Name: Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj metodę pomiaru sił w odtworzonych wiązkach mikrotubul przy użyciu pułapki optycznej i mikroskopii TIRF. Technika ta umożliwia badanie mechaniki cytoszkieletu na poziomie nanometrycznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony R21 AG067436 (dla JP i SF), T32 AG057464 (dla ET) oraz Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (dla SF).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Sieci mikrotubul są wykorzystywane przez niezliczone typy komórek do wykonywania szerokiego zakresu zadań, które mają zasadniczo charakter mechaniczny. Aby opisać, w jaki sposób komórki funkcjonują zarówno w stanie zdrowym, jak i chorobowym, kluczowe jest zrozumienie, w jaki sposób te sieci w skali mikronowej są zorganizowane i regulowane przez białka o rozmiarach nanometrów, które wspólnie je budują. Narzędzia biofizyczne, takie jak pęseta optyczna, są dobrze przystosowane do badania mechanochemii kluczowych białek w te...

Komórki wykorzystują sieci mikrotubul do wykonywania szerokiej gamy zadań mechanicznych, począwszy od transportu pęcherzyków1,2,3 do segregacji chromosomów podczas mitozy4,5,6. Wiele białek, które oddziałują z mikrotubulami, takich jak molekularne białka motoryczne kinezyna i dyneina, generuje siły i jest regulowanych przez obciążenia mechaniczne. Aby lepiej zrozumieć, jak funkcjonują te krytyczne cząsteczki, naukowcy zastosowali metody biofizyczne pojedynczych cząsteczek, takie jak pułapkowanie optyczne i mikroskopia TIRF, do bezpośredniego monitorowania krytycznych parametrów, takich jak szybkość kroku bez obciążenia, procesywność i zależności między siłą a prędkością dla poszczególnych białek. Najczęściej stosowaną geometrią eksperymentalną było dołączanie białek motorycznych bezpośrednio do kulek pułapkowych, których sferyczna geometria i rozmiar naśladują pęcherzyki poddawane transportowi napędzanemu silnikiem. Liczne kinezyny, w tym kinesin-17,8,9, kinesin-210,11,12, kinesin-313,14,15,16 kinesin-517,18, kinesin-819,20, a także dynein i kompleksy dyneinowe21,22,23,24,25, zostały zbadane tymi metodami.
Jednak w wielu procesach komórkowych białka motoryczne i niemotoryczne wykorzystują mikrotubule zarówno jako tor, jak i ładunek26,27. Co więcej, w tych scenariuszach, w których włókna mikrotubul są sieciowane w wiązki wyższego rzędu, białka te funkcjonują jako zespoły, a nie pojedyncze jednostki. Na przykład w dzielących się komórkach somatycznych gęste sieci włókien samoorganizują się, tworząc aparat wrzeciona mitotycznego28,29,30. Międzybiegunowa sieć mikrotubul wrzeciona jest bardzo dynamiczna i jest w dużej mierze ułożona z końcami ujemnymi skierowanymi w stronę biegunów wrzeciona i końcami dodatnimi zachodzącymi na siebie w pobliżu równika wrzeciona. Filamenty we wrzecionie są sieciowane przez białka motoryczne, takie jak kinesin-531,32,33, kinesin-1234,35,36, and kinesin-1437,38,39, lub białka niemotoryczne, takie jak PRC140,41,42,43 lub NuMA44,45,46. Często poruszają się lub doświadczają naprężeń mechanicznych podczas procesów takich jak przepływ w kierunku bieguna lub podczas koordynowania centrowania chromosomów podczas metafazy lub segregacji chromosomów podczas anafazy47,48,49,50,51,52. Integralność aparatu wrzeciona w skali mikronowej poprzez mitozę opiera się zatem na starannie regulowanej równowadze sił pchających i ciągnących generowanych i podtrzymywanych przez tę sieć oddziałujących ze sobą włókien. Jednak narzędzia potrzebne do zbadania tej mechanicznej regulacji i wyjaśnienia, w jaki sposób zespoły białkowe współpracują ze sobą, aby koordynować ruchy mikrotubul i wytwarzać siły potrzebne do prawidłowego montażu wrzeciona, zostały opracowane dopiero niedawno, a my dopiero zaczynamy rozumieć zasady biofizyczne, które definiują dynamiczne sieci mikrotubul.
Celem tego manuskryptu jest zademonstrowanie kroków wymaganych do odtworzenia usieciowanych par mikrotubul in vitro, unieruchomienia tych wiązek w komorze mikroskopowej, która pozwala na jednoczesną wizualizację fluorescencyjną zarówno mikrotubul, jak i białek sieciujących oraz pomiar siły w nanoskali, oraz solidne przetwarzanie tych danych. Szczegółowo opisujemy kroki potrzebne do stabilnej polimeryzacji mikrotubul znakowanych fluorescencją, przygotowania szkiełek nakrywkowych mikroskopu do mocowania, przygotowania kulek polistyrenowych do eksperymentów z pułapką optyczną oraz montażu usieciowanych sieci włókien, które zachowują swoją funkcjonalność in vivo, umożliwiając jednocześnie bezpośrednią manipulację biofizyczną.

