Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9

Protokół oferuje prostą metodę oczyszczania aktywnych silników molekularnych za pomocą systemu bakulowirusa Sf9. Szczegółowo opisano również ruchliwość pojedynczych cząsteczek i testy poślizgu wielosilnikowego w celu zbadania mechanizmu regulacyjnego białek motorycznych. Cała ta tradycyjna ekspresja wektora Sf9 bakulowirusa i jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa doprowadzą czyste i aktywne białko motoryczne do zbadania mechanistycznych szczegółów superprocesyjnych kinezyn w układach jednocząsteczkowych i wielosilnikowych.

Oprócz silników kinezynowych, protokół może być stosowany do badania właściwości biochemicznych i biofizycznych innych białek opartych na cytoszkieletzie, takich jak dionina i miozyna. Protokół jest szczegółowy i łatwy do naśladowania. Niektóre sugestie dotyczą ostrożnego obchodzenia się z komórkami Sf9, ponieważ są one podatne na zanieczyszczenie, oraz przestrzegania notatek zawartych w protokole.

Demonstracja wizualna jest bardzo skuteczna, łatwa do naśladowania i zrozumienia krytycznych kroków, szczególnie dla tych, którzy nigdy nie wykonywali tych testów. Procedurę zademonstrują Pushpanjali Soppina i Dipeshwari Shewale, doktoranci współpracujący ze mną i Pradeepem Naikiem. Na początek zasiej komórki w naczyniu o pojemności 35 mililitrów, o gęstości 4,5 razy 10 do piątych komórek na mililitr.

Po 24 godzinach wymieszaj jeden mikrogram bakimidowego DNA i 100 mikrolitrów niesuplementowanej pożywki Grace w probówce. Wymieszaj sześć mikrolitrów odczynnika do transfekcji w innej probówce ze 100 mikrolitrami nieuzupełnionej pożywki Grace. Ostrożnie przenieś zawartość pierwszej probówki do drugiej probówki.

Wymieszaj je i inkubuj mieszaninę przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 0,8 mililitra nieuzupełnionej pożywki Grace do mieszanki. Wymieszaj i odessaj pożywkę Sf900 SFM z komórek.

Dodać przygotowaną pożywkę do transfekcji kroplami na wierzch komórek i inkubować płytkę przez sześć godzin. Następnie ostrożnie usuń mieszaninę transfekcyjną. Dodać dwa mililitry pożywki SF900 SFM i dalej inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Następnie sprawdź ekspresję białka motorycznego pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym. Zebrać pożywkę z zainfekowanymi komórkami i wirować przez pięć minut w temperaturze 500 G. Zebrać supernatant i zatrzaskowo zamrozić porcje. Dodać 10 mililitrów pożywki SF900 SFM z komórkami i jeden mililitr bulionu wirusa P-zero w sterylnej, stożkowej kolbie o pojemności 100 mililitrów.

Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza ze stałym wstrząsaniem przy 90 obr./min. Po 72 godzinach odwirować komórki w 15-mililitrowej, sterylnej stożkowej probówce o stężeniu 500 G przez pięć minut i zebrać supernatant. Aby uzyskać ekspresję białka na dużą skalę, należy zainfekować 30 mililitrów kultury zawiesinowej jednym mililitrem wirusa zapasowego P1.

72 godziny po zakażeniu sprawdź komórki pod kątem ekspresji białka i zbierz komórki w sterylnych, 50-mililitrowych, stożkowych probówkach. Po odwirowaniu wyrzuć supernatant i zbierz osad komórkowy. Aby zlizować komórki, dodaj trzy mililitry lodowatego buforu do lizy do osadu komórkowego.

Wiruj lizat komórkowy w temperaturze 150 000 G przez 30 minut, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant i wymieszać go z 40 mikrolitrami żywicy o powinowactwie 50%ANTI-FLAG M2. Inkubować mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny, przetaczając się od końca do końca.

Teraz opluj żywicę FLAG, wirując z prędkością 500 G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj granulat żywicy FLAG trzykrotnie lodowatym buforem do mycia. A po trzecim praniu ostrożnie opróżnij bufor myjący.

