Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Nasz protokół pozwala naukowcom budować motywy cytoszkieletu z oczyszczonych składników i bezpośrednio mierzyć siły generowane przez te sieci, aby zrozumieć, jak te mechaniczne składniki komórki funkcjonują zarówno w stanie zdrowym, jak i chorobowym. Ta metoda pozwala nam określić ilościowo siły i bezpośrednio skorelować te liczby, aby zachować parametry zaangażowanych białek, w tym stężenie i gęstość białka. Parametry, które są na ogół niemożliwe do uzyskania w komórce.

Ta metoda może zapewnić wgląd w każdy rodzaj sieci cytoszkieletu, taki jak te zaangażowane w mitozę lub rozwój neuronalny. Można go łatwo dostosować do badania sieci zaangażowanych w skurcz mięśni lub migrację komórek, po prostu wymieniając te konkretne białka, które są używane. Najtrudniejszym aspektem tej metody jest koordynacja różnych technologii, w tym pułapki optycznej z pojedynczą wiązką i mikroskopu TIRF.

Ponadto eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami wymagają starannego przygotowania powierzchni, takich jak szkiełko nakrywkowe, dlatego przygotowanie wysokiej jakości próbek ma kluczowe znaczenie. Zacznij od zbudowania komory wilgotnościowej, umieszczając złożoną, niestrzępiącą się chusteczkę zwilżoną ultraczystą wodą na dnie pustego pudełka z końcówkami do pipet. Wprowadzić wszystkie odczynniki, pipetując płyn na jednym końcu kanału i odprowadzając płyn na drugi koniec.

Używając końcówki do pipety o kącie 20 mikrolitrów, powoli przelej 10 mikrolitrów po 0,5 miligrama na mililitr streptawidyny lub NeutrAvidin. Inkubować szkiełko w komorze wilgotnościowej przez 4 minuty z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w dół. Przepłucz komorę za pomocą 20 mikrolitrów 1x BRB80 za pomocą niestrzępiącej się chusteczki do wyciągnięcia płynów.

Po powtórzeniu przepływających odczynników i kolejnej inkubacji, przepłukać etap 10 mikrolitrami 0,5 miligrama na mililitr roztworu blokującego kazeinę. Wlej 10 mikrolitrów rozcieńczonych biotynylowanych mikrotubul dalekiej czerwieni do komory, a następnie przepłucz komorę 20 mikrolitrami 1x BRB80. Po przepuszczeniu odczynnika i inkubacji, jak pokazano wcześniej, przepłukać etap 10 mikrolitrami odpowiedniego stężenia białka niemotorycznego, które ma być badane, a następnie wprowadzić 10 mikrolitrów mikrotubul rodaminy i powtórzyć inkubację i płukanie.

Następnie połącz 1 mikrolitr kulek pokrytych kinezyną rigor i 19 mikrolitrów buforu reakcyjnego. Uszczelnij obie krawędzie komory przezroczystym lakierem do paznokci i poczekaj, aż lakier wyschnie. Zastosuj instrument z odwróconym mikroskopem, który ma całkowite możliwości obrazowania fluorescencji wewnętrznego odbicia i w którym skonstruowano pułapkę optyczną z pojedynczą wiązką.

Dodaj 1 kroplę olejku immersyjnego na szkiełko nakrywkowe komory próbki. Trzymając szkiełko nakrywkowe komory próbki skierowaną w dół, umieść próbkę, która ma być zobrazowana, na platformie mikroskopu. Powoli podnieś obiektyw do góry, tak aby zarówno szkiełko nakrywkowe, jak i obiektyw stykały się z olejem.

Wyreguluj wysokość obiektywu tak, aby powierzchnia szkiełka nakrywkowego w komorze próbki była ostra. Rejestruj jednoklatkowe obrazy próbek we wszystkich trzech kanałach. W przypadku eksperymentów użyj od 100 do 200 milisekund ekspozycji.

Dostosuj moc lasera, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu z próbek, jednocześnie minimalizując wybielanie fotograficzne w ciągu 2 do 5 minut, gdy badany jest pojedynczy pakiet. Częstość wiązek mikrotubul na pole widzenia powinna wynosić około trzech do czterech wiązek mikrotubul na 100 mikrolitrów na 100 mikrolitrów pola widzenia na komorę. Obserwuj gęstość kulek w próbce za pomocą jasnego pola i obiektywu 100x na mikroskopie.