<table><tbody><tr><td>Laser światłowodowy iterbowy o mocy 10 W, 1064nm</td><td>IPG Photonics</td><td>YLR-10-1064-LP</td><td></td></tr><tr><td>405/488/561 / 640nm Czterozakresowy zestaw laserowy do zastosowań TIRF</td><td>Chroma</td><td>TRF89901v2</td><td></td></tr><tr><td>6x Przeciwciało Tag His, koniugat biotyny</td><td>Invitrogen</td><td>#MA1-21315-BTIN</td><td></td></tr><tr><td>Aceton, klasa HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-608-395</td><td></td></tr><tr><td>Alfa kazeina z mleka krowiego</td><td>Sigma</td><td>1002484390</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>Benzonaza</td><td>Novagen</td><td>70746-3</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-PEG-SVA-5000</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td></td><td></td>NC0479433</tr><tr><td>BL21 (DE3) Rosetta Cells</td><td>Millipore Sigma</td><td>71-400-3</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>190311</td><td></td></tr><tr><td>CFI Apo 100X/1.49NA zanurzeniowy w oleju Obiektyw TIRF</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>ACROS Organics</td><td>227920250</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe, na 8 szkiełek nakrywkowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>C14784</td><td></td></tr><tr><td>Wycieraczki do delikatnych zadań</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza bezwodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3501</td><td></td></tr><tr><td>D-sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-25</td><td></td></tr><tr><td>Ecoline Termostat zanurzeniowy E100 z wanną 003</td><td>LAUDA-Brinkmann</td><td>27709</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Millipore Corporation</td><td>32462-25GM</td><td></td></tr><tr><td>FIDŻI / Obraz J</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matowe szkiełka mikroskopowe</td><td>Corning</td><td>12-553-10</td><td>75mmx25mm, o grubości 0,9-1,1mm</td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>195196</td><td>Typ VII, bez dodatku tlenu</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td>JBS-NU-405S</td><td>Może być przechowywany przez kilka miesięcy w temperaturze -20 &deg; C i do roku przy -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Złota uszczelka Szkło</td><td>Thermo Scientific</td><td>3405</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Fisher Scientific</td><td>03196-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td> Eksykator laboratoryjny <td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bel-Art</td><td>999320237</td><td>rozmiar płytki 190mm</td></tr><tr><td>Siarczan Kanamycyny</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KIF5A K439 (aa:1-439)-6His</td><td>Gilbert Lab, RPI</td><td>N/A</td><td>doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberley Clark</td><td>Z188956</td><td>niestrzępiący</td></tr><tr><td>się olejek immersyjny</td> do chusteczek, typ B <td>Cargille</td><td>16484</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka</td><td>ThorLabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>LuNA Uruchomienie lasera (4 kanały: 405, 488, 561, 640nm)</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>100834</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrat octanu magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP215-500</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>MPEG-SVA MW-5000</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td></td><td></td>NC0107576</tr><tr><td>Neutravadin</td><td>Invitrogen</td><td>PI31000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon Ti-E</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Nikon LuN4 Laser</td></tr><tr><td>Ni-NTA Żywica Thermo</td><td>Scientific</td><td>88221</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotyd - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA GAACTTTCAAAGGC</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotyd - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA ACTCAGAATAGGTG</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Otwarta grubościenna rurka poliwęglanowa, 0,2 mL, 7 mm x 22 mm</td><td>Redlica Beckman 343755</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima-TLX Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>361544</td><td></td></tr><tr><td>paklitaksel (odpowiednik Taxol)</td><td>Rury Thermo Fisher Scientific</td><td>P3456</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ACROS Organics</td><td>172615000</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Millipore</td><td>7110-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina wieprzowa, etykieta biotyny</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T333P</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina wieprzowa, cytoszkielet fluorowy HiLyte 647</td>, <td>Inc.</td><td>TL670M</td><td>daleko oznaczona na czerwono</td></tr><tr><td>tubulina wieprzowa,</td><td>cytoszkielet rodaminowy, Inc.</td><td>TL590M</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina wieprzowa, cytoszkielet białka tubuliny</td><td>, Inc.</td><td>T240</td><td></td></tr><tr><td>Octan potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>Prime 95B Kamera sCMOS</td><td>Fotometryczna</td><td>głowica czujnika detektora kwadrantowego Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThorLabs</td><td>PDQ80A</td><td></td></tr><tr><td>Quikchange Lightning Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Kwadratowe okulary ochronne</td><td>Corning</td><td>12-553-450</td><td>18 mm x 18 mm, o grubości 0,13-0,17 mm</td></tr><tr><td>Streptawidin Microspheres</td><td>Polysciences Inc.</td><td>24162-1</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Superose-6</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0915--96</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100 Wirnik o stałym kącie</td> nachylenia <td>Beckman Coulter</td><td>343840</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa (Sonicator)</td><td>Vevor</td><td>JPS-08A(DD)</td><td>304 stal nierdzewna, częstotliwość 40 kHz, moc 60 W</td></tr><tr><td>Rozwiązanie Vectabond APTES</td><td>Wektor Laboratories</td><td>SP-1800-7</td><td></td></tr><tr><td>Windex Zasilany płyn do mycia szyb z amoniakiem-D</td><td>S.C. Johnson</td><td>SJN695237</td><td></td></tr></tbody></table>

bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles

Sieci mikrotubul są wykorzystywane w komórkach do wykonywania szerokiego zakresu zadań, począwszy od działania jako ścieżki transportu pęcherzyków, a skończywszy na pracy jako wyspecjalizowane układy podczas mitozy w celu regulacji segregacji chromosomów. Białka, które oddziałują z mikrotubulami, obejmują silniki, takie jak kinezyny i dyneina, które mogą generować aktywne siły i ruch kierunkowy, a także białka niemotoryczne, które sieciują włókna w sieci wyższego rzędu lub regulują dynamikę włókien. Do tej pory badania biofizyczne białek związanych z mikrotubulami w przeważającej mierze koncentrowały się na roli pojedynczych białek motorycznych potrzebnych do transportu pęcherzyków i poczyniono znaczne postępy w wyjaśnianiu właściwości generujących siły i mechanochemicznej regulacji kinezyn i dynein. Jednak w przypadku procesów, w których mikrotubule działają zarówno jako ładunek, jak i tor, na przykład podczas przesuwania się filamentu w wrzecionie mitotycznym, znacznie mniej wiadomo na temat biofizycznej regulacji zespołów zaangażowanych w sieciowanie białek. W tym miejscu szczegółowo opisujemy naszą metodologię bezpośredniego sondowania generowania siły i odpowiedzi w usieciowanych sieciach minimalnych mikrotubul odtworzonych z oczyszczonych mikrotubul i białek mitotycznych. Pary mikrotubul są sieciowane przez białka będące przedmiotem zainteresowania, jedna mikrotubula jest unieruchomiona na szkiełku nakrywkowym mikroskopu, a druga mikrotubula jest manipulowana przez pułapkę optyczną. Jednoczesna mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem pozwala na wielokanałową wizualizację wszystkich elementów tej sieci mikrotubul, gdy włókna rozsuwają się w celu wytworzenia siły. Pokazujemy również, w jaki sposób techniki te można wykorzystać do badania sił pchających wywieranych przez zespoły kinezyny-5 oraz jak powstają siły hamowania lepkiego między przesuwającymi się parami mikrotubul usieciowanych przez mitotyczny MAP PRC1. Testy te dostarczają informacji na temat mechanizmów montażu i funkcji wrzeciona i mogą być szerzej przystosowane do badania mechaniki gęstej sieci mikrotubul w różnych kontekstach, takich jak aksony i dendryty neuronów oraz polarne komórki nabłonkowe.

