Name: Śledzenie zmian wywołanych przez leki w transporcie receptorów po internalizacji za pomocą analizy kolokalizacyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy kolokalizacji receptorów po leczeniu komórek w hodowli. Technika wykorzystuje wielokanałową mikroskopię konfokalną do badania transportu receptorów w neurobiologii i farmakologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant od CIHR (MOP394808) oraz Kanadyjską Katedrę Badań dla C.M.C. E.W.O. otrzymał stypendium podyplomowe od NSERC.

Uwaga: Ten protokół jest zasadniczo kompatybilny z różnymi monowarstwowymi modelami hodowli komórek/tkanek, schematami leczenia farmakologicznego i celami znakowania. W związku z tym w rzeczywistym użytkowaniu wiele specyficznych parametrów będzie się różnić w zależności od projektu eksperymentalnego. W tym miejscu odwołania do tych parametrów zdefiniowanych przez użytkownika są ogólne. Przykładowe warunki, które służą do uzyskania reprezentatywnych wyników, są zaznaczone kursywą.
1. Rozwiązania
<ol>
	<li>Przygotować bufor do mycia, mieszając 0,1 M hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej z buforem trisowym (300 mM) i 0,05% polisorbatu 20; pH 7,4 w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj bufor blokujący. Do 0,05 M tris-buffered hypertonic (300 mM) soli fizjologicznej dodać 0,05% polisorbatu 20, 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1% żelatyny ze skóry ryb i dostosować pH do 7,4 w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczalnik przeciwciał, dodając 0,05% polisorbatu 20, 1% BSA, 0,1% żelatyny ze skóry ryb do 0,05 M hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej buforowanej trisem (300 mM) i dostosować pH do 7,4 w temperaturze 4 oC. 
	Uwaga: pH Tris jest zależne od temperatury. Oznacza to, że zmiana temperatury zmieni pH roztworu. Aby zapewnić spójność, te powinny być zawsze dostosowane do temperatury, w której będą używane.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa
Uwaga: Odpowiednie protokoły hodowli komórkowych będą się różnić w zależności od użytego typu komórek. Procedury te muszą być oddzielnie zoptymalizowane. Szczegółowe metodologie hodowli komórkowych są łatwo dostępne, w tym16. Podobną procedurę zastosowano w celu uzyskania reprezentatywnych wyników, z zauważalnymi różnicami:
<ol>
	<li>Hodowla neuronów zwojów korzenia grzbietowego od dorosłych zwierząt zgodnie z opisem 12. Użyj pożywki dla dorosłych neuronów do hodowli komórek. Zmniejsz gęstość komórek glejowych poprzez wstępne powlekanie, a nie glutaminian. Powoduje to mieszaną hodowlę neuronów glejowych wyhodowaną na 12-okrągłych szklanych szkiełkach nakrywkowych z co najmniej 30-60 neuronami na płytkę i towarzyszącymi komórkami glejowymi wyhodowanymi do około 40% zbieżności. Należy zauważyć, że neurony w hodowli pierwotnej nie będą się replikować i zostaną wypchnięte z płytki przez współhodowany glej, jeśli pozwoli się glejowi nadmiernie rosnąć. Aby uniknąć wpływu na neurony, fizyczna redukcja liczby glejowej jest lepsza niż metody chemiczne/farmakologiczne. 
	Uwaga: Na potrzeby tego protokołu zakładamy, że komórki będące przedmiotem zainteresowania są hodowane do ich eksperymentalnie pożądanego stanu i powlekane jednowarstwowo. Uważamy, że najwygodniejsze jest powlekanie na 12-okrągłych szklanych szkiełkach nakrywkowych w płytkach 24-dołkowych. Wszystkie opisane objętości i procedury są odpowiednie dla jednego szkiełka nakrywkowego w jednym dołku na płytce 24-dołkowej.</li>
</ol>
3. Leczenie farmakologiczne hodowanych komórek
Uwaga: Możliwe jest wielokrotne sekwencyjne lub nakładające się na siebie leczenie farmakologiczne. Leki, dawki/stężenia i czas trwania ekspozycji będą zależeć od konkretnego eksperymentu.
<ol>
	<li>Usunąć oryginalną pożywkęwzrostową 16 i zastąpić ją pożywką zawierającą interesujący lek (leki) w wybranym stężeniu (stężeniach). W takim przypadku należy użyć 10 μM morfiny rozpuszczonej w soli fizjologicznej lub użyć soli fizjologicznej jako kontroli. 
	Uwaga: Ważne jest, aby każda niezależna kontrpróba (zazwyczaj pojedyncza kultura na płytce 24-dołkowej) zawierała ten sam wspólny warunek kontrolny. Umożliwi to normalizację danych między powtórzeniami, co koryguje zmienność między próbami.</li>
	<li>Inkubować komórki w pierwotnych warunkach wzrostu16 przez 48 godzin.</li>
	<li>W przypadku kolejnych terapii farmakologicznych powtórzyć kroki 3.1 i 3.2 z Deltorphin 1 μM, SNC80 1 μM lub nośnikiem i inkubować przez 60 minut12. Rozpuszczaj deltorfinę II w wodzie i rozpuszczaj SNC80 w 10 mM w 40 μM HCl i sonikat, rozcieńczony do 1 mM w wodzie. 
	Uwaga: Protokół ten zakłada, że lek (leki) został rozpuszczony w taki sposób, że można go rozpuścić w pożądanym stężeniu (stężeniach) w wybranej pożywce wzrostowej. Odpowiednie procedury takiej solubilizacji będą się różnić w zależności od danego leku i muszą być osobno zoptymalizowane.</li>
	<li>Umyj komórki delikatnie, trzykrotnie, ~ 1 ml buforu myjącego na pranie. Każde płukanie należy wykonywać, delikatnie zasysając płyn ze studzienki, a następnie niezwłocznie i delikatnie, ponownie napełniając studzienkę świeżym roztworem, zgodnie z życzeniem (w tym przypadku buforem do mycia).</li>
</ol>
4. Fiksacja i immunocytochemia
Uwaga:Konkretne cele etykietowania będą się różnić w zależności od eksperymentu. W naszym użyciu oznaczyliśmy receptory opioidowe delta (DOR) oraz Rab5, Rab 11 i LAMP1, jak to zostało omówione. Specyficzne użyte przeciwciała będą zależeć od konkretnego eksperymentu. Optymalne warunki znakowania zależą od zastosowanego przeciwciała (przeciwciał). Znacznie pełniejsze omówienie tego tematu znajduje się poniżej.
<ol>
