Name: Izolacja i kwantyfikacja neurotoksyny botulinowej ze złożonych matryc za pomocą testów matrycowych BoTest (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-03T22:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Poznaj metodę izolacji i kwantyfikacji neurotoksyny botulinowej z złożonych matryc żywnościowych przy użyciu immunoprecypitacji i spektroskopii fluorescencyjnej. Technika zapewnia czułość porównywalną z bioassayem mysim.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować H. Olivaresowi i D. Ruge za cenne dyskusje i rady. Badania te były częściowo wspierane przez przyznanie NSF SBIR (IIP-1127245 dla BioSentinel Inc.) oraz kontrakt Departamentu Obrony (W81XWH-07-2-0045 dla BioSentinel Inc.).

F. M. Dunning, T. M. Piazza, F. Zeytin i W. C. Tucker są pracownikami lub właścicielami firmy BioSentinel Inc. Firma BioSentinel obecnie produkuje i wprowadziła na rynek niektóre z odczynników przedstawionych w niniejszym raporcie.

Protokół ten opisuje procedury ilościowego oznaczania kompleksu BoNT/A, holotoksyny lub supernatantu kultury Clostridium w złożonych matrycach. Protokół jest jednak taki sam w przypadku testowania innych serotypów BoNT (np. BoNT/B, E i F) z ich odpowiednimi testami matrycowymi56,60, chociaż czułość testu będzie się różnić w zależności od serotypów i testów. Protokół ten nie uwzględnia każdego możliwego rodzaju próbki i mogą być wymagane pewne modyfikacje w zależności od konkretnego składu pró...