Zastosuj koncentrację kulek w taki sposób, aby kulki znajdowały się średnio w odległości co najmniej 10 mikrometrów od siebie i upewnij się, że są wolne od wszelkiego rodzaju ograniczeń lub skupisk na powierzchni. Upewnij się, że biotynylowane dalekie czerwone mikrotubule są mocno przymocowane do powierzchni szkiełka nakrywkowego i że rodamina nie wykazuje widocznych ruchów Browna. Upewnij się, że mikrotubule rodaminy są przyłączone do biotynylowanych mikrotubul za pomocą mapy sieciowania i widocznie ulegają wahaniom na swoich wolnych końcach.

Zidentyfikuj odpowiedni pakiet mikrotubul, który zawiera tylko dwie mikrotubule, jedną biotynylowaną z przyczepieniem na całej powierzchni i jedną niebiotynylowaną mikrotubulę, która jest częściowo wolna w roztworze i jest wyrównana na osi x lub y. Użyj pułapki optycznej, aby uchwycić swobodny koralik demonstrujący ruch Browna. Po uwięzieniu koralika ostrożnie przenieś koralik do wybranej wiązki mikrotubul, upewniając się, że żadne inne kulki nie zostaną wciągnięte do pułapki.

Upewnij się, że kulka znajduje się w odległości kilku mikronów od obszaru nakładania się zawierającego białka sieciujące. Ostrożnie opuść koralik w osi z, aż zetknie się z krawędzią wolnego segmentu mikrotubuli rodaminy. Delikatnie pociągnij do góry i przesuń prostopadle do osi mikrotubul, aby sprawdzić przyczepienie, obserwując zginanie mikrotubuli rodaminy i podążając za pozycją ściegu.

Ostrożnie wyrównaj mikrotubulę rodaminy wzdłuż osi mikrotubuli mikrotubuli przymocowanej powierzchniowo, przesuwając stopień nanopozycjonowania i ustaw parametry automatycznego ciągnięcia wiązki mikrotubul. Ustaw kierunek wzdłuż równoległej osi mikrotubul. Ustaw żądaną prędkość ciągnięcia i żądany czas ciągnięcia w zależności od długości zakładki.

Rozpocznij rejestrowanie danych fluorescencyjnych w trzech kanałach z szybkością od 1 do 2 klatek na sekundę. Użyj zoptymalizowanych mocy lasera i czasów naświetlania. Inicjuj zautomatyzowany ruch stolika i rejestruj dane pułapkowania ze stopnia detektora czułego na położenie i stopnia kamery fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Wyłącz pułapki, aby uwolnić koralik i powtórz eksperyment zgodnie z potrzebami. Zespoły niezbędnego mitotycznego białka motorycznego kinezyny-5 mogą regulować przesuwanie się mikrotubul, generując zarówno siły pchające, jak i hamujące, które skalują się liniowo wraz z długością nakładania się. Stwierdzono, że domena ogona C-końcowego jest wymagana do wydajnego sieciowania i generowania siły.

Białko o pełnej długości jest w stanie generować trwałe siły, które stabilizują się, gdy wszystkie białka motoryczne osiągną swoją indywidualną siłę zatrzymania. Jednak silnik kinezyny-5 pozbawiony ogona C-końcowego generuje maksymalne siły, które są prawie pięciokrotnie mniejsze. Zespoły niemotorycznego białka mitotycznego PRC1 działają jak mechaniczna kapsuła na deskę rozdzielczą, aby zapobiec przesuwaniu się mikrotubul w strefie środkowej wrzeciona anafazowego.

Siły oporu nie zależą od długości nakładających się na siebie regionów między parami mikrotubul ani od lokalnej gęstości sieciowania, ale silnie zależą od całkowitego stężenia zaangażowanych cząsteczek PRC1. Metodę tę można dostosować do badania różnych systemów biologicznych, takich jak organizacja mikrobiologiczna i neurony, przy użyciu alternatywnych białek. Można go również łatwo rozszerzyć o analizę geometrii sieci opartej na aktynie w celu zbadania skurczu mięśni lub ruchliwości komórek.

Technika ta pozwala badać unikalną geometrię całkowitej komórki, w której włókna są zarówno torem, jak i ładunkiem i są zorganizowane przez małe zespoły białek. Te geometrie lepiej naśladują to, co dzieje się w komórkach podczas wielu procesów biologicznych.