Izolacja i kwantyfikacja neurotoksyny botulinowej ze złożonych matryc za pomocą testów matrycowych BoTest

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie aktywności proteolitycznej neurotoksyny botulinowej w złożonych matrycach, takich jak próbki farmaceutyczne, środowiskowe i żywnościowe. Cel ten osiąga się poprzez wstępne opracowanie próbek badawczych oraz próbek do krzywej wzorcowej, jeśli jest to konieczne, w celu ustalenia odpowiednich warunków pH i lepkości. Następnie neurotoksyna botulinowa jest immunoprecypitowana z próbek przy użyciu kulek magnetycznych powlekanych przeciwciałami.

Następnie kuleczki magnetyczne są dokładnie przemywane w celu usunięcia wszelkich związków zakłócających, a następnie resuspenderowane w zoptymalizowanym buforze reakcyjnym. Na koniec przemyte kuleczki inkubuje się z białkowym reporterem, a następnie spektroskopowo mierzy stopień rozszczepienia reportera w czasie. Ostatecznie porównanie stopnia rozszczepienia reportera w próbkach testowych z próbkami krzywej wzorcowej służy do ilościowego oznaczenia aktywności toksyny botulinowej w próbkach testowych z czułością zbliżoną do bioanaliz z użyciem myszy.

Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak testy na myszach, bioanalizy, metody immunologiczne i inne metody fluorescencyjne, są brak konieczności wykorzystania zwierząt oraz udowodniona skuteczność w analizie bardzo złożonych matryc występujących w próbkach żywności, środowiskowych i farmaceutycznych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ wymagane jest staranne przygotowanie i rozcieńczenie próbek. Procedurę tę zaprezentuje dr Mark Dunning, naukowiec z Bio Sentinel.

Przygotować bufory zgodnie z protokołem tekstowym w celu wygenerowania krzywej wzorcowej do ilościowego oznaczania próbek testowych, odważyć 10 ± 0,01 g stałej próbki żywności do probówki stożkowej o pojemności 50 ml i odstawić; próbka ta będzie służyć jako rozcieńczalnik. Do drugiej probówki odważyć 2 ± 0,01 g stałej próbki żywności. Na powierzchnię 2-gramowej próbki żywności nanieść neurotoksynę botulinową (BoNT) do końcowego stężenia 30 000 MLD₅₀ na gram żywności. Inkubować rozcieńczalnik oraz próbki wzbogacone w temperaturze pokojowej lub w 4 °C przez dwie godziny, aby umożliwić interakcję BoNT z matrycą żywnościową.

Aby zasymulować naturalne zanieczyszczenie, należy zapoznać się z protokołem tekstowym w celu uzyskania informacji o dodatkowych typach próbek. Następnie należy dodać jeden mililitr GPB na gram żywności do próbek wzbogaconych i niewzbogaconych, a następnie za pomocą tłuczka homogenizować do całkowitego wymieszania. Oblicz całkowitą objętość dwugramowej próbki wzbogaconej na podstawie przybliżonej całkowitej objętości próbki z 10 gramami rozcieńczalnika.

Następnie do próbki rozcieńczalnika o masie 10 g oraz do próbki wzbogaconej o masie 2 g dodaj 1/10 objętości buforu neutralizującego 10x, w zależności od ich całkowitych objętości. Próbki dokładnie wymieszaj poprzez odwracanie, a następnie częściowo sklaruj obie próbki, wirując je przez 10 minut przy 6 000 ×g w temperaturze 4 °C. Natychmiast zlej nadsączniki i przenieś je do nowych probówek, przyjmując próbkę wzbogaconą jako D1, a próbkę niewzbogaconą jako rozcieńczalnik; pozostałe próbki do krzywej wzorcowej przygotuj w probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.

Aby przygotować próbki pokarmów stałych, należy odważyć 2 ± 0,01 g stałej, nieznanej próbki do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Dodać 2 ml GPB i za pomocą tłuczka zhomogenizować próbkę. Następnie do próbki dodać 1/10 objętości 10 x buforu neutralizującego i dokładnie wymieszać przez odwracanie probówki. Po częściowym sklarowaniu próbki poprzez wirowanie przez 10 min przy 6 000 ×g i 4 °C, bezzwłocznie przenieść co najmniej 750 µL supernatantu do probówki do mikrowirówki.

