie pipetując od 10 do 20 razy 10-mililitrową pipetą serologiczną, aby rozbić wszelkie grudki tkanek. Następnie przefiltruj zawiesinę sekwencyjnie przez sitka do komórek o wielkości 100 mikronów, 70 mikronów, a na końcu o wielkości 40 mikronów, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Następnie odwirować zawiesinę komórek o sile 200 x g przez cztery minuty.
Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do lizy krwinek czerwonych na dwie minuty w temperaturze pokojowej przed rozcieńczeniem go czterema mililitrami środka myjącego. Powtórz etap wirowania i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze środka myjącego. Rozcieńczyć 10 mikrolitrów zawiesiny komórek 90 mikrolitrami pożywki myjącej, aby uzyskać rozcieńczenie zawiesiny komórek od 1 do 10.
Zmieszać 10 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny komórek z 10 mikrolitrami barwienia trypanem i umieścić 10 mikrolitrów mieszaniny na standardowym hemocytometrze do liczenia komórek. W tej procedurze dodaj 50 mikrolitrów mysiej surowicy do zawiesiny komórkowej i inkubuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał. Następnie odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez cztery minuty.
Usunąć sklarowany osad i ponownie zawiesić go w roztworze myjącym. Następnie wsypać 50 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej z dwóch polistyrenowych probówek do cytometrii przepływowej z okrągłym dnem dla izotypu i niebarwionych kontroli, a pozostałą objętość umieścić w trzeciej probówce do barwienia wielobarwnego. Dodaj pięć przeciwciał do zawiesiny pojedynczej komórki w celu barwienia wielokolorowego.
Delikatnie odpipetować, aby wymieszać przeciwciała z komórkami i inkubować wszystkie probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut w ciemności. Przygotować koraliki kontrolne kompensacji, dodając jedną kroplę kulek dodatnich do 100 mikrolitrów pożywki myjącej w pięciu probówkach cytometrii przepływowej. Dodaj przeciwciała indywidualnie do każdej z pięciu probówek.
Następnie inkubuj wszystkie probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut w ciemności. W międzyczasie przygotuj probówki do pobierania komórek, każda zawierająca 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej EGM-2 i umieść je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji przeciwciał dodaj pięć mililitrów pożywki myjącej, aby umyć komórki i kulki w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych przeciwciał.
Odwirować wszystkie probówki o masie 200 x g przez cztery minuty. Powtórzyć etapy mycia i wirowania i ostrożnie zdekantować supernatant. Następnie ponownie zawieś komórki w podłożu myjącym w stężeniu od jednego razy 10 do 6 komórek na 250 mikrolitrów.
Następnie ponownie zawieś kulki w 100 mikrolitrach środka myjącego. Przenieś zawiesiny komórek i kulek do sortownika komórek na lodzie w ciemności. Dodaj jedną kroplę ujemnych kulek do probówek kontrolnych z dodatnią kompensacją koralików i użyj ich do ustawienia kompensacji fluorescencji.
Następnie uruchom niebarwione komórki kontrolne, aby ustalić fluorescencję tła i ustawić napięcia. Następnie uruchom izotypy kontrolne, aby ustalić progi fluorescencji tła związane z niespecyficznym wiązaniem. Uruchom wielobarwną próbkę i zbierz populacje komórek perycytów i przybyszów do probówek zbiorczych.
W tej procedurze dodaj 100 mikrolitrów sterylnego 0,2% roztworu żelatyny na centymetr kwadratowy obszaru wzrostu i mieszaj ręcznie, aby pokryć całość studzienek. Następnie inkubuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie całkowicie usuń roztwór żelatyny.
Trzymaj zebrane komórki na lodzie podczas przygotowywania płytek hodowlanych. Następnie odwirować świeżo zebrane komórki o sile 200 x g przez cztery minuty i delikatnie zawiesić osad komórek w odpowiedniej ilości EGM-2. Następnie wysiewaj komórki na płytkach pokrytych żelatyną.
Na tym rysunku żywe komórki zostały bramkowane, aby najpierw wykluczyć komórki CD45-dodatnie, a następnie komórki CD56-dodatnie. Komórki śródbłonka CD144-dodatnie zostały następnie usunięte z frakcji CD56-ujemnej. Z tej końcowej populacji wybrano CD146-dodatnie, CD34-ujemne perycyty i CD146-ujemne, CD34-dodatnie komórki przybyszowe, a następnie pobrano.