Neurotoksyny botulinowe (BoNTs) są najbardziej śmiercionośnymi znanymi substancjami, z dożylnymi dawkami śmiertelnymi dla ludzi szacowanymi na 1-3 ng/kg1,2. Istnieje siedem strukturalnie podobnych serotypów BoNT, oznaczonych od A do G, z których każdy składa się z domeny łańcucha ciężkiego odpowiedzialnej za wiązanie, wychwyt i translokację komórek do cytozolu oraz łańcucha lekkiego, który koduje endopeptydazę cynkową3-5. Wyśmienita toksyczność BoNT wynika częściowo z jego specyficznego wiązania i wnikania do neuronów ruchowych w połączeniu nerwowo-mięśniowym6. Po wejściu do neuronu endopeptydaza łańcucha lekkiego specyficznie rozszczepia jedno lub więcej rozpuszczalnych białek receptora białka przyłączającego czynnik wrażliwy na N-etylomaleimid (SNARE) wymaganych do fuzji pęcherzyków, hamując uwalnianie neuroprzekaźników i prowadząc do porażenia wiotkiego7-14. Powszechnie znany jako choroba "zatrucie jadem kiełbasianym", paraliż przepony i mięśni międzyżebrowych przez BoNT ostatecznie prowadzi do niewydolności oddechowej i śmierci, chyba że otrzyma się wczesną diagnozę i leczenie.
Ludzki jad kiełbasiany przenoszony przez żywność jest najczęściej kojarzony z serotypami BoNT A, B, E i F (BoNT/A, BoNT/B, itd.) i zwykle wynika ze spożycia skażonej żywności15,16; chociaż odnotowano kilka przypadków zatrucia jadem kiełbasianym wśród osób zażywających narkotyki dożylnie17,18. W Stanach Zjednoczonych zatrucie jadem kiełbasianym u niemowląt wynikające ze spożycia zarodników Clostridium przez dzieci poniżej pierwszego roku życia jest najczęstszą formą zatrucia jadem kiełbasianymw wieku 19-21 lat. Jednak zarówno w Stanach Zjednoczonych, jak i za granicą odnotowano ogniska BoNT przenoszone przez żywność wynikające z niewłaściwego domowego konserwowania i przetwarzania żywności. W latach 2000-2009 na całym świecie zgłoszono co najmniej 338 przypadków zatrucia jadem kiełbasianym, w tymsześć ofiar śmiertelnych. Zdolność do szybkiego i czułego wykrywania ognisk zatrucia jadem kiełbasianym przenoszonym przez żywność jest kluczowym wskazaniem, które może pomóc we wczesnej diagnozie23,24. Ponadto metody wykrywania, które umożliwiają opłacalne i rutynowe badanie żywności, doprowadzą do poprawy bezpieczeństwa żywnościowego.
Specyficzność neuronalna BoNT i długi biologiczny okres półtrwania również sprawiają, że jest to silny środek terapeutyczny. W Stanach Zjednoczonych leki na bazie BoNT są zatwierdzone przez Agencję ds. Żywności i Leków do leczenia schorzeń kosmetycznych i zaburzeń związanych z nerwowo-mięśniowymi, w tym zmarszczek gładzizny czoła, dystonii szyjnej, migrenowych bólów głowy, pęcherza nadreaktywnego i zeza. Udokumentowane są liczne zastosowania "off-label", w tym leczenie wysokimi dawkami ciężkiej dysfunkcji mięśni25-28. Dokładne określenie ilościowe toksyn ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego dawkowania, ponieważ niedostateczne dawkowanie może prowadzić do nieskutecznego leczenia, podczas gdy przedawkowanie naraża pacjentów na ryzyko potencjalnie szkodliwych skutków ubocznych. Niestety, żaden ustandaryzowany protokół oznaczania siły działania nie jest wspólny dla wszystkich producentów, co powoduje rozbieżności w definicjach jednostek między produktami leczniczymi na bazie BoNT29-31.
Standardowym testem na BoNT jest test biologiczny na myszach, w którym próbki zawierające BoNT są wstrzykiwane dootrzewnowo myszom, a liczba zgonów zarejestrowanych w ciągu 1-7 dniwynosi 16,32,33. Test biologiczny myszy jest bardzo czuły z granicami wykrywalności (LOD) 5-10 pg BoNT/A34; jednak obawy etyczne związane z wykorzystywaniem zwierząt, wysokie koszty szkolenia personelu i utrzymania obiektów dla zwierząt, długi czas testów i brak znormalizowanych protokołów spowodowały wezwania do opracowania znormalizowanych, wolnych od zwierząt metod testowania i kwantyfikacji BoNT35-39. Niedawno opracowano kilka alternatywnych metod kwantyfikacji BoNT, które oferują czułość testu biologicznego myszy lub myszy40-49. Metody te powszechnie wykorzystują fluorescencję, spektrometrię mas lub metody immunologiczne i oferują czas oznaczania znacznie krótszy niż test biologiczny na myszach bez użycia na zwierzętach. Wykazano, że metody spektrometrii mas w połączeniu z technikami immunologicznymi wykrywają i określają ilościowo BoNT zawarty w żywności i innych złożonych próbkach; Jednak wymagania dotyczące szkolenia personelu i specjalistyczny sprzęt ograniczają te testydo 50-55. Większość innych alternatywnych testów nie jest łatwa do zastosowania do złożonych testów próbek lub brakuje im przepustowości wymaganej do rutynowych testów BoNT. Wysoce zmienny charakter lepkości, pH, zawartości soli i składników matrycy próbek żywności stanowi szczególnie trudne wyzwanie przy próbie opracowania metod oznaczania in vitro z czułością odpowiadającą ekstremalnej sile działania BoNT. Co więcej, nawet proste i stosunkowo łagodne systemy buforowe, takie jak te wynikające z ponownego zawieszania produktów leczniczych na bazie BoNT, zawierają sól, albuminy i stabilizatory cukru (tj. substancje pomocnicze), które znacząco wpływają na siłę działania BoNT in vitro 56. Oczyszczanie toksyn jest wymagane do dokładnego badania aktywności wszystkich próbek z wyjątkiem najprostszych56-59.
