Name: Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Poznaj metodę przygotowania segmentowanych mikrotubul z fotodestrukcyjnymi końcówkami do badania ruchów białek i nanocząstek napędzanych depolimeryzacją. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę dynamiki mikrotubul w badaniach biologii komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować F. I. Ataullakhanovowi za pomoc w projektowaniu i produkcji komór przepływowych wielokrotnego użytku, N. Daszkiewiczowi, N. Gudimczukowi i A. Korbalewowi za dostarczenie zdjęć do rysunków, N. Gudimchukowi i P. Zacharowowi za opracowanie protokołu i dostarczenie odczynników do przygotowania nasion mikrotubul znakowanych digoksygeniną, A. Potapenko za pomoc w edycji tekstu oraz innym członkom laboratorium Griszczuk za wskazówki i dyskusje. Praca ta była częściowo wspierana przez grant NIH GM R01-098389 oraz grant pilotażowy z Pennsylvania Muscle Institute dla E.L.G., który jest stypendystą Kimmela, przez granty RFBR 12-04-00111-a, 13-04-40190-H i 13-04-40188-H, Prezydium Rosyjskiej Akademii Nauk (Mechanizmy Integracji Systemów Molekularnych oraz programy Molekularnej i Molekularnej Biologii Komórki) dla F. I. Ataullakhanova, NIH przyznał GM R01 GM033787 J.R. McIntoshowi oraz stypendium podoktorskie Fundacji Dmitrija Zimina dla V.A.V.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wiele testów jednocząsteczkowych obecnie rutynowo wykorzystuje specjalnie przygotowane szkiełka nakrywkowe, aby drastycznie zmniejszyć niespecyficzne przywieranie białek. Procedura, którą tutaj opisujemy, jest modyfikacją oryginalnego protokołu opracowanego w laboratorium Howarda32 i stwierdzamy, że silanizacja szkiełek nakrywkowych jest warta wysiłku, nawet w przypadku testów perełkowych opartych na DIC, które nie wykorzystują fluorescencji. Komory wyposażone w takie szkiełka nakrywkowe wykazują znacznie czys...

