Izolacja i kwantyfikacja neurotoksyny botulinowej ze złożonych matryc za pomocą testów matrycowych BoTest

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie aktywności proteolitycznej neurotoksyny botulinowej w złożonych matrycach, takich jak próbki farmaceutyczne, środowiskowe i spożywcze. Osiąga się to poprzez pierwsze przetworzenie, test i w razie potrzeby próbki krzywej wzorcowej, aby ustalić odpowiednie warunki pH i lepkości. Następnie neurotoksyna botulinowa jest wytrącana immunologicznie z próbek za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami.

Następnie kulki magnetyczne są dokładnie myte w celu usunięcia wszelkich związków zakłócających i ponownie zawieszane w zoptymalizowanym buforze reakcyjnym. Na koniec umyte kulki są inkubowane z reporterem białkowym i spektroskopowo mierzą rozszczepienie reportera w czasie. Ostatecznie porównanie rozszczepienia reporterowego w próbkach testowych z próbkami o krzywej standardowej wykorzystuje się do ilościowego określenia aktywności toksyny botulinowej w próbkach badanych z czułością testu biologicznego u myszy do myszy zbliżonej do myszy.

Główne zalety tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak mysie, testy biologiczne, immunologiczne i inne metody fluorescencyjne, polegają na tym, że test ten nie wymaga użycia zwierząt i wykazano, że jest stosowany w wysoce złożonych matrycach znajdujących się w próbkach żywności, środowiskowych i farmaceutycznych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, mogą mieć problemy, ponieważ wymagane jest staranne przetwarzanie i rozcieńczanie próbki. Tę procedurę zademonstruje dr Mark Dunning, naukowiec z Bio Sentinel.

Przygotuj zgodnie z protokołem tekstowym, aby wygenerować krzywą wzorcową do ilościowego oznaczania próbek testowych, odważ 10 plus minus 0,01 grama stałej próbki żywności do 50-mililitrowej stożkowej probówki i odłóż tę próbkę na bok, która zostanie użyta jako rozcieńczalnik w drugiej probówce, odważ dwa plus minus 0,01 grama próbki żywności stałej. Dodać neurotoksynę botulinową lub zakupioną na powierzchnię dwugramowej próbki żywności do końcowego stężenia 30 000 MLD 50 na gram żywności. Inkubuj próbki rozcieńczalnika i wzbogacone w temperaturze pokojowej lub czterech stopniach Celsjusza przez dwie godziny, aby dać botowi czas na interakcję z matrycą żywności.

Naśladując naturalne zanieczyszczenie, zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby uzyskać dodatkowe typy próbek. Następnie dodaj jeden mililitr GPB na gram żywności do próbek z dodatkiem i uns i użyj tłuczka do homogenizacji, aż dokładnie się zmiksują. Ekstrapolować całkowitą objętość dwugramowej próbki z dodatkiem wzbogaconej próbki z przybliżonej całkowitej objętości 10-gramowej próbki rozcieńczalnika.

Następnie dodaj jedną dziesiątą objętość 10 x buforu neutralizacyjnego do 10 gramowej próbki rozcieńczalnika, a dwa gramy kupiłeś próbkę wzbogaconą na podstawie ich całkowitych objętości. Dobrze wymieszane próbki przez inwersję, częściowo sklarować obie próbki przez wirowanie przez 10 minut w temperaturze 6 000 razy większej niż grawitacja i w czterech stopniach Celsjusza. Następnie natychmiast usuń supernatanty i przenieś do nowych probówek za pomocą bota, próbkę wzbogaconą jako D, a próbkę bez wzbogacenia jako rozcieńczalnik wygeneruj pozostałe próbki krzywej wzorcowej w 1,5-mililitrowych mikroprobówkach wirówek.

Aby przygotować próbki żywności stałej, zacznij od odważenia dwóch plus minus 0,01 grama nieznanej próbki stałej do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj dwa mililitry GPB i użyj tłuczka do homogenizacji próbki. Następnie dodać jedną dziesiątą objętości 10 x buforu neutralizacyjnego do próbki i dobrze wymieszać przez odwrócenie po częściowym oczyszczeniu próbki przez wirowanie przez 10 minut przy 6 000 razy większej grawitacji i czterech stopniach Celsjusza natychmiast przenieść co najmniej 750 mikrolitrów supernatantu do mikroprobówki wirówkowej.

