Name: Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Poznaj metodę przygotowania segmentowanych mikrotubul z fotodestrukcyjnymi końcówkami do badania ruchów białek i nanocząstek napędzanych depolimeryzacją. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę dynamiki mikrotubul w badaniach biologii komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować F. I. Ataullakhanovowi za pomoc w projektowaniu i produkcji komór przepływowych wielokrotnego użytku, N. Daszkiewiczowi, N. Gudimczukowi i A. Korbalewowi za dostarczenie zdjęć do rysunków, N. Gudimchukowi i P. Zacharowowi za opracowanie protokołu i dostarczenie odczynników do przygotowania nasion mikrotubul znakowanych digoksygeniną, A. Potapenko za pomoc w edycji tekstu oraz innym członkom laboratorium Griszczuk za wskazówki i dyskusje. Praca ta była częściowo wspierana przez grant NIH GM R01-098389 oraz grant pilotażowy z Pennsylvania Muscle Institute dla E.L.G., który jest stypendystą Kimmela, przez granty RFBR 12-04-00111-a, 13-04-40190-H i 13-04-40188-H, Prezydium Rosyjskiej Akademii Nauk (Mechanizmy Integracji Systemów Molekularnych oraz programy Molekularnej i Molekularnej Biologii Komórki) dla F. I. Ataullakhanova, NIH przyznał GM R01 GM033787 J.R. McIntoshowi oraz stypendium podoktorskie Fundacji Dmitrija Zimina dla V.A.V.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wiele testów jednocząsteczkowych obecnie rutynowo wykorzystuje specjalnie przygotowane szkiełka nakrywkowe, aby drastycznie zmniejszyć niespecyficzne przywieranie białek. Procedura, którą tutaj opisujemy, jest modyfikacją oryginalnego protokołu opracowanego w laboratorium Howarda32 i stwierdzamy, że silanizacja szkiełek nakrywkowych jest warta wysiłku, nawet w przypadku testów perełkowych opartych na DIC, które nie wykorzystują fluorescencji. Komory wyposażone w takie szkiełka nakrywkowe wykazują znacznie czys...