	<li>Utrwalić komórki przez zanurzenie w ~ 300 μl 4% paraformaldehydu w 0,1 M roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem przez 10 minut w temperaturze 37 ºC. 
	Uwaga: Ważne jest, aby 4% paraformaldehyd był świeżo przygotowany ze względu na autofluorescencję spowodowaną użyciem wcześniej zamrożonego paraformaldehydu.</li>
	<li>Przemyć komórki delikatnie, 3 razy, ~ 1 ml buforu płuczącego na każde przemycie, jak opisano w ppkt 3.3.</li>
	<li>Inkubować komórki w buforze blokującym o objętości 300 μl przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami w 300 μl rozcieńczalnika przeciwciał przez 48 godzin w temperaturze 4 °C. W naszym zastosowaniu pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko DOR (królicze anty-DOR) i jedno z: Rab5 (mysi anty-Rab5), Rab 11 (mysi anty-Rab11) i LAMP1 (kozia anty-LAMP1).</li>
	<li>Przemyć komórki delikatnie, trzykrotnie, ~ 1 ml buforu płuczącego na każde przemycie, jak opisano w ppkt 3.3.</li>
	<li>Inkubować komórki z drugorzędowymi przeciwciałami sprzężonymi z różnymi fluoroforami (patrz dyskusja poniżej) w 300 μl rozcieńczalnika przeciwciał przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. W tym i wszystkich kolejnych krokach chroń komórki przed światłem. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, należy użyć emitującego zieleń anty-królika sprzężonego z fluoroforem i albo emitującego czerwień fluoroforu sprzężonego z anty-myszem, albo emitującego czerwień fluoroforu sprzężonego z fluoroforem</li>.
	<li>Przemyć komórki delikatnie, 3 razy, ~ 1 ml buforu płuczącego na każde przemycie, jak opisano w ppkt 3.3.</li>
	<li>Usunąć 12-okrągłe szkiełka nakrywkowe z płytek 24-dołkowych, pozostawiając ~ 1 ml buforu do płukania w każdym dołku, przytrzymując płytkę na wysokości ~ 45º, i podważyć szkiełko nakrywkowe z dna studzienki za pomocą drobnych kleszczy. Szkiełko nakrywkowe oprze się o ścianę studni, skąd można je łatwo usunąć za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe, stroną z komórką do dołu, na szkiełkach mikroskopowych z medium mocującym zapobiegającym blaknięciu.</li>
</ol>
5. Ustawienia mikroskopu
<ol>
	<li>Używając obiektywu o dużym powiększeniu (100X), najpierw zlokalizuj reprezentatywną komórkę, która ma być obrazowana za pomocą epifluorescencji.</li>
	<li>Skonfiguruj ustawienia przechwytywania obrazu, aby rejestrować 8-bitowe, nieskompresowane obrazy TIFF każdego oznaczonego kanału (do wykrywania każdego użytego fluoroforu, np. 488 nm i 594 nm), aby obrazować każdy kanał sekwencyjnie (według linii lub klatki) i aby uzyskać ostateczny obraz średnio od 4 do 6 skanów. Optymalna rozdzielczość obrazu będzie zależna od mikroskopu, ale 1024 x 1024 zazwyczaj daje dobre wyniki.</li>
	<li>Przełącz się na ścieżkę obrazowania konfokalnego i ustaw ostrość na płaszczyźnie z przechodzącej przez środek komórki.</li>
	<li>Zoptymalizuj otwór otworkowy (zwykle 1 jednostkę Airy), moc lasera i napięcie lampy fotopowielacza (wzmocnienie) oraz przesunięcie dla każdego kanału. Zapisz/zapisz te ustawienia. Użyj tych samych ustawień mikroskopu do obrazowania wszystkich komórek oznaczonych dla dowolnej pary docelowej w tej samej kontrpróbie. 
	Uwaga: Ten proces zwykle skutkuje wystarczającym fotowybielaniem, że ta komórka nie powinna być obrazowana do analizy.</li>
</ol>
6. Obrazowanie
<ol>
	<li>Używając obiektywu o dużym powiększeniu (np. 100X), najpierw zlokalizuj komórkę, która ma być obrazowana za pomocą epifluorescencji.</li>
	<li>Przełącz się na ścieżkę obrazowania konfokalnego i ustaw ostrość na płaszczyźnie z przechodzącej przez środek komórki. Jeśli to możliwe, użyj programowego powiększania/przycinania, aby ograniczyć obszar skanowania do interesującej Cię komórki.</li>
	<li>Przechwytuj obrazy dla każdego oznaczonego kanału, korzystając z wcześniej ustalonych ustawień. Powtórzyć kroki od 6.1 do 6.3 w celu zobrazowania 15 lub więcej komórek na warunek na powtórzoną próbę, aby zapewnić wystarczającą ilość próbki.</li>
</ol>
7. Analiza kolokalizacji
<ol>
	<li>Otwórz parę obrazów (np. "zielony" i "czerwony") komórki w ImageJ. Użyj polecenia Image > Color > Merge Channels..., aby wygenerować obraz RGB.</li>
	<li>Narysuj zaznaczenie wokół interesującej Cię komórki. Użyj wtyczki ImageJ "PSC Colocalization" (11; dostępnej w https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/), aby określić ilościowo kolokalizację celów w wybranej komórce.</li>
	<li>Zapisz żądaną miarę kolokalizacji (zazwyczaj r 17 Pearsona). Powtórz kroki od 7.1 do 7.3 dla każdej zobrazowanej komórki.</li>
</ol>
8. Normalizacja danych
<ol>
	<li>Oblicza się średnią zarejestrowanych wartości kolokalizacji wspólnych warunków kontrolnych dla każdej kontrpróby każdego warunku etykietowania. 
	Uwaga: Na przykład średnia wartości kolokalizacji neuronów w stanie leku "48-godzinny nośnik, 60-minutowy nośnik" w każdym z 3 niezależnych powtórzeń w każdym z 3 warunków znakowania (receptor i każdy z 3 przedziałów).</li>
	<li>Pomnóż średnie przez (-1), aby uzyskać przesunięcie dla każdej repliki w każdym warunku etykietowania. Dodaj przesunięcie dla każdej repliki w każdym warunku etykietowania do każdej wartości kolokalizacji w tej replikacji. 
	Uwaga: Spowoduje to normalizację danych w taki sposób, że średnia miara kolokalizacji dla wspólnego warunku kontrolnego wynosi 0 w każdej powtórzonej każdej warunku etykietowania.</li>
	<li>Zbierz dane ze wszystkich replik każdego warunku etykietowania. 
	Uwaga: Zmiany w kolokalizacji mogą być teraz analizowane w różnych powtórzeniach. Analiza statystyczna będzie zależała od projektu eksperymentu, ale zazwyczaj będzie obejmować analizę wariancji (ANOVA), po której następują odpowiednie testy post-hoc (np. Tukey). Zasoby statystyczne można znaleźć np. w punkcie 18.</li>
</ol>

