Name: Kompatybilna z wysoką przepustowością platforma oparta na FRET do identyfikacji i charakterystyki modulatorów łańcucha lekkiego neurotoksyny botulinowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Odkryj metodę FRET do identyfikacji inhibitorów łańcucha lekkiego neurotoksyny botulinowej typu A. To wysokoprzepustowe podejście umożliwia szybkie przesiewanie małych cząsteczek i określanie ich kinetyki hamowania enzymu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant z National Institutes of Health (AI082190 T.J.D.) i California Institute for Regenerative Medicine (TB1-01186 i CL1-00502).

Ręczne badanie przesiewowe lub oznaczanie IC50
Ten protokół może być użyty do określenia względnej siły związku (wartość IC50) poprzez przygotowanie serii rozcieńczeń związku, lub do ręcznego badania przesiewowego na obecność inhibitorów małych cząsteczek o pojedynczym stężeniu.
1. Przygotowanie, odczynników i wymaganego oprzyrządowania
<ol>
	<li>Przygotować 50 ml buforu testowego (40 mM HEPES, pH 7,4 i 0,01% Tween-20) i wysterylizować filtrem. Bufor może być przechowywany w temperaturze pokojowej (RT) przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Przygotować robocze rozcieńczenie 70 nM rekombinowanej neurotoksyny botulinowej/łańcucha lekkiego A (LC/A (1-425))17 w buforze testowym, delikatnie odwirować i przechowywać na lodzie. Badanie każdego związku wymaga co najmniej 120 μl roboczego rozcieńczenia LC/A.</li>
	<li>Przygotować 7 μM rozcieńczenie robocze substratu BoNT/A LC na bazie FRET w buforze testowym zawierającym 10% DMSO. Początkowo rozcieńczyć 5 mM roztwór podstawowy substratu w odpowiedniej objętości 100% DMSO, a następnie powoli (kroplami) dodać bufor do oznaczania, delikatnie mieszając. Zawiń w folię i przechowuj na lodzie. Badanie każdego związku wymaga co najmniej 130 μl roboczego rozcieńczenia substratu.</li>
	<li>Skonfiguruj czytnik płytek do mikromiareczkowania fluorescencji tak, aby potrząsał płytką ze średnią prędkością przez 10 sekund, a następnie monitoruj fluorescencję przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 490 nm i 523 nm co 5 minut (tryb kinetyczny) przez 90 minut przy RT. Należy zauważyć, że tworzenie się produktu (tj. wzrost fluorescencji) jest liniowe przez cały ten okres czasu (rysunek 1A).</li>
</ol>
2. Przygotowanie serii rozcieńczeń złożonych
<ol>
	<li>Określić zakres stężeń związku (tj. liczbę rozcieńczeń w szeregu rozcieńczeń i współczynnik rozcieńczenia); zakres stężeń dobiera się na podstawie oczekiwanej wartości IC50, aby zapewnić optymalne dopasowanie krzywej. W przypadku związków o nieznanym IC50 jako najwyższe stężenie związku należy użyć nierozcieńczonego składnika.</li>
	<li>Oznaczyć probówki odpowiednią nazwą związku i stężeniem.</li>
	<li>Podaniec 100% DMSO do wszystkich probówek, aby przygotować je do seryjnego rozcieńczania złożonego. Zalecana jest co najmniej 2 μl końcowej objętości rozcieńczenia, przy czym 1 μl każdego stężenia stosuje się na basenie na płytce do oznaczania. Na przykład standardowa seria rozcieńczeń 1:3 wymaga zmieszania 2 μl związku z 4 μl DMSO na probówkę.</li>
