Name: Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania aktywnych silników molekularnych z rodziny kinezyn-3 przy użyciu systemu ekspresji Sf9-baculowirusowej. Protokół obejmuje analizę motoryki pojedynczych cząsteczek i testy poślizgowe wielu silników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

V.S. i P.S. dziękują prof. Kristen J. Verhey (University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA) i prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, India) za ich bezwarunkowe wsparcie podczas całego badania. P.S. dziękuje dr Sivapriya Kirubakaran za wsparcie przez cały czas trwania projektu. V.S. dziękuje za finansowanie poprzez DBT (nr grantu: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 i BT/RLF/Re-entry/45/2015) oraz DST-SERB (nr grantu: Zb.Orz. (2016/000913). P.K.N dziękuje ICMR za dofinansowanie (Grant nr 5/13/13/2019/NCD-III). P.S. potwierdza dofinansowanie z DST (nr grantu: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S dziękuje za stypendium z IIT Gandhinagar.

<ol><li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+motor+toolbox+for+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular motor toolbox for intracellular transport.</a> Cell. 112, 467-480 (2003).</li>
<li>Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+kinesin+superfamily%3A+insights+into+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function.</a> Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).</li>
<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+in+neurons%3A+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function%2C+development%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).</li>
<li>Hirokawa, N., Takemura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+and+mechanisms+of+directional+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).</li>
<li>Patel, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF13A+motors+are+regulated+by+Rab22A+to+function+as+weak+dimers+inside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Advances%22%5BJournal%5D)">KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell.</a> Scientific Advances. 7 (6), (2021).</li>
<li>Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-based+transport+-+basic+mechanisms%2C+traffic+rules+and+role+in+neurological+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis.</a> Journal of Cellular Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).</li>
<li>Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+and+neurodegenerative+disease%3A+vesicle-motor+complex+formation+and+their+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Degernative+Neurological+and+Neuromuscular+Disease%22%5BJournal%5D)">Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation.</a> Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).</li>
<li>Rath, O., Kozielski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesins+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Kinesins and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).</li>
<li>Wang, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF14+promotes+cell+proliferation+via+activation+of+Akt+and+is+directly+targeted+by+miR-200c+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer.</a> International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).</li>
<li>Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Run+length+distribution+of+dimerized+kinesin-3+molecular+motors%3A+comparison+with+dimeric+kinesin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1.</a> Scientific Reports. 9 (1), 16973(2019).</li>
<li>Scarabelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+processivity+determinants+of+the+Kinesin-3+motor+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain.</a> Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).</li>
<li>Soppina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization+of+mammalian+kinesin-3+motors+results+in+superprocessive+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).</li>
<li>Soppina, V., Verhey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+family-specific+K-loop+influences+the+microtubule+on-rate+but+not+the+superprocessivity+of+kinesin-3+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Cell%22%5BJournal%5D)">The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors.</a> Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).</li>
<li>Soppina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-3+motors+are+fine-tuned+at+the+molecular+level+to+endow+distinct+mechanical+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs.</a> BMC Biology. , (2022).</li>
<li>Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+Expressed+in+insect+cells+improves+microtubule+in+vitro+gliding+performance%2C+long-term+stability+and+guiding+efficiency+in+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Nanobioscience%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures.</a> IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).</li>
<li>Schmidt, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+expression+systems+in+the+pharmaceutical+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).</li>
<li>Kurland, C., Gallant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Errors+of+heterologous+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Errors of heterologous protein expression.</a> Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).</li>
<li>Tao, L., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+assay+of+mitotic+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and assay of mitotic motors.</a> Methods. 51 (2), 233-241 (2010).</li>
<li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).</li>
<li>Felberbaum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+baculovirus+expression+vector+system%3A+A+commercial+manufacturing+platform+for+viral+vaccines+and+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors.</a> Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).</li>
<li>Kumar, N., Pandey, D., Halder, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+N+%22Trends+in+Insect+Molecular+Biology+and+Biotechnology%22">Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology</a>. Kumar, D., Gong, C. , Springer International Publishing. 163-191 (2018).</li>
<li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+fluorescent+probes+for+bioimaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Japan+Academy.+Series+B.+Physical+and+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of fluorescent probes for bioimaging applications.</a> Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).</li>
<li>Hassan, M., Klaunberg, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+fluorescence+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo.</a> Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).</li>
<li>Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy for biological imaging.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell fluorescence imaging.</a> Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).</li>
<li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li>
<li>Wojtovich, A. P., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+ROS+production%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of ROS production.</a> Redox Biology. 2, 368-376 (2014).</li>
<li>Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+single+Kinesin+molecules+in+the+cytoplasm+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells.</a> Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).</li>
<li>Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+temperature+on+kinesin-driven+microtubule+gliding+and+kinesin+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity.</a> FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).</li>
<li>Porter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+microtubule+movement+produced+by+sea+urchin+egg+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).</li>
<li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies%3A+natural+single-domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).</li>
<li>Verma, S., Kumar, N., Verma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+paclitaxel+on+critical+nucleation+concentration+of+tubulin+and+its+effects+thereof%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).</li>
<li>Parness, J., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxol+binds+to+polymerized+tubulin+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Taxol binds to polymerized tubulin in vitro.</a> Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).</li>
<li>Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+microtubule+assembly+in+vitro+by+taxol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol.</a> Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).</li>
<li>Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+human+%28pro%29renin+receptor+in+insect+cells+using+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system.</a> Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).</li>
<li>Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+baculovirus+expression+system+for+generation+of+virus-like+particles%3A+successes+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges.</a> Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).</li>
<li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+tag+protein+fusions%3A+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).</li>
<li>Huang, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+paclitaxel+induces+fewer+hematopoietic+and+cardiovascular+complications+than+bioequivalent+doses+of+Taxol%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol.</a> International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować.