<ol><li>Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Trafficking of G protein-coupled receptors.</a> Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).</li>
<li>Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+GPCRs+by+endocytic+membrane+trafficking+and+its+potential+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).</li>
<li>Hislop, J. N., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ubiquitination+in+endocytic+trafficking+of+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors.</a> Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).</li>
<li>Nagi, K., Piñeyro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+opioid+receptor+signalling%3A+implications+for+the+development+of+analgesic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Brain%22%5BJournal%5D)">Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance.</a> Mol. Brain. 4 (1), 25(2011).</li>
<li>Whistler, J. L., Enquist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+postendocytic+sorting+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors.</a> Science. 297 (5581), 615-620 (2002).</li>
<li>Von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+opioid+receptors+by+endocytic+membrane+traffic%3A+mechanisms+and+translational+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Alcohol+Depend%22%5BJournal%5D)">Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications.</a> Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).</li>
<li>Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteromerization+of+the+%C2%B5-+and+%CE%B4-opioid+receptors+produces+ligand-biased+antagonism+and+alters+%C2%B5-receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).</li>
<li>Wang, H. -B., Guan, J. -S., Bao, L., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+subcellular+distribution+of+delta-opioid+receptor+fused+with+various+tags+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem.+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells.</a> Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).</li>
<li>Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockin+mice+expressing+fluorescent+delta-opioid+receptors+uncover+G+protein-coupled+receptor+dynamics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).</li>
<li>He, S. -Q., Zhang, Z. -N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+%C2%B5-opioid+receptor+activity+by+preventing+%CE%B4-opioid+receptor-mediated+codegradation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation.</a> Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).</li>
<li>French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+fluorescent+markers+in+confocal+microscope+images+of+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).</li>
<li>Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+morphine+treatment+alters+%CE%B4+opioid+receptor+post-internalization+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking.</a> Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).</li>
<li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li>
<li>Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+targeting+of+mu-delta+opioid+receptor+heterodimers+by+RTP4%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).</li>
<li>Gupta, A., Mulder, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+abundance+of+opioid+receptor+heteromers+after+chronic+morphine+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration.</a> Sci. Signal. 3 (131), ra54(2010).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).</li>
<li>Bolte, S., Cordelières, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li>
<li>Field, A., Miles, J., Field, Z. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aField%2C+A+%22Discovering+Statistics+Using+R%22">Discovering Statistics Using R</a>. , SAGE Publications. Los Angeles, CA. (2012).</li>
<li>Mattioli, T. -A. M., Milne, B., Cahill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-low+dose+naltrexone+attenuates+chronic+morphine-induced+gliosis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pain%22%5BJournal%5D)">Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats.</a> Mol. Pain. 6, 22(2010).</li>
<li>Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+differences+among+various+proteins+as+blocking+agents+for+ELISA+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates.</a> J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Molecular+Probes+Handbook%22">The Molecular Probes Handbook</a>. Johnson, I., Spence, M. , Life Technologies. Carlsbad, CA. (2010).</li>
<li>Morris, T. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+immunocytochemical+staining+with+multiple+rabbit+polyclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies.</a> J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. , Springer. New York, NY. (2006).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%E2%80%99+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li>
<li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images%3A+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zoptymalizowaliśmy ten protokół do analizy pierwotnych kultur dorosłych neuronów zwojowych korzenia grzbietowego (pierwotnych neuronów czuciowych). Może być również stosowany, z niewielką modyfikacją lub bez modyfikacji, do szeroko pojętych komórek hodowlanych jednowarstwowych. Analiza kolokalizacyjna jest również możliwa w przypadku wycinków tkanek i innych tego typu preparatów11, jednak leczenie farmakologiczne i składniki utrwalania/przygotowania tkanek nie byłyby odpowiednie.
Co...

