Name: Izolacja i kwantyfikacja neurotoksyny botulinowej ze złożonych matryc za pomocą testów matrycowych BoTest (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-03T22:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Poznaj metodę izolacji i kwantyfikacji neurotoksyny botulinowej z złożonych matryc żywnościowych przy użyciu immunoprecypitacji i spektroskopii fluorescencyjnej. Technika zapewnia czułość porównywalną z bioassayem mysim.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować H. Olivaresowi i D. Ruge za cenne dyskusje i rady. Badania te były częściowo wspierane przez przyznanie NSF SBIR (IIP-1127245 dla BioSentinel Inc.) oraz kontrakt Departamentu Obrony (W81XWH-07-2-0045 dla BioSentinel Inc.).

F. M. Dunning, T. M. Piazza, F. Zeytin i W. C. Tucker są pracownikami lub właścicielami firmy BioSentinel Inc. Firma BioSentinel obecnie produkuje i wprowadziła na rynek niektóre z odczynników przedstawionych w niniejszym raporcie.

Protokół ten opisuje procedury ilościowego oznaczania kompleksu BoNT/A, holotoksyny lub supernatantu kultury Clostridium w złożonych matrycach. Protokół jest jednak taki sam w przypadku testowania innych serotypów BoNT (np. BoNT/B, E i F) z ich odpowiednimi testami matrycowymi56,60, chociaż czułość testu będzie się różnić w zależności od serotypów i testów. Protokół ten nie uwzględnia każdego możliwego rodzaju próbki i mogą być wymagane pewne modyfikacje w zależności od konkretnego składu pró...