Testy matrycowe BoTest zostały zaprojektowane do szybkiego, wysokowydajnego i spójnego oznaczania ilościowego BoNT z wysoce złożonych próbek przy użyciu sprzętu powszechnie spotykanego w laboratoriach badawczych56,60. Testy te wykorzystują kulki paramagnetyczne kowalencyjnie połączone z przeciwciałami anty-BoNT specyficznymi dla serotypu do wiązania i sekwestracji BoNT z próbki, a następnie usuwania zakłócających związków matrycy przez mycie. Po przemyciu, związana aktywność proteolityczna BoNT jest następnie oznaczana ilościowo w zoptymalizowanym buforze reakcyjnym przy użyciu reportera zgodnego z badanym serotypem BoNT. Te reportery są białkami fluorogennymi składającymi się z N-końcowego ugrupowania cyjanowego białka fluorescencyjnego (CFP) i C-końcowego ugrupowania pochodnej białka żółtej fluorescencji (Venus) połączonego substratem BoNT, resztami SNAP25 141-206 lub resztami synaptobrevin 33-94 stanowiącymi odpowiednio reportery BoTest A/E lub B/D/F/G45. Rozszczepienie reporterowe przez BoNT jest monitorowane za pomocą rezonansowego transferu energii Förstera (FRET). Gdy reporter jest nienaruszony, wzbudzenie CFP powoduje FRET do Wenus, wygaszając emisję CFP i ekscytującą emisję na Wenus. Rozszczepienie reportera przez BoNT zapobiega FRET, prowadząc do wzrostu emisji CFP i zmniejszenia emisji z Wenus. Aktywność BoNT można następnie zmierzyć ilościowo za pomocą stosunku emisji CFP i Venus. LOD poniżej 3 pg są możliwe w przypadku szerokiej gamy produktów spożywczych przy użyciu wysokowydajnej płytki 96-dołkowejformatu 56. Zwiększoną czułość można uzyskać przy użyciu większych objętości próbek, ponieważ test pozwala na zagęszczenie toksyny na powierzchni kulki.
Testy BoTest Matrix dla BoNT A, B, E i F zostały opracowane i przetestowane na próbkach żywności, farmaceutycznych i środowiskowych56,60. W tym miejscu opisano procedury wykonywania tych testów w celu wykrycia BoNT w próbkach o niskiej złożoności (np. farmaceutycznej, BoNT w buforze) i wysokiej złożoności (np. żywność, środowisko). W niniejszym protokole omówiono konkretne metody przetwarzania dla kilku typów próbek, a typy próbek nieopisane w niniejszym dokumencie można zazwyczaj dostosować przy użyciu kombinacji przedstawionych metod. Protokół został opracowany i przetestowany z BoNT/A, ale można go dostosować do innych serotypów BoNT przy użyciu ich odpowiednich testów, jak pokazano w innym miejscu56,60.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do wykrywania neurotoksyny botulinowej BoTest Matrix A</td><td>Dostępne są również zestawy do wykrywania BioSentinel A1015 dla BoNT/B i F.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych Varioskan</td><td>Flash Thermo Fisher Scientific</td><td>5250040</td><td>Można stosować większość jednostek monochromatorowych lub filtrowych o zdolności wzbudzenia 434 nm i emisji 470 nm i 526 nm.</td></tr><tr><td>96-dołkowa magnetyczna płytka separująca kulki</td><td>V& P Scientific</td><td>VP771H</td><td>Można stosować inne płytki magnetyczne, ale płytka powinna być zaprojektowana tak, aby oddzielać koraliki z boku studni.</td></tr><tr><td>Magnetyczna myjka do talerzy BioTek</td><td></td><td>ELx405 VSRM</td><td>Opcjonalna, wymagana tylko do automatycznego mycia płyt.&nbsp; Można również użyć innych podkładek płytowych kompatybilnych z koralikami magnetycznymi, ale należy je przetestować przed użyciem.</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td>Opcjonalna, wymagana tylko w przypadku próbek wymagających odwirowania.</td></tr><tr><td>Mikser płytowy MixMate</td><td></td><td></td> Wytrząsarka orbitalna Eppendorf 22674200 <td></td></tr><tr><td></td> Używany w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 25 stopni;<td></td><td></td><td> C Jeśli dostępna jest kontrola temperatury</td></tr>, <tr><td>tabletki z inhibitorem proteazy bez EDTA,</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Wymagane tylko do badań żywności lub środowiska. Inhibitory proteazy muszą być wolne od EDTA.</td></tr><tr><td>BoNT/A</td><td>Metabiologics</td><td></td><td>Opcjonalny, wymagany tylko do celów standaryzacji i kwantyfikacji</td></tr><tr><td>Czarne, płaskodenne płytki 96-dołkowe</td><td>NUNC</td><td>237105</td><td>Płytki nie powinny być poddawane obróbce</td></tr><tr><td>Taśma uszczelniająca 96-dołkową płytkę</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i kwantyfikacja neurotoksyny botulinowej ze złożonych matryc za pomocą testów matrycowych botest