System ekspresji bakulowirusa Sf9 jest jedną z najbardziej wszechstronnych i skutecznych metod wysokoprzepustowej produkcji białek 19,36,37. Zdolność komórek Sf9 do modyfikacji potranslacyjnej jest wysoce porównywalna z systemem ssaków15. Istotną wadą korzystania z tego systemu jest to, że jest on powolny i wrażliwy na zanieczyszczenia. Jednym z najbardziej krytycznych etapów jest skuteczna infekcja i uda...

Ogromnie zatłoczone środowisko komórkowe stwarza wiele wyzwań w sortowaniu przeznaczonych do tego białek i molekuł. To intensywne obciążenie związane z organizacją i czasoprzestrzenną dystrybucją cząsteczek w cytoplazmie jest ułatwione przez silniki molekularne i ścieżki cytoszkieletowe. Silniki molekularne to enzymy, które hydrolizują waluty energii, takie jak ATP, i wykorzystują tę energię podczas ruchu i generowania siły1. W oparciu o podobieństwo sekwencji aminokwasów, kinezyny są pogrupowane w 14 rodzin i pomimo tego podobieństwa, każdy silnik w unikalny sposób przyczynia się do funkcjonowania komórki. Silniki z rodziny Kinesin-3 stanowią jedną z największych, obejmującą pięć podrodzin (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 i KIF28)2, związanych z różnymi funkcjami komórkowymi i fizjologicznymi, w tym transportem pęcherzyków, sygnalizacją, mitozą, migracją jądrową i rozwojem 3,4,5. Upośledzenie funkcji transportu kinezyny-3 wiąże się z wieloma zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, wadami rozwojowymi i chorobami nowotworowymi6,7,8,9.
Ostatnie prace wykazały, że silniki kinesin-3 są monomerami, ale ulegają dimeryzacji wywołanej przez ładunek i powodują szybką i superprocesową ruchliwość w porównaniu do konwencjonalnych kinesin10,11,12,13. Ich charakterystyka biochemiczna i biofizyczna wymaga dużej ilości oczyszczonych, aktywnych białek. Jednak ich produkcja w prokariotycznym systemie ekspresji skutkowała nieaktywnymi lub zagregowanymi silnikami, prawdopodobnie z powodu niezgodnej syntezy, fałdowania i modyfikacji białek14,15,16,17,18. Aby obejść takie ograniczenia i zwiększyć wydajność, opracowaliśmy solidny system ekspresji bakulowirusa Sf9 do ekspresji i oczyszczania tych silników.
System ekspresji bakulowirusa wykorzystuje linie komórkowe owadów Sf9 jako system gospodarza do wysokoprzepustowej ekspresji białek rekombinowanych eukariotycznych19,20. Bakulowirus posiada silny promotor polihedryny, który pomaga w heterologicznej ekspresji genów i produkcji rozpuszczalnych białek rekombinowanych17. Ze względu na swoją opłacalność, bezpieczeństwo obsługi i wysoką ekspresję aktywnego białka, stał się potężnym narzędziem21. Aby wyrazić interesujące nas białko, kluczowym krokiem jest wygenerowanie rekombinowanego bakmidu. Ponieważ dostępne na rynku zestawy generujące bakcydy są drogie i będziemy pracować z większą liczbą próbek, opracowaliśmy wewnętrzny protokół zarówno dla dużych, jak i małych wkładek silników kinezyny-3 do bakmidów. Oczyszczone z Sf9 silniki kinezyny-3 wykorzystano do scharakteryzowania in vitro właściwości ślizgowych pojedynczych cząsteczek i wielosilnikowych mikrotubul przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). Silniki są oznaczone C-końcowymi cząsteczkami fluorescencyjnymi (3xmCit), aby zapewnić lepszy sygnał i zmniejszone fotowybielanie. Ze względu na zwiększony stosunek sygnału do szumu, mniejszą fototoksyczność i selektywne obrazowanie bardzo małego obszaru w pobliżu szkiełka nakrywkowego, obrazowanie TIRF jest szeroko stosowane do wizualizacji dynamiki białek na poziomie pojedynczej cząsteczki in vivo i in vitro.
To badanie omawia oczyszczanie silników kinezyny-3 za pomocą systemu ekspresji Sf9-bakulowirusa oraz obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro i wielosilnikowej analizy ślizgowej silników za pomocą mikroskopii TIRF. Podsumowując, badanie to pokazuje, że właściwości ruchowe silników oczyszczonych z Sf9 są identyczne z właściwościami silników przygotowanych z lizatów komórek ssaków. Dlatego uważamy, że system Sf9-bakulowirusa może być przystosowany do ekspresji i oczyszczania dowolnego białka motorycznego, które jest przedmiotem zainteresowania.

