Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie dwóch odrębnych populacji wielopotencjalnych prekursorowych komórek okołynaczyniowych z ludzkiej tkanki serca. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu regeneracji serca, takie jak wkład poszczególnych podzbiorów populacji komórek okołynaczyniowych w ten proces. Główną zaletą tej techniki jest uzyskanie populacji komórek progenitorowych o zmniejszonej heterogeniczności i poprawionej żywotności w porównaniu z wybranymi głównymi technikami odrywania komórek od podłoża.

Technika ta może mieć zastosowanie w terapii niedokrwiennej choroby serca, ponieważ wykazano, że podtypy okołynacznych komórek macierzystych posiadają potencjał kardiomiogenny. Choć metoda ta pozwala na zgłębienie roli komórek okołynacznych w regeneracji serca, może być ona również stosowana w badaniu innych aspektów chorób serca, takich jak włóknienie mięśnia sercowego. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności związane z wykorzystaniem żywych komórek, co wynika z konieczności zachowania świeżości tkanki.

Aby rozpocząć tę procedurę, po usunięciu osierdzia, głównych naczyń krwionośnych i przedsionków, należy umieścić próbkę w medium piorącym w szalce Petriego. Następnie mięsień komór wpadać na małe kawałki o wielkości około 1 mm³ i przetworzyć je bezzwłocznie, aby uzyskać najwyższą wydajność komórek. Następnie należy przygotować świeży roztwór trawienny i ogrzać go do 37 °C w łaźni wodnej.

Następnie przefiltrować zawiesinę fragmentów tkanki przez sito o oczkach 100 micron oraz dwukrotnie przemyć je w PBS. Przenieść fragmenty tkanki do sterylnego pojemnika o pojemności 30 mililitr z szczelnie zamykaną pokrywką. Dodać roztwór trawienny i umieścić pojemnik w zamkniętym plastikowym worku w wstrząsanej kąpieli wodnej w temperaturze 37 degrees Celsius przy prędkości 120 RPM.

Po 15 minutach odwróć naczynie trzy razy. Następnie umieść je z powrotem w kąpieli wodnej na kolejne 15 minut. Po tym czasie wyjmij naczynie i zneutralizuj kolagenazy za pomocą pięciu mililitrów DMEM uzupełnionego o 20% FBS.

Następnie utrzeć strawioną tkankę, delikatnie pipetując ją od 10 do 20 razy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml, aby rozbić grudki tkankowe. Następnie przepuścić zawiesinę kolejno przez sitka komórkowe o rozmiarach oczek 100 µm, 70 µm, a na koniec 40 µm, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Po tym etapie odwirować zawiesinę komórkową z prędkością 200 x g przez cztery minuty.

Ostrożnie odlej nadsącz i resuspenduj osad w 1 ml buforu do lizy erytrocytów przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie rozcieńcz go 4 ml medium piorącego. Powtórz etap wirowania i resuspenduj osad w 1 ml medium piorącego. Rozcieńcz 10 µL zawiesiny komórkowej w 90 µL medium piorącego, aby przygotować rozcieńczenie zawiesiny komórkowej 1:10.

Wymieszaj 10 µL rozcieńczonej zawiesiny komórek z 10 µL barwnika trypan blue i nanieś 10 µL mieszaniny na standardowy komorę Bürckera w celu policzenia komórek. W tej procedurze dodaj 50 µL surowicy mysiej do zawiesiny komórek i inkubuj ją w temperaturze 4 °C przez 20 minut, aby zablokować nieswoiste wiązanie przeciwciał. Następnie odwiruj zawiesinę komórek z prędkością 200 × g przez 4 minuty.

Usunąć nadsącz i resuspendować osad w medium piorącym. Następnie odmierzyć i przenieść 50 µL zawiesiny komórkowej do każdej z dwóch polistyrenowych probówek z okrągłym dnem do cytometrii przepływowej dla kontroli izotypowej oraz kontroli niebarwionej, a pozostałą objętość przelać do trzeciej probówki w celu barwienia wielokolorowego. Do zawiesiny pojedynczych komórek przeznaczonej do barwienia wielokolorowego dodać pięć przeciwciał.

Ostrożnie wymieszać przeciwciała z komórkami za pomocą pipety, a następnie inkubować wszystkie probówki w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności. Przygotować kuleczki do kontroli kompensacji, dodając jedną kroplę kuleczek pozytywnych do 100 µL medium piorącego w pięciu probówkach do cytometrii przepływowej. Do każdej z pięciu probówek dodać poszczególne przeciwciała.

Następnie inkubować wszystkie probówki w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności. W międzyczasie przygotować probówki do zbierania komórek, każda zawierająca 500 µL pożywki hodowlanej EGM-2, i umieścić je w temperaturze 4 °C. Po inkubacji z przeciwciałami dodać 5 mL medium płuczącego, aby przemyć komórki i kuleczki w celu usunięcia nie związanych przeciwciał.

Wszystkie probówki odwiruj przy 200 × g przez cztery minuty. Powtórz etapy płukania i wirowania, a następnie ostrożnie odlej nadsącz. Następnie resuspenduj komórki w medium płuczącym do stężenia 1 × 10⁶ komórek na 250 µL.

Następnie resuspendować kuleczki w 100 µL medium płuczącego. Przenieść zawiesiny komórek i kuleczek do sortera komórkowego w transporcie w lodzie i w ciemności. Do probówek z kontrolą kompensacji dla kuleczek pozytywnych dodać jedną kroplę kuleczek negatywnych i wykorzystać je do ustawienia kompensacji fluorescencji.

Następnie należy przeanalizować niestrzebowane komórki kontrolne, aby ustalić fluorescencję tła i ustawić napięcia. Następnie należy przeanalizować izotypy kontrolne, aby ustalić progi fluorescencji tła związane z niespecyficznym wiązaniem. Następnie należy przeanalizować próbkę barwioną wielobarwnie i zebrać populacje perycytów oraz komórek błony zewnętrznej do probówek zbierających.

W tej procedurze należy dodać 100 µL sterylnego 0,2% roztworu żelatyny na centymetr kwadratowy powierzchni wzrostu i wymieszać ręcznie, aby pokryć całą powierzchnię dołków. Następnie płytki należy inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Po tym czasie należy całkowicie usunąć roztwór żelatyny.

Zebrane komórki należy przechowywać w lodzie podczas przygotowywania płytek hodowlanych. Następnie świeżo zebrane komórki wirować przy 200 x g przez cztery minuty i delikatnie resuspender osad komórkowy w odpowiedniej ilości EGM-2. Po tym wysiać komórki na płytki pokryte żelatyną.

Na tej rycinie żywe komórki poddano bramkowaniu, aby w pierwszej kolejności wykluczyć komórki CD45-dodatnie, a następnie komórki CD56-dodatnie. Następnie z frakcji CD56-ujemnej usunięto CD144-dodatnie komórki śródbłonka. Z tej końcowej populacji wyselekcjonowano i następnie pobrano perycyty CD146-dodatnie i CD34-ujemne oraz komórki adwentycjalne CD146-ujemne i CD34-dodatnie.

Zarówno hodowle perycytów mięśnia sercowego, jak i komórek adventicjalnych oczyszczonych metodą FACS wykazują morfologię od wrzecionowatej do gwiaździstej. Po opanowaniu techniki, jej prawidłowe wykonanie zajmuje około pięciu godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że najświeższe próbki zapewnią najwyższą wydajność żywych komórek.

Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak komórkowa kardiomioplastyka, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczące przydatności tych komórek w leczeniu niedokrwiennej choroby serca.