Kompatybilna z wysoką przepustowością platforma oparta na FRET do identyfikacji i charakterystyki modulatorów łańcucha lekkiego neurotoksyny botulinowej

Ogólnym celem tej procedury jest badanie małych cząsteczek pod kątem neurotoksyny botulinowej, hamowania łańcucha lekkiego. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie serii rozcieńczeń związków z dużą dokładnością i precyzją. Drugim krokiem jest przeniesienie rozcieńczeń złożonych na czarną płytkę 96-dołkową.

Następnie rozcieńczony enzym łańcucha lekkiego dodaje się do płytki i enzym inkubuje się ze związkiem przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ostatnim krokiem jest dodanie substratu progu łańcucha lekkiego w celu zainicjowania reakcji, która jest monitorowana za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ostatecznie należy zastosować wtórne badania przesiewowe, które wykorzystują niefluorescencyjny substrat peptydowy, w celu potwierdzenia aktywności związku i wyznaczenia bardziej rygorystycznych stałych kinetycznych, takich jak stała dysocjacji inhibitora lub ki.

Główną zaletą tego testu w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metody oparte na HPLC lub metody komórkowe, jest to, że jest prosty do wykonania, łatwo zautomatyzowany i może być używany do porównywania względnej siły działania wielu związków. Osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć trudności z przygotowaniem serii rozcieńczeń związków i prawidłowym mieszaniem płytki po dodaniu wszystkich składników. Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania i odczynników zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Skonfiguruj czytnik płytek tak, aby potrząsał płytką ze średnią prędkością przez 10 sekund, a następnie monitorował fluorescencję przy długości fali wzbudzenia 490 nanometrów i długości fali emisji 523 nanometrów co pięć minut w trybie kinetycznym przez godzinę 30 minut w temperaturze pokojowej. Po określeniu zakresu stężeń związku oznacz probówki z odpowiednią nazwą związku i stężeniem, Eloqua, 100% tlenkiem dimetylosulfa lub DMSO do wszystkich probówek, aby przygotować je do rozcieńczenia zbóż złożonych. Następnie należy przygotować seryjne rozcieńczanie związków dla standardowej serii rozcieńczeń od jednego do trzech.

Dodać dwa mikrolitry nierozcieńczonego związku do czterech mikrolitrów DMSO w pierwszej probówce z serii rozcieńczeń i dobrze wymieszać z nową końcówką pipety. Usunąć dwa mikrolitry pierwszego rozcieńczenia i dodać do czterech mikrolitrów DMSO w drugiej mieszance probówkowej. Dobrze powtórzyć dla pozostałych rozcieńczeń.

Upewnij się, że dobrze wymieszałeś rozcieńczenia związków, aby upewnić się, że stężenia związków są dokładne. Przykryj probówki złożone i odłóż je na bok W temperaturze pokojowej uzyskać płaską denną, nieprzezroczystą czarną płytkę 96-dołkową. Korzystając z zalecanej konfiguracji tablicy, którą można znaleźć w protokole tekstowym.

Ręcznie dozować jeden mikrolitr odpowiedniego rozcieńczenia związku bezpośrednio na dno każdej odpowiedniej studzienki dla studzienek od pierwszej do dziewiątej, dozować jeden mikrolitr najwyższego stężenia związku, który ma być badany, do dołka.11. Służy jako związek wewnętrznej kontroli fluorescencji. Ta kontrola ma na celu określenie, czy same związki są fluorescencyjne i/lub wpływają na hydrolizę substratu.

Ręcznie dozuj jeden mikrolitr znanego silnego inhibitora do studni, 12 jako kontrolę pozytywną i jeden mikrolitr 100% DMSO do studni. 10 jako kontrola ujemna z automatycznym dozowaniem pipetowym. 79 mikrolitrów buforu do oznaczania na bok studzienek, jeden przez 10 i 12 oraz 89 mikrolitrów na bok studzienki, 11.

Upewnij się, że nie dotykasz końcówki do dna studni, w której znajduje się związek, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego studzienek. Vortex, rozcieńczony enzym łańcucha lekkiego, i użyj automatycznego pipetera, aby dodać 10 mikrolitrów enzymu z boku każdej studzienki, z wyjątkiem studzienki 11. Delikatnie postukaj w płytkę, aby upewnić się, że całkowita objętość dodanego enzymu trafia na dno studzienki, delikatnie wymieszaj, przykryj i inkubuj płytkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Ta inkubacja zapewnia etap równowagi wstępnej, w którym związki mogą związać się z łańcuchem lekkim. Przed dodaniem substratu delikatnie wymieszaj neurotoksynę botulinową z substratem o łańcuchu lekkim. Następnie za pomocą automatycznej pipety dodaj 10 mikrolitrów substratu z boku każdej z nich.

Cóż, pamiętaj, aby dodać substrat po stronie studni przeciwnej do miejsca, w którym enzym został dodany wcześniej. Delikatnie postukaj w płytkę, aby natychmiast wymieszać odczynniki. Umieścić płytkę w czytniku płytek do mikromiareczkowania fluorescencyjnego i rozpocząć wcześniej skonfigurowany program.