<table><tbody><tr><td>Sf9 kultury i materiały transfekcyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG M2 affinity</td><td>Biolegend</td><td>651502</td><td>Do oczyszczania białek</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td>Do oczyszczania białek</td></tr><tr><td>Cellfectin</td><td>Invitrogen</td><td>10362100</td><td>Do transfekcji Sf9</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D5545</td><td>Do oznaczania ruchliwości i oczyszczania białek</td></tr><tr><td>Peptyd FLAG</td><td>Sigma</td><td>F3290</td><td>Do oczyszczania białek</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Do zamrażania białka</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Do buforu do lizy Sf9</td></tr><tr><td>IGEPAL CA 630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>Do buforu do lizy Sf9</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Do przygotowania</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>Do oczyszczania białek</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>Do przygotowania</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Do przygotowania buforu do lizy</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Do oczyszczania białek</td></tr><tr><td>Komórki Sf9</td><td>Uprzejmy prezent od dr Thomasa Pucadyila (Indyjski Instytut Naukowy) Edukacja i Badania, Pune, Indie).</td><td></td><td>Do ekspresji bakulowirów i oczyszczania białek</td></tr><tr><td>Butelki hodowlane Sf9</td><td>Thermo Scientific</td><td>4115-0125</td><td>Do hodowli zawiesinowych</td></tr><tr><td>Sf-900/SFM pożywka (1X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10902-096 -500ml</td><td>Do hodowli komórek Sf9</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S1888</td><td>Przygotowanie buforu lizującego dla komórek Sf9</td></tr><tr><td>Niesuplementowany Grace' s media</td><td>Thermo Scientific</td><td>11595030 -500 ml</td><td>Do transfekcji Sf9</td></tr> <tr><td> polimeryzacji mirotubuli i materiałów do oznaczania pojedynczych cząsteczek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A2647</td><td>Do oznaczania ruchliwości i ślizgu</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Do blokowania komory ruchliwości</td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma</td><td>C9322</td><td>Dla Test ruchliwości i ślizgania</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td>Do rozpuszczania rodaminy</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3777</td><td>Do przygotowania</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Do oznaczania ruchliwości i ślizgania</td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Do oznaczania ruchliwości i ślizgania</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td>Do polimeryzacji mikrotubul</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P1767</td><td>Przygotowanie RUR bufor pH 6,9</td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td>Do przygotowania do testów ruchliwości i ślizgu</td></tr><tr><td><mocny>Materiały do oznaczania ślizgu mikrotubul</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>26G&nbsp; Igła</td><td>Dispovan</td><td></td><td>Do ścinania mikrotubul</td></tr><tr><td>Kazeina</td><td>Sigma</td><td>C3400</td><td>Do Test ślizgowy mikrotubul</td></tr><tr><td>Nanociała GFP</td><td>Prezent od dr Sivaraja Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA)</td><td></td><td>Do mocowania silników do szkiełka