Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie ruchów cząsteczek białka i kulek pokrytych białkiem z końcami mikrotubul depolimeryzujących. Osiąga się to poprzez zmontowanie komory przepływowej wielokrotnego użytku z czystym szkiełkiem nakrywkowym. Następnie przygotowywane są nasiona mikrotubul przymocowane do szkiełka nakrywkowego i wykorzystywane do nukleacji mikrotubul, które następnie są tymczasowo stabilizowane za pomocą fotozniszczalnych czapek.

Następnie białka znakowane GFP lub kulki pokryte białkiem są wprowadzane do komory przepływowej i wiążą się z segmentowanymi mikrotubulami. Depolimeryzacja w mikrowannie jest następnie wyzwalana przez usunięcie nakrętek za pomocą fotoablacji. Obrazy są analizowane za pomocą CH w celu określenia, czy znakowane białka wykazują zachowanie śledzenia końcówki, czyli ruch wraz z końcami depolimeryzujących mikrotubul.

Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na wyzwalanie mikrotubul z wysoką rozdzielczością czasową i specjalną. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Protokół rozpoczyna się od przygotowania i montażu komory przepływowej z wykorzystaniem frezowania ultradźwiękowego.

Zmodyfikuj zwykłe szkiełka mikroskopowe tak, aby miały dwa rowki. Wykonaj rowki w odległości 14 milimetrów od siebie. Daj lub weź jeden milimetr, co jest optymalne dla komór zmontowanych przy użyciu kwadratowych szkiełek nakrywkowych o średnicy 22 milimetrów.

Następnie umieść rurkę polietylenową o długości 100 milimetrów w każdym rowku w suwaku, pozostawiając około pięciu milimetrowych zwisów na wewnętrznych końcach rowków. Zamocuj rurki wewnątrz rowków za pomocą kleju cyjanoakrylowego, całkowicie osadzając rurki w rowkach. Ostrożnie wypełnij rowki klejem epoksydowym, nie rozlewając.

Pozostaw do wyschnięcia na jeden dzień. Następnego dnia. Użyj ostrej żyletki, aby przeciąć zestalony klej, trzy do czterech milimetrów od dystalnego końca każdego miejsca mocowania.

Zdejmowanie części proksymalnie do środka prowadnicy. Rury powinny pozostać w swoich rowkach, a nacięcia powinny tworzyć płaskie powierzchnie z otworami na rury. Następnie napełnij strzykawkę wodą i sprawdź, czy rurki działają prawidłowo.

Jeśli ciecz płynie swobodnie, nałóż kroplę kleju epoksydowego o średnicy około pięciu milimetrów na zewnętrzne końce rowków i pozostaw do wyschnięcia na około jeden dzień. Gotowe studzienki przepływowe są dzięki temu trwałe i mogą być używane wielokrotnie przez wiele miesięcy. Ten trzygodzinny protokół przygotowuje 12 szkiełek nakrywkowych.

Wymaga dygestoria, jednego ceramicznego uchwytu na szkiełko nakrywkowe, trzech 15-mililitrowych słoików do barwienia i 1 250-mililitrowego szklanego słoika z pokrywką. Słoiki do barwienia muszą zmieścić cztery, regularne szkiełka nakrywkowe o średnicy 22 milimetrów w stosie. Zacznij od stosu 12 wstępnie oczyszczonych i wysuszonych szkiełek nakrywkowych w ceramicznym uchwycie.

Napełnij słoik plus jeden odpychający roztwór silenu i powoli opuść szkiełka. Zamknij słoik i inkubuj go przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Najważniejszym krokiem w celu zapewnienia jednolitej cywilizacji szkiełek nakrywkowych jest unikanie wszelkich śladów wody podczas inkubacji szkiełek nakrywkowych w roztworze Selene.

Ten krok jest niezbędny do szczelnego przymocowania nasion mikrorurek. Później w protokole, gdy szkiełka nakrywkowe są gotowe, wyjmij ceramiczny uchwyt ze słoika. Następnie przenieś szkiełka nakrywkowe pojedynczo za pomocą pęsety pokrytej teflonem z uchwytu ceramicznego do słoików do barwienia załadowanych metanolem.