Receptory, zwłaszcza receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), są rutynowo transportowane wewnątrzkomórkowo, do i z powierzchni komórki1. Te złożone i ściśle kontrolowane procesy dyktują dostępne w komórkach uzupełnienia receptorów i regulują aktywność czasową receptora, odczulanie i uwrażliwienie 2-4. Co ważne, procesy te reagują na środowisko komórkowe, w tym na aktywność lub brak aktywności receptorów wywołanych przez leki. Oznacza to, że działanie ligandów na receptory może zmieniać wewnątrzkomórkowy transport tych receptorów, zmieniając w ten sposób odpowiedź komórki. W ten sposób zewnętrzne ligandy wywierają jeszcze większy wpływ na funkcjonowanie komórki, nawet poza klasycznymi kaskadami posłańca-efektora5,6.
Badanie takich zmian w indukowanym transporcie receptorów jest trudne. Wszystkie dostępne techniki wiążą się z ograniczeniami. Testy ochrony biotyny zostały wykorzystane do monitorowania populacji receptorów powierzchniowych. Receptory te są biotynylowane i przeprowadza się przebieg immunoprecypitacji w czasie w celu ilościowego określenia zmniejszenia biotynylowanych receptorów w czasie. Technika ta zasadniczo monitoruje stopniową degradację początkowej, znakowanej populacji receptorów7 i jest bardzo przydatna w konstruowaniu przebiegów czasowych tego procesu. Niestety, test ten nie jest w stanie monitorować żadnego procesu poza degradacją pierwotnej puli receptorów, takim jak internalizacja, recykling lub nowe receptory. Ponadto dodanie przeciwciała w zakresie 150 kDa do receptora w zakresie 50 kDa może zmienić transport receptora8,9, a technika ta może być trudna do zastosowania w przypadku receptorów o niskim poziomie ekspresji.
Inne procedury wykorzystują różne metody do identyfikacji wewnątrzkomórkowych przedziałów transportowych (np. endosomów, itp.) i oceny ich kolokalizacji z interesującymi receptorami. Obejmuje to wykorzystanie systemów heterologicznych eksprymujących chimeryczne konstrukty receptorów i markerów przedziałów znakowane białkiem fluorescencyjnym (np. GTPazy z rodziny Rab). Potencjalnie umożliwia to wykorzystanie obrazowania żywych komórek, usuwając problemy związane z fiksacją i przepuszczalnością. Chociaż taka strategia jest skuteczna, cierpi z powodu tych samych ograniczeń, co systemy heterologiczne w ogóle: wpływ znaczników i poziomu wyrażeń na zachowanie związane z handlem i niezgodność z bardziej fizjologicznie reprezentatywnymi typami komórek. Bardziej popularne barwniki są używane do łatwego oznaczania przedziałów wewnątrzkomórkowych (np. lizosomów, rzekomo)10. Barwniki mogą jednak być pozbawione specyficzności (wszystkie organelle kwasowe w przypadku barwników do lizosomów) i nie oceniają transportu przez inne przedziały. Mimo to techniki te pozwalają na znaczną kontrolę nad systemem i warunkami eksperymentalnymi i mogą korzystać z metod analizy kolokalizacji przedstawionych poniżej.
Metoda, którą tutaj prezentujemy, udoskonala śledzenie transportu receptorów poprzez kolokalizację. Wykorzystując immunocytochemię (ICC) do oznaczania odpowiednich markerów, możliwe jest zidentyfikowanie wielu odrębnych przedziałów wewnątrzkomórkowych. Pozwala to również na stosowanie fizjologicznie istotnych pierwotnych kultur komórkowych zamiast systemów heterologicznych. Ten protokół ICC polega na ustaleniu komórek będących przedmiotem zainteresowania przed znakowaniem; Pozwala to na etykietowanie w określonym punkcie czasowym po leczeniu farmakologicznym. W ten sposób powstaje "migawka" globalnych powiązań receptor-przedział w tym punkcie czasowym. Mając wiele punktów czasowych, można również skonstruować przebieg zmian w czasie trafikowania.
Krótko mówiąc, komórki są traktowane lekami, oznaczane dla interesującego nas receptora i wewnątrzkomórkowego przedziału, konfokalnie obrazowane, a mikrofotografie są analizowane w celu matematycznego ilościowego określenia kolokalizacji receptora i przedziału11. W naszym zastosowaniu zbadaliśmy kolokalizację receptora z Rab5, Rab11 i białkiem błonowym związanym z lizosomalnym białkiem błonowym 1 (LAMP1). Markery te identyfikują odpowiednio wczesne endosomy, endosomy recyklingowe i lizosomy. Te środki kolokalizacji działają jako wskaźniki zastępcze dla nadrzędnych procesów internalizacji, recyklingu i degradacji12.
Podobnie jak w przypadku wszystkich technik, należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia. Ze względu na konieczność zobrazowania każdego analizowanego neuronu, technika ta może stać się dość pracochłonna w zależności od liczby warunków i punktów czasowych. Wszystkie znakowanie immunologiczne musi również zmagać się z wpływem na ultrastrukturę komórkową, lokalizację białek i dostępność epitopów spowodowanym utrwaleniem i przepuszczalnością13.
Chociaż pierwotnie zoptymalizowana do użytku z pierwotnymi hodowlami pierwotnych neuronów czuciowych, ta metoda jest szeroko kompatybilna z innymi monowarstwowymi modelami hodowli.
Użycie matematycznie skwantyfikowanej miary kolokalizacji jest, w szczególności, znacznie bardziej rygorystyczne metodologicznie niż poprzednie techniki używane do oceny zmian w transporcie receptorów, które często opierały się na niejasnych, subiektywnych miarach, takich jak wizualnie sprawdzone nakładki wielokanałowe14.
Ta technika jest szczególnie przydatna ze względu na jej szeroką kompatybilność z interwencjami in vivo (przed generacją hodowli pierwotnej), interwencjami in vitro (podczas wzrostu hodowli) i różnymi celami znakowania15. W związku z tym może być dostosowany do wielu różnych pytań badawczych.