	<li>Przygotować seryjne rozcieńczenia związków i wirować lub ręcznie dokładnie wymieszać między każdym rozcieńczeniem; wymieniać końcówki pipet pomiędzy każdym rozcieńczeniem. Dla standardowej serii rozcieńczeń 1:3 dodać 2 μl nierozcieńczonego związku do 4 μl DMSO w pierwszej probówce z serii rozcieńczeń i dobrze wymieszać. Za pomocą nowej końcówki do pipety usunąć 2 μl pierwszego rozcieńczenia i dodać do 4 μl DMSO w drugiej probówce; Dobrze wymieszaj. Powtórzyć dla pozostałych rozcieńczeń. Upewnij się, że dobrze wymieszałeś rozcieńczenia związków, aby upewnić się, że stężenia związków są dokładne.</li>
	<li>Przykryj probówki złożone i odstaw na bok w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie i plamienie płytki (Tabela 1)
<ol>
	<li>Otrzymać płaską denną, nieprzezroczystą, czarną płytkę 96-dołkową. Patrz zalecany układ płytek w Tabeli 1, gdzie każda seria rozcieńczeń związków jest sformatowana w rzędach płytki 96-dołkowej. Ręcznie dozować 1 μl odpowiedniego rozcieńczenia związku bezpośrednio na dno każdej odpowiedniej studzienki (studzienki 1-9). Dozować 1 μl najwyższego stężenia badanego związku do studzienka 11 (wewnętrzna kontrola fluorescencji związku).</li>
	<li>Ręcznie dozować 1 μl znanego silnego inhibitora do studzienki 12 (kontrola dodatnia) i 1 μl 100% DMSO do studzienki 10 (kontrola ujemna).</li>
	<li>Za pomocą automatycznego pipetatora dozować 79 μl buforu do oznaczania na bok studzienek 1-10 i 12 (rozcieńczenia związków i kontrola pozytywna) oraz 89 μl na bok basenika 11 (złożona wewnętrzna kontrola fluorescencji). Upewnij się, że nie dotykasz końcówki do dna studni, w której znajduje się związek, aby nie zanieczyścić krzyżowo studzienek. </li>
	<li>Odwirować robocze rozcieńczenie LC/A i użyć automatycznego pipetora, aby dodać 10 μl z boku każdej studzienki, z wyjątkiem studzienki 11 (złożona wewnętrzna kontrola fluorescencji). Delikatnie postukaj w płytkę, aby upewnić się, że cały dodany enzym trafi na dno studzienki.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj, przykryj i inkubuj płytkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ta inkubacja zapewnia etap wstępnej równowagi, w którym związki wiążą się z LC/A przed dodaniem substratu.</li>
</ol>
4. Dodawanie substratu i pomiar fluorescencji
<ol>
	<li>Delikatnie zmieszać podłoże BoNT/A LC i za pomocą automatycznego pipetora dodać 10 μl substratu po drugiej stronie każdej studzienki. Pamiętaj, aby dodać substrat po stronie studni przeciwnej do miejsca, w którym enzym został dodany wcześniej.</li>
	<li>Delikatnie postukać w płytkę, aby wymieszać odczynniki, natychmiast umieścić je w czytniku płytek i rozpocząć pomiar fluorescencji z ustawieniami określonymi wcześniej w kroku 1.4.</li>
	<li>Prędkości enzymu oblicza się na podstawie nachylenia linii wygenerowanej przez wykres względnej jednostki fluorescencji (RFU) w funkcji czasu w okresie liniowym reakcji.</li>
</ol>
Tabela 1.Sugerowany układ płytki testowej.