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Dokładne wykrywanie i oznaczanie ilościowe neurotoksyny botulinowej (BoNT) w złożonych matrycach jest wymagane do testowania próbek farmaceutycznych, środowiskowych i spożywczych. Szybkie testy BoNT żywności są potrzebne podczas kryminalistyki epidemicznej, diagnozowania pacjentów i testowania bezpieczeństwa żywności, podczas gdy dokładne testy siły działania są wymagane do produkcji produktów leczniczych opartych na BoNT i bezpieczeństwa pacjentów. Szeroko stosowany test biologiczny na myszach do testowania BoNT jest bardzo czuły, ale brakuje mu precyzji i przepustowości potrzebnej do szybkich i rutynowych testów BoNT. Co więcej, wykorzystanie testów biologicznych na zwierzętach spowodowało wezwania ze strony organów regulacyjnych ds. produktów leczniczych i obrońców praw zwierząt w USA i za granicą do zastąpienia testu biologicznego na myszach w testach na BoNT. Opracowano kilka testów zastępczych in vitro, które dobrze współpracują z oczyszczonym BoNT w prostych, ale większość z nich nie ma zastosowania do testowania w wysoce złożonych matrycach. W tym miejscu przedstawiono protokół detekcji BoNT w złożonych matrycach za pomocą testów BoTest Matrix. Test składa się z trzech części: pierwsza część obejmuje przygotowanie próbek do badania, druga część to etap immunoprecypitacji przy użyciu kulek paramagnetycznych pokrytych przeciwciałem anty-BoNT w celu oczyszczenia BoNT z matrycy, a trzecia część określa ilościowo aktywność proteolityczną izolowanego BoNT za pomocą reportera fluorogenicznego. Protokół został napisany z myślą o testach o wysokiej przepustowości na płytkach 96-dołkowych przy użyciu zarówno matryc płynnych, jak i stałych i wymaga około 2 godzin ręcznego przygotowania z całkowitym czasem oznaczania 4-26 godzin w zależności od rodzaju próbki, obciążenia toksyną i pożądanej czułości. Przedstawiono dane do testów BoNT/A z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, produktem leczniczym, supernatantem hodowli, 2% mlekiem i świeżymi pomidorami i obejmują omówienie parametrów krytycznych dla powodzenia testu.