Następnie dodaj 70 mikrolitrów buforu do przemywania zawierającego 100 mikrogramów na mililitr peptydu FLAG do granulki żywicy i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jak pokazano wcześniej. Po odwirowaniu zebrać supernatant zawierający oczyszczone białko do świeżej probówki. Przygotuj mieszaninę polimeryzacyjną zgodnie z opisem w manuskrypcie i dodaj 10 mikrolitrów tubuliny do mieszaniny polimeryzacyjnej.

Przenieś probówkę do bloku grzewczego, wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez 30 minut. Po przygotowaniu buforu stabilizującego mikrotubule należy go ogrzać i dodać do spolimeryzowanych mikrotubul. Po przygotowaniu komory komórek przepływowych o ruchliwości przepuść przez komorę 30 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu mikrotubul.

Po 30 minutach przelej od 40 do 50 mikrolitrów buforu blokującego i inkubuj go. Przygotuj mieszaninę ruchliwości i dodaj do niej jeden mikrolitr oczyszczonego silnika. Dobrze wymieszaj i przelej roztwór do komory ruchliwości.

Uszczelnij oba końce komory ruchliwości i obrazu pod oświetleniem TIRF. Skoncentruj się na poszczególnych silnikach oznaczonych mCitirine, poruszających się procesowo. Wymieszaj tubulinę znakowaną rodaminą z nieznakowaną tubuliną w stosunku od 1 do 10.

Po 30 minutach polimeryzacji delikatnie dodać 30 mikrolitrów wstępnie podgrzanego buforu stabilizacyjnego mikrotubul i inkubować dalej przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ścinać mikrotubule przez pipetowanie za pomocą kapilarnej końcówki ładującej. Po przygotowaniu komory przepływu ruchliwości przelej 50 mikrolitrów oczyszczonych nanociał GFP Sf9 i inkubuj przez 30 minut.

Zablokuj powierzchnię szkiełka nakrywkowego, przepływając 50 mikrolitrów bufora blokowego. Przygotuj 50 mikrolitrów mieszanki silnikowej. Wlej go do komory po delikatnym wymieszaniu roztworu i inkubuj przez 30 minut.

Umyć komorę dwukrotnie 50 mikrolitrami kazeiny P12. Przygotować mieszaninę do oznaczania ślizgu i delikatnie ją wymieszać przed przelaniem do komory ruchliwości. Uszczelnij końce komory ruchliwości i wyobraź sobie mikrotubulę ślizgającą się pod oświetleniem TIRF.

Po 48 godzinach od transfekcji nietransfekowane komórki wydają się małe, okrągłe i mocno przylegające. Jednak transfekowane komórki, wykazujące ekspresję białka, były luźno przyczepione do powierzchni i wykazywały zwiększoną średnicę komórki. Po 72 godzinach ponad 90% komórek Sf9 uległo ekspresji fluorescencyjnie znakowanej kinezyny-3 KIF1A, a komórki były luźno związane z powierzchnią.

Białko motoryczne kinezyny-3 oczyszczono z transfekowanych komórek Sf9. Kymograf przedstawia ruch kinezyny-3 chodzący procesowo po powierzchni mikrotubul. Zdarzenia motoryczne wykazały średnią prędkość i długość biegu wynoszącą odpowiednio około 2,44 mikrometra na sekundę i 10,79 mikrometra.

Kymograf wskazuje na płynne ślizganie się mikrotubul przez silniki kinezyny-3 ze średnią prędkością około 1,37 mikrometra na sekundę. Najważniejsze jest, aby dodać bufor stabilizacyjny bez naruszania mieszanki mikrotubul i nie ścinać mikrotubul. Protokół byłby przydatny do innych zastosowań, takich jak pomiary ATPazy, analiza biofizyczna, mechanizmy, testy rekonstytucji in vitro i tak dalej.

Korzystając z oczyszczonych silników sf9, wykazaliśmy niedawno, że silniki kinezyny-3 są szybkie i superprocesowe. Co ciekawe, silniki te wykazują wysokie wskaźniki rotacji ATP w porównaniu z dobrze scharakteryzowanym silnikiem Kinesin-1.