<obramowanie tabeli="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>Cóż #</th>
			<th>Opis studni</th>
			<th>związek</th>
			<th>Bufor testowy</th>
			<th>substrat</th>
			<th>Lc</th>
			<th>Dmso</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Dawka złożona 1</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl </td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>Dawka złożona 2</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Dawka złożona 3</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Dawka złożona 4</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Dawka złożona 5</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Dawka złożona 6</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Dawka złożona 7</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>Dawka złożona 8</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>Dawka złożona 9</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>Kontrola ujemna 
			(100% aktywności LC)</td>
			<td>---</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>Złożona wewnętrzna kontrola fluorescencji</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>89 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>Kontrola pozytywna 
			(0% aktywności LC)</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Zautomatyzowana obsługa dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych
5. Przygotowanie, odczynników, tabliczek złożonych, kodów kreskowych i wymaganego oprzyrządowania
<ol>
	<li>Rozmrażać szczelnie zamknięte płytki wyjściowe w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Przygotować 500 ml (lub więcej, w zależności od liczby związków do przesiewu) buforu testowego (40 mM HEPES, pH 7,4 i 0,01% Tween-20) i wysterylizować filtrem. Przefiltrowany bufor testowy może być przechowywany w RT przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Przygotować robocze rozcieńczenie 8,75 nM rekombinowanego BoNT/A LC (1-425) w buforze testowym, wirować i przechowywać na lodzie. Każda studzienka w 384-dołkowej płytce o małej objętości wymaga 8 μl. Przygotuj 10-15% nadmiaru, czyli około 3,7 ml lub każdą płytkę 384-dołkową o małej objętości.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenie robocze substratu BoNT/A LC na bazie 3,5 μM FRET w buforze testowym zawierającym 10% DMSO. Początkowo rozcieńczyć 5 mM roztwór podstawowy substratu bezpośrednio w odpowiedniej objętości 100% DMSO, a następnie powoli (kroplami) dodać bufor do oznaczania, delikatnie mieszając. Zawiń w folię i przechowuj na lodzie. Każda studzienka w 384-dołkowej płytce o małej objętości wymaga 2 μl. Przygotuj 10-15% nadmiaru, czyli około 1 ml na każdą płytkę 384-dołkową o małej objętości.</li>
	<li>Przygotuj kody kreskowe dla każdej czarnej, 384-dołkowej, niskoobjętościowej płytki do mikromiareczkowania [płytki testowej] i przyklej etykietę bezpośrednio do boku płytki, gdzie skaner kodów kreskowych może ją odczytać; upewnij się, że etykieta nie wystaje poza bok płytki, ponieważ może to przeszkadzać w obsłudze płytek i układaniu ich w stosy. Ułóż talerze w kolejności numerycznej i odłóż na bok. Zakryj górną płytę. Należy pamiętać, że ten krok jest opcjonalny, ale ułatwia śledzenie wyników dla odpowiednich związków, gdy używanych jest wiele płytek.</li>
	<li>Odwirować rozmrożone, szczelnie zamknięte płytki wyjściowe o masie 200 x g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Ostrożnie zdejmij uszczelkę płyty, upewnij się, że usunąłeś pozostały klej i przykryj płytkę czystą plastikową pokrywką, aby zapobiec parowaniu. Należy pamiętać, że jeśli na powierzchni płytki znajduje się jakikolwiek klej, może on zakłócać automatyczne przenoszenie pokrywki i układanie płyt. Umieść przykrytą płytkę w hotelu przymocowanym do pojemnika na płyny. Nie trzymaj płytek odkrytych, ponieważ spowoduje to parowanie.</li>
	<li>Skonfiguruj piętrowy czytnik mikropłytek do miareczkowania fluorescencji, aby odczytywać fluorescencję każdej płytki testowej przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 490 nm i 523 nm co 30 minut (tryb kinetyczny) przez 3-6 cykli w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
6. Przygotowanie narzędzia do przypinania
<ol>
	<li>Sprawdź wzrokowo narzędzie do kołków z głowicą 384 pod kątem wszelkich nieprawidłowości, w tym wypaczeń, odprysków lub dużych zanieczyszczeń.</li>