Mikrotubule są wysoce konserwatywnymi strukturami cytoszkieletu, które są ważne dla architektury komórkowej, ruchliwości komórek, podziału komórek i transportu wewnątrzkomórkowego1. Te dynamiczne polimery łączą się z tubuliny w obecności GTP i spontanicznie przełączają się między wzrostem a skracaniem2. Mikrotubule są bardzo cienkie (tylko 25 nm średnicy), dlatego do obserwacji mikrotubul za pomocą mikroskopu świetlnego należy stosować specjalne techniki optyczne w celu zwiększenia kontrastu. Wcześniejsze prace z tymi polimerami badały ich zachowanie dynamiczne przy użyciu różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC)3. To i podobne badania in vitro wykazały, że w typowych warunkach eksperymentalnych mikrotubule ulegają katastrofie i przechodzą na depolimeryzację tylko rzadko, raz na 5-15 minut (częstotliwość ta dotyczy stężenia rozpuszczalnej tubuliny 7-15 mM badanego w temperaturze 28-32 °C)4. W związku z tym zaproponowano różne techniki indukcji depolimeryzacji mikrotubul w kontrolowany sposób. Skracanie mikrotubul można wywołać przez wypłukanie rozpuszczalnej tubuliny5,6, przecięcie mikrotubul wiązką lasera7 lub użycie mikrotubul podzielonych na segmenty8, jak opisano tutaj. Wcześniejsze prace z wykorzystaniem segmentowanych mikrotubul, a także stochastycznie przełączających się polimerów, wykazały, że małe ładunki wewnątrzkomórkowe, takie jak chromosomy, pęcherzyki i kulki pokryte białkiem, mogą poruszać się na końcach skracających się mikrotubul9-13. Uważa się, że zjawisko to ma bezpośredni wpływ na ruchy chromosomów w komórkach mitotycznych, a mechanizmy leżące u jego podstaw są obecnie aktywnie badane14-16.
Ostatnio techniki oparte na fluorescencji, w tym mikroskopia całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF), zostały wykorzystane do badania ruchliwości z dynamicznymi końcami mikrotubul17-24. Zaletą tego podejścia jest to, że umożliwia badanie interakcji między mikrotubulami a białkami wiążącymi mikrotubule w czasie rzeczywistym przy użyciu białek znakowanych różnymi fluoroforami. Stwierdzono, że kilka kompleksów białkowych porusza się procesowo z wydłużającymi się i/lub skracającymi końcami mikrotubul. Należą do nich białka związane z mikrotubulami Dam110,12,18, Ska119 i XMAP21520, a także silniki kinezynowe Kif18A21,22, MCAK23 i CENP-E24. Białka te wykazują procesywne śledzenie końcówek, które zasadniczo różnią się od klasycznych białek śledzących końcówki, takich jak EB125. Chociaż cząsteczki EB1 i związani z nimi partnerzy wydają się być stabilnie związani z dynamicznymi końcami mikrotubul, poszczególne cząsteczki pozostają związane z końcówką mikrotubuli tylko przez ~ 0,8 sekundy, szybko wymieniając się z rozpuszczalną pulą26. W przeciwieństwie do tego, procesywne urządzenia śledzące końcówki, takie jak Dam1, poruszają się z końcami mikrotubul na wiele mikronów, a ich związek z końcówkami mikrotubul może trwać przez wiele sekund. Czas asocjacji końcówki, a także wynikająca z niego szybkość śledzenia, zależy w dużym stopniu od liczby cząsteczek tworzących kompleks śledzący końcówkę27. Większe zespoły białkowe są zwykle znacznie lepszymi tropicielami końcówek. Na przykład tak złożone zespoły, jak izolowane kinetochory drożdży, mogą pozostawać sprzężone z końcami mikrotubul przez28 godzin. Stwierdzono, że niektóre białka wiążące mikrotubule, np. kompleks białkowy kinetochorowy Ndc80, nie są w stanie śledzić końców mikrotubul na poziomie pojedynczej cząsteczki, jednak Ndc80 jest bardzo skuteczny w sprzęganiu ruchu ładunku kulkowego19,29-31. Dlatego, aby zrozumieć mechanizm śledzenia końcówek przez różne kompleksy białkowe, a także ich role biologiczne, ważne jest zbadanie śledzenia końcówek jako funkcji liczby cząsteczek w kompleksie śledzenia końcówek, a także określenie zdolności tych kompleksów do wykazywania zbiorowej ruchliwości na powierzchni ładunku perełek.
Poniżej przedstawiamy szczegółowe protokoły przygotowania i przeprowadzenia eksperymentów z segmentowanymi mikrotubulami (Rysunek 1A). Po pierwsze, dostępne na rynku szkiełka szklane są modyfikowane w celu mocowania krótkich rurek z polietylenu (Protokół 1). Komora przepływowa mikroskopii wielokrotnego użytku jest następnie składana z takiego szkiełka oraz chemicznie lub plazmowo oczyszczonego i silanizowanego szkiełka nakrywkowego (protokół 2)32-34. Uzyskana objętość komory wynosi tylko 20-25 μl (lub tak mała jak 15 μl, patrz uwaga 3 w protokole 1), wliczając w to objętość rurki doprowadzającej. Można również stosować dostępne na rynku komory przepływowe, ale ich objętość jest zwykle większa, co prowadzi do niepotrzebnego marnotrawstwa białek. W przypadku zastosowania większej komory, objętość wszystkich roztworów w poniższych protokołach powinna być skalowana proporcjonalnie. Nasiona mikrotubul są następnie przygotowywane, na przykład przy użyciu wolno hydrolizowalnego analogu GTP, GMPCPP (trifosforan guanozyno-5'-[(α,β)-metyleno]trifosforan) (protokół 3, patrz także Hyman i wsp.35). Nasiona są unieruchamiane na oczyszczonym szkiełku nakrywkowym, a następnie powierzchnia jest blokowana, aby zapobiec niespecyficznemu wchłanianiu innych białek32 (protokół 4 opisuje immobilizację nasion za pomocą digoksygeniny). Segmentowane mikrotubule można następnie przygotować za pomocą protokołu 5. Głównym uzasadnieniem tego podejścia jest to, że dynamiczne polimery mikrotubul, które tworzą się w obecności GTP, mogą być tymczasowo stabilizowane przez dodanie krótkich "czapeczek" stabilnych segmentów tubuliny, które zawierają GMPCPP. Kapturki te zawierają również tubulinę znakowaną rodaminą, dzięki czemu można je usunąć po prostu oświetlając pole widzenia laserem o długości fali 530-550 nm lub lampą łukową rtęciową (Protokół 6)36. Intensywność fluorescencji sygnału śledzenia końcówki może być następnie wykorzystana do oszacowania liczby cząsteczek, które przemieszczają się wraz z demontującymi się końcami mikrotubul, biorąc pod uwagę nierówności oświetlenia pola mikroskopowego (Protokół 7). Podobne podejście można zastosować do badania interakcji między mikrotubulami depolimeryzującymi a kulkami pokrytymi białkiem, przygotowanymi zgodnie z opisem w27 (Protokół 8). Niektóre białka łatwo wiążą się ze ściankami segmentowanych mikrotubul, ale pęseta laserowa może być również używana do przytrzymywania kulki w pobliżu ściany mikrotubul, ułatwiając w ten sposób jej wiązanie.