Jest to nieznane rozcieńczenie pierwsze. Dodać 675 mikrolitrów rozcieńczalnika do dwóch probówek oznaczonych jako nieznane rozcieńczenie drugie i trzy. Rozcieńczalnik będzie tym samym przetworzonym materiałem, który jest używany do generowania krzywej standardowej.

Użyj rozcieńczenia pierwszego, aby uzyskać rozcieńczenie seryjne, przenosząc 75 mikrolitrów rozcieńczenia pierwszego do probówki z rozcieńczalnikiem drugim i mieszając. Następnie przenieść 75 mikrolitrów rozcieńczenia dwa do probówki z rozcieńczeniem trzecim i wymieszać. Aby sklarować próbki, należy je odwirować przez pięć minut co najmniej 14 000 razy. Grawitacja.

Natychmiast usunąć supernatanty i przenieść do nowych probówek, aby ustawić płytkę na próbki, dodać 20 mikrolitrów 10 x buforu wiążącego do każdej studzienki, każdą nieznaną próbkę, a standardowe zakrzywione próbki od D od jednego do D osiem wymagają trzech dołków, a próbka D dziewięć wymaga sześciu dołków. Dodaj 200 mikrolitrów każdej próbki do odpowiednich dołków i użyj mieszalnika do mikropłytek, aby mieszać płytkę przez 10 sekund. Wiruj kulki IPA przez 10 sekund z najwyższą prędkością lub do całkowitego zawieszenia.

Następnie odpipetować 20 mikrolitrów kulek do każdej studzienki próbki i mieszać płytkę przez 30 sekund. Inkubować płytkę w inkubatorze z obrotową płytką przez dwie godziny przy prędkości 750 obr./min i temperaturze 25 stopni Celsjusza lub temperaturze pokojowej, aby umyć płytkę za pomocą automatycznej myjki do płytek. Po uruchomieniu programu prime umieść płytkę na 96-dołkowej magnetycznej płytce rozdzielającej kulki na podkładce do płytek.

Następnie uruchom główny program prania. Po zakończeniu programu wyjmij płytkę z podkładki. Dodać 50 mikrolitrów jednego buforu reakcyjnego x do każdej studzienki próbki i mieszać przez 30 sekund.

Aby zainicjować test matrycowy testu bot, dodaj 50 mikrolitrów 0,5 mikromolowego reportera AE. Do każdej studzienki próbki, aby zapobiec efektom krawędzi, dodaj 100 mikrolitrów wody do każdego niewykorzystanego. Cóż, użyj taśmy sufitowej, aby uszczelnić płytę, osłoń ją przed światłem i inkubuj w temperaturze 750 obr./min i 25 stopni Celsjusza lub temperaturze pokojowej.

Przy każdym odczycie należy wyjąć płytkę z inkubatora. Usuń taśmę sufitową i natychmiast umieść płytkę Na 96-dołkowej magnetycznej płycie rozdzielającej koraliki pozwól koralikom oddzielić się przez dwie minuty. Umieścić płytkę w czytniku mikropłytek i zmierzyć emisje na około 470 i około 526 nanometrach pod wzbudzeniem na około 434 nanometrach.

Jeśli wymagane są dodatkowe czasy odczytu, po ponownym zawieszeniu kulek na 30 sekund na mieszalniku do mikropłytek, ponownie zamknij płytkę i włóż ją z powrotem do inkubatora. Pokazano tutaj wyniki testów przy użyciu bota, holo toiny wzbogaconej o PBS i przetestowanej po dwóch, czterech i 24 godzinach inkubacji z reporterem AE. Rozszczepienie reportera przez bota jest mierzone jako zmniejszenie współczynnika emisji mierzonego przez nasz czytnik płytek jako około 2,7 dla nienaruszonego reportera do około 0,7 dla w pełni rozszczepionego reportera.

Konkretne wartości będą różne między czytnikami płytek, co widać po przesunięciu krzywej w lewo, wydłużony czas inkubacji z reporterem powoduje zwiększone rozszczepienie reportera. Punkty danych badane w trzech egzemplarzach wykazują niskie odchylenie standardowe średniej i podążają za oczekiwanym trendem wzrostu współczynnika emisji przy zmniejszonym ładunku toksyn. Nieprzestrzeganie przez test tej oczekiwanej tendencji może wskazywać na błąd podczas wytwarzania rozcieńczenia lub dane wykreślające stosunki emisji z prób kontrolnych niezawierających bota A również pozostają stałe podczas inkubacji, co wskazuje na brak niespecyficznej aktywności proteazy.