Przygotowanie pęczków mikrotubul odpowiednich do analizy biofizycznej uznaje się za udane, jeśli spełnione zostaną kilka kluczowych kryteriów. Po pierwsze, obrazowanie w trzech kolorach powinno ujawnić dwa wyrównane mikrotubule z koncentracją białka sieciującego preferencyjnie zdobiącego region nakładania (Rysunek 5B,C oraz Rysunek 6B). Idealnie, odległość między krawędzią nakładania a wolnym końcem mikrotubuli znakowanej rodamy...

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Microtubule networks are employed in cells to accomplish a wide range of tasks, ranging from acting as tracks for vesicle transport to working as ...

Nasz protokół pozwala naukowcom budować motywy cytoszkieletu z oczyszczonych składników i bezpośrednio mierzyć siły generowane przez te sieci, aby zrozumieć, jak te mechaniczne składniki komórki funkcjonują zarówno w stanie zdrowym, jak i chorobowym. Ta metoda pozwala nam określić ilościowo siły i bezpośrednio skorelować te liczby, aby zachować parametry zaangażowanych białek, w tym stężenie i gęstość białka. Parametry, które są na ogół niemożliwe do uzyskania w komórce.Ta metoda może zapewnić wgląd w każdy rodzaj sieci cytoszkieletu, taki jak te zaangażowane w mitozę lub rozwój neuronalny. Można go łatwo dostosować do badania sieci zaangażowanych w skurcz mięśni lub migrację komórek, po prostu wymieniając te konkretne białka, które są używane. Najtrudniejszym aspektem tej metody jest koordynacja różnych technologii, w tym pułapki optycznej z pojedynczą wiązką i mikroskopu TIRF.Ponadto eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami wymagają starannego przygotowania powierzchni, takich jak szkiełko nakrywkowe, dlatego przygotowanie wysokiej jakości próbek ma kluczowe znaczenie. Zacznij od zbudowania komory wilgotnościowej, umieszczając złożoną, niestrzępiącą się chusteczkę zwilżoną ultraczystą wodą na dnie pustego pudełka z końcówkami do pipet. Wprowadzić wszystkie odczynniki, pipetując płyn na jednym końcu kanału i odprowadzając płyn na drugi koniec.Używając końcówki do pipety o kącie 20 mikrolitrów, powoli przelej 10 mikrolitrów po 0,5 miligrama na mililitr streptawidyny lub NeutrAvidin. Inkubować szkiełko w komorze wilgotnościowej przez 4 minuty z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w dół. Przepłucz komorę za pomocą 20 mikrolitrów 1x BRB80 za pomocą niestrzępiącej się chusteczki do wyciągnięcia płynów.Po powtórzeniu przepływających odczynników i kolejnej inkubacji, przepłukać etap 10 mikrolitrami 0,5 miligrama na mililitr roztworu blokującego kazeinę. Wlej 10 mikrolitrów rozcieńczonych biotynylowanych mikrotubul dalekiej czerwieni do komory, a następnie przepłucz komorę 20 mikrolitrami 1x BRB80. Po przepuszczeniu odczynnika i inkubacji, jak pokazano wcześniej, przepłukać etap 10 mikrolitrami odpowiedniego stężenia białka niemotorycznego, które ma być badane, a następnie wprowadzić 10 mikrolitrów mikrotubul rodaminy i powtórzyć inkubację i płukanie.Następnie połącz 1 mikrolitr kulek pokrytych kinezyną rigor i 19 mikrolitrów buforu reakcyjnego. Uszczelnij obie krawędzie komory przezroczystym lakierem do paznokci i poczekaj, aż lakier wyschnie. Zastosuj instrument z odwróconym mikroskopem, który ma całkowite możliwości obrazowania fluorescencji wewnętrznego odbicia i w którym skonstruowano pułapkę optyczną z pojedynczą wiązką.Dodaj 1 kroplę olejku immersyjnego na szkiełko nakrywkowe komory próbki. Trzymając szkiełko nakrywkowe komory próbki skierowaną w dół, umieść próbkę, która ma być zobrazowana, na platformie mikroskopu. Powoli podnieś obiektyw do góry, tak aby zarówno szkiełko nakrywkowe, jak i obiektyw stykały się z olejem.Wyreguluj wysokość obiektywu tak, aby powierzchnia szkiełka nakrywkowego w komorze próbki była ostra. Rejestruj jednoklatkowe obrazy próbek we wszystkich trzech kanałach. W przypadku eksperymentów użyj od 100 do 200 milisekund ekspozycji.Dostosuj moc lasera, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu z próbek, jednocześnie minimalizując wybielanie fotograficzne w ciągu 2 do 