Jest to pierwsze rozcieńczenie nieznanego. Do dwóch probówek oznakowanych jako rozcieńczenie nieznanego dwa i trzy należy dodać 675 µL rozcieńczalnika. Rozcieńczalnik stanowi ten sam przetworzony materiał, który został użyty do wygenerowania krzywej wzorcowej.

Wykorzystaj rozcieńczenie pierwsze do przygotowania rozcieńczeń seryjnych, przenosząc 75 µL rozcieńczenia pierwszego do probówki z rozcieńczeniem drugim i mieszając. Następnie przenieś 75 µL rozcieńczenia drugiego do probówki z rozcieńczeniem trzecim i wymieszaj. Aby sklarować próbki, odwiruj je przez pięć minut przy prędkości co najmniej 14 000 ×g.

Należy natychmiast usunąć nadsączniki i przenieść je do nowych probówek w celu przygotowania płytki dla próbek, a następnie dodać 20 µL 10 x buforu wiążącego do każdej studni; każda nieznana próbka oraz próbki krzywej standardowej od D1 do D8 wymagają trzech studni, natomiast próbka D9 wymaga sześciu studni. Dodać 200 µL każdej próbki do odpowiednich studni i wymieszać płytkę za pomocą mieszalnika do mikropłytek przez 10 sekund. Kulki IPA należy wstrząsnąć w vortexie przez 10 sekund z maksymalną prędkością lub do całkowitego resuspnowania.

Następnie pipetujemy 20 µL kulek do każdej studzienki z próbką i mieszamy płytkę przez 30 sekund. Płytkę inkubuje się w obrotowym inkubatorze do płytek przez dwie godziny przy 750 RPM i 25 °C lub w temperaturze pokojowej, a następnie płucze przy użyciu automatycznego myjnika do płytek. Po uruchomieniu programu przygotowawczego (prime) należy umieścić płytkę na 96-dołkowej płycie do separacji magnetycznej w myjniku do płytek.

Następnie uruchom główny program płukania. Po zakończeniu programu wyjmij płytkę z myjki. Do każdej studzienki z próbką dodaj 50 µL buforu reakcyjnego 1x i mieszaj przez 30 sekund.

Aby rozpocząć test matrycy bot, należy dodać 50 µL reportera AE o stężeniu 0,5 µM do każdego dołka z próbką. Aby zapobiec efektom brzegowym, do każdego niewykorzystanego dołka należy dodać 100 µL wody. Płytkę należy uszczelnić taśmą uszczelniającą, zabezpieczyć przed światłem i inkubować przy 750 RPM w temperaturze 25 °C lub w temperaturze pokojowej.

Przy każdym pomiarze wyjmij płytkę z inkubatora. Usuń taśmę zabezpieczającą górną część płytki i natychmiast umieść ją na płytce do separacji magnetycznej dla 96 dołków; pozostaw kuleczki do separacji na dwie minuty. Umieść płytkę w czytniku mikropłytek i zmierz emisje przy około 470 i około 526 nanometrach przy wzbudzeniu o długości około 434 nanometrów.

Jeśli pożądane są dodatkowe czasy odczytu, po ponownym zawieszeniu kulek przez 30 sekund na mieszalniku do mikropłytek, należy ponownie zamknąć płytkę i umieścić ją w inkubatorze. Przedstawione tutaj wyniki testu dotyczą bot holo toxin dodanej do PBS i przetestowanej po inkubacji z reporterem AE przez dwie, cztery i 24 godziny. Rozszczepienie reportera przez bot mierzone jest jako spadek stosunku emisji odczytywanego przez czytnik płytek, od około 2,7 dla reportera nienaruszonego do około 0,7 dla reportera całkowicie rozszczepionego.

Konkretne wartości będą się różnić w zależności od czytnika płytek, co widać po przesunięciu krzywej w lewo; przedłużony czas inkubacji z reporterem skutkuje zwiększonym rozszczepieniem reportera. Punkty danych testowane w trzech powtórzeniach wykazują niskie odchylenie standardowe średniej i podążają za oczekiwanym trendem zwiększenia stosunku emisji przy zmniejszonym obciążeniu toksyną. Brak zgodności testu z tym oczekiwanym trendem może wskazywać na błąd podczas przygotowywania rozcieńczeń lub nanoszenia danych; stosunki emisji w kontrolach nie zawierających bot A pozostają również stabilne podczas inkubacji, co wskazuje na brak nieswoistej aktywności proteazy.