Neurotoksyny botulinowe (BoNTs) są najbardziej śmiercionośnymi znanymi substancjami, z dożylnymi dawkami śmiertelnymi dla ludzi szacowanymi na 1-3 ng/kg1,2. Istnieje siedem strukturalnie podobnych serotypów BoNT, oznaczonych od A do G, z których każdy składa się z domeny łańcucha ciężkiego odpowiedzialnej za wiązanie, wychwyt i translokację komórek do cytozolu oraz łańcucha lekkiego, który koduje endopeptydazę cynkową3-5. Wyśmienita toksyczność BoNT wynika częściowo z jego specyficznego wiązania i wnikania do neuronów ruchowych w połączeniu nerwowo-mięśniowym6. Po wejściu do neuronu endopeptydaza łańcucha lekkiego specyficznie rozszczepia jedno lub więcej rozpuszczalnych białek receptora białka przyłączającego czynnik wrażliwy na N-etylomaleimid (SNARE) wymaganych do fuzji pęcherzyków, hamując uwalnianie neuroprzekaźników i prowadząc do porażenia wiotkiego7-14. Powszechnie znany jako choroba "zatrucie jadem kiełbasianym", paraliż przepony i mięśni międzyżebrowych przez BoNT ostatecznie prowadzi do niewydolności oddechowej i śmierci, chyba że otrzyma się wczesną diagnozę i leczenie.
Ludzki jad kiełbasiany przenoszony przez żywność jest najczęściej kojarzony z serotypami BoNT A, B, E i F (BoNT/A, BoNT/B, itd.) i zwykle wynika ze spożycia skażonej żywności15,16; chociaż odnotowano kilka przypadków zatrucia jadem kiełbasianym wśród osób zażywających narkotyki dożylnie17,18. W Stanach Zjednoczonych zatrucie jadem kiełbasianym u niemowląt wynikające ze spożycia zarodników Clostridium przez dzieci poniżej pierwszego roku życia jest najczęstszą formą zatrucia jadem kiełbasianymw wieku 19-21 lat. Jednak zarówno w Stanach Zjednoczonych, jak i za granicą odnotowano ogniska BoNT przenoszone przez żywność wynikające z niewłaściwego domowego konserwowania i przetwarzania żywności. W latach 2000-2009 na całym świecie zgłoszono co najmniej 338 przypadków zatrucia jadem kiełbasianym, w tymsześć ofiar śmiertelnych. Zdolność do szybkiego i czułego wykrywania ognisk zatrucia jadem kiełbasianym przenoszonym przez żywność jest kluczowym wskazaniem, które może pomóc we wczesnej diagnozie23,24. Ponadto metody wykrywania, które umożliwiają opłacalne i rutynowe badanie żywności, doprowadzą do poprawy bezpieczeństwa żywnościowego.
Specyficzność neuronalna BoNT i długi biologiczny okres półtrwania również sprawiają, że jest to silny środek terapeutyczny. W Stanach Zjednoczonych leki na bazie BoNT są zatwierdzone przez Agencję ds. Żywności i Leków do leczenia schorzeń kosmetycznych i zaburzeń związanych z nerwowo-mięśniowymi, w tym zmarszczek gładzizny czoła, dystonii szyjnej, migrenowych bólów głowy, pęcherza nadreaktywnego i zeza. Udokumentowane są liczne zastosowania "off-label", w tym leczenie wysokimi dawkami ciężkiej dysfunkcji mięśni25-28. Dokładne określenie ilościowe toksyn ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego dawkowania, ponieważ niedostateczne dawkowanie może prowadzić do nieskutecznego leczenia, podczas gdy przedawkowanie naraża pacjentów na ryzyko potencjalnie szkodliwych skutków ubocznych. Niestety, żaden ustandaryzowany protokół oznaczania siły działania nie jest wspólny dla wszystkich producentów, co powoduje rozbieżności w definicjach jednostek między produktami leczniczymi na bazie BoNT29-31.
Standardowym testem na BoNT jest test biologiczny na myszach, w którym próbki zawierające BoNT są wstrzykiwane dootrzewnowo myszom, a liczba zgonów zarejestrowanych w ciągu 1-7 dniwynosi 16,32,33. Test biologiczny myszy jest bardzo czuły z granicami wykrywalności (LOD) 5-10 pg BoNT/A34; jednak obawy etyczne związane z wykorzystywaniem zwierząt, wysokie koszty szkolenia personelu i utrzymania obiektów dla zwierząt, długi czas testów i brak znormalizowanych protokołów spowodowały wezwania do opracowania znormalizowanych, wolnych od zwierząt metod testowania i kwantyfikacji BoNT35-39. Niedawno opracowano kilka alternatywnych metod kwantyfikacji BoNT, które oferują czułość testu biologicznego myszy lub myszy40-49. Metody te powszechnie wykorzystują fluorescencję, spektrometrię mas lub metody immunologiczne i oferują czas oznaczania znacznie krótszy niż test biologiczny na myszach bez użycia na zwierzętach. Wykazano, że metody spektrometrii mas w połączeniu z technikami immunologicznymi wykrywają i określają ilościowo BoNT zawarty w żywności i innych złożonych próbkach; Jednak wymagania dotyczące szkolenia personelu i specjalistyczny sprzęt ograniczają te testydo 50-55. Większość innych alternatywnych testów nie jest łatwa do zastosowania do złożonych testów próbek lub brakuje im przepustowości wymaganej do rutynowych testów BoNT. Wysoce zmienny charakter lepkości, pH, zawartości soli i składników matrycy próbek żywności stanowi szczególnie trudne wyzwanie przy próbie opracowania metod oznaczania in vitro z czułością odpowiadającą ekstremalnej sile działania BoNT. Co więcej, nawet proste i stosunkowo łagodne systemy buforowe, takie jak te wynikające z ponownego zawieszania produktów leczniczych na bazie BoNT, zawierają sól, albuminy i stabilizatory cukru (tj. substancje pomocnicze), które znacząco wpływają na siłę działania BoNT in vitro 56. Oczyszczanie toksyn jest wymagane do dokładnego badania aktywności wszystkich próbek z wyjątkiem najprostszych56-59.