Mikrotubule są wysoce konserwatywnymi strukturami cytoszkieletu, które są ważne dla architektury komórkowej, ruchliwości komórek, podziału komórek i transportu wewnątrzkomórkowego1. Te dynamiczne polimery łączą się z tubuliny w obecności GTP i spontanicznie przełączają się między wzrostem a skracaniem2. Mikrotubule są bardzo cienkie (tylko 25 nm średnicy), dlatego do obserwacji mikrotubul za pomocą mikroskopu świetlnego należy stosować specjalne techniki optyczne w celu zwiększenia kontrastu. Wcześniejsze prace z tymi polimerami badały ich zachowanie dynamiczne przy użyciu różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC)3. To i podobne badania in vitro wykazały, że w typowych warunkach eksperymentalnych mikrotubule ulegają katastrofie i przechodzą na depolimeryzację tylko rzadko, raz na 5-15 minut (częstotliwość ta dotyczy stężenia rozpuszczalnej tubuliny 7-15 mM badanego w temperaturze 28-32 °C)4. W związku z tym zaproponowano różne techniki indukcji depolimeryzacji mikrotubul w kontrolowany sposób. Skracanie mikrotubul można wywołać przez wypłukanie rozpuszczalnej tubuliny5,6, przecięcie mikrotubul wiązką lasera7 lub użycie mikrotubul podzielonych na segmenty8, jak opisano tutaj. Wcześniejsze prace z wykorzystaniem segmentowanych mikrotubul, a także stochastycznie przełączających się polimerów, wykazały, że małe ładunki wewnątrzkomórkowe, takie jak chromosomy, pęcherzyki i kulki pokryte białkiem, mogą poruszać się na końcach skracających się mikrotubul9-13. Uważa się, że zjawisko to ma bezpośredni wpływ na ruchy chromosomów w komórkach mitotycznych, a mechanizmy leżące u jego podstaw są obecnie aktywnie badane14-16.
Ostatnio techniki oparte na fluorescencji, w tym mikroskopia całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF), zostały wykorzystane do badania ruchliwości z dynamicznymi końcami mikrotubul17-24. Zaletą tego podejścia jest to, że umożliwia badanie interakcji między mikrotubulami a białkami wiążącymi mikrotubule w czasie rzeczywistym przy użyciu białek znakowanych różnymi fluoroforami. Stwierdzono, że kilka kompleksów białkowych porusza się procesowo z wydłużającymi się i/lub skracającymi końcami mikrotubul. Należą do nich białka związane z mikrotubulami Dam110,12,18, Ska119 i XMAP21520, a także silniki kinezynowe Kif18A21,22, MCAK23 i CENP-E24. Białka te wykazują procesywne śledzenie końcówek, które zasadniczo różnią się od klasycznych białek śledzących końcówki, takich jak EB125. Chociaż cząsteczki EB1 i związani z nimi partnerzy wydają się być stabilnie związani z dynamicznymi końcami mikrotubul, poszczególne cząsteczki pozostają związane z końcówką mikrotubuli tylko przez ~ 0,8 sekundy, szybko wymieniając się z rozpuszczalną pulą26. W przeciwieństwie do tego, procesywne urządzenia śledzące końcówki, takie jak Dam1, poruszają się z końcami mikrotubul na wiele mikronów, a ich związek z końcówkami mikrotubul może trwać przez wiele sekund. Czas asocjacji końcówki, a także wynikająca z niego szybkość śledzenia, zależy w dużym stopniu od liczby cząsteczek tworzących kompleks śledzący końcówkę27. Większe zespoły białkowe są zwykle znacznie lepszymi tropicielami końcówek. Na przykład tak złożone zespoły, jak izolowane kinetochory drożdży, mogą pozostawać sprzężone z końcami mikrotubul przez28 godzin. Stwierdzono, że niektóre białka wiążące mikrotubule, np. kompleks białkowy kinetochorowy Ndc80, nie są w stanie śledzić końców mikrotubul na poziomie pojedynczej cząsteczki, jednak Ndc80 jest bardzo skuteczny w sprzęganiu ruchu ładunku kulkowego19,29-31. Dlatego, aby zrozumieć mechanizm śledzenia końcówek przez różne kompleksy białkowe, a także ich role biologiczne, ważne jest zbadanie śledzenia końcówek jako funkcji liczby cząsteczek w kompleksie śledzenia końcówek, a także określenie zdolności tych kompleksów do wykazywania zbiorowej ruchliwości na powierzchni ładunku perełek.
Poniżej przedstawiamy szczegółowe protokoły przygotowania i przeprowadzenia eksperymentów z segmentowanymi mikrotubulami (Rysunek 1A). Po pierwsze, dostępne na rynku szkiełka szklane są modyfikowane w celu mocowania krótkich rurek z polietylenu (Protokół 1). Komora przepływowa mikroskopii wielokrotnego użytku jest następnie składana z takiego szkiełka oraz chemicznie lub plazmowo oczyszczonego i silanizowanego szkiełka nakrywkowego (protokół 2)32-34. Uzyskana objętość komory wynosi tylko 20-25 μl (lub tak mała jak 15 μl, patrz uwaga 3 w protokole 1), wliczając w to objętość rurki doprowadzającej. Można również stosować dostępne na rynku komory przepływowe, ale ich objętość jest zwykle większa, co prowadzi do niepotrzebnego marnotrawstwa białek. W przypadku zastosowania większej komory, objętość wszystkich roztworów w poniższych protokołach powinna być skalowana proporcjonalnie. Nasiona mikrotubul są następnie przygotowywane, na przykład przy użyciu wolno hydrolizowalnego analogu GTP, GMPCPP (trifosforan guanozyno-5'-[(α,β)-metyleno]trifosforan) (protokół 3, patrz także Hyman i wsp.35). Nasiona są unieruchamiane na oczyszczonym szkiełku nakrywkowym, a następnie powierzchnia jest blokowana, aby zapobiec niespecyficznemu wchłanianiu innych białek32 (protokół 4 opisuje immobilizację nasion za pomocą digoksygeniny). Segmentowane mikrotubule można następnie przygotować za pomocą protokołu 5. Głównym uzasadnieniem tego podejścia jest to, że dynamiczne polimery mikrotubul, które tworzą się w obecności GTP, mogą być tymczasowo stabilizowane przez dodanie krótkich "czapeczek" stabilnych segmentów tubuliny, które zawierają GMPCPP. Kapturki te zawierają również tubulinę znakowaną rodaminą, dzięki czemu można je usunąć po prostu oświetlając pole widzenia laserem o długości fali 530-550 nm lub lampą łukową rtęciową (Protokół 6)36. Intensywność fluorescencji sygnału śledzenia końcówki może być następnie wykorzystana do oszacowania liczby cząsteczek, które przemieszczają się wraz z demontującymi się końcami mikrotubul, biorąc pod uwagę nierówności oświetlenia pola mikroskopowego (Protokół 7). Podobne podejście można zastosować do badania interakcji między mikrotubulami depolimeryzującymi a kulkami pokrytymi białkiem, przygotowanymi zgodnie z opisem w27 (Protokół 8). Niektóre białka łatwo wiążą się ze ściankami segmentowanych mikrotubul, ale pęseta laserowa może być również używana do przytrzymywania kulki w pobliżu ściany mikrotubul, ułatwiając w ten sposób jej wiązanie.