Rysunek ten przedstawia ogólną metodologię stosowaną do wykrywania lub ilościowego oznaczania dowolnej nieznanej próbki względem krzywej wzorcowej oraz analizę ilościową próbek farmaceutycznych bot a. Krzywa wzorcowa została wygenerowana w PBS z oczyszczonym bot, a holo toin i opracowana równolegle z rozcieńczeniami produktu leczniczego przygotowanymi z jednej fiolki 100 jednostek liofilizowanego Botoxu rehydratyzowanego w 0,9% soli fizjologicznej; w tym teście liniowa część krzywej wzorcowej mieści się w zakresie stosunku emisji od 2,11 do 1,05 i jest zaznaczona na rysunku przerywaną ramką. Następnie z krzywej wzorcowej interpolowano stężenia trzech nieznanych próbek, które mieściły się w tym zakresie liniowym.

W tym eksperymencie świeże pomidory oraz 2% mleko zostały wykorzystane jako stała i ciekła macierz żywnościowa, do których wprowadzono bot A, stanowiący kompleks białek rdzenia, hemaglutynin oraz neurotoksyny. Kombinacja ta została wybrana, ponieważ przypomina toksynę powstającą podczas naturalnego skażenia Clostridium, co pokazano tutaj. Odzysk bot A zaobserwowano w obu macierzach.

Ponadto wydłużenie czasu inkubacji z reporterem zwiększa czułość analizy, ale nie prowadzi do obniżenia stosunków emisji dla kontroli bez toksyny, co wskazuje, że obserwowane cięcie wynika z obecności bot A, a nie z przeniesienia niespecyficznych proteaz z żywności do analizy. W poniższej tabeli podsumowano wartości bot A-L-O-D-L-O-Q oraz EC 50 dla obu produktów żywnościowych w każdym z przedstawionych punktów czasowych. LOD i LOQ zdefiniowano odpowiednio jako najniższe stężenie próbki ze stosunkiem emisji niższym niż trzy oraz o 10 odchyleń standardowych poniżej tła.

Przewiduje się pewną zmienność LOD i LOQ w zależności od macierzy, ponieważ efekty macierzy mogą wpływać na wiązanie toksyny z kuleczkami oraz na odzysk kuleczek podczas płukania. Choć z danych wynika, że odzysk toksyny z 2% mleka był wyższy niż z pomidorów, znaczna część tej różnicy wynika z dodatkowego rozcieńczenia wymaganego do homogenizacji próbek pomidorów w GPB. Pomidory, oprócz tego, że są stałą macierzą spożywczą, stanowią istotny typ próbki, w której regulacja pH i siły jonowej jest kluczowa dla powodzenia analizy.

Rysunek ten ilustruje odpowiedzi testu podczas badania pomidorów z dodatkiem lub bez dodatku 10-krotnego buforu neutralizującego. Brak dodania buforu skutkuje niskim odzyskiem bot A z próbek, co objawia się stałym stosunkiem emisji dla wszystkich testowanych stężeń bot A; natomiast dodanie 10-krotnego buforu neutralizującego pozwala na czułą detekcję toksyny. Niespecyficzne proteazy mogą być endogenne dla próbki żywności lub wprowadzone podczas stosowania nieoczyszczonych preparatów bot, takich jak hodowle Clostridium i ich nadsączki, i mogą rozszczepiać reporter AE, prowadząc do wyników fałszywie dodatnich. Przykład ten demonstruje niespecyficzną aktywność proteaz występujących w nadsączkach z hodowli Clostridium bot a przy użyciu zmodyfikowanego reportera, który nie jest już rozszczepiany przez bot A. Wysoki poziom rozszczepienia reportera wskazuje na obecność w hodowli.

Nadpływ zawiera znaczną aktywność proteaz, którą skutecznie niweluje dodanie inhibitorów proteaz. Po opanowaniu tej techniki, całkowity czas analizy może wynosić od czterech do 26 godzin, w zależności od rodzaju próbki i ładunku toksyny. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat izolacji i kwantyfikacji neurotoksyny botulinum z próbek złożonych z wykorzystaniem immunoprecypitacji w fluorescencyjnym systemie reporterowym białek.

Należy pamiętać, że praca z neurotoksynami botulinowymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy stosować środki ostrożności, takie jak rękawice, odzież laboratoryjna oraz komory bezpieczeństwa chemicznego i biologicznego.