Po zakończeniu programu oblicz prędkości enzymu, rysując na wykresie względną jednostkę fluorescencji w funkcji czasu i obliczając nachylenie linii w okresie liniowym reakcji. Przygotuj się do zautomatyzowanej operacji dla badań przesiewowych o wysokiej przepustowości, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, Demonstrując część protokołu badań przesiewowych o wysokiej przepustowości, będziesz młodym doktorem w moim laboratorium. Pokaże, w jaki sposób związki są przenoszone na płytki w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu laboratoryjnego sprzętu do automatyzacji Po dozowaniu rozcieńczonej neurotoksyny botulinowej, enzymu łańcucha lekkiego do płytki testowej.

Przypisz obszary na platformie obsługi cieczy dla płytek złożonych, płytek testowych i pojemników z roztworami czyszczącymi. Zaprogramować osobę zajmującą się cieczami tak, aby umieszczała płytki złożone i płytki testowe w wyznaczonych pozycjach i zdejmowała pokrywki płytek przed tłoczeniem. Skalibruj oprogramowanie programu do stemplowania i upewnij się, że kołki do stemplowania są zanurzone, ale nie rysują dolnej części płytki testowej.

Wytłocz 50 nanolitrów związku bezpośrednio na płytce testowej zawierającej osiem mikrolitrów neurotoksyny botulinowej. Lekki łańcuch. Wyczyść szpilki po każdej płytce, zanurzając je w DMSO, a następnie susząc na bibułce i powtarzając ten proces z izopropanolem i metanolem.

Na koniec wysuszyć kołki nad wentylatorem po wytłoczeniu związków na płytkach testowych enzymem. Oddzielnie ułóż podstawowe płytki złożone, a płytki testowe przykryj górną płytkę testową w stosie, aby zapobiec parowaniu, i odłóż na bok. Upewnij się, że inkubujesz łańcuch lekki ze związkami przez co najmniej pięć minut w temperaturze pokojowej.

Dłuższe czasy inkubacji można zastosować przy tłoczeniu dużej liczby płytek. Na koniec dozować substrat do płytek testowych i zmierzyć fluorescencję zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Niezależnie od tego, czy wykonujesz test neurotoksyny botulinowej na bazie progów jako łańcuch lekki w sposób niskoprzepustowy, czy wysokoprzepustowy, wzrost fluorescencji powinien być obserwowany w czasie, gdy neurotoksyna botulinowa, łańcuch lekki jest inkubowany z substratem.

Jeśli badane są seryjne rozcieńczenia związku, często uzyskuje się serię linii o różnym nachyleniu. Tu. Końcowe stężenie związku na bazie hydroksy podaje się w jednostkach mikromolowych. Otóż 10 w opisanym tutaj układzie tablic rejestracyjnych służy jako kontrola ujemna, gdzie dodawany jest tylko pojazd.

Szybkość tej reakcji definiuje się jako 100% aktywność enzymu, a szybkość w obecności związku można znormalizować do tej szybkości, aby uzyskać względną szybkość lub procentowe hamowanie. Gdy test jest wykonywany z seryjnymi rozcieńczeniami związku, wykres szybkości reakcji w stosunku do stężenia inhibitora można wykorzystać do określenia połowy maksymalnego stężenia hamującego lub IC 50. Zakres rozcieńczenia powinien być tak dobrany, aby wykres wyglądał na esiowaty w celu optymalnego dopasowania krzywej.

Wartość IC 50 jest względną miarą siły działania, którą najlepiej opisać jako pozorną wartość KI, ponieważ zależy ona od stężenia enzymu obecnego w teście. Wartość ta może być następnie wykorzystana do porównania i uszeregowania siły działania kilku związków, jeśli zostaną przetestowane. Równolegle, odpowiednie wymieszanie płytki po dodaniu każdego składnika jest kluczowe dla uzyskania płynnego liniowego wzrostu fluorescencji w czasie, co jest niezbędne do dokładnego wyznaczenia prędkości początkowych.

Ten wykres przedstawia reprezentatywny eksperyment, w którym nie było wystarczającego mieszania, a tempo tworzenia się produktu nie jest liniowe w czasie. Myląca analiza danych Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż dwie godziny dla maksymalnie ośmiu związków. Po tym eksperymencie można przeprowadzić inne testy z niefluorescencyjnymi substratami peptydowymi, aby potwierdzić, że związki hamują neurotoksynę botulinową, łańcuch lekki i aktywność somatyczną.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić względną siłę działania inhibitorów łańcucha lekkiego neurotoksyny botulinowej. Protokół został zrealizowany w trzech krokach. Po pierwsze, przygotowanie serii rozcieńczeń związków.

Po drugie, dodanie rekombinowanego enzymu łańcucha lekkiego, a po trzecie, dodanie substratu fluorescencyjnego i późniejszy pomiar na czytniku płytek fluorescencyjnych.