<table><tbody><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna z ryb zimnowodnych skóra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041-100G</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Płytki do hodowli komórkowych: 24-dołkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>720084</td><td></td></tr><tr><td>12-kołowa szklana osłona mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>1254580</td><td></td></tr><tr><td>Aqua/Poly-Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sód Fosforan dwuzasadowy</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S9763-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Polysciences</td><td>00380-1</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze - Standard/Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-DOR</td><td>MyBioSource</td><td>MBS316175</td><td>Używany w 1:1,500</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-Rab5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7904</td><td>Używany w 1:750</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-Rab11</td><td>Millipore</td><td>05-853</td><td>Używane w 1:500</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-LAMP1</td> Santa <td>Cruz</td><td>SC8098</td><td>Używane w 1:750</td></tr><tr><td>Osioł anty-królik Alexa 488 sprzężone przeciwciało</td><td>Life Technologies</td><td>A-21206</td><td>Używane w 1:200 do 1:2,000</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie Alexa 594 Sprzężone Life</td><td>Technologies</td><td>A-11005</td><td>Używane w 1:200 do 1:2,000</td></tr><tr><td>Osioł anty-koza Alexa 594 sprzężone przeciwciało</td><td>Life</td><td>Technologies A-11058</td><td>Używane w 1:200 do 1:2,000</td></tr></tbody></table>

Śledzenie zmian wywołanych przez leki w transporcie receptorów po internalizacji za pomocą analizy kolokalizacyjnej