Schemat podsumowujący kroki opisanego protokołu przedstawiono na Rysunku 2. Analiza wymaga od 4 do 26 h w zależności od rodzaju próbki i pożądanej czułości testu, przy czym czas pracy własnej wynosi jedynie ok. 2 h. Analizę przeprowadza się na płytkach 96-dołkowych, co w zależności od rodzaju wykonywanych badań pozwala na analizę trzech powtórzeń dla maksymalnie 20 próbek, wliczając standardy, na jednej płytce.
Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne wyniki test...

Testy wykrywania neurotoksyny botulinowej (BoNT) BoTest Matrix szybko oczyszczają i kwantyfikują BoNT z różnych matryc próbek. Tutaj prezentujemy protokół wykrywania i oznaczania ilościowego BoNT zarówno z matryc stałych, jak i ciekłych oraz demonstrujemy test z BOTOXEM, pomidorami i mlekiem.

Izolacja i kwantyfikacja neurotoksyny botulinowej ze złożonych matryc za pomocą testów matrycowych BoTest

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie aktywności proteolitycznej neurotoksyny botulinowej w złożonych matrycach, takich jak próbki farmaceutyczne, środowiskowe i żywnościowe. Cel ten osiąga się poprzez wstępne opracowanie próbek badawczych oraz próbek do krzywej wzorcowej, jeśli jest to konieczne, w celu ustalenia odpowiednich warunków pH i lepkości. Następnie neurotoksyna botulinowa jest immunoprecypitowana z próbek przy użyciu kulek magnetycznych powlekanych przeciwciałami.Następnie kuleczki magnetyczne są dokładnie przemywane w celu usunięcia wszelkich związków zakłócających, a następnie resuspenderowane w zoptymalizowanym buforze reakcyjnym. Na koniec przemyte kuleczki inkubuje się z białkowym reporterem, a następnie spektroskopowo mierzy stopień rozszczepienia reportera w czasie. Ostatecznie porównanie stopnia rozszczepienia reportera w próbkach testowych z próbkami krzywej wzorcowej służy do ilościowego oznaczenia aktywności toksyny botulinowej w próbkach testowych z czułością zbliżoną do bioanaliz z użyciem myszy.Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak testy na myszach, bioanalizy, metody immunologiczne i inne metody fluorescencyjne, są brak konieczności wykorzystania zwierząt oraz udowodniona skuteczność w analizie bardzo złożonych matryc występujących w próbkach żywności, środowiskowych i farmaceutycznych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ wymagane jest staranne przygotowanie i rozcieńczenie próbek. Procedurę tę zaprezentuje dr Mark Dunning, naukowiec z Bio Sentinel.Przygotować bufory zgodnie z protokołem tekstowym w celu wygenerowania krzywej wzorcowej do ilościowego oznaczania próbek testowych, odważyć 10 ± 0,01 g stałej próbki żywności do probówki stożkowej o pojemności 50 ml i odstawić; próbka ta będzie służyć jako rozcieńczalnik. Do drugiej probówki odważyć 2 ± 0,01 g stałej próbki żywności. Na powierzchnię 2-gramowej próbki żywności nanieść neurotoksynę botulinową (BoNT) do końcowego stężenia 30 000 MLD₅₀ na gram żywności. Inkubować rozcieńczalnik oraz próbki wzbogacone w temperaturze pokojowej lub w 4 °C przez dwie godziny, aby umożliwić interakcję BoNT z matrycą żywnościową.Aby zasymulować naturalne zanieczyszczenie, należy zapoznać się z protokołem tekstowym w celu uzyskania informacji o dodatkowych typach próbek. Następnie należy dodać jeden mililitr GPB na gram żywności do próbek wzbogaconych i niewzbogaconych, a następnie za pomocą tłuczka homogenizować do całkowitego wymieszania. Oblicz całkowitą objętość dwugramowej próbki wzbogaconej na podstawie przybliżonej całkowitej objętości próbki z 10 gramami rozcieńczalnika.Następnie do próbki rozcieńczalnika o masie 10 g oraz do próbki wzbogaconej o masie 2 g dodaj 1/10 objętości buforu neutralizującego 10x, w zależności od ich całkowitych objętości. Próbki dokładnie wymieszaj poprzez odwracanie, a następnie częściowo sklaruj obie próbki, wirując je przez 10 minut przy 6 000 ×g w temperaturze 4 °C. Natychmiast zlej nadsączniki i przenieś je do nowych probówek, przyjmując próbkę wzbogaconą jako D1, a próbkę niewzbogaconą jako rozcieńczalnik; pozostałe próbki