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>Tabela 1. Mikroskopia i inny sprzęt.</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss Nikon</td><td>Axio Imager 2 Eclipse Ti</td><td>można stosować inne modele mikroskopów zdolne do obrazowania DIC i epifluorescencji</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Zeiss Nikon</td><td>420490-9900-000 CFI Apo 100x Olej 1.49</td><td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td></tr><tr><td>Grzejnik obiektywowy</td><td>Bioptechs</td><td>150803, 150819-19</td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtra fluorescencyjnego</td><td>Chroma</td><td>49004 lub 49008 41017 lub 49020</td><td>zoptymalizowana pod kątem fluorescencji rodaminy&nbsp; zoptymalizowany pod kątem fluorescencji GFP</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji</td><td>freeware MicroManager Molecular Devices</td><td>nie dotyczy MetaMorph 7.5</td><td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ inne oprogramowanie może być używane do pozyskiwania obrazów i śledzenia cząstek</td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td><td>Kamera EMCCD o wysokiej czułości</td></tr><tr><td>Laser pułapkujący</td><td>IPG Photonics</td><td>YLR-10-1064-LP</td><td>Laser 1,064 nm, 10 W</td></tr><tr><td>Lasery fluorescencyjne</td><td>wzbudzające Coherent, Inc. Coherent, Inc.</td><td>Szafir 488 LP Szafir 552 LP</td><td>wzbudzenie zielonych fluoroforów wzbudzenie czerwonych fluoroforów</td></tr><tr><td>Myjka plazmowa</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Komercyjne komory przepływowe</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-20 lub RC-30</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna</td><td>Cole Palmer Harvard Aparatura</td><td>Masterflex 77120-52 Pico Plus</td><td>Obie pompy zapewniają wymaganą szybkość przepływu cieczy, ale pompa perystaltyczna może pulsować z bardzo małą prędkością. Przepływ z pompą strzykawkową jest bardziej spójny dla szerokiego zakresu szybkości, ale ta pompa ma bezwładność.</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Tabela 2. Przygotowanie komory mikroskopowej.</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane szkiełka mikroskopowe do komór wielokrotnego użytku</td><td>Precyzyjne szkła w Kolorado</td><td>Niestandardowe zamówienie www.precisionglassblowing.com</td><td>Szczeliny soniczne w szkiełkach na podstawie schematów w <mocny>Rysunek 1</mocny></td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa</td><td>Intramedic</td><td>427410</td><td>ID 0,58 mm, OD 0,965 mm; Użyj tych rurek, aby połączyć zmontowaną komorę z pompą i pojemnikiem na odpady</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa</td><td>Intramedic</td><td>427400</td><td>ID 0,28 mm, OD 0,61 mm; Użyj tych rurek do wykonania komory wielokrotnego użytku</td></tr><tr><td>Zwykłe szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Można stosować inne podobne szkiełka</td></tr><tr><td>nakrywkowe VWR</td><td></td><td>48393-150, 48366-067</td><td>Można stosować inne podobne szkiełka nakrywkowe</td></tr><tr><td>Uszczelniacz silikonowy</td><td>World Precision Instruments</td><td>KIT, USZCZELNIACZ SILIKONOWY 5 MIN UTWARDZANIE</td><td></td></tr><tr><td>Klej epoksydowy</td><td>Loctite</td><td>83082</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Scotch 3M</td><td>AD114</td><td>Lub klej cyjanoakrylowy innych producentów</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 3. Czyszczenie i powlekanie szkiełek nakrywkowych.</td></tr><tr><td>Molecular Sitves, klasa 564</td><td>Macron</td><td>4490-04</td><td></td></tr><tr><td>Słoik do barwienia szkła nakrywkowego</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>21036</td><td></td></tr><tr><td>Ceramiczny uchwyt na szkiełko nakrywkowe</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542e40</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne Repel Silane</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Anti-digoksygenina AB</td><td>Roche Applied Science</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 4. Przygotowanie nasion i segmentowanych mikrotubul.</td></tr><tr><td>Tubulin</td><td>oczyszczona z mózgów krów Cytoskeleton, Inc</td><td> T238P</td><td>Aby zapoznać się z protokołami oczyszczania, patrz 49&ndash; 51 Nieznakowana tubulina</td></tr> wieprzowa <tr><td>Znakowana tubulina</td><td>Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen</td><td>TL590M C1171 (rodamina) A-2952 (digoksygenina)</td><td>Tubulina wieprzowa znakowana rodaminą Tubulina może być znakowana dowolnym barwnikiem reagującym z aminami, jak w referencji52.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-405</td><td>Aliquot i przechowywać w temperaturze -70 & deg; C</td></tr><tr><td>VALAP</td><td>Wazelina, lanolina i parafina w proporcji 1:1:2 masowo</td><td></td><td>patrz odniesienie9</td></tr></tbody></table>

przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Depolimeryzacja mikrotubul może dostarczyć siły do transportu różnych kompleksów białkowych i kulek pokrytych białkiem in vitro. Uważa się, że mechanizmy leżące u podstaw odgrywają istotną rolę w ruchach chromosomów zależnych od mikrotubul podczas podziału komórki, ale odpowiednie białka i ich dokładne role są słabo zdefiniowane. W związku z tym istnieje rosnąca potrzeba opracowania testów do badania takiej ruchliwości in vitro przy użyciu oczyszczonych składników i określonego środowiska biochemicznego. Mikrotubule są jednak z natury niestabilnymi polimerami; Ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Protokoły, które tutaj opisujemy, wykorzystują segmentowane mikrotubule, które są wykonane z fotoablakowalnych czapek stabilizujących. Depolimeryzacja takich segmentowanych mikrotubul może być wywołana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób badania ruchliwości na demontujących się końcach mikrotubul. Technika ta może być wykorzystana do przeprowadzenia analizy ilościowej liczby cząsteczek w znakowanych fluorescencyjnie kompleksach białkowych, które poruszają się procesowo wraz z dynamicznymi końcami mikrotubul. Aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu w tym i innych ilościowych testach fluorescencyjnych, szkiełka nakrywkowe powinny być poddawane obróbce w celu zmniejszenia niespecyficznej absorpcji rozpuszczalnych białek znakowanych fluorescencyjnie. Przedstawiono szczegółowe protokoły uwzględniające nierówności oświetlenia fluorescencyjnego i określające intensywność pojedynczego fluoroforu przy użyciu równoodległego dopasowania Gaussa. Na koniec opisujemy zastosowanie segmentowanych mikrotubul do badania zależnych od mikrotubul ruchów mikrokulek pokrytych białkiem, dostarczając wglądu w zdolność różnych białek motorycznych i niemotorycznych do łączenia depolimeryzacji mikrotubul z procesowym ruchem ładunku.