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

Wewnątrzkomórkowy transport receptorów to zbiór złożonych i wysoce kontrolowanych procesów. Transport receptorów moduluje sygnalizację i ogólną odpowiedź komórki na ligandy i sam w sobie jest pod wpływem warunków wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych, w tym sygnalizacji indukowanej ligandem. Zoptymalizowany do stosowania z monowarstwowymi hodowanymi komórkami, ale z możliwością rozszerzenia na swobodnie unoszące się wycinki tkanki, protokół ten wykorzystuje znakowanie immunologiczne i analizę kolokalizacyjną do śledzenia zmian w wewnątrzkomórkowym transporcie receptorów zarówno po przewlekłych/przedłużonych, jak i ostrych interwencjach, w tym leczeniu lekami egzogennymi. Po leczeniu farmakologicznym komórki są podwójnie znakowane immunologicznie dla receptora i markerów dla interesujących przedziałów wewnątrzkomórkowych. Sekwencyjna mikroskopia konfokalna jest następnie wykorzystywana do przechwytywania dwukanałowych fotomikrofotografii pojedynczych komórek, które są poddawane komputerowej analizie kolokalizacyjnej w celu uzyskania ilościowych wyników kolokalizacji. Wyniki te są znormalizowane, aby umożliwić łączenie niezależnych powtórzeń przed analizą statystyczną. Reprezentatywne mikrofotografie mogą być również przetwarzane w celu wygenerowania ilustracyjnych rycin. W tym miejscu opisujemy potężną i elastyczną technikę ilościowej oceny indukowanego transportu receptorów.

Dzięki zastosowaniu tej techniki możliwe jest ilościowe określenie zmian w transporcie receptorów po ich internalizacji, następujących po przewlekłym/długotrwałym oraz ostrym podaniu leku. Po potraktowaniu lekiem, fiksacji i znakowaniu, wykonuje się dwukanałowe mikrofotografie o wysokiej rozdzielczości dla każdej analizowanej komórki. Reprezentatywne obrazy mogą zostać połączone z kolokalizacją w fałszywych kolorach w celu stworzenia ilustracyjnych rysunków (Rysunek 1). Następująca po tym analiza kolokal...

Ruch receptorów moduluje sygnalizację i reakcję komórki na ligandy i sam reaguje na warunki komórkowe, w tym sygnalizację indukowaną przez ligand. W tym miejscu opisujemy potężną i elastyczną technikę ilościowej oceny transportu receptorów indukowanego przez lek za pomocą znakowania immunologicznego i analizy kolokalizacyjnej.