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>Tabela 1. Mikroskopia i inny sprzęt.</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss Nikon</td><td>Axio Imager 2 Eclipse Ti</td><td>można stosować inne modele mikroskopów zdolne do obrazowania DIC i epifluorescencji</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Zeiss Nikon</td><td>420490-9900-000 CFI Apo 100x Olej 1.49</td><td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td></tr><tr><td>Grzejnik obiektywowy</td><td>Bioptechs</td><td>150803, 150819-19</td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtra fluorescencyjnego</td><td>Chroma</td><td>49004 lub 49008 41017 lub 49020</td><td>zoptymalizowana pod kątem fluorescencji rodaminy&nbsp; zoptymalizowany pod kątem fluorescencji GFP</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji</td><td>freeware MicroManager Molecular Devices</td><td>nie dotyczy MetaMorph 7.5</td><td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ inne oprogramowanie może być używane do pozyskiwania obrazów i śledzenia cząstek</td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td><td>Kamera EMCCD o wysokiej czułości</td></tr><tr><td>Laser pułapkujący</td><td>IPG Photonics</td><td>YLR-10-1064-LP</td><td>Laser 1,064 nm, 10 W</td></tr><tr><td>Lasery fluorescencyjne</td><td>wzbudzające Coherent, Inc. Coherent, Inc.</td><td>Szafir 488 LP Szafir 552 LP</td><td>wzbudzenie zielonych fluoroforów wzbudzenie czerwonych fluoroforów</td></tr><tr><td>Myjka plazmowa</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Komercyjne komory przepływowe</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-20 lub RC-30</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna</td><td>Cole Palmer Harvard Aparatura</td><td>Masterflex 77120-52 Pico Plus</td><td>Obie pompy zapewniają wymaganą szybkość przepływu cieczy, ale pompa perystaltyczna może pulsować z bardzo małą prędkością. Przepływ z pompą strzykawkową jest bardziej spójny dla szerokiego zakresu szybkości, ale ta pompa ma bezwładność.</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Tabela 2. Przygotowanie komory mikroskopowej.</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane szkiełka mikroskopowe do komór wielokrotnego użytku</td><td>Precyzyjne szkła w Kolorado</td><td>Niestandardowe zamówienie www.precisionglassblowing.com</td><td>Szczeliny soniczne w szkiełkach na podstawie schematów w <mocny>Rysunek 1</mocny></td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa</td><td>Intramedic</td><td>427410</td><td>ID 0,58 mm, OD 0,965 mm; Użyj tych rurek, aby połączyć zmontowaną komorę z pompą i pojemnikiem na odpady</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa</td><td>Intramedic</td><td>427400</td><td>ID 0,28 mm, OD 0,61 mm; Użyj tych rurek do wykonania komory wielokrotnego użytku</td></tr><tr><td>Zwykłe szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Można stosować inne podobne szkiełka</td></tr><tr><td>nakrywkowe VWR</td><td></td><td>48393-150, 48366-067</td><td>Można stosować inne podobne szkiełka nakrywkowe</td></tr><tr><td>Uszczelniacz silikonowy</td><td>World Precision Instruments</td><td>KIT, USZCZELNIACZ SILIKONOWY 5 MIN UTWARDZANIE</td><td></td></tr><tr><td>Klej epoksydowy</td><td>Loctite</td><td>83082</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Scotch 3M</td><td>AD114</td><td>Lub klej cyjanoakrylowy innych producentów</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 3. Czyszczenie i powlekanie szkiełek nakrywkowych.</td></tr><tr><td>Molecular Sitves, klasa 564</td><td>Macron</td><td>4490-04</td><td></td></tr><tr><td>Słoik do barwienia szkła nakrywkowego</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>21036</td><td></td></tr><tr><td>Ceramiczny uchwyt na szkiełko nakrywkowe</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542e40</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne Repel Silane</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Anti-digoksygenina AB</td><td>Roche Applied Science</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 4. Przygotowanie nasion i segmentowanych mikrotubul.</td></tr><tr><td>Tubulin</td><td>oczyszczona z mózgów krów Cytoskeleton, Inc</td><td> T238P</td><td>Aby zapoznać się z protokołami oczyszczania, patrz 49&ndash; 51 Nieznakowana tubulina</td></tr> wieprzowa <tr><td>Znakowana tubulina</td><td>Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen</td><td>TL590M C1171 (rodamina) A-2952 (digoksygenina)</td><td>Tubulina wieprzowa znakowana rodaminą Tubulina może być znakowana dowolnym barwnikiem reagującym z aminami, jak w referencji52.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-405</td><td>Aliquot i przechowywać w temperaturze -70 & deg; C</td></tr><tr><td>VALAP</td><td>Wazelina, lanolina i parafina w proporcji 1:1:2 masowo</td><td></td><td>patrz odniesienie9</td></tr></tbody></table>

przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Depolimeryzacja mikrotubul może dostarczyć siły do transportu różnych kompleksów białkowych i kulek pokrytych białkiem in vitro. Uważa się, że mechanizmy leżące u podstaw odgrywają istotną rolę w ruchach chromosomów zależnych od mikrotubul podczas podziału komórki, ale odpowiednie białka i ich dokładne role są słabo zdefiniowane. W związku z tym istnieje rosnąca potrzeba opracowania testów do badania takiej ruchliwości in vitro przy użyciu oczyszczonych składników i określonego środowiska biochemicznego. Mikrotubule są jednak z natury niestabilnymi polimerami; Ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Protokoły, które tutaj opisujemy, wykorzystują segmentowane mikrotubule, które są wykonane z fotoablakowalnych czapek stabilizujących. Depolimeryzacja takich segmentowanych mikrotubul może być wywołana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób badania ruchliwości na demontujących się końcach mikrotubul. Technika ta może być wykorzystana do przeprowadzenia analizy ilościowej liczby cząsteczek w znakowanych fluorescencyjnie kompleksach białkowych, które poruszają się procesowo wraz z dynamicznymi końcami mikrotubul. Aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu w tym i innych ilościowych testach fluorescencyjnych, szkiełka nakrywkowe powinny być poddawane obróbce w celu zmniejszenia niespecyficznej absorpcji rozpuszczalnych białek znakowanych fluorescencyjnie. Przedstawiono szczegółowe protokoły uwzględniające nierówności oświetlenia fluorescencyjnego i określające intensywność pojedynczego fluoroforu przy użyciu równoodległego dopasowania Gaussa. Na koniec opisujemy zastosowanie segmentowanych mikrotubul do badania zależnych od mikrotubul ruchów mikrokulek pokrytych białkiem, dostarczając wglądu w zdolność różnych białek motorycznych i niemotorycznych do łączenia depolimeryzacji mikrotubul z procesowym ruchem ładunku.