Testy matrycowe BoTest zostały zaprojektowane do szybkiego, wysokowydajnego i spójnego oznaczania ilościowego BoNT z wysoce złożonych próbek przy użyciu sprzętu powszechnie spotykanego w laboratoriach badawczych56,60. Testy te wykorzystują kulki paramagnetyczne kowalencyjnie połączone z przeciwciałami anty-BoNT specyficznymi dla serotypu do wiązania i sekwestracji BoNT z próbki, a następnie usuwania zakłócających związków matrycy przez mycie. Po przemyciu, związana aktywność proteolityczna BoNT jest następnie oznaczana ilościowo w zoptymalizowanym buforze reakcyjnym przy użyciu reportera zgodnego z badanym serotypem BoNT. Te reportery są białkami fluorogennymi składającymi się z N-końcowego ugrupowania cyjanowego białka fluorescencyjnego (CFP) i C-końcowego ugrupowania pochodnej białka żółtej fluorescencji (Venus) połączonego substratem BoNT, resztami SNAP25 141-206 lub resztami synaptobrevin 33-94 stanowiącymi odpowiednio reportery BoTest A/E lub B/D/F/G45. Rozszczepienie reporterowe przez BoNT jest monitorowane za pomocą rezonansowego transferu energii Förstera (FRET). Gdy reporter jest nienaruszony, wzbudzenie CFP powoduje FRET do Wenus, wygaszając emisję CFP i ekscytującą emisję na Wenus. Rozszczepienie reportera przez BoNT zapobiega FRET, prowadząc do wzrostu emisji CFP i zmniejszenia emisji z Wenus. Aktywność BoNT można następnie zmierzyć ilościowo za pomocą stosunku emisji CFP i Venus. LOD poniżej 3 pg są możliwe w przypadku szerokiej gamy produktów spożywczych przy użyciu wysokowydajnej płytki 96-dołkowejformatu 56. Zwiększoną czułość można uzyskać przy użyciu większych objętości próbek, ponieważ test pozwala na zagęszczenie toksyny na powierzchni kulki.
Testy BoTest Matrix dla BoNT A, B, E i F zostały opracowane i przetestowane na próbkach żywności, farmaceutycznych i środowiskowych56,60. W tym miejscu opisano procedury wykonywania tych testów w celu wykrycia BoNT w próbkach o niskiej złożoności (np. farmaceutycznej, BoNT w buforze) i wysokiej złożoności (np. żywność, środowisko). W niniejszym protokole omówiono konkretne metody przetwarzania dla kilku typów próbek, a typy próbek nieopisane w niniejszym dokumencie można zazwyczaj dostosować przy użyciu kombinacji przedstawionych metod. Protokół został opracowany i przetestowany z BoNT/A, ale można go dostosować do innych serotypów BoNT przy użyciu ich odpowiednich testów, jak pokazano w innym miejscu56,60.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do wykrywania neurotoksyny botulinowej BoTest Matrix A</td><td>Dostępne są również zestawy do wykrywania BioSentinel A1015 dla BoNT/B i F.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych Varioskan</td><td>Flash Thermo Fisher Scientific</td><td>5250040</td><td>Można stosować większość jednostek monochromatorowych lub filtrowych o zdolności wzbudzenia 434 nm i emisji 470 nm i 526 nm.</td></tr><tr><td>96-dołkowa magnetyczna płytka separująca kulki</td><td>V& P Scientific</td><td>VP771H</td><td>Można stosować inne płytki magnetyczne, ale płytka powinna być zaprojektowana tak, aby oddzielać koraliki z boku studni.</td></tr><tr><td>Magnetyczna myjka do talerzy BioTek</td><td></td><td>ELx405 VSRM</td><td>Opcjonalna, wymagana tylko do automatycznego mycia płyt.&nbsp; Można również użyć innych podkładek płytowych kompatybilnych z koralikami magnetycznymi, ale należy je przetestować przed użyciem.</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td>Opcjonalna, wymagana tylko w przypadku próbek wymagających odwirowania.</td></tr><tr><td>Mikser płytowy MixMate</td><td></td><td></td> Wytrząsarka orbitalna Eppendorf 22674200 <td></td></tr><tr><td></td> Używany w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 25 stopni;<td></td><td></td><td> C Jeśli dostępna jest kontrola temperatury</td></tr>, <tr><td>tabletki z inhibitorem proteazy bez EDTA,</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Wymagane tylko do badań żywności lub środowiska. Inhibitory proteazy muszą być wolne od EDTA.</td></tr><tr><td>BoNT/A</td><td>Metabiologics</td><td></td><td>Opcjonalny, wymagany tylko do celów standaryzacji i kwantyfikacji</td></tr><tr><td>Czarne, płaskodenne płytki 96-dołkowe</td><td>NUNC</td><td>237105</td><td>Płytki nie powinny być poddawane obróbce</td></tr><tr><td>Taśma uszczelniająca 96-dołkową płytkę</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i kwantyfikacja neurotoksyny botulinowej ze złożonych matryc za pomocą testów matrycowych botest