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowa ocena kolokalizacji przestrzennej par docelowych, a w tym przypadku badanie indukowanego lekiem transportu receptorów. Osiąga się to poprzez traktowanie żywych hodowli komórkowych lekiem w celu wywołania zmian w transporcie receptorów. W drugim kroku podwójne znakowanie immunochemiczne receptorów docelowych i wewnątrzkomórkowych przedziałów transportowych pozwala na następującą lokalizację przestrzenną par docelowych przy użyciu wielokanałowej mikroskopii konfokalnej.Ilościowa analiza kolokalizacji jest wykorzystywana do pomiaru tendencji receptorów docelowych i przedziałów komórkowych do współwystępowania w tym samym miejscu. Wyniki wykazują zmiany w transporcie receptorów po zastosowaniu leku, w oparciu o kolokalizację receptorów i wewnątrzkomórkowych przedziałów transportowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak nakładanie obrazów (overlay colocalization), jest dostarczenie ilościowych miar kolokalizacji, co umożliwia przeprowadzanie znacznie bardziej zaawansowanych analiz i projektowanie złożonych eksperymentów.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat transportu receptorów, można ją również zastosować do badania zmian w przestrzennej kolokalizacji niemal dowolnych dwóch białek w hodowlach komórkowych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy usunąć pierwotne pożywka wzrostowe i zastąpić je pożywką zawierającą badany lek w wybranym stężeniu. Następnie komórki należy inkubować w pierwotnych warunkach hodowli przez wybrany czas ekspozycji.Po inkubacji komórki należy delikatnie przemyć trzy razy, używając za każdym razem 1 mL buforu do mycia. Następnie komórki należy utrwalić w 300 µL 4%paraformaldehydu w 0,1 M PBS przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Po tym czasie komórki należy ponownie przemyć trzy razy, używając za każdym razem 1 mL buforu do mycia.Następnie inkubować komórki w 300 µL buforu blokującego przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po tym czasie inkubować komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym w 300 µL rozcieńczalnika przeciwciał przez 48 godzin w temperaturze 4 °C. Następnie delikatnie przemyć komórki trzy razy, używając za każdym razem 1 mL buforu do mycia.Następnie inkubować komórki z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z Fluorem w 300 µL rozcieńczalnika przeciwciał przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc komórki przed światłem. Po godzinie delikatnie przemyć komórki buforem do mycia, stosując 1 mL buforu podczas każdego z trzech cykli płukania. Aby usunąć szkiełko nakrywkowe z płytki 24-dołkowej, należy przechylić płytkę pod kątem 45 stopni.Umieść końcówkę pęsety precyzyjnej przy górnej krawędzi szkiełka nakrywki w miejscu, w którym styka się ono z dnem dołka. Następnie delikatnie przechyl szkiełko nakrywki w buforze piorącym, odsuwając je od dna dołka. Szkiełko nakrywki oprze się o ściankę dołka, skąd można je łatwo usunąć za pomocą pęsety.Następnie przymocuj szkiełka nakrywkowe z komórkami skierowanymi w dół do szkiełek przedmiotowych, stosując medium montażowe zapobiegające blaknięciu (anti-fading), używając obiektywu o dużym powiększeniu 100x. Najpierw, za pomocą epi-fluorescencji, zlokalizuj reprezentatywną komórkę do obrazowania. Następnie skonfiguruj ustawienia przechwytywania obrazu; zapisuj nieskompresowane obrazy TIFF 8-bitowe dla każdego znakowanego kanału, aby obrazować każdy kanał sekwencyjnie i uśrednić od czterech do sześciu skanów dla obrazu końcowego.Następnie przełącz się na ścieżkę obrazowania konfokalnego i ustaw ostrość na płaszczyznę Z przechodzącą przez środek komórki. Zoptymalizuj otwór pinhole, moc lasera oraz napięcie i offset fotopowielacza dla każdego kanału. Zapisz te ustawienia i stosuj je podczas obrazowania wszystkich komórek znakowanych dla danej pary celów.W tej samej replikacie zlokalizuj kolejne komórki, które mają zostać zobrazowane przy użyciu obiektywu o dużym powiększeniu. Korzystając z fluorescencji epi, przełącz się na ścieżkę obrazowania konfokalnego i ustaw ostrość na płaszczyznę Z przechodzącą przez środek komórki, jeśli jest dostępna. Użyj funkcji przycinania zoomu w oprogramowaniu, aby ograniczyć obszar skanowania do wybranej komórki. Następnie.Wykonaj zdjęcia dla każdego oznakowanego kanału, korzystając z wcześniej ustalonych ustawień, a następnie powtórz procedury, aby zobrazować 15 lub więcej komórek na warunek w każdej powtórce, w celu zapewnienia wystarczającej liczby zebranych próbek. W tej procedurze otwórz parę obrazów komórki w programie ImageJ. Użyj polecenia merge channels, aby wygenerować obraz RGB.Następnie obrysuj interesującą komórkę. Użyj wtyczki SC colocalization w programie ImageJ, aby ilościowo określić kolokalizację celów w wybranej komórce. Zapisz pożądany parametr kolokalizacji i powtórz tę procedurę dla każdej komórki na obrazie.Następnie oblicz średnią z zapisanych wartości kolokalizacji dla wspólnych warunków kontrolnych każdego powtórzenia w każdym wariancie znakowania. Pomnóż otrzymane średnie przez minus jeden, aby wyznaczyć wartość przesunięcia (offset) dla każdego powtórzenia w każdym wariancie znakowania. Następnie dodaj wartość przesunięcia dla każdego powtórzenia w każdym wariancie znakowania do każdej wartości kolokalizacji w danym powtórzeniu.Pozwoli to na normalizację danych w taki sposób, aby średnia miara kolokalizacji dla wspólnej grupy kontrolnej wynosiła zero w każdym powtórzeniu każdego z warunków znakowania. Następnie wszystkie dane ze wszystkich powtórzeń każdego warunku znakowania umożliwią analizę zmian w kolokalizacji pomiędzy powtórzeniami. Przedstawione tutaj są kultury pierwotne neuronów sensorycznych zzęsłów korzeni grzbietowych, które zostały poddane przedłużonej i ostrej ekspozycji na leki. Następnie komórki poddano immunoznakowaniu w kierunku receptorów delta-opioidowych oraz markera endosomów recyklingujących z wykorzystaniem odrębnych par przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, a następnie obrazowano za pomocą dwukanałowej sekwencyjnej mikroskopii konfokalnej.Oprócz późniejszej ilościowej kolokalizacji i analizy, reprezentatywne obrazy zostały przetworzone w celu wygenerowania przedstawionych tutaj fałszywie kolorowych map kolokalizacji. Średnie wyniki kolokalizacji receptorów delta opioidowych z markerami wczesnych endosomów, endosomów recyklingujących i lizosomów w każdym z przedziałów są porównywane pomiędzy grupami otrzymującymi różne ostre dawki leków, co pozwala na zaobserwowanie indukowanych lekami zmian w transporcie receptorów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pozyskać wysokiej jakości, spójne mikrografie, które umożliwią poprawną analizę ilościową.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania ilościowej analizy kolokalizacji.

tracking-drug-induced-changes-receptor-post-internalization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Monitorowanie zmian wywołanych lekami w transporcie receptora po internalizacji przez analizę ko-lokalizacyjną

Regulowana endocytoza kontroluje poziomy ekspresji na powierzchni komórki dla większości białek błonowych. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy redukowalne, nieprzenikające przez błonę odczynniki do biotinylacji, aby zmierzyć tempo endocytozy transportera dopaminy (DAT), który jest politopeowym białkiem błonowym. Metoda ta umożliwia prostą procedurę pomiaru tempa endocytozy większości białek błony plazmatycznej.

Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Ruch błony neuronalnej dynamicznie kontroluje dostępność białek błony plazmatycznej i znacząco wpływa na neuroprzekaźnictwo. Do tej pory trudno było zmierzyć neuronalny transport endocytarny w dorosłych neuronach. W tym miejscu opisujemy wysoce skuteczną, ilościową metodę pomiaru szybkich zmian ekspresji białek powierzchniowych ex vivo w ostrych wycinkach mózgu.

Biotynylacja wycinków mózgu: podejście ex vivo do pomiaru specyficznego dla regionu transportu białek błony plazmatycznej w dorosłych neuronach

Tutaj demonstrujemy użycie fluorescencyjnego barwnika Alexa sprzężonego z α-bungarotoksyną do pomiaru lokalizacji powierzchni receptora GABA A i endocytozy w neuronach hipokampa. Dzięki zastosowaniu konstruktów z krótkim znacznikiem zewnątrzkomórkowym, który wiąże α-bungarotoksynę, można uzyskać analizę transportu endocytarnego białek błony komórkowej.

Używanie znacznika miejsca wiązania α-bungarotoksyny do badania lokalizacji i transportu błony receptora GABA A

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania komórek wyrażających receptory angiotensyny typu 1a znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zainicjowanej przez leczenie angiotensyną II. Technika ta obejmuje znakowanie lizosomów drugim markerem fluorescencyjnym, a następnie wykorzystanie oprogramowania do analizy kolokalizacji receptora i lizosomu w trzech wymiarach w czasie.

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Ten protokół opisuje wykrywanie za pomocą mikroskopii konfokalnej internalizacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) w komórkach ssaków. Obejmuje podstawową procedurę hodowli komórek, transfekcji i mikroskopii konfokalnej oraz zapewnia wydajną i łatwą do interpretacji metodę wykrywania subkomórkowej lokalizacji i internalizacji GPCR wyrażanego fuzją.

Wykrywanie internalizacji receptora sprzężonego z białkiem G aktywowanym ligandem za pomocą mikroskopii konfokalnej

Pobudliwość neuronów może być modulowana poprzez dynamiczny proces endo- i egzocytozy pobudzających jonotropowych receptorów glutaminianu. Opisany tutaj jest dostępny test o wysokiej zawartości do ilościowego określania puli populacji receptorów powierzchniowych i wewnętrznych.

Test o wysokiej zawartości do monitorowania transportu receptora AMPA

Ten artykuł przedstawia metodę badania transportu receptora glutaminianu (GluR) w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa. Wykorzystując podejście oparte na podawaniu przeciwciał do znakowania endogennych lub nadmiernie eksprymowanych receptorów w połączeniu z podejściami farmakologicznymi, metoda ta pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych regulujących ekspresję powierzchniową GluR poprzez modulację procesów internalizacji lub recyklingu.

Podejście do karmienia przeciwciałami w celu zbadania transportu receptora glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa

Interakcje GPCR-β-aresztin to nowa dziedzina w odkrywaniu leków GPCR. Dokładne, precyzyjne i łatwe do skonfigurowania metody są niezbędne do monitorowania takich interakcji w żywych systemach. Pokazujemy test komplementacji strukturalnej do monitorowania interakcji GPCR-β-arrestin w żywych komórkach w czasie rzeczywistym i można go rozszerzyć na dowolny GPCR.

Monitorowanie interakcji GPCR-β-arrestin1/2 w żywych systemach w czasie rzeczywistym w celu przyspieszenia odkrywania leków

Biorąc pod uwagę, że GPCR są atrakcyjnymi celami dla leków, badania przesiewowe ligandów GPCR są niezbędne do identyfikacji związków ołowiowych i badań nad desierotyzacją. W ramach tych wysiłków opisujemy PRESTO-Tango, platformę zasobów typu open source wykorzystywaną do jednoczesnego profilowania przejściowej rekrutacji β-arrestin2 przy około 300 GPCR przy użyciu testu reporterowego opartego na TEV.

Równoległe przesłuchanie rekrutacji β-Arrestin2 do badań przesiewowych ligandów w skali GPCR przy użyciu testu PRESTO-Tango

Poznaj metodę ilościowej analizy kolokalizacji receptorów po leczeniu komórek w hodowli. Technika wykorzystuje wielokanałową mikroskopię konfokalną do badania transportu receptorów w neurobiologii i farmakologii.

Śledzenie zmian wywołanych przez leki w transporcie receptorów po internalizacji za pomocą analizy kolokalizacyjnej

Przeglądaj więcej filmów