Śledzenie białek na depolimeryzujących końcach mikrotubul. Drożdżowy komponent kinetochory Dam1 jest zdecydowanie najlepszym białkiem śledzącym końce depolimeryzujących mikrotubul14. Ten 10-podjednostkowy kompleks znakowany GFP może być łatwo ekspresowany i oczyszczany z komórek bakteryjnych18,38, dlatego zalecamy jego stosowanie jako kontroli pozytywnej w teście śledzenia końców. Białko fluorescencyjne, które śledzi depolimeryzujący koniec mikrotubuli, jest widoczne jako jasny fluo...

Mikrotubule są z natury niestabilnymi polimerami, a ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące segmentowane mikrotubule z fotoablakowalnymi czapeczkami stabilizującymi. Depolimeryzacja segmentowanych mikrotubul może być wyzwalana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób analizę ruchów z demontującymi końcami mikrotubul.

Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie ruchów cząsteczek białka i kulek pokrytych białkiem z końcami mikrotubul depolimeryzujących. Osiąga się to poprzez zmontowanie komory przepływowej wielokrotnego użytku z czystym szkiełkiem nakrywkowym. Następnie przygotowywane są nasiona mikrotubul przymocowane do szkiełka nakrywkowego i wykorzystywane do nukleacji mikrotubul, które następnie są tymczasowo stabilizowane za pomocą fotozniszczalnych czapek.Następnie białka znakowane GFP lub kulki pokryte białkiem są wprowadzane do komory przepływowej i wiążą się z segmentowanymi mikrotubulami. Depolimeryzacja w mikrowannie jest następnie wyzwalana przez usunięcie nakrętek za pomocą fotoablacji. Obrazy są analizowane za pomocą CH w celu określenia, czy znakowane białka wykazują zachowanie śledzenia końcówki, czyli ruch wraz z końcami depolimeryzujących mikrotubul.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na wyzwalanie mikrotubul z wysoką rozdzielczością czasową i specjalną. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Protokół rozpoczyna się od przygotowania i montażu komory przepływowej z wykorzystaniem frezowania ultradźwiękowego.Zmodyfikuj zwykłe szkiełka mikroskopowe tak, aby miały dwa rowki. Wykonaj rowki w odległości 14 milimetrów od siebie. Daj lub weź jeden milimetr, co jest optymalne dla komór zmontowanych przy użyciu kwadratowych szkiełek nakrywkowych o średnicy 22 milimetrów.Następnie umieść rurkę polietylenową o długości 100 milimetrów w każdym rowku w suwaku, pozostawiając około pięciu milimetrowych zwisów na wewnętrznych końcach rowków. Zamocuj rurki wewnątrz rowków za pomocą kleju cyjanoakrylowego, całkowicie osadzając rurki w rowkach. Ostrożnie wypełnij rowki klejem epoksydowym, nie rozlewając.Pozostaw do wyschnięcia na jeden dzień. Następnego dnia. Użyj ostrej żyletki, aby przeciąć zestalony klej, trzy do czterech milimetrów od dystalnego końca każdego miejsca mocowania.Zdejmowanie części proksymalnie do środka prowadnicy. Rury powinny pozostać w swoich rowkach, a nacięcia powinny tworzyć płaskie powierzchnie z otworami na rury. Następnie napełnij strzykawkę wodą i sprawdź, czy rurki działają prawidłowo.Jeśli ciecz płynie swobodnie, nałóż kroplę kleju epoksydowego o średnicy około pięciu milimetrów na zewnętrzne końce rowków i pozostaw do wyschnięcia na około jeden dzień. Gotowe studzienki przepływowe są dzięki temu trwałe i mogą być używane wielokrotnie przez wiele miesięcy. Ten trzygodzinny protokół przygotowuje 12 szkiełek nakrywkowych.Wymaga dygestoria, jednego ceramicznego uchwytu na szkiełko nakrywkowe, trzech 15-mililitrowych słoików do barwienia i 1 250-mililitrowego szklanego słoika z pokrywką. Słoiki do barwienia muszą zmieścić cztery, regularne szkiełka nakrywkowe o średnicy 22 milimetrów w stosie. Zacznij od stosu 12 wstępnie