do krzywej wzorcowej przygotuj w probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.Aby przygotować próbki pokarmów stałych, należy odważyć 2 ± 0,01 g stałej, nieznanej próbki do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Dodać 2 ml GPB i za pomocą tłuczka zhomogenizować próbkę. Następnie do próbki dodać 1/10 objętości 10 x buforu neutralizującego i dokładnie wymieszać przez odwracanie probówki. Po częściowym sklarowaniu próbki poprzez wirowanie przez 10 min przy 6 000 ×g i 4 °C, bezzwłocznie przenieść co najmniej 750 µL supernatantu do probówki do mikrowirówki.Jest to pierwsze rozcieńczenie nieznanego. Do dwóch probówek oznakowanych jako rozcieńczenie nieznanego dwa i trzy należy dodać 675 µL rozcieńczalnika. Rozcieńczalnik stanowi ten sam przetworzony materiał, który został użyty do wygenerowania krzywej wzorcowej.Wykorzystaj rozcieńczenie pierwsze do przygotowania rozcieńczeń seryjnych, przenosząc 75 µL rozcieńczenia pierwszego do probówki z rozcieńczeniem drugim i mieszając. Następnie przenieś 75 µL rozcieńczenia drugiego do probówki z rozcieńczeniem trzecim i wymieszaj. Aby sklarować próbki, odwiruj je przez pięć minut przy prędkości co najmniej 14 000 ×g.Należy natychmiast usunąć nadsączniki i przenieść je do nowych probówek w celu przygotowania płytki dla próbek, a następnie dodać 20 µL 10 x buforu wiążącego do każdej studni; każda nieznana próbka oraz próbki krzywej standardowej od D1 do D8 wymagają trzech studni, natomiast próbka D9 wymaga sześciu studni. Dodać 200 µL każdej próbki do odpowiednich studni i wymieszać płytkę za pomocą mieszalnika do mikropłytek przez 10 sekund. Kulki IPA należy wstrząsnąć w vortexie przez 10 sekund z maksymalną prędkością lub do całkowitego resuspnowania.Następnie pipetujemy 20 µL kulek do każdej studzienki z próbką i mieszamy płytkę przez 30 sekund. Płytkę inkubuje się w obrotowym inkubatorze do płytek przez dwie godziny przy 750 RPM i 25 °C lub w temperaturze pokojowej, a następnie płucze przy użyciu automatycznego myjnika do płytek. Po uruchomieniu programu przygotowawczego (prime) należy umieścić płytkę na 96-dołkowej płycie do separacji magnetycznej w myjniku do płytek.Następnie uruchom główny program płukania. Po zakończeniu programu wyjmij płytkę z myjki. Do każdej studzienki z próbką dodaj 50 µL buforu reakcyjnego 1x i mieszaj przez 30 sekund.Aby rozpocząć test matrycy bot, należy dodać 50 µL reportera AE o stężeniu 0,5 µM do każdego dołka z próbką. Aby zapobiec efektom brzegowym, do każdego niewykorzystanego dołka należy dodać 100 µL wody. Płytkę należy uszczelnić taśmą uszczelniającą, zabezpieczyć przed światłem i inkubować przy 750 RPM w temperaturze 25 °C lub w temperaturze pokojowej.Przy każdym pomiarze wyjmij płytkę z inkubatora. Usuń taśmę zabezpieczającą górną część płytki i natychmiast umieść ją na płytce do separacji magnetycznej dla 96 dołków; pozostaw kuleczki do separacji na dwie minuty. Umieść płytkę w czytniku mikropłytek i zmierz emisje przy około 470 i około 526 nanometrach przy wzbudzeniu o długości około 434 nanometrów.Jeśli pożądane są dodatkowe czasy odczytu, po ponownym zawieszeniu kulek przez 30 sekund na mieszalniku do mikropłytek, należy ponownie zamknąć płytkę i umieścić ją w inkubatorze. Przedstawione tutaj wyniki testu dotyczą bot holo toxin dodanej do PBS i przetestowanej po inkubacji z reporterem AE przez dwie, cztery i 24 godziny. Rozszczepienie reportera przez bot mierzone jest jako spadek stosunku emisji odczytywanego przez czytnik płytek, od około 2,7 dla reportera nienaruszonego do około 0,7 dla reportera całkowicie rozszczepionego.Konkretne wartości będą się różnić w zależności od czytnika płytek, co widać po przesunięciu krzywej w lewo; przedłużony czas inkubacji z reporterem skutkuje zwiększonym rozszczepieniem reportera. Punkty danych testowane w trzech powtórzeniach wykazują niskie odchylenie standardowe średniej i podążają za oczekiwanym trendem zwiększenia stosunku emisji przy zmniejszonym obciążeniu toksyną. Brak zgodności testu z tym oczekiwanym