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Dokładne wykrywanie i oznaczanie ilościowe neurotoksyny botulinowej (BoNT) w złożonych matrycach jest wymagane do testowania próbek farmaceutycznych, środowiskowych i spożywczych. Szybkie testy BoNT żywności są potrzebne podczas kryminalistyki epidemicznej, diagnozowania pacjentów i testowania bezpieczeństwa żywności, podczas gdy dokładne testy siły działania są wymagane do produkcji produktów leczniczych opartych na BoNT i bezpieczeństwa pacjentów. Szeroko stosowany test biologiczny na myszach do testowania BoNT jest bardzo czuły, ale brakuje mu precyzji i przepustowości potrzebnej do szybkich i rutynowych testów BoNT. Co więcej, wykorzystanie testów biologicznych na zwierzętach spowodowało wezwania ze strony organów regulacyjnych ds. produktów leczniczych i obrońców praw zwierząt w USA i za granicą do zastąpienia testu biologicznego na myszach w testach na BoNT. Opracowano kilka testów zastępczych in vitro, które dobrze współpracują z oczyszczonym BoNT w prostych, ale większość z nich nie ma zastosowania do testowania w wysoce złożonych matrycach. W tym miejscu przedstawiono protokół detekcji BoNT w złożonych matrycach za pomocą testów BoTest Matrix. Test składa się z trzech części: pierwsza część obejmuje przygotowanie próbek do badania, druga część to etap immunoprecypitacji przy użyciu kulek paramagnetycznych pokrytych przeciwciałem anty-BoNT w celu oczyszczenia BoNT z matrycy, a trzecia część określa ilościowo aktywność proteolityczną izolowanego BoNT za pomocą reportera fluorogenicznego. Protokół został napisany z myślą o testach o wysokiej przepustowości na płytkach 96-dołkowych przy użyciu zarówno matryc płynnych, jak i stałych i wymaga około 2 godzin ręcznego przygotowania z całkowitym czasem oznaczania 4-26 godzin w zależności od rodzaju próbki, obciążenia toksyną i pożądanej czułości. Przedstawiono dane do testów BoNT/A z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, produktem leczniczym, supernatantem hodowli, 2% mlekiem i świeżymi pomidorami i obejmują omówienie parametrów krytycznych dla powodzenia testu.