5 minut, gdy badany jest pojedynczy pakiet. Częstość wiązek mikrotubul na pole widzenia powinna wynosić około trzech do czterech wiązek mikrotubul na 100 mikrolitrów na 100 mikrolitrów pola widzenia na komorę. Obserwuj gęstość kulek w próbce za pomocą jasnego pola i obiektywu 100x na mikroskopie.Zastosuj koncentrację kulek w taki sposób, aby kulki znajdowały się średnio w odległości co najmniej 10 mikrometrów od siebie i upewnij się, że są wolne od wszelkiego rodzaju ograniczeń lub skupisk na powierzchni. Upewnij się, że biotynylowane dalekie czerwone mikrotubule są mocno przymocowane do powierzchni szkiełka nakrywkowego i że rodamina nie wykazuje widocznych ruchów Browna. Upewnij się, że mikrotubule rodaminy są przyłączone do biotynylowanych mikrotubul za pomocą mapy sieciowania i widocznie ulegają wahaniom na swoich wolnych końcach.Zidentyfikuj odpowiedni pakiet mikrotubul, który zawiera tylko dwie mikrotubule, jedną biotynylowaną z przyczepieniem na całej powierzchni i jedną niebiotynylowaną mikrotubulę, która jest częściowo wolna w roztworze i jest wyrównana na osi x lub y. Użyj pułapki optycznej, aby uchwycić swobodny koralik demonstrujący ruch Browna. Po uwięzieniu koralika ostrożnie przenieś koralik do wybranej wiązki mikrotubul, upewniając się, że żadne inne kulki nie zostaną wciągnięte do pułapki.Upewnij się, że kulka znajduje się w odległości kilku mikronów od obszaru nakładania się zawierającego białka sieciujące. Ostrożnie opuść koralik w osi z, aż zetknie się z krawędzią wolnego segmentu mikrotubuli rodaminy. Delikatnie pociągnij do góry i przesuń prostopadle do osi mikrotubul, aby sprawdzić przyczepienie, obserwując zginanie mikrotubuli rodaminy i podążając za pozycją ściegu.Ostrożnie wyrównaj mikrotubulę rodaminy wzdłuż osi mikrotubuli mikrotubuli przymocowanej powierzchniowo, przesuwając stopień nanopozycjonowania i ustaw parametry automatycznego ciągnięcia wiązki mikrotubul. Ustaw kierunek wzdłuż równoległej osi mikrotubul. Ustaw żądaną prędkość ciągnięcia i żądany czas ciągnięcia w zależności od długości zakładki.Rozpocznij rejestrowanie danych fluorescencyjnych w trzech kanałach z szybkością od 1 do 2 klatek na sekundę. Użyj zoptymalizowanych mocy lasera i czasów naświetlania. Inicjuj zautomatyzowany ruch stolika i rejestruj dane pułapkowania ze stopnia detektora czułego na położenie i stopnia kamery fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym.Wyłącz pułapki, aby uwolnić koralik i powtórz eksperyment zgodnie z potrzebami. Zespoły niezbędnego mitotycznego białka motorycznego kinezyny-5 mogą regulować przesuwanie się mikrotubul, generując zarówno siły pchające, jak i hamujące, które skalują się liniowo wraz z długością nakładania się. Stwierdzono, że domena ogona C-końcowego jest wymagana do wydajnego sieciowania i generowania siły.Białko o pełnej długości jest w stanie generować trwałe siły, które stabilizują się, gdy wszystkie białka motoryczne osiągną swoją indywidualną siłę zatrzymania. Jednak silnik kinezyny-5 pozbawiony ogona C-końcowego generuje maksymalne siły, które są prawie pięciokrotnie mniejsze. Zespoły niemotorycznego białka mitotycznego PRC1 działają jak mechaniczna kapsuła na deskę rozdzielczą, aby zapobiec przesuwaniu się mikrotubul w strefie środkowej wrzeciona anafazowego.Siły oporu nie zależą od długości nakładających się na siebie regionów między parami mikrotubul ani od lokalnej gęstości sieciowania, ale silnie zależą od całkowitego stężenia zaangażowanych cząsteczek PRC1. Metodę tę można dostosować do badania różnych systemów biologicznych, takich jak organizacja mikrobiologiczna i neurony, przy użyciu alternatywnych białek. Można go również łatwo rozszerzyć o analizę geometrii sieci opartej na aktynie w celu zbadania skurczu mięśni lub ruchliwości komórek.Technika ta pozwala badać unikalną geometrię całkowitej komórki, w której włókna są zarówno torem, jak i ładunkiem i są zorganizowane przez małe zespoły białek. Te geometrie lepiej naśladują to, co dzieje się w komórkach podczas wielu procesów biologicznych.