oczyszczonych i wysuszonych szkiełek nakrywkowych w ceramicznym uchwycie.Napełnij słoik plus jeden odpychający roztwór silenu i powoli opuść szkiełka. Zamknij słoik i inkubuj go przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Najważniejszym krokiem w celu zapewnienia jednolitej cywilizacji szkiełek nakrywkowych jest unikanie wszelkich śladów wody podczas inkubacji szkiełek nakrywkowych w roztworze Selene.Ten krok jest niezbędny do szczelnego przymocowania nasion mikrorurek. Później w protokole, gdy szkiełka nakrywkowe są gotowe, wyjmij ceramiczny uchwyt ze słoika. Następnie przenieś szkiełka nakrywkowe pojedynczo za pomocą pęsety pokrytej teflonem z uchwytu ceramicznego do słoików do barwienia załadowanych metanolem.Teraz załaduj trzy słoiki do zbiornika na wodę w wannie sonicznej, w której znajduje się metalowy lub szklany postument. Poziom wody powinien znajdować się na dwóch trzecich wysokości słoików, sonikuj słoiki z mocą 70 watów przez 20 minut. Podczas sonikacji należy zmieniać roztwór metanolu co pięć minut.Po zakończeniu sonikacji spłucz, pokrywę wyczyść 10 razy wodą dejonizowaną. Jeśli siloizacja zadziałała prawidłowo, szkiełka nakrywkowe będą wyglądały na suche Po wyjęciu z wody, niezależnie od wyglądu, dokładnie usuń resztki wody. Poprzez transfer azotu gazowego, wysuszona pokrywa wsuwa się do suszonego azotu, zamykanego pojemnika.Przekładka Kim wyciera się między szkiełkami nakrywkowymi. Można je przechowywać w ten sposób przez kilka tygodni w temperaturze pokojowej. Protokół ten wymaga od jednej do dwóch godzin, jednej komory przepływowej i przygotowanych stabilizowanych nasion mikrorurkowych G-M-P-C-P.Najpierw zmontuj komorę przepływową. Przymocuj dwa kawałki taśmy dwustronnej wzdłuż środkowej powierzchni przygotowanego suwaka o szerokości pięciu milimetrów i mocno dociśnij szkiełko nakrywkowe do taśmy. Za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra napełnij komorę 100 mikrolitrami roztworu B rrb 80 przez rurkę.Następnie wyciśnij małą kroplę dwukolorowego uszczelniacza do szybkiego odlewania na małą plastikową szalkę Petriego. Wymieszaj szybko i dokładnie wykałaczką. Zmieni kolor na zielony.Uszczelniacz należy nałożyć natychmiast wzdłuż wszystkich krawędzi szkiełka nakrywkowego. Sprawdź, czy szczeliwo nie wnika zbyt głęboko pod szkiełko nakrywkowe. Jeśli rurka jest zablokowana, odłącz strzykawkę i podnieś rurkę, aby delikatnie docisnąć, aby zapobiec wyciekaniu szczeliwa Po 10 minutach upewnij się, że przepływ roztworu nie jest ograniczony.Następnie przenieś komorę do ogrzanego stolika mikroskopowego w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Podłącz jedną z probówek do pompy w celu usunięcia roztworu. Zanurzyć wolny koniec rurki wlotowej w fiolce o średnicy 0,5 milimetra z ciepłym buforem BRB 80.Ustaw pompę na 100 mikrolitrów na minutę i w razie potrzeby delikatnie wypchnij z niej pęcherzyki powietrza. Można to również zrobić ręcznie. Teraz użyj pompy, aby załadować 30 mikrolitrów ciepłych przeciwciał antygenowych.Wyłącz pompę i odczekaj pięć minut. Wyłączaj pompę podczas wszystkich inkubacji. Następnie umyj komory około 100 mikrolitrami ciepłego b rrb 80.Następnie przelej 50 mikrolitrów 1%onic F1 27 w BRB 80. Odczekaj 10 minut, aż zablokuje hydrofobową powierzchnię silosowego szkiełka nakrywkowego. Teraz umyj komory 100 mikrolitrami buforu ruchliwości.Następnie zmniejsz prędkość pompy do 15 mikrolitrów na minutę i przetapiaj komorę za pomocą 30 do 40 mikrolitrów nasion mikrotubul rozcieńczonych od jednego do 200 do jednego do 600 w buforze ruchliwości. Inkubować nasiona przez 15 minut, a następnie umyć komorę 400 mikrolitrami buforu ruchliwości o stężeniu 