Śledzenie zmian wywołanych przez leki w transporcie receptorów po internalizacji za pomocą analizy kolokalizacyjnej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowa ocena przestrzennej kolokalizacji par docelowych, w tym przypadku badanie transportu receptorów indukowanego przez leki. Osiąga się to poprzez traktowanie żywych hodowanych komórek lekiem w celu indukowania zmienionego transportu receptorów. Drugim krokiem jest podwójne znakowanie immunologiczne docelowych receptorów i wewnątrzkomórkowych przedziałów transportowych, które umożliwiają przestrzenną lokalizację par docelowych za pomocą wielokanałowej mikroskopii konfokalnej.

Ilościowa analiza kolokalizacji służy do pomiaru tendencji docelowych receptorów i przedziałów do znajdowania się w tym samym miejscu. Wyniki wskazują na zmiany w transporcie receptorów po leczeniu farmakologicznym w oparciu o kolokalizację receptorów i wewnątrzkomórkowych przedziałów transportowych. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak kolokalizacja nakładkowa, jest to, że zapewnia ona ilościowe pomiary kolokalizacji, co z kolei pozwala na znacznie bardziej zaawansowane analizy i złożone projekty eksperymentalne.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat transportu receptorów, może być również zastosowana do zmian w przestrzennej kolokalizacji prawie dowolnych dwóch białek w hodowanych komórkach. Aby rozpocząć tę procedurę, należy usunąć oryginalną pożywkę wzrostową i zastąpić ją pożywką zawierającą interesujący lek w wybranym stężeniu. Następnie należy inkubować komórki w pierwotnych warunkach wzrostu przez wybrany czas trwania zabiegu.

Po inkubacji delikatnie przemyć komórki jednym mililitrem buforu płuczącego za każdym razem trzy razy. Utrwal komórki za pomocą 300 mikrolitrów 4% para formaldehydu w 0,1 molowym PBS przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie ponownie przemyj komórki jednym mililitrem buforu myjącego, za każdym razem trzy razy.

Następnie inkubować komórki w 300 mikrolitrach buforu blokującego przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym w 300 mikrolitrach rozcieńczalnika przeciwciał przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie delikatnie przemyj komórki jednym mililitrem bufora myjącego za każdym razem przez trzy razy.

Następnie inkubuj komórki z drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z fluorem w 300 mikrolitrach rozcieńczalnika przeciwciał przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej i chroń komórki przed światłem. Po godzinie delikatnie przemyj komórki jednym mililitrem buforu myjącego za każdym razem trzy razy. Aby usunąć szkiełko nakrywkowe z płytki 24-dołkowej, przytrzymaj płytkę pod kątem 45 stopni.

Umieść końcówkę cienkich kleszczyków na górnej krawędzi szkiełka nakrywkowego w miejscu, w którym styka się z dnem studni. Następnie delikatnie odchyl szkiełko nakrywkowe w buforze do mycia od dna studni. Szkiełko nakrywkowe oprze się o ścianę studni, skąd można je łatwo usunąć za pomocą kleszczy.

Następnie zamontuj szkiełka nakrywkowe komórkami skierowanymi w dół na szkiełkach mikroskopowych za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu, używając obiektywu o dużym powiększeniu 100 razy. Najpierw zlokalizuj reprezentatywną komórkę, która ma być obrazowana za pomocą fluorescencji epi. Następnie skonfiguruj ustawienia przechwytywania obrazu Nagrywaj ośmiobitowe, nieskompresowane obrazy tiff każdego oznaczonego kanału, aby obrazować każdy kanał sekwencyjnie i uśredniać od czterech do sześciu skanów w celu uzyskania końcowego obrazu.

Następnie przełącz się na ścieżkę obrazowania konfokalnego i ustaw ostrość na płaszczyźnie Z przechodzącej przez środek komórki. Zoptymalizuj moc lasera otworkowego i napięcie lampy powielacza zdjęć oraz przesunięcie dla każdego kanału. Zapisz te ustawienia i użyj tych samych ustawień do obrazowania wszystkich komórek oznaczonych dla dowolnej pary docelowej.

W tym samym Replikuj następne komórki lokalizatora, które mają być zobrazowane za pomocą obiektywu o dużym powiększeniu. Korzystając z epi fluorescencji, przełącz się na ścieżkę obrazowania konfokalnego i ustaw ostrość na płaszczyźnie Z przechodzącej przez środek komórki, jeśli jest dostępna. Użyj programowej funkcji przycinania zoomu, aby ograniczyć obszar skanowania do interesującej Cię komórki. Potem.

Przechwyć obrazy dla każdego oznaczonego kanału, korzystając z wcześniej ustalonych ustawień, i powtórz procedury, aby zobrazować 15 lub więcej komórek na warunek na replikę. W celu zapewnienia wystarczającego pobrania próbki. W tej procedurze otwórz parę obrazów komórki na obrazie J. Użyj polecenia kanałów scalania kolorów obrazu, aby wygenerować obraz RGB.

Następnie obrysuj interesującą Cię komórkę. Użyj wtyczki obrazu j kolokalizacji SC, aby określić ilościowo kolokalizację celów w wybranej komórce. Zapisz żądaną miarę kolokalizacji i powtórz procedurę dla każdej komórki obrazu.

Następnie należy obliczyć średnią zarejestrowanych wartości kolokalizacji wspólnych warunków kontrolnych dla każdej kontrpróby każdego warunku etykietowania. Pomnóż średnie przez minus jeden, aby uzyskać przesunięcie dla każdej repliki w każdym warunku etykietowania. Następnie dodaj przesunięcie dla każdej repliki w każdym warunku etykietowania do każdej wartości kolokalizacji w tej replikacji.

Spowoduje to normalizację danych w taki sposób, że średnia miara kolokalizacji dla wspólnego warunku kontrolnego wynosi zero w każdej powtórzonej każdej warunku etykietowania. Następnie wszystkie dane ze wszystkich powtórzeń każdego warunku znakowania pozwolą na analizę zmian w kolokalizacji w powtórzeniach Pokazano tutaj pierwotne kultury neuronów czuciowych zwojów korzenia grzbietowego, które były narażone na długotrwałe i ostre leczenie farmakologiczne. Komórki zostały następnie znakowane immunologicznie pod kątem receptorów opioidowych delta i markera endosomów recyklingu z odrębnymi pierwszorzędowymi parami przeciwciał drugorzędowych i zostały zobrazowane za pomocą dwukanałowej sekwencyjnej mikroskopii konfokalnej.

Oprócz późniejszej kolokalizacji i analizy ilościowej, te reprezentatywne obrazy zostały przetworzone w celu wygenerowania map kolokalizacji fałszywych kolorów pokazanych tutaj. Porównuje się średnie wyniki kolokalizacji receptorów opioidowych delta i markerów endosomów recyklingu wczesnych endosomów i kolokalizacji receptorów lizosomów z każdym przedziałem między grupami otrzymującymi różne ostre leczenie farmakologiczne i obserwuje się zmiany w transporcie receptorów wywołane przez leki. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o uzyskaniu wysokiej jakości spójnych mikrofotografii, które umożliwią prawidłową analizę ilościową.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić ilościową analizę kolokalizacji.