directly-measuring-forces-within-reconstituted-active-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule opisujemy zastosowanie pęset magnetycznych do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób wysoce równoległy.

Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Mikrotubule są z natury niestabilnymi polimerami, a ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące segmentowane mikrotubule z fotoablakowalnymi czapeczkami stabilizującymi. Depolimeryzacja segmentowanych mikrotubul może być wyzwalana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób analizę ruchów z demontującymi końcami mikrotubul.

Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Aby się rozwijać, stożki wzrostu muszą wywierać siłę napędową na środowisko zewnętrzne. Wytwarzanie sił uciągu zależy od dynamiki aktyny i sprzężenia sprzęgła. W niniejszej pracy opisano metody analizy dynamiki aktyny, sprzęgu sprzęgła i sił trakcyjnych dla wyprzedzenia stożka wzrostu.

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Przedstawiono i omówiono tworzenie wiązek aktomiozyny in vitro oraz pomiar siły generowania zespołu miozyny za pomocą pęsety optycznej.

Sondowanie mechaniki zespołu miozyny w wiązkach filamentów aktynowych za pomocą pęsety optycznej

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Ten artykuł przedstawia protokoły do inżynierii i charakteryzowania przestrajalnych trójwymiarowych sieci kompozytowych współsplątanych filamentów aktynowych i mikrotubul. Kompozyty przechodzą aktywną restrukturyzację i ruch balistyczny, napędzany silnikami miozyny II i kinezyny, a także są dostrojone przez względne stężenia aktyny, mikrotubul, białek motorycznych i pasywnych środków sieciujących.

Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

Poznaj metodę pomiaru sił w odtworzonych wiązkach mikrotubul przy użyciu pułapki optycznej i mikroskopii TIRF. Technika ta umożliwia badanie mechaniki cytoszkieletu na poziomie nanometrycznym.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Przeglądaj więcej filmów