100 mikrolitrów na minutę, aby usunąć niezwiązany materiał. Następnie zmniejsz prędkość pompy do 30 mikrolitrów na minutę i przelej komorę wstępnie ciepłym, nieoznakowanym roztworem tubuliny.Najważniejszym aspektem tego protokołu jest unikanie pęcherzyków powietrza. Używać świeżo przygotowanych roztworów tubuliny i przestrzegać dokładnego czasu protokołu, zwłaszcza podczas zamykania mikrorurkami. Monitoruj wzrost mikrorurki za pomocą optyki DIC podczas pięcio- do siedmiominutowej inkubacji.Mikrotubule zwykle rosną około 10 mikronów, szybko wymieniają roztwór na przedwojenną mieszankę tubuliny Rumine i pozostawiają od ośmiu do 10 minut więcej czasu inkubacji. Dobrze umyj komorę 100 mikrolitrami buforu ruchliwości o stężeniu 20 mikrolitrów na minutę w celu usunięcia turbulencji i nukleotydów, a także rozpuszczalnych fragmentów mikrokanalików. Następnie perfaktoruj komorę podgrzanym roztworem białka znakowanego GFP lub kulek pokrytych białkiem i kontynuuj obrazowanie składnika kinetycznego drożdży DAM, jeden znakowany GFP został oczyszczony z komórek bakteryjnych i wykorzystany jako kontrola pozytywna do testów śledzenia końcówek.Takie białka podążają za depolimeryzującym końcem mikrokanalika i równomiernie przesuwają się w kierunku nasion przyczepionych do szkiełka nakrywkowego. Białka te pojawiają się jako ukośna linia na odpowiednim wykresie, który można następnie przeanalizować w celu określenia liczby cząsteczek białka w kompleksie śledzenia końcówki. Analiza ta jest szczegółowo opisana w protokole tekstowym.W przeciwieństwie do tego, białka, które nie przechylają się na ścieżce, nie wykazują wzbogacenia sygnału fluorescencji na rozpadającym się mikrokońcu. Jest to widoczne w przypadku ludzkiego białka NDC 80 GFP. Wiązanie między kulkami pokrytymi białkiem a mikrotubulami jest zwykle dość silne, więc po dodaniu kulek do komory mikroskopowej łatwo wiązały się z segmentowanymi mikrotubulami przymocowanymi do szkiełka nakrywkowego.Gdy śledzenie koralików jest procesowe, można dokonać wielu obserwacji. Koraliki, które przyczepiły się do jednej mikrotubuli, wykazywały ruch podobny do łuku, ponieważ mikrotubule obracają się lekko wokół miejsca ich wzrostu. Gdy nasadka stabilizująca jest podświetlona, jeśli widać tylko jeden czerwony segment dystalnie od nasion i koralików, wówczas koralik jest przymocowany do jednego mikrokanalika.Nakrętkę często można zobaczyć podążającą za ruchem kulek jednakowo, dopóki nasadka nie zostanie wybielona Ruch kulki wkrótce po wybielaniu wydaje się zgodny z orientacją mikrotubul. Gdy mikrorurka skraca się, a koralik przesuwa się w kierunku nasiona, amplituda oscylacji podobnych do łuku maleje. Jeśli koraliki nie tworzą trwałych przyczepów do stabilnych mikrotubul.Pułapkowanie laserowe może być stosowane koraliki z różnymi konstruktami białkowymi kinezyny skierowanej na koniec plus SE E wymagało tej techniki do wystrzelenia koralików na segmentowe ścianki mikrorurek w obecności TP. Koraliki te poruszały się szybko w kierunku zakrytych mikrorurkami plus końców na wykresie. Ruch ten skutkował ukośną linią skierowaną w stronę nasadki po jej zniszczeniu. Koraliki pokryte ściętym białkiem szpiegowskim oderwały się od mikrokanalika, jak wskazuje zielona strzałka.W przeciwieństwie do tego, koraliki z białkiem B na całej długości mogą utrzymywać ruch w odwrotnym kierunku. Jest to postrzegane jako zygzakowaty wzór na wykresie chm spowodowany ruchem w kierunkach przeciwnych do dodatniego i/lub ujemnego końca mikrotubul. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować komory przepływowe i hodować segmentowane mikrotubule do badania ruchów napędzanych demontażem mikrojajowodów.