Schemat podsumowujący kroki opisanego protokołu przedstawiono na Rysunku 2. Analiza wymaga od 4 do 26 h w zależności od rodzaju próbki i pożądanej czułości testu, przy czym czas pracy własnej wynosi jedynie ok. 2 h. Analizę przeprowadza się na płytkach 96-dołkowych, co w zależności od rodzaju wykonywanych badań pozwala na analizę trzech powtórzeń dla maksymalnie 20 próbek, wliczając standardy, na jednej płytce.
Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne wyniki test...

Testy wykrywania neurotoksyny botulinowej (BoNT) BoTest Matrix szybko oczyszczają i kwantyfikują BoNT z różnych matryc próbek. Tutaj prezentujemy protokół wykrywania i oznaczania ilościowego BoNT zarówno z matryc stałych, jak i ciekłych oraz demonstrujemy test z BOTOXEM, pomidorami i mlekiem.

Izolacja i kwantyfikacja neurotoksyny botulinowej ze złożonych matryc za pomocą testów matrycowych BoTest

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie aktywności proteolitycznej neurotoksyny botulinowej w złożonych matrycach, takich jak próbki farmaceutyczne, środowiskowe i żywnościowe. Cel ten osiąga się poprzez wstępne opracowanie próbek badawczych oraz próbek do krzywej wzorcowej, jeśli jest to konieczne, w celu ustalenia odpowiednich warunków pH i lepkości. Następnie neurotoksyna botulinowa jest immunoprecypitowana z próbek przy użyciu kulek magnetycznych powlekanych przeciwciałami.Następnie kuleczki magnetyczne są dokładnie przemywane w celu usunięcia wszelkich związków zakłócających, a następnie resuspenderowane w zoptymalizowanym buforze reakcyjnym. Na koniec przemyte kuleczki inkubuje się z białkowym reporterem, a następnie spektroskopowo mierzy stopień rozszczepienia reportera w czasie. Ostatecznie porównanie stopnia rozszczepienia reportera w próbkach testowych z próbkami krzywej wzorcowej służy do ilościowego oznaczenia aktywności toksyny botulinowej w próbkach testowych z czułością zbliżoną do bioanaliz z użyciem myszy.Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak testy na myszach, bioanalizy, metody immunologiczne i inne metody f

isolation-quantification-botulinum-neurotoxin-from-complex-matrices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolacja i ilościowa ocena toksyny botulinowe z złożonych matryc za pomocą testów matrycowych BoTest

Ten film demonstruje test immunologiczny oparty na multipleksie do ilościowego oznaczania wielu celów cytokin w próbce. Mieszanina odrębnych mikrosfer sprzężonych z przeciwciałami specyficznymi dla cytokin służy do wiązania cytokin obecnych w próbce. Reporterki znakowane streptawidyną są unieruchamiane na związanych cytokinach za pomocą biotynylowanych przeciwciał wykrywających. Cytometria przepływowa identyfikuje związane cytokiny na podstawie unikalnych rozmiarów i intensywności wewnętrznej...

Multipleksowy test immunologiczny oparty na kulkach do ilościowego określania wielu celów cytokin

Łańcuch lekki neurotoksyny botulinowej typu A (BoNT/A LC) to metaloproteaza, która dostaje się do neuronów ruchowych, rozszczepia ich substrat SNAP-25 i zakłóca neurotransmisję, powodując tym samym porażenie wiotkie. Wykorzystując wysokoprzepustowy test oparty na FRET, duże biblioteki małych cząsteczek mogą być badane pod kątem ich wpływu na aktywność enzymatyczną BoNT/A LC.

Kompatybilna z wysoką przepustowością platforma oparta na FRET do identyfikacji i charakterystyki modulatorów łańcucha lekkiego neurotoksyny botulinowej

Neurotoksyna botulinowa jest jedną z najsilniejszych toksyn wśród czynników zagrożenia biologicznego kategorii A, jednak terapia poekspozycyjna nie jest dostępna. Metoda obrazowania o wysokiej zawartości jest potężną metodologią identyfikacji nowych inhibitorów, ponieważ umożliwia wieloparametrowe badania przesiewowe z wykorzystaniem biologicznie istotnych neuronów ruchowych, które są głównym celem tej toksyny.

