Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie dwóch odrębnych populacji multipotencjalnych okołonaczyniowych komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji serca, takie jak wkład w ten proces podzbiorów populacji komórek okołonaczyniowych. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że prowadzi ona do uzyskania populacji komórek progenitorowych o zmniejszonej heterogeniczności i lepszej żywotności wybranych głównych technik adhezji ex.

Technika ta może mieć implikacje w terapii choroby niedokrwiennej serca, ponieważ wykazano, że podtypy okołonaczyniowych komórek macierzystych mają potencjał kardiomiogenny. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat roli komórek okołonaczyniowych w regeneracji serca, może być również zastosowana do badania innych aspektów chorób serca, takich jak zwłóknienie mięśnia sercowego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z żywotnym wykorzystaniem komórek w wyniku świeżości tkanek.

Aby rozpocząć tę procedurę, po usunięciu osierdzia, głównych naczyń i przedsionków, umieść próbkę w podłożu myjącym na szalce Petriego. Następnie pokrój mięsień sercowy komory na małe kawałki o wielkości około jednego milimetra sześciennego i natychmiast je przetwórz, aby uzyskać najwyższą wydajność komórek. Następnie przygotuj świeży roztwór trawiący i podgrzej go do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej.

Następnie przefiltruj zawieszone kawałki tkanek przez sitko o średnicy 100 mikronów i umyj je dwukrotnie PBS. Przenieś kawałki tkanek do sterylnego 30-mililitrowego pojemnika ze szczelnie zamkniętą pokrywką. Dodaj roztwór wytrawiający i umieść pojemnik w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza ustawionej na 120 obr./min.

Po 15 minutach odwróć pojemnik trzy razy. Następnie umieść go z powrotem w łaźni wodnej na dodatkowe 15 minut. Następnie usuń i ugasz kolagenazy pięcioma mililitrami DMEM uzupełnionymi 20% FBS.

Następnie należy rozcierać strawioną tkankę, delikatnie pipetując od 10 do 20 razy 10-mililitrową pipetą serologiczną, aby rozbić wszelkie grudki tkanek. Następnie przefiltruj zawiesinę sekwencyjnie przez sitka do komórek o wielkości 100 mikronów, 70 mikronów, a na końcu o wielkości 40 mikronów, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Następnie odwirować zawiesinę komórek o sile 200 x g przez cztery minuty.

Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do lizy krwinek czerwonych na dwie minuty w temperaturze pokojowej przed rozcieńczeniem go czterema mililitrami środka myjącego. Powtórz etap wirowania i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze środka myjącego. Rozcieńczyć 10 mikrolitrów zawiesiny komórek 90 mikrolitrami pożywki myjącej, aby uzyskać rozcieńczenie zawiesiny komórek od 1 do 10.

Zmieszać 10 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny komórek z 10 mikrolitrami barwienia trypanem i umieścić 10 mikrolitrów mieszaniny na standardowym hemocytometrze do liczenia komórek. W tej procedurze dodaj 50 mikrolitrów mysiej surowicy do zawiesiny komórkowej i inkubuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał. Następnie odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez cztery minuty.

Usunąć sklarowany osad i ponownie zawiesić go w roztworze myjącym. Następnie wsypać 50 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej z dwóch polistyrenowych probówek do cytometrii przepływowej z okrągłym dnem dla izotypu i niebarwionych kontroli, a pozostałą objętość umieścić w trzeciej probówce do barwienia wielobarwnego. Dodaj pięć przeciwciał do zawiesiny pojedynczej komórki w celu barwienia wielokolorowego.

Delikatnie odpipetować, aby wymieszać przeciwciała z komórkami i inkubować wszystkie probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut w ciemności. Przygotować koraliki kontrolne kompensacji, dodając jedną kroplę kulek dodatnich do 100 mikrolitrów pożywki myjącej w pięciu probówkach cytometrii przepływowej. Dodaj przeciwciała indywidualnie do każdej z pięciu probówek.

Następnie inkubuj wszystkie probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut w ciemności. W międzyczasie przygotuj probówki do pobierania komórek, każda zawierająca 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej EGM-2 i umieść je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji przeciwciał dodaj pięć mililitrów pożywki myjącej, aby umyć komórki i kulki w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych przeciwciał.

Odwirować wszystkie probówki o masie 200 x g przez cztery minuty. Powtórzyć etapy mycia i wirowania i ostrożnie zdekantować supernatant. Następnie ponownie zawieś komórki w podłożu myjącym w stężeniu od jednego razy 10 do 6 komórek na 250 mikrolitrów.

Następnie ponownie zawieś kulki w 100 mikrolitrach środka myjącego. Przenieś zawiesiny komórek i kulek do sortownika komórek na lodzie w ciemności. Dodaj jedną kroplę ujemnych kulek do probówek kontrolnych z dodatnią kompensacją koralików i użyj ich do ustawienia kompensacji fluorescencji.

Następnie uruchom niebarwione komórki kontrolne, aby ustalić fluorescencję tła i ustawić napięcia. Następnie uruchom izotypy kontrolne, aby ustalić progi fluorescencji tła związane z niespecyficznym wiązaniem. Uruchom wielobarwną próbkę i zbierz populacje komórek perycytów i przybyszów do probówek zbiorczych.

W tej procedurze dodaj 100 mikrolitrów sterylnego 0,2% roztworu żelatyny na centymetr kwadratowy obszaru wzrostu i mieszaj ręcznie, aby pokryć całość studzienek. Następnie inkubuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie całkowicie usuń roztwór żelatyny.

Trzymaj zebrane komórki na lodzie podczas przygotowywania płytek hodowlanych. Następnie odwirować świeżo zebrane komórki o sile 200 x g przez cztery minuty i delikatnie zawiesić osad komórek w odpowiedniej ilości EGM-2. Następnie wysiewaj komórki na płytkach pokrytych żelatyną.

Na tym rysunku żywe komórki zostały bramkowane, aby najpierw wykluczyć komórki CD45-dodatnie, a następnie komórki CD56-dodatnie. Komórki śródbłonka CD144-dodatnie zostały następnie usunięte z frakcji CD56-ujemnej. Z tej końcowej populacji wybrano CD146-dodatnie, CD34-ujemne perycyty i CD146-ujemne, CD34-dodatnie komórki przybyszowe, a następnie pobrano.

Obie kultury perycytów mięśnia sercowego i komórek przybyszowych oczyszczonych metodą FACS wykazują morfologię komórek wrzecionowatych do gwiaździstych. Po opanowaniu tej techniki zajmie to około pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że najświeższe próbki zapewnią najlepszą wydajność żywotnych komórek.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak kardiomioplastyka komórkowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak przydatność tych komórek w leczeniu choroby niedokrwiennej serca.