Obie kultury perycytów mięśnia sercowego i komórek przybyszowych oczyszczonych metodą FACS wykazują morfologię komórek wrzecionowatych do gwiaździstych. Po opanowaniu tej techniki zajmie to około pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że najświeższe próbki zapewnią najlepszą wydajność żywotnych komórek.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak kardiomioplastyka komórkowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak przydatność tych komórek w leczeniu choroby niedokrwiennej serca.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W tym artykule przedstawiono metodę izolacji dwóch odrębnych populacji wszechstronnych komórek prekursorowych otaczających naczyniakrwionośne z tkanki serca człowieka. Technika ma na celu zwiększenie zrozumienia regeneracji serca i roli komórek otaczających naczynia w tym procesie.
Kluczowe elementy badania
Dział obszaru nauki
- Regeneracja serca
- Biologia komórek macierzystych
- Populacje komórek otaczających naczynia
Tło
- Tkanka serca człowieka zawiera wszechstronne komórki prekursorowe otaczające naczyniakrwionośne.
- Komórki te mogą przyczyniać się do regeneracji mięśnia sercowego.
- Badanie koncentruje się na perycytach CD146 + CD34 - i komórkach przyśrodkowych CD34 + CD146 -.
- Zrozumienie tych populacji może poinformować terapie dla choroby niedokrwiennej serca.
Cel badania
- Izolacja i oczyszczanie specyficznych populacji komórek otaczających naczynia.
- Zbadanie ich wkładu w regenerację serca.
- Zmniejszenie zróżnicowania i poprawa przeżywalności izolowanych komórek.
Wykorzystane metody
- Izolacja peryocytów CD146 + CD34 - i komórek przyśrodkowych CD34 + CD146 -.
- Zastosowanie głównych technik były-adhezyjnych.
- Ocena przeżywalności i zróżnicowania komórek.
- Potencjalne zastosowanie w badaniach nad bliznowaceniem mięśnia sercowego.
Główne wyniki
- Pomyślna izolacja dwóch odrębnych populacji komórek otaczających naczynia.
- Poprawiona przeżywalność komórek macierzystych w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
- Wgląd w rolę komórek otaczających naczynia w regeneracji serca.
- Metoda możliwa do zastosowania w innych badaniach chorób serca.
Wnioski
- Technika zwiększa zrozumienie mechanizmów regeneracji serca.
- Może prowadzić do postępu w terapiach choroby niedokrwiennej serca.
- Przyszłe badania mogą zbadać szersze implikacje dla zdrowia serca.
Najczęściej zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolating defined perivascular precursor cell populations from human myocardium enables mechanistic de-risking in cardiac regeneration research by reducing cellular heterogeneity and improving viability. This approach supports target validation and phenotypic screening for ischemic heart disease therapies by providing reproducible, disease-relevant systems. The method enhances predictive confidence in preclinical models through standardized isolation of CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding perivascular cell contributions to cardiac regeneration.
- Operational Value: Reduces biological noise through prospective isolation of homogeneous multipotent precursor subpopulations.
- Strategic Value: Supports target de-risking by clarifying functional roles of specific perivascular subsets in myocardial repair pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological systems with defined surface marker profiles for consistent compound screening.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via FACS-based purification of pericyte and adventitial cell populations.
- Strategic Value: Facilitates scalable platform reuse for evaluating drug effects on cardiac progenitor cell function and viability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant human cardiac cell models for investigating myocardial fibrosis and ischemic injury mechanisms.
- Operational Value: Enables translational continuity from discovery to preclinical validation using clinically relevant perivascular subsets.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by improving predictive value of preclinical efficacy and safety assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying purified perivascular precursor cells for hypothesis testing in early discovery, assay-ready cells for screening applications, and translationally relevant models for preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through isolation of defined perivascular cell populations.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cell suspensions with quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative assessment of cell viability, purity, and functional readouts following isolation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via use of human-derived, disease-relevant cardiac progenitor cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable FACS-based isolation platform applicable across cardiac disease models and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in perivascular cell function.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cardiac progenitor cell isolation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency through better target validation and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiac regeneration programs based on validated precursor cell activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, cell sorting, and primary tissue handling.
- Dependent on access to FACS instrumentation, antibody panels, and sterile cell culture infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and gating strategies for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different tissue sources or disease models.
- Limited by tissue freshness requirements, as viable cell yield declines with sample degradation.