trendem może wskazywać na błąd podczas przygotowywania rozcieńczeń lub nanoszenia danych; stosunki emisji w kontrolach nie zawierających bot A pozostają również stabilne podczas inkubacji, co wskazuje na brak nieswoistej aktywności proteazy.Rysunek ten przedstawia ogólną metodologię stosowaną do wykrywania lub ilościowego oznaczania dowolnej nieznanej próbki względem krzywej wzorcowej oraz analizę ilościową próbek farmaceutycznych bot a. Krzywa wzorcowa została wygenerowana w PBS z oczyszczonym bot, a holo toin i opracowana równolegle z rozcieńczeniami produktu leczniczego przygotowanymi z jednej fiolki 100 jednostek liofilizowanego Botoxu rehydratyzowanego w 0,9% soli fizjologicznej; w tym teście liniowa część krzywej wzorcowej mieści się w zakresie stosunku emisji od 2,11 do 1,05 i jest zaznaczona na rysunku przerywaną ramką. Następnie z krzywej wzorcowej interpolowano stężenia trzech nieznanych próbek, które mieściły się w tym zakresie liniowym.W tym eksperymencie świeże pomidory oraz 2% mleko zostały wykorzystane jako stała i ciekła macierz żywnościowa, do których wprowadzono bot A, stanowiący kompleks białek rdzenia, hemaglutynin oraz neurotoksyny. Kombinacja ta została wybrana, ponieważ przypomina toksynę powstającą podczas naturalnego skażenia Clostridium, co pokazano tutaj. Odzysk bot A zaobserwowano w obu macierzach.Ponadto wydłużenie czasu inkubacji z reporterem zwiększa czułość analizy, ale nie prowadzi do obniżenia stosunków emisji dla kontroli bez toksyny, co wskazuje, że obserwowane cięcie wynika z obecności bot A, a nie z przeniesienia niespecyficznych proteaz z żywności do analizy. W poniższej tabeli podsumowano wartości bot A-L-O-D-L-O-Q oraz EC 50 dla obu produktów żywnościowych w każdym z przedstawionych punktów czasowych. LOD i LOQ zdefiniowano odpowiednio jako najniższe stężenie próbki ze stosunkiem emisji niższym niż trzy oraz o 10 odchyleń standardowych poniżej tła.Przewiduje się pewną zmienność LOD i LOQ w zależności od macierzy, ponieważ efekty macierzy mogą wpływać na wiązanie toksyny z kuleczkami oraz na odzysk kuleczek podczas płukania. Choć z danych wynika, że odzysk toksyny z 2% mleka był wyższy niż z pomidorów, znaczna część tej różnicy wynika z dodatkowego rozcieńczenia wymaganego do homogenizacji próbek pomidorów w GPB. Pomidory, oprócz tego, że są stałą macierzą spożywczą, stanowią istotny typ próbki, w której regulacja pH i siły jonowej jest kluczowa dla powodzenia analizy.Rysunek ten ilustruje odpowiedzi testu podczas badania pomidorów z dodatkiem lub bez dodatku 10-krotnego buforu neutralizującego. Brak dodania buforu skutkuje niskim odzyskiem bot A z próbek, co objawia się stałym stosunkiem emisji dla wszystkich testowanych stężeń bot A; natomiast dodanie 10-krotnego buforu neutralizującego pozwala na czułą detekcję toksyny. Niespecyficzne proteazy mogą być endogenne dla próbki żywności lub wprowadzone podczas stosowania nieoczyszczonych preparatów bot, takich jak hodowle Clostridium i ich nadsączki, i mogą rozszczepiać reporter AE, prowadząc do wyników fałszywie dodatnich. Przykład ten demonstruje niespecyficzną aktywność proteaz występujących w nadsączkach z hodowli Clostridium bot a przy użyciu zmodyfikowanego reportera, który nie jest już rozszczepiany przez bot A. Wysoki poziom rozszczepienia reportera wskazuje na obecność w hodowli.Nadpływ zawiera znaczną aktywność proteaz, którą skutecznie niweluje dodanie inhibitorów proteaz. Po opanowaniu tej techniki, całkowity czas analizy może wynosić od czterech do 26 godzin, w zależności od rodzaju próbki i ładunku toksyny. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat izolacji i kwantyfikacji neurotoksyny botulinum z próbek złożonych z wykorzystaniem immunoprecypitacji w fluorescencyjnym systemie reporterowym białek.Należy pamiętać, że praca z neurotoksynami botulinowymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy stosować środki ostrożności, takie jak rękawice, odzież laboratoryjna oraz komory bezpieczeństwa chemicznego i biologicznego.