Rysunek ten przedstawia ogólną metodologię zastosowaną do wykrywania lub ilościowego oznaczania dowolnej nieznanej próbki w stosunku do krzywej standardowej i określa ilościowo próbki farmaceutycznych botów A. Krzywa standardowa została wygenerowana w PBS z oczyszczonym botem, holo toiną i przetwarzana równolegle z rozcieńczeniami produktu leczniczego wygenerowanego z pojedynczej fiolki 100 jednostek liofilizowanego botoksu uwodnionego w 0,9% soli fizjologicznej w tym teście, liniowa część krzywej standardowej mieści się w przedziale od 2,11 do 1,05 i jest oznaczona przerywanym polem na rysunku. Stężenia trzech niewiadomych, które mieszczą się w tym zakresie liniowym, zostały następnie interpolowane z krzywej standardowej.

W tym eksperymencie świeże pomidory i 2% mleko zostały użyte jako stałe i płynne matryce pokarmowe i wzbogacone botem, kompleksem składającym się z rdzenia białka związanego z hollo, toiną i neurotoksyną. Ta kombinacja została wybrana, ponieważ przypomina toksynę wytwarzaną podczas naturalnego zanieczyszczenia Clostridium, jak pokazano tutaj. Odzyskiwanie bota A obserwuje się w przypadku obu macierzy.

Ponadto wydłużony czas inkubacji z reporterem zwiększa czułość testu, ale nie powoduje zmniejszenia współczynników emisji dla kontroli bez toksyny, co wskazuje na obserwowane rozszczepienie wynika z botu A, a nie z nieswoistej proteazy przeniesionej z żywności w teście. W tej tabeli podsumowano boty A-L-O-D-L-O-Q i EC 50 dla obu produktów spożywczych w każdym pokazanym punkcie czasowym. LOD i LOQ definiuje się jako próbkę o najniższym stężeniu, której współczynnik emisji jest niższy niż, odpowiednio, trzy i 10 odchyleń standardowych poniżej tła.

Oczekuje się pewnej zmienności między matrycami w zakresie LOD i LOQ, ponieważ efekty matrycy mogą wpływać na wiązanie toksyny z kulkami i odzyskiwanie kulek podczas mycia. Chociaż z danych wynika, że z mleka 2% było więcej odzysku toksyn niż z pomidorów, duża część tej różnicy wynika z dodatkowego rozcieńczenia wymaganego do homogenizacji próbek pomidorów w GPB. Oprócz tego, że pomidory są stałą matrycą pokarmową, są godnym uwagi typem próbki, w której dostosowanie pH i siły jonowej ma kluczowe znaczenie dla powodzenia testu.

Rysunek ten ilustruje reakcje testu podczas badania pomidorów z włączeniem 10-krotnego buforu neutralizującego lub bez niego. Niedodanie buforu powoduje słabe odtworzenie bota A z próbek i jest wykazane stałym stosunkiem emisji we wszystkich badanych stężeniach botów A dodanie 10-krotnego buforu neutralizacyjnego, jednak powoduje wrażliwe wykrywanie toksyn, niespecyficzne proteazy mogą być endogenne do próbki żywności lub wprowadzane przy użyciu nieoczyszczonych preparatów bot, takich jak kultura Clostridium, supernatantów i mogą rozszczepić detektor AE, prowadząc do fałszywie dodatnich wyników. Ten przykład pokazuje niespecyficzną aktywność proteazy znalezioną w supernatantach kultury Clostridium bot przy użyciu zmodyfikowanego reportera, który nie jest już rozszczepiany przez bota A. Wysoki poziom rozszczepienia reporterowego wskazuje na kulturę.

Supernatant zawiera znaczną aktywność proteazy, która jest skutecznie negowana przez dodanie inhibitorów proteazy. Po opanowaniu technikę tę można przeprowadzić w ciągu od czterech do 26 godzin, w zależności od rodzaju próbki i obciążenia toksynami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować i określić ilościowo neurotoksynę botulinową ze złożonych próbek za pomocą immunoprecypitacji w systemie reporterowym białka opartym na fluorescencji.

Nie zapominaj, że praca z neurotoksynami botulinowymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy stosować środki ostrożności, takie jak rękawiczki, kody laboratoryjne oraz komory bezpieczeństwa chemicznego i biologicznego.