nakrywkowego</td></tr><tr><td>Rhodamine</td><td>Thermo Scientific</td><td>46406</td><td>Do przygotowania tubuliny</td></tr><tr><td>mikroskopu i innych przyrządów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml, 1,5 i 2 ml probówek</td> <td>mikrowirówekEppendorf</td><td></td><td>Do hodowli i oczyszczania Sf9</td></tr><tr><td>10ml&nbsp; jednorazowe sterylne pipety</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Do hodowli i oczyszczania Sf9</td></tr><tr><td>10ul, 200ul, 1ml końcówki do mikropipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Do hodowli i oczyszczania Sf9</td></tr><tr><td>15ml probówki konkalne</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Do hodowli i oczyszczania Sf9</td></tr><tr><td>35mm naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Cole Palmer</td><td>15179-39</td><td>Do hodowli Sf9</td></tr><tr><td>Balance</td><td>Sartorious</td><td></td><td>0,01g-300g</td></tr><tr><td>Stołowy inkubator do wytrząsania jamy ustnej</td><td>REMI</td><td></td><td>Do hodowli suspenculture Sf9 w temperaturze 28oC</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>EMCCD Andor iXon Ultra 897</td><td></td><td>Do obrazowania i akwizycji TIRF</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>Scotch</td><td></td><td>Do wykonywania komory ruchliwości</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Fisherfinest</td><td>Rozmiar 12-548-5A</td><td>; 22X30</td></tr><tr><td>Szkiełko</td><td>Blue Star</td><td></td><td>Do wykonywania komory ruchliwości</td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Neuation</td><td></td><td>Rozpuszczanie wosku parafinowego</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon Eclipse Ti- U</td><td></td><td>Do sprawdzania ekspresji białek</td></tr><tr><td>Lasery</td><td>488nm (100mW)</td><td></td><td>Do obrazowania TIRF</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td>Do zamrażania i przechowywania próbek</td></tr><tr><td>Mikrokapilarna końcówka ładująca</td><td>Eppendorf</td><td>EP022491920</td><td>Do ścinania mikrotubul</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Eclipse Ti2-E z konfiguracją DIC Do</td><td></td><td>obrazowania TIRF</td></tr><tr><td>Mini spin</td><td>Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd</td><td></td><td>Do szybkiego obracania</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>100X TIRF z zanurzeniem w oleju 1,49NA Do</td><td></td><td>obrazowania</td></tr> <tr><td>TIRFOptima UltraCentrifuge XE</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Do oczyszczania białek</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Corning</td><td>Coring 430</td><td>Do regulacji pH</td></tr><tr><td>Pipeta Chłopiec</td><td>VWR</td><td></td><td>Do hodowli i oczyszczania Sf9</td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Do oczyszczania białek</td></tr><tr><td>Sorvall ST8R </td><td>wirówka Thermo Scientific</td><td></td><td>Oczyszczanie białek</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Do polimeryzacji mikrotubul</td></tr><tr><td>Rotor ultrawirówki</td><td>Redlica Beckman Rotor</td><td></td><td>SW60Ti</td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówek</td><td>Beckman</td><td></td><td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Neuation Mieszanie</td><td></td><td>próbek</td></tr><tr><td>Wosk</td><td>Sigma</td><td>V001228</td><td>Do uszczelnienia komory ruchliwości</td></tr></tbody></table>

analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny kinesin-3 sf9

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

Złożone środowisko komórkowe stanowi wyzwanie dla analizy ruchliwości pojedynczych molekuł. Jednak postęp w technikach obrazowania usprawnił badania pojedynczych cząsteczek i zyskał ogromną popularność w wykrywaniu i zrozumieniu dynamicznego zachowania cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie. W tym miejscu opisujemy szczegółową metodę badań in vitro pojedynczych cząsteczek silników z rodziny kinezyny-3 przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). Kinesin-3 to duża rodzina, która odgrywa kluczową rolę w funkcjach komórkowych i fizjologicznych, od wewnątrzkomórkowego transportu ładunku, przez podział komórek, po rozwój. Wykazaliśmy wcześniej, że konstytutywnie aktywne dimeryczne silniki kinezyny-3 wykazują szybką i superprocesywną ruchliwość z wysokim powinowactwem do mikrotubul na poziomie pojedynczej cząsteczki przy użyciu lizatów komórkowych przygotowanych przez ekspresję silnika w komórkach ssaków. Nasze laboratorium bada silniki kinezyny-3 i ich mechanizmy regulacyjne przy użyciu podejść komórkowych, biochemicznych i biofizycznych, a takie badania wymagają oczyszczonych białek na dużą skalę. Ekspresja i oczyszczanie tych silników przy użyciu komórek ssaków byłoby kosztowne i czasochłonne, podczas gdy ekspresja w prokariotycznym systemie ekspresji skutkowała znacznie zagregowanym i nieaktywnym białkiem. Aby przezwyciężyć ograniczenia stwarzane przez systemy oczyszczania bakteryjnego i lizat komórek ssaków, opracowaliśmy solidny system ekspresji bakulowirusa Sf9 do ekspresji i oczyszczania tych silników. Silniki kinezyny-3 są C-końcowe znakowane 3-tandemowymi białkami fluorescencyjnymi (3xmCitirine lub 3xmCit), które zapewniają wzmocnione sygnały i zmniejszone fotowybielanie. Analiza in vitro pojedynczych cząsteczek i wielosilnikowych białek oczyszczonych z Sf9 pokazuje, że silniki kinezyny-3 są szybkie i superprocesywne, podobnie jak nasze poprzednie badania z użyciem lizatów komórek ssaków. Inne zastosowania wykorzystujące te testy obejmują szczegółową wiedzę na temat warunków oligomerowych silników, specyficznych czynników wiążących równoległych do badań biochemicznych oraz ich stanu kinetycznego.

Aby przeprowadzić ekspresję i oczyszczanie aktywnych i funkcjonalnych rekombinowanych białek motorowych na dużą skalę z wykorzystaniem systemu ekspresyjnego Sf9-bakulowirus, konieczne jest wytworzenie cząstek wirusowych stabilnie niosących sekwencję kodującą w celu zakażenia komórek Sf9. W tym celu komórki Sf9 przetransfekowano rekombinowanym bakmidem kodującym KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG. Po 72 h znaczna populacja komórek wykazała ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (mCitrine) oraz powiększenie komórek i jąder (...

To badanie szczegółowo opisuje oczyszczanie KIF1A(1-393LZ), członka rodziny kinezyny-3, przy użyciu systemu ekspresji Sf9-bakulowirusa. Analiza in vitro pojedynczych cząsteczek i wielu silników ślizgowych tych oczyszczonych silników wykazała silne właściwości ruchliwości porównywalne z silnikami z lizatu komórkowego ssaków. W ten sposób system Sf9-bakulowirusa jest podatny na ekspresję i oczyszczanie białka motorycznego będącego przedmiotem zainteresowania.

Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Protokół oferuje prostą metodę oczyszczania aktywnych silników molekularnych za pomocą systemu bakulowirusa Sf9. Szczegółowo opisano również ruchliwość pojedynczych cząsteczek i testy poślizgu wielosilnikowego w celu zbadania mechanizmu regulacyjnego białek motorycznych. Cała ta tradycyjna ekspresja wektora Sf9 bakulowirusa i jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa doprowadzą czyste i aktywne białko motoryczne do zbadania mechanistycznych szczegółów superprocesyjnych kinezyn w układach jednocząsteczkowych i wielosilnikowych.Oprócz silników kinezynowych, protokół może być stosowany do badania właściwości biochemicznych i biofizycznych innych białek opartych na cytoszkieletzie, takich jak dionina i miozyna. Protokół jest szczegółowy i łatwy do naśladowania. Niektóre sugestie dotyczą ostrożnego obchodzenia się z komórkami Sf9, ponieważ są one podatne na zanieczyszczenie, oraz przestrzegania notatek zawartych w protokole.Demonstracja wizualna jest bardzo skuteczna, łatwa do naśladowania i zrozumienia krytycznych kroków, szczególnie dla tych, którzy nigdy nie wykonywali tych testów. Procedurę zademonstrują Pushpanjali Soppina i Dipeshwari Shewale, doktoranci współpracujący ze mną i Pradeepem Naikiem. Na początek zasiej komórki w naczyniu o pojemności 35 mililitrów, o gęstości 4,5 razy 10 do piątych komórek na mililitr.Po 24 godzinach wymieszaj jeden mikrogram bakimidowego DNA i 100 mikrolitrów niesuplementowanej pożywki Grace w probówce. Wymieszaj sześć mikrolitrów odczynnika do transfekcji w innej probówce ze 100 mikrolitrami nieuzupełnionej pożywki Grace. Ostrożnie przenieś zawartość pierwszej probówki do drugiej probówki.Wymieszaj je i inkubuj mieszaninę przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 0,8 mililitra nieuzupełnionej pożywki Grace do mieszanki. Wymieszaj i odessaj pożywkę Sf900 SFM z komórek.Dodać przygotowaną pożywkę do transfekcji kroplami na wierzch komórek i inkubować płytkę przez sześć godzin. Następnie ostrożnie usuń mieszaninę transfekcyjną. Dodać dwa mililitry pożywki SF900 SFM i dalej inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 48 godzin.Następnie sprawdź ekspresję białka motorycznego pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym. Zebrać pożywkę z zainfekowanymi komórkami i wirować przez pięć minut w temperaturze 500 G. Zebrać supernatant i zatrzaskowo zamrozić porcje. Dodać 10 mililitrów pożywki SF900 SFM z komórkami i jeden mililitr bulionu wirusa P-zero w sterylnej, stożkowej kolbie o pojemności 100 mililitrów.Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza ze stałym wstrząsaniem przy 90 obr./min. Po 72 godzinach odwirować komórki w 15-mililitrowej, sterylnej stożkowej probówce o stężeniu 500 G przez pięć minut i zebrać supernatant. Aby uzyskać ekspresję białka na dużą skalę, należy zainfekować 30 mililitrów kultury zawiesinowej jednym mililitrem wirusa zapasowego P1.72 godziny po zakażeniu sprawdź komórki pod kątem ekspresji białka i zbierz komórki w sterylnych, 50-mililitrowych, stożkowych probówkach. Po odwirowaniu wyrzuć supernatant i zbierz osad komórkowy. Aby zlizować komórki, dodaj trzy mililitry lodowatego buforu do lizy do osadu komórkowego.Wiruj lizat komórkowy w temperaturze 150 000 G przez 30 minut, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant i wymieszać go z 40 mikrolitrami żywicy o powinowactwie 50%ANTI-FLAG M2. Inkubować mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny, przetaczając się od końca do końca.Teraz opluj żywicę FLAG, wirując z prędkością 500 