Śledzenie zmian wywołanych przez leki w transporcie receptorów po internalizacji za pomocą analizy kolokalizacyjnej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowa ocena kolokalizacji przestrzennej par docelowych, a w tym przypadku badanie indukowanego lekiem transportu receptorów. Osiąga się to poprzez traktowanie żywych hodowli komórkowych lekiem w celu wywołania zmian w transporcie receptorów. W drugim kroku podwójne znakowanie immunochemiczne receptorów docelowych i wewnątrzkomórkowych przedziałów transportowych pozwala na następującą lokalizację przestrzenną par docelowych przy użyciu wielokanałowej mikroskopii konfokalnej.

Ilościowa analiza kolokalizacji jest wykorzystywana do pomiaru tendencji receptorów docelowych i przedziałów komórkowych do współwystępowania w tym samym miejscu. Wyniki wykazują zmiany w transporcie receptorów po zastosowaniu leku, w oparciu o kolokalizację receptorów i wewnątrzkomórkowych przedziałów transportowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak nakładanie obrazów (overlay colocalization), jest dostarczenie ilościowych miar kolokalizacji, co umożliwia przeprowadzanie znacznie bardziej zaawansowanych analiz i projektowanie złożonych eksperymentów.

Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat transportu receptorów, można ją również zastosować do badania zmian w przestrzennej kolokalizacji niemal dowolnych dwóch białek w hodowlach komórkowych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy usunąć pierwotne pożywka wzrostowe i zastąpić je pożywką zawierającą badany lek w wybranym stężeniu. Następnie komórki należy inkubować w pierwotnych warunkach hodowli przez wybrany czas ekspozycji.

Po inkubacji komórki należy delikatnie przemyć trzy razy, używając za każdym razem 1 mL buforu do mycia. Następnie komórki należy utrwalić w 300 µL 4%paraformaldehydu w 0,1 M PBS przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Po tym czasie komórki należy ponownie przemyć trzy razy, używając za każdym razem 1 mL buforu do mycia.

Następnie inkubować komórki w 300 µL buforu blokującego przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po tym czasie inkubować komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym w 300 µL rozcieńczalnika przeciwciał przez 48 godzin w temperaturze 4 °C. Następnie delikatnie przemyć komórki trzy razy, używając za każdym razem 1 mL buforu do mycia.

Następnie inkubować komórki z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z Fluorem w 300 µL rozcieńczalnika przeciwciał przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc komórki przed światłem. Po godzinie delikatnie przemyć komórki buforem do mycia, stosując 1 mL buforu podczas każdego z trzech cykli płukania. Aby usunąć szkiełko nakrywkowe z płytki 24-dołkowej, należy przechylić płytkę pod kątem 45 stopni.

Umieść końcówkę pęsety precyzyjnej przy górnej krawędzi szkiełka nakrywki w miejscu, w którym styka się ono z dnem dołka. Następnie delikatnie przechyl szkiełko nakrywki w buforze piorącym, odsuwając je od dna dołka. Szkiełko nakrywki oprze się o ściankę dołka, skąd można je łatwo usunąć za pomocą pęsety.

Następnie przymocuj szkiełka nakrywkowe z komórkami skierowanymi w dół do szkiełek przedmiotowych, stosując medium montażowe zapobiegające blaknięciu (anti-fading), używając obiektywu o dużym powiększeniu 100x. Najpierw, za pomocą epi-fluorescencji, zlokalizuj reprezentatywną komórkę do obrazowania. Następnie skonfiguruj ustawienia przechwytywania obrazu; zapisuj nieskompresowane obrazy TIFF 8-bitowe dla każdego znakowanego kanału, aby obrazować każdy kanał sekwencyjnie i uśrednić od czterech do sześciu skanów dla obrazu końcowego.

Następnie przełącz się na ścieżkę obrazowania konfokalnego i ustaw ostrość na płaszczyznę Z przechodzącą przez środek komórki. Zoptymalizuj otwór pinhole, moc lasera oraz napięcie i offset fotopowielacza dla każdego kanału. Zapisz te ustawienia i stosuj je podczas obrazowania wszystkich komórek znakowanych dla danej pary celów.

W tej samej replikacie zlokalizuj kolejne komórki, które mają zostać zobrazowane przy użyciu obiektywu o dużym powiększeniu. Korzystając z fluorescencji epi, przełącz się na ścieżkę obrazowania konfokalnego i ustaw ostrość na płaszczyznę Z przechodzącą przez środek komórki, jeśli jest dostępna. Użyj funkcji przycinania zoomu w oprogramowaniu, aby ograniczyć obszar skanowania do wybranej komórki. Następnie.

Wykonaj zdjęcia dla każdego oznakowanego kanału, korzystając z wcześniej ustalonych ustawień, a następnie powtórz procedury, aby zobrazować 15 lub więcej komórek na warunek w każdej powtórce, w celu zapewnienia wystarczającej liczby zebranych próbek. W tej procedurze otwórz parę obrazów komórki w programie ImageJ. Użyj polecenia merge channels, aby wygenerować obraz RGB.

Następnie obrysuj interesującą komórkę. Użyj wtyczki SC colocalization w programie ImageJ, aby ilościowo określić kolokalizację celów w wybranej komórce. Zapisz pożądany parametr kolokalizacji i powtórz tę procedurę dla każdej komórki na obrazie.

Następnie oblicz średnią z zapisanych wartości kolokalizacji dla wspólnych warunków kontrolnych każdego powtórzenia w każdym wariancie znakowania. Pomnóż otrzymane średnie przez minus jeden, aby wyznaczyć wartość przesunięcia (offset) dla każdego powtórzenia w każdym wariancie znakowania. Następnie dodaj wartość przesunięcia dla każdego powtórzenia w każdym wariancie znakowania do każdej wartości kolokalizacji w danym powtórzeniu.

Pozwoli to na normalizację danych w taki sposób, aby średnia miara kolokalizacji dla wspólnej grupy kontrolnej wynosiła zero w każdym powtórzeniu każdego z warunków znakowania. Następnie wszystkie dane ze wszystkich powtórzeń każdego warunku znakowania umożliwią analizę zmian w kolokalizacji pomiędzy powtórzeniami. Przedstawione tutaj są kultury pierwotne neuronów sensorycznych zzęsłów korzeni grzbietowych, które zostały poddane przedłużonej i ostrej ekspozycji na leki. Następnie komórki poddano immunoznakowaniu w kierunku receptorów delta-opioidowych oraz markera endosomów recyklingujących z wykorzystaniem odrębnych par przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, a następnie obrazowano za pomocą dwukanałowej sekwencyjnej mikroskopii konfokalnej.

Oprócz późniejszej ilościowej kolokalizacji i analizy, reprezentatywne obrazy zostały przetworzone w celu wygenerowania przedstawionych tutaj fałszywie kolorowych map kolokalizacji. Średnie wyniki kolokalizacji receptorów delta opioidowych z markerami wczesnych endosomów, endosomów recyklingujących i lizosomów w każdym z przedziałów są porównywane pomiędzy grupami otrzymującymi różne ostre dawki leków, co pozwala na zaobserwowanie indukowanych lekami zmian w transporcie receptorów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pozyskać wysokiej jakości, spójne mikrografie, które umożliwią poprawną analizę ilościową.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania ilościowej analizy kolokalizacji.