Śledzenie białek na depolimeryzujących końcach mikrotubul. Drożdżowy komponent kinetochory Dam1 jest zdecydowanie najlepszym białkiem śledzącym końce depolimeryzujących mikrotubul14. Ten 10-podjednostkowy kompleks znakowany GFP może być łatwo ekspresowany i oczyszczany z komórek bakteryjnych18,38, dlatego zalecamy jego stosowanie jako kontroli pozytywnej w teście śledzenia końców. Białko fluorescencyjne, które śledzi depolimeryzujący koniec mikrotubuli, jest widoczne jako jasny fluo...

Mikrotubule są z natury niestabilnymi polimerami, a ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące segmentowane mikrotubule z fotoablakowalnymi czapeczkami stabilizującymi. Depolimeryzacja segmentowanych mikrotubul może być wyzwalana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób analizę ruchów z demontującymi końcami mikrotubul.

Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie ruchów cząsteczek białka i kulek pokrytych białkiem z końcami mikrotubul depolimeryzujących. Osiąga się to poprzez zmontowanie komory przepływowej wielokrotnego użytku z czystym szkiełkiem nakrywkowym. Następnie przygotowywane są nasiona mikrotubul przymocowane do szkiełka nakrywkowego i wykorzystywane do nukleacji mikrotubul, które następnie są tymczasowo stabilizowane za pomocą fotozniszczalnych czapek.Następnie białka znakowane GFP lub kulki pokryte białkiem są wprowadzane do komory przepływowej i wiążą się z segmentowanymi mikrotubulami. Depolimeryzacja w mikrowannie jest następnie wyzwalana przez usunięcie nakrętek za pomocą fotoablacji. Obrazy są analizowane za pomocą CH w celu określenia, czy znakowane białka wykazują zachowanie śledzenia końcówki, czyli ruch wraz z końcami depolimeryzujących mikrotubul.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na wyzwalanie mikrotubul z wysoką rozdzielczością czasową i specjalną. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Protokół rozpoczyna się od przygotowania i montażu komory przepływowej z wykorzystaniem frezowania ultradźwiękowego.Zmodyfikuj zwykłe szkiełka mikroskop

preparation-segmented-microtubules-to-study-motions-driven

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie posegmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez rozpadające się końce mikrotubul

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Tutaj prezentujemy solidną i szczegółową metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywym krążkiem komórkowym i przetwarzania obrazów opartego na MATLAB.

Pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych

Mikrotubule, które są polimerami tubuliny, odgrywają kluczową rolę jako składnik cytoszkieletu w komórkach eukariotycznych i są znane ze swojej dynamicznej niestabilności. W badaniu tym opracowano metodę frakcjonowania mikrotubul w celu rozdzielenia ich na stabilne mikrotubule, labilne mikrotubule i wolną tubulinę w celu oceny stabilności mikrotubul w różnych tkankach myszy.

Ilościowa technika frakcjonowania mikrotubul w celu oddzielenia stabilnych mikrotubul, labilnych mikrotubul i wolnej tubuliny w tkankach myszy

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

To badanie szczegółowo opisuje oczyszczanie KIF1A(1-393LZ), członka rodziny kinezyny-3, przy użyciu systemu ekspresji Sf9-bakulowirusa. Analiza in vitro pojedynczych cząsteczek i wielu silników ślizgowych tych oczyszczonych silników wykazała silne właściwości ruchliwości porównywalne z silnikami z lizatu komórkowego ssaków. W ten sposób system Sf9-bakulowirusa jest podatny na ekspresję i oczyszczanie białka motorycznego będącego przedmiotem zainteresowania.

Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9

Ten artykuł przedstawia protokół tworzenia zespołów mikrotubul w kształcie taktoidów przy użyciu MAP65, roślinnego środka sieciującego mikrotubul, oraz PEG jako czynnika tłumiącego.

Samodzielny montaż taktoidów mikrotubul

Ten artykuł przedstawia protokoły do inżynierii i charakteryzowania przestrajalnych trójwymiarowych sieci kompozytowych współsplątanych filamentów aktynowych i mikrotubul. Kompozyty przechodzą aktywną restrukturyzację i ruch balistyczny, napędzany silnikami miozyny II i kinezyny, a także są dostrojone przez względne stężenia aktyny, mikrotubul, białek motorycznych i pasywnych środków sieciujących.

Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

Przedstawione tutaj są metody przygotowania aktywnych nematyków z mikrotubul i silników kinezynowych, w tym przygotowanie i budowa białek oraz wykorzystanie studni do aktywnego uwięzienia nematycznego.

Formowanie, ograniczanie i obserwacja aktywnych nematyk opartych na mikrotubulach

Tutaj opisujemy protokół ekstrakcji endogennej tubuliny z komórek ssaków, które mogą nie mieć lub zawierać specyficzne enzymy modyfikujące mikrotubule, w celu uzyskania mikrotubul wzbogaconych o określoną modyfikację. Następnie opisujemy, w jaki sposób wyekstrahowane mikrotubule można ozdobić oczyszczonymi białkami wiążącymi mikrotubule w celu przygotowania siatek do mikroskopii krioelektronowej.

Ekstrakcja zmodyfikowanych mikrotubul z komórek ssaków w celu badania kompleksów mikrotubula-białko za pomocą mikroskopii krioelektronowej

Poznaj metodę przygotowania segmentowanych mikrotubul z fotodestrukcyjnymi końcówkami do badania ruchów białek i nanocząstek napędzanych depolimeryzacją. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę dynamiki mikrotubul w badaniach biologii komórki.

Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

Przeglądaj więcej filmów