G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj granulat żywicy FLAG trzykrotnie lodowatym buforem do mycia. A po trzecim praniu ostrożnie opróżnij bufor myjący.Następnie dodaj 70 mikrolitrów buforu do przemywania zawierającego 100 mikrogramów na mililitr peptydu FLAG do granulki żywicy i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jak pokazano wcześniej. Po odwirowaniu zebrać supernatant zawierający oczyszczone białko do świeżej probówki. Przygotuj mieszaninę polimeryzacyjną zgodnie z opisem w manuskrypcie i dodaj 10 mikrolitrów tubuliny do mieszaniny polimeryzacyjnej.Przenieś probówkę do bloku grzewczego, wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez 30 minut. Po przygotowaniu buforu stabilizującego mikrotubule należy go ogrzać i dodać do spolimeryzowanych mikrotubul. Po przygotowaniu komory komórek przepływowych o ruchliwości przepuść przez komorę 30 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu mikrotubul.Po 30 minutach przelej od 40 do 50 mikrolitrów buforu blokującego i inkubuj go. Przygotuj mieszaninę ruchliwości i dodaj do niej jeden mikrolitr oczyszczonego silnika. Dobrze wymieszaj i przelej roztwór do komory ruchliwości.Uszczelnij oba końce komory ruchliwości i obrazu pod oświetleniem TIRF. Skoncentruj się na poszczególnych silnikach oznaczonych mCitirine, poruszających się procesowo. Wymieszaj tubulinę znakowaną rodaminą z nieznakowaną tubuliną w stosunku od 1 do 10.Po 30 minutach polimeryzacji delikatnie dodać 30 mikrolitrów wstępnie podgrzanego buforu stabilizacyjnego mikrotubul i inkubować dalej przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ścinać mikrotubule przez pipetowanie za pomocą kapilarnej końcówki ładującej. Po przygotowaniu komory przepływu ruchliwości przelej 50 mikrolitrów oczyszczonych nanociał GFP Sf9 i inkubuj przez 30 minut.Zablokuj powierzchnię szkiełka nakrywkowego, przepływając 50 mikrolitrów bufora blokowego. Przygotuj 50 mikrolitrów mieszanki silnikowej. Wlej go do komory po delikatnym wymieszaniu roztworu i inkubuj przez 30 minut.Umyć komorę dwukrotnie 50 mikrolitrami kazeiny P12. Przygotować mieszaninę do oznaczania ślizgu i delikatnie ją wymieszać przed przelaniem do komory ruchliwości. Uszczelnij końce komory ruchliwości i wyobraź sobie mikrotubulę ślizgającą się pod oświetleniem TIRF.Po 48 godzinach od transfekcji nietransfekowane komórki wydają się małe, okrągłe i mocno przylegające. Jednak transfekowane komórki, wykazujące ekspresję białka, były luźno przyczepione do powierzchni i wykazywały zwiększoną średnicę komórki. Po 72 godzinach ponad 90% komórek Sf9 uległo ekspresji fluorescencyjnie znakowanej kinezyny-3 KIF1A, a komórki były luźno związane z powierzchnią.Białko motoryczne kinezyny-3 oczyszczono z transfekowanych komórek Sf9. Kymograf przedstawia ruch kinezyny-3 chodzący procesowo po powierzchni mikrotubul. Zdarzenia motoryczne wykazały średnią prędkość i długość biegu wynoszącą odpowiednio około 2,44 mikrometra na sekundę i 10,79 mikrometra.Kymograf wskazuje na płynne ślizganie się mikrotubul przez silniki kinezyny-3 ze średnią prędkością około 1,37 mikrometra na sekundę. Najważniejsze jest, aby dodać bufor stabilizacyjny bez naruszania mieszanki mikrotubul i nie ścinać mikrotubul. Protokół byłby przydatny do innych zastosowań, takich jak pomiary ATPazy, analiza biofizyczna, mechanizmy, testy rekonstytucji in vitro i tak dalej.Korzystając z oczyszczonych silników sf9, wykazaliśmy niedawno, że silniki kinezyny-3 są szybkie i superprocesowe. Co ciekawe, silniki te wykazują wysokie wskaźniki rotacji ATP w porównaniu z dobrze scharakteryzowanym silnikiem Kinesin-1.