Teraz załaduj trzy słoiki do zbiornika na wodę w wannie sonicznej, w której znajduje się metalowy lub szklany postument. Poziom wody powinien znajdować się na dwóch trzecich wysokości słoików, sonikuj słoiki z mocą 70 watów przez 20 minut. Podczas sonikacji należy zmieniać roztwór metanolu co pięć minut.

Po zakończeniu sonikacji spłucz, pokrywę wyczyść 10 razy wodą dejonizowaną. Jeśli siloizacja zadziałała prawidłowo, szkiełka nakrywkowe będą wyglądały na suche Po wyjęciu z wody, niezależnie od wyglądu, dokładnie usuń resztki wody. Poprzez transfer azotu gazowego, wysuszona pokrywa wsuwa się do suszonego azotu, zamykanego pojemnika.

Przekładka Kim wyciera się między szkiełkami nakrywkowymi. Można je przechowywać w ten sposób przez kilka tygodni w temperaturze pokojowej. Protokół ten wymaga od jednej do dwóch godzin, jednej komory przepływowej i przygotowanych stabilizowanych nasion mikrorurkowych G-M-P-C-P.

Najpierw zmontuj komorę przepływową. Przymocuj dwa kawałki taśmy dwustronnej wzdłuż środkowej powierzchni przygotowanego suwaka o szerokości pięciu milimetrów i mocno dociśnij szkiełko nakrywkowe do taśmy. Za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra napełnij komorę 100 mikrolitrami roztworu B rrb 80 przez rurkę.

Następnie wyciśnij małą kroplę dwukolorowego uszczelniacza do szybkiego odlewania na małą plastikową szalkę Petriego. Wymieszaj szybko i dokładnie wykałaczką. Zmieni kolor na zielony.

Uszczelniacz należy nałożyć natychmiast wzdłuż wszystkich krawędzi szkiełka nakrywkowego. Sprawdź, czy szczeliwo nie wnika zbyt głęboko pod szkiełko nakrywkowe. Jeśli rurka jest zablokowana, odłącz strzykawkę i podnieś rurkę, aby delikatnie docisnąć, aby zapobiec wyciekaniu szczeliwa Po 10 minutach upewnij się, że przepływ roztworu nie jest ograniczony.

Następnie przenieś komorę do ogrzanego stolika mikroskopowego w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Podłącz jedną z probówek do pompy w celu usunięcia roztworu. Zanurzyć wolny koniec rurki wlotowej w fiolce o średnicy 0,5 milimetra z ciepłym buforem BRB 80.

Ustaw pompę na 100 mikrolitrów na minutę i w razie potrzeby delikatnie wypchnij z niej pęcherzyki powietrza. Można to również zrobić ręcznie. Teraz użyj pompy, aby załadować 30 mikrolitrów ciepłych przeciwciał antygenowych.

Wyłącz pompę i odczekaj pięć minut. Wyłączaj pompę podczas wszystkich inkubacji. Następnie umyj komory około 100 mikrolitrami ciepłego b rrb 80.

Następnie przelej 50 mikrolitrów 1%onic F1 27 w BRB 80. Odczekaj 10 minut, aż zablokuje hydrofobową powierzchnię silosowego szkiełka nakrywkowego. Teraz umyj komory 100 mikrolitrami buforu ruchliwości.

Następnie zmniejsz prędkość pompy do 15 mikrolitrów na minutę i przetapiaj komorę za pomocą 30 do 40 mikrolitrów nasion mikrotubul rozcieńczonych od jednego do 200 do jednego do 600 w buforze ruchliwości. Inkubować nasiona przez 15 minut, a następnie umyć komorę 400 mikrolitrami buforu ruchliwości o stężeniu 100 mikrolitrów na minutę, aby usunąć niezwiązany materiał. Następnie zmniejsz prędkość pompy do 30 mikrolitrów na minutę i przelej komorę wstępnie ciepłym, nieoznakowanym roztworem tubuliny.