isolation-quantification-botulinum-neurotoxin-from-complex-matrices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolacja i ilościowa ocena toksyny botulinowe z złożonych matryc za pomocą testów matrycowych BoTest

Przedstawiono protokół wykrywania trichotecenów (mykotoksyn stanowiących zagrożenie dla zdrowia ludzi) z wykorzystaniem nowo opracowanej metody przesiewowej, opartej na konkurencyjnej metodzie immunochemicznej oraz końcowej detekcji elektrochemicznej.

Metoda ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) do wykrywania mikotoksyn

W niniejszym raporcie opisujemy, w jaki sposób rezonans plazmonów powierzchniowych jest wykorzystywany do wykrywania przenikania toksyn do cytozolu gospodarza. Ta wysokoczuła metoda pozwala na uzyskanie ilościowych danych dotyczących zawartości toksyn w cytozolu i może być zastosowana w przypadku wielu rodzajów toksyn.

Wykrywanie translokacji toksyny do cytozolu gospodarza przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Ten film demonstruje test immunologiczny oparty na multipleksie do ilościowego oznaczania wielu celów cytokin w próbce. Mieszanina odrębnych mikrosfer sprzężonych z przeciwciałami specyficznymi dla cytokin służy do wiązania cytokin obecnych w próbce. Reporterki znakowane streptawidyną są unieruchamiane na związanych cytokinach za pomocą biotynylowanych przeciwciał wykrywających. Cytometria przepływowa identyfikuje związane cytokiny na podstawie unikalnych rozmiarów i intensywności wewnętrznej...

Multipleksowy test immunologiczny oparty na kulkach do ilościowego określania wielu celów cytokin

Łańcuch lekki neurotoksyny botulinowej typu A (BoNT/A LC) to metaloproteaza, która dostaje się do neuronów ruchowych, rozszczepia ich substrat SNAP-25 i zakłóca neurotransmisję, powodując tym samym porażenie wiotkie. Wykorzystując wysokoprzepustowy test oparty na FRET, duże biblioteki małych cząsteczek mogą być badane pod kątem ich wpływu na aktywność enzymatyczną BoNT/A LC.

Kompatybilna z wysoką przepustowością platforma oparta na FRET do identyfikacji i charakterystyki modulatorów łańcucha lekkiego neurotoksyny botulinowej

Neurotoksyna botulinowa jest jedną z najsilniejszych toksyn wśród czynników zagrożenia biologicznego kategorii A, jednak terapia poekspozycyjna nie jest dostępna. Metoda obrazowania o wysokiej zawartości jest potężną metodologią identyfikacji nowych inhibitorów, ponieważ umożliwia wieloparametrowe badania przesiewowe z wykorzystaniem biologicznie istotnych neuronów ruchowych, które są głównym celem tej toksyny.

Test obrazowania o wysokiej zawartości do identyfikacji inhibitorów neurotoksyny botulinowej

Opisany jest niestandardowy protokół różnicowania komórek ES myszy w zdefiniowane populacje wysoce czystych neuronów wykazujących działające synapsy i emergentne zachowanie sieci. Analiza elektrofizjologiczna wykazała utratę przekaźnictwa synaptycznego po ekspozycji na serotypy neurotoksyny botulinowej /A-/G i neurotoksynę tężcową.

Ocena funkcjonalna neurotoksyn biologicznych w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Ten protokół przedstawia zweryfikowaną metodę chromatografii cieczowej, mobilności jonów i spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości, do określania obecności alkaloidów sporyszu w żywności, zgodnie z niedawno wydanym rozporządzeniem Komisji (UE) 2023/915.

Wykrywanie regulowanych alkaloidów sporyszu w matrycach spożywczych za pomocą chromatografii cieczowej - spektrometria ruchliwości jonów uwięzionych w elektronice - spektrometria mas czasu przelotu

Niniejszy protokół wideo demonstruje metodę testu neurosfer w celu generowania i namnażania neuralnych komórek macierzystych z obszaru okołokomorowego dorosłej myszy oraz dostarcza wskazówek technicznych pozwalających na uzyskanie powtarzalnych kultur neurosfer.

Izolacja i ekspansja dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Eksplanty z układu dopaminergicznego śródmózgowia oraz prążkowia są wykorzystywane w teście z matrycą kolagenową do analizy in vitro rozwoju szlaków mezostriatalnych i striatonigralnych. W tym teście wzrost i prowadzenie aksonów mogą być manipulowane oraz kwantyfikowane. Metodę tę można również zmodyfikować w celu oceny innych obszarów lub sygnałów molekularnych.

Disekcja i hodowla eksplantów dopaminergicznych i prążkowiowych myszy w trójwymiarowych testach w matrycy kolagenowej

Poznaj metodę izolacji i kwantyfikacji neurotoksyny botulinowej z złożonych matryc żywnościowych przy użyciu immunoprecypitacji i spektroskopii fluorescencyjnej. Technika zapewnia czułość porównywalną z bioassayem mysim.

Izolacja i kwantyfikacja neurotoksyny botulinowej ze złożonych matryc za pomocą testów matrycowych BoTest

Przeglądaj więcej filmów