single-molecule-analysis-sf9-purified-superprocessive-kinesin-3

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji aktywnej, pełnowymiarowej kinezyny z embrionów Drosophila do biofizycznych badań pojedynczych cząsteczek. Przedstawiamy sposób zbierania embrionów, przygotowania lizatu embrionalnego, a następnie polimeryzacji mikrotubul (MT). Kinezynę oczyszcza się poprzez jej unieruchomienie na mikrotubulach, odwirowanie kompleksów kinezyna-MT, a następnie uwolnienie kinezyny z mikrotubul poprzez dodanie ATP.

Izolacja i oczyszczanie kinezyny z embrionów Drosophila

Wewnątrzkomórkowy transport ładunków, takich jak pęcherzyki czy organelle, odbywa się za pomocą molekularnych białek motorycznych, które śledzą na spolaryzowanych mikrotubulach. Protokół ten opisuje korelację kierunkowości transportu pojedynczych cząstek ładunku poruszających się wewnątrz neuronów, do względnej ilości i rodzaju związanych z nimi białek motorycznych.

Charakterystyka składu silników molekularnych na ruchomym ładunku aksonalnym za pomocą analizy "mapowania ładunku"

Tutaj prezentowany jest protokół identyfikacji ładunków Kinesin-1. Bezsilnikowy mutant ciężkiego łańcucha Kinesin-1 (KIF5B) agreguje się w cytoplazmie i indukuje agregację jej ładunków. Oba agregaty są wykrywane pod mikroskopią fluorescencyjną. Podobną strategię można zastosować do identyfikacji ładunków innych białek motorycznych.

Identyfikacja ładunków kinezyny-1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Prezentujemy protokół budowy molekularnych wahadłowców, gdzie przylegające do powierzchni białka motoryczne kinezyny napędzają mikrotubule znakowane barwnikiem. Słabe oddziaływania kinezyn z powierzchnią umożliwiają ich odwracalne przywiązanie do niej. W ten sposób powstaje system w nanoskali, który wykazuje dynamiczny montaż i demontaż swoich elementów przy zachowaniu swojej funkcjonalności.

Montaż molekularnych wahadłowców zasilanych przez odwracalnie przyłączone kinezyny

Celem tego protokołu jest tworzenie zespołów silników molekularnych na nanostrukturach origami DNA i obserwowanie ruchliwości zespołu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem.

Produkcja zespołów motorycznych dyneiny i kinezyny na nanostrukturach DNA origami do obserwacji pojedynczych cząsteczek

Dwukierunkowa mitoza kinezyna-5 Cin8 gromadzi się w klastrach, które rozdzielają się i łączą podczas swojej ruchliwości. Akumulacja w gromadach zmienia również prędkość i kierunkowość Cin8. W tym miejscu opisano protokół oznaczania ruchliwości z oczyszczonym Cin8-GFP oraz analizy właściwości ruchliwych pojedynczych cząsteczek i klastrów Cin8.

Ruchliwość pojedynczych cząsteczek i klastrów dwukierunkowej kinezyny-5 Cin8 oczyszczonej z komórek S. cerevisiae

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

Zgłoszono platformę jednocząsteczkowych pęsety magnetycznej do manipulowania G-quadruplexami, która pozwala na badanie stabilności i regulacji G4 przez różne białka.

Manipulacja pojedynczymi cząsteczkami G-kwadrupleksów za pomocą pęsety magnetycznej

Poznaj metodę oczyszczania aktywnych silników molekularnych z rodziny kinezyn-3 przy użyciu systemu ekspresji Sf9-baculowirusowej. Protokół obejmuje analizę motoryki pojedynczych cząsteczek i testy poślizgowe wielu silników.

Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9

Przeglądaj więcej filmów