Test obrazowania o wysokiej zawartości do identyfikacji inhibitorów neurotoksyny botulinowej

Opisany jest niestandardowy protokół różnicowania komórek ES myszy w zdefiniowane populacje wysoce czystych neuronów wykazujących działające synapsy i emergentne zachowanie sieci. Analiza elektrofizjologiczna wykazała utratę przekaźnictwa synaptycznego po ekspozycji na serotypy neurotoksyny botulinowej /A-/G i neurotoksynę tężcową.

Ocena funkcjonalna neurotoksyn biologicznych w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych

Ten protokół przedstawia zweryfikowaną metodę chromatografii cieczowej, mobilności jonów i spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości, do określania obecności alkaloidów sporyszu w żywności, zgodnie z niedawno wydanym rozporządzeniem Komisji (UE) 2023/915.

Wykrywanie regulowanych alkaloidów sporyszu w matrycach spożywczych za pomocą chromatografii cieczowej - spektrometria ruchliwości jonów uwięzionych w elektronice - spektrometria mas czasu przelotu

Eksplanty z układu dopaminergicznego śródmózgowia oraz prążkowia są wykorzystywane w teście z matrycą kolagenową do analizy in vitro rozwoju szlaków mezostriatalnych i striatonigralnych. W tym teście wzrost i prowadzenie aksonów mogą być manipulowane oraz kwantyfikowane. Metodę tę można również zmodyfikować w celu oceny innych obszarów lub sygnałów molekularnych.

Disekcja i hodowla eksplantów dopaminergicznych i prążkowiowych myszy w trójwymiarowych testach w matrycy kolagenowej

Obwody neuronalne są zorganizowane topograficznie w przedziały funkcjonalne o specyficznych profilach molekularnych. W niniejszej pracy przedstawiamy praktyczne i techniczne kroki służące do ujawnienia globalnej topografii mózgu z wykorzystaniem wszechstronnego podejścia opartego na barwieniu immunohistochemicznym całych preparatów (wholemount). Demonstrujemy użyteczność tej metody, wykorzystując dobrze poznaną cytoarchitekturę i obwody móżdżku.

Immunohistochemia całego preparatu w celu ujawnienia złożonej topografii mózgu

Ten film demonstruje łatwą i niezawodną strategię przygotowania czystych kultur komórek śródbłonka z embrionalnej przodomózgowia w ciągu 10-12 dni i będzie przydatny do badań skoncentrowanych na wielu aspektach angiogenezy mózgowej.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka z zarodka przodomózgowia

Ten artykuł opisuje system hodowli neuronów, który może być używany do uzyskiwania dużych ilości czystych próbek aksonalnych do analiz biochemicznych i immunocytochemicznych. Technika ta pozwoli na lepsze zrozumienie prawidłowej fizjologii aksonów i szlaków sygnałowych prowadzących do neurodegeneracji.

Produkcja i izolacja aksonów z neuronów czuciowych do analizy biochemicznej przy użyciu filtrów porowatych

Kultury neuronów są dobrym modelem do badania nowych technik stymulacji mózgu poprzez ich wpływ na pojedyncze neurony lub populację neuronów. Przedstawiono różne metody stymulacji wzorcowych kultur neuronalnych za pomocą pola elektrycznego wytwarzanego bezpośrednio przez elektrody kąpielowe lub indukowanego przez zmienne w czasie pole magnetyczne.

Zewnętrzne wzbudzenie neuronów za pomocą pól elektrycznych i magnetycznych w kulturach jedno- i dwuwymiarowych

Poznaj metodę izolacji i kwantyfikacji neurotoksyny botulinowej z złożonych matryc żywnościowych przy użyciu immunoprecypitacji i spektroskopii fluorescencyjnej. Technika zapewnia czułość porównywalną z bioassayem mysim.

Izolacja i kwantyfikacja neurotoksyny botulinowej ze złożonych matryc za pomocą testów matrycowych BoTest

Przeglądaj więcej filmów