preparation-segmented-microtubules-to-study-motions-driven

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie posegmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez rozpadające się końce mikrotubul

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Tutaj prezentujemy solidną i szczegółową metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywym krążkiem komórkowym i przetwarzania obrazów opartego na MATLAB.

Pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych

Mikrotubule, które są polimerami tubuliny, odgrywają kluczową rolę jako składnik cytoszkieletu w komórkach eukariotycznych i są znane ze swojej dynamicznej niestabilności. W badaniu tym opracowano metodę frakcjonowania mikrotubul w celu rozdzielenia ich na stabilne mikrotubule, labilne mikrotubule i wolną tubulinę w celu oceny stabilności mikrotubul w różnych tkankach myszy.

Ilościowa technika frakcjonowania mikrotubul w celu oddzielenia stabilnych mikrotubul, labilnych mikrotubul i wolnej tubuliny w tkankach myszy

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

To badanie szczegółowo opisuje oczyszczanie KIF1A(1-393LZ), członka rodziny kinezyny-3, przy użyciu systemu ekspresji Sf9-bakulowirusa. Analiza in vitro pojedynczych cząsteczek i wielu silników ślizgowych tych oczyszczonych silników wykazała silne właściwości ruchliwości porównywalne z silnikami z lizatu komórkowego ssaków. W ten sposób system Sf9-bakulowirusa jest podatny na ekspresję i oczyszczanie białka motorycznego będącego przedmiotem zainteresowania.

Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9

Ten artykuł przedstawia protokół tworzenia zespołów mikrotubul w kształcie taktoidów przy użyciu MAP65, roślinnego środka sieciującego mikrotubul, oraz PEG jako czynnika tłumiącego.

Samodzielny montaż taktoidów mikrotubul

Ten artykuł przedstawia protokoły do inżynierii i charakteryzowania przestrajalnych trójwymiarowych sieci kompozytowych współsplątanych filamentów aktynowych i mikrotubul. Kompozyty przechodzą aktywną restrukturyzację i ruch balistyczny, napędzany silnikami miozyny II i kinezyny, a także są dostrojone przez względne stężenia aktyny, mikrotubul, białek motorycznych i pasywnych środków sieciujących.

Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

Przedstawione tutaj są metody przygotowania aktywnych nematyków z mikrotubul i silników kinezynowych, w tym przygotowanie i budowa białek oraz wykorzystanie studni do aktywnego uwięzienia nematycznego.

Formowanie, ograniczanie i obserwacja aktywnych nematyk opartych na mikrotubulach

Tutaj opisujemy protokół ekstrakcji endogennej tubuliny z komórek ssaków, które mogą nie mieć lub zawierać specyficzne enzymy modyfikujące mikrotubule, w celu uzyskania mikrotubul wzbogaconych o określoną modyfikację. Następnie opisujemy, w jaki sposób wyekstrahowane mikrotubule można ozdobić oczyszczonymi białkami wiążącymi mikrotubule w celu przygotowania siatek do mikroskopii krioelektronowej.

Ekstrakcja zmodyfikowanych mikrotubul z komórek ssaków w celu badania kompleksów mikrotubula-białko za pomocą mikroskopii krioelektronowej

Poznaj metodę przygotowania segmentowanych mikrotubul z fotodestrukcyjnymi końcówkami do badania ruchów białek i nanocząstek napędzanych depolimeryzacją. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę dynamiki mikrotubul w badaniach biologii komórki.

Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

Przeglądaj więcej filmów