Najważniejszym aspektem tego protokołu jest unikanie pęcherzyków powietrza. Używać świeżo przygotowanych roztworów tubuliny i przestrzegać dokładnego czasu protokołu, zwłaszcza podczas zamykania mikrorurkami. Monitoruj wzrost mikrorurki za pomocą optyki DIC podczas pięcio- do siedmiominutowej inkubacji.

Mikrotubule zwykle rosną około 10 mikronów, szybko wymieniają roztwór na przedwojenną mieszankę tubuliny Rumine i pozostawiają od ośmiu do 10 minut więcej czasu inkubacji. Dobrze umyj komorę 100 mikrolitrami buforu ruchliwości o stężeniu 20 mikrolitrów na minutę w celu usunięcia turbulencji i nukleotydów, a także rozpuszczalnych fragmentów mikrokanalików. Następnie perfaktoruj komorę podgrzanym roztworem białka znakowanego GFP lub kulek pokrytych białkiem i kontynuuj obrazowanie składnika kinetycznego drożdży DAM, jeden znakowany GFP został oczyszczony z komórek bakteryjnych i wykorzystany jako kontrola pozytywna do testów śledzenia końcówek.

Takie białka podążają za depolimeryzującym końcem mikrokanalika i równomiernie przesuwają się w kierunku nasion przyczepionych do szkiełka nakrywkowego. Białka te pojawiają się jako ukośna linia na odpowiednim wykresie, który można następnie przeanalizować w celu określenia liczby cząsteczek białka w kompleksie śledzenia końcówki. Analiza ta jest szczegółowo opisana w protokole tekstowym.

W przeciwieństwie do tego, białka, które nie przechylają się na ścieżce, nie wykazują wzbogacenia sygnału fluorescencji na rozpadającym się mikrokońcu. Jest to widoczne w przypadku ludzkiego białka NDC 80 GFP. Wiązanie między kulkami pokrytymi białkiem a mikrotubulami jest zwykle dość silne, więc po dodaniu kulek do komory mikroskopowej łatwo wiązały się z segmentowanymi mikrotubulami przymocowanymi do szkiełka nakrywkowego.

Gdy śledzenie koralików jest procesowe, można dokonać wielu obserwacji. Koraliki, które przyczepiły się do jednej mikrotubuli, wykazywały ruch podobny do łuku, ponieważ mikrotubule obracają się lekko wokół miejsca ich wzrostu. Gdy nasadka stabilizująca jest podświetlona, jeśli widać tylko jeden czerwony segment dystalnie od nasion i koralików, wówczas koralik jest przymocowany do jednego mikrokanalika.

Nakrętkę często można zobaczyć podążającą za ruchem kulek jednakowo, dopóki nasadka nie zostanie wybielona Ruch kulki wkrótce po wybielaniu wydaje się zgodny z orientacją mikrotubul. Gdy mikrorurka skraca się, a koralik przesuwa się w kierunku nasiona, amplituda oscylacji podobnych do łuku maleje. Jeśli koraliki nie tworzą trwałych przyczepów do stabilnych mikrotubul.

Pułapkowanie laserowe może być stosowane koraliki z różnymi konstruktami białkowymi kinezyny skierowanej na koniec plus SE E wymagało tej techniki do wystrzelenia koralików na segmentowe ścianki mikrorurek w obecności TP. Koraliki te poruszały się szybko w kierunku zakrytych mikrorurkami plus końców na wykresie. Ruch ten skutkował ukośną linią skierowaną w stronę nasadki po jej zniszczeniu. Koraliki pokryte ściętym białkiem szpiegowskim oderwały się od mikrokanalika, jak wskazuje zielona strzałka.

W przeciwieństwie do tego, koraliki z białkiem B na całej długości mogą utrzymywać ruch w odwrotnym kierunku. Jest to postrzegane jako zygzakowaty wzór na wykresie chm spowodowany ruchem w kierunkach przeciwnych do dodatniego i/lub ujemnego końca mikrotubul. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować komory przepływowe i hodować segmentowane mikrotubule do badania ruchów napędzanych demontażem mikrojajowodów.