	<li>Napełnij trzy oddzielne tace około 1 calem 100% metanolu (klasa HPLC), 100% izopropanolu (klasa HPLC) i roztworem do czyszczenia narzędzi do szpilek rozcieńczonym w ultraczystej wodzie.</li>
	<li>Napełnij stację czyszczącą na urządzeniu do obsługi cieczy 100% DMSO.</li>
	<li>Ułóż 2-3 kawałki czystej, nowej bibuły na tacy. Ważne jest, aby skalibrować robota w osi z tak, aby kołki stykały się z bibułą, ale jej nie przebijały.</li>
	<li>Przymocuj nasadkę wentylatora do obszaru roboczego w celu wysuszenia kołków po umyciu.</li>
	<li>Przymocuj narzędzie do szpilek do ramienia robota obsługującego ciecze i wstępnie wyczyść szpilki, zanurzając je w DMSO, susząc na bibułce, mocząc przez 2 minuty w roztworze czyszczącym, susząc na bibułce, zanurzając w izopropanolu, susząc na bibułce, zanurzając w metanolu, susząc na bibułce i na koniec susząc nad wentylatorem.</li>
</ol>
7. Przygotowanie dozownika płynów o małej objętości
<ol>
	<li>Podłącz kasetę o małej objętości (1-10 μl) do dozownika płynów i podłącz przewód odpływowy do odpowiedniego naczynia.</li>
	<li>Sprawdź wzrokowo dysze dozujące kasety i sprawdź, czy nie są wypaczone, rozdarte lub zablokowane. Ważne jest, aby utrzymywać kanały i dysze w czystości, ponieważ opady lub zanieczyszczenia wpłyną na dystrybucję cieczy.</li>
	<li>Zalać kanały, przepuszczając 30 ml ultraczystej wody, 30 ml 70% etanolu, a następnie 30 ml ultraczystej wody ponownie bezpośrednio do naczynia na odpady.</li>
	<li>Umieść 384-dołkową płytkę testową o małej objętości w dozowniku cieczy i dodaj znaną objętość wody do każdej studzienki. Sprawdź wzrokowo, aby upewnić się, że każda studzienka otrzymuje odpowiednią objętość i że między studzienkami nie ma rozlania ani roztworu.</li>
	<li>Zalać rurki powietrzem przez około 5 sekund, aby usunąć wodę i wysuszyć kanały.</li>
</ol>
8. Dozowanie lekkiego łańcucha BoNT/A na płytkę testową
<ol>
	<li>Zanurz przewód dozownika cieczy w roztworze roboczym BoNT/A LC, zalej w celu usunięcia powietrza i dozuj 8 μl do każdej studzienki 384-dołkowej płytki testowej o małej objętości. Należy pamiętać, że płyty mogą być ręcznie umieszczane w obszarze roboczym urządzenia do obsługi cieczy lub automatycznie ustawiane i ponownie układane w stosy za pomocą dołączonego hotelu płytowego.</li>
	<li>Przykryj każdą płytkę czystą plastikową pokrywką i ułóż w innej kolumnie talerza przymocowanego do pojemnika na płyny. Nie trzymaj płytek rozszczelnionych, ponieważ może to spowodować parowanie.</li>
	<li>Wyczyść dozownik płynu, przepuszczając 30 ml ultraczystej wody, 30 ml 70% etanolu, 30 ml ultraczystej wody ponownie bezpośrednio do naczynia na odpady.</li>
	<li>Zalać rurki powietrzem przez około 5 sekund, aby wysuszyć kanały.</li>
</ol>
9. Tłoczenie związków na płytce testowej
<ol>
	<li>Przypisz obszary na platformie obsługi cieczy dla płytek złożonych, płytek testowych i pojemników z roztworami czyszczącymi.</li>
	<li>Zaprogramować osobę zajmującą się cieczami tak, aby umieszczała płytki złożone i płytki testowe w wyznaczonych pozycjach i zdejmowała pokrywki płytek przed tłoczeniem.</li>
	<li>Ostemplować 50 nl związku bezpośrednio na płytce testowej zawierającej 8 μl BoNT/A LC. Podczas kalibracji programu do tłoczenia upewnij się, że kołki są zanurzone, ale nie rysuj dolnej części płytki testowej. Należy pamiętać, że dodanie związków w 100% DMSO może stworzyć lokalną strefę denaturacji enzymu w miarę jego dyspersji. W związku z tym należy dołożyć starań, aby ocenić poziom denaturacji enzymów poprzez porównanie kontroli opartej wyłącznie na DMSO z kontrolą niepoddawaną działaniu środka (tj. enzymem bez dodatku DMSO).</li>
	<li>Wyczyść szpilki po każdej płycie, zanurzając w DMSO, susząc na bibułce, zanurzając w izopropanolu, susząc na bibułce, zanurzając w metanolu, susząc na bibułce i na koniec susząc nad wentylatorem.</li>
	<li>Po wytłoczeniu związków na płytce testowej enzymem, oddzielnie ułóż płytki ze związkami podstawowymi i płytki testowe. Przykryj górną płytkę testową w stosie, aby zapobiec parowaniu i odłóż na bok. Upewnij się, że inkubujesz LC ze związkami przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej; Dłuższe czasy inkubacji można stosować przy tłoczeniu dużej liczby płytek.</li>
</ol>
10. Dozowanie substratu do płytki testowej
<ol>
	<li>Zanurzyć przewód dolotowy maszyny do obsługi cieczy w roztworze roboczym podłoża BoNT/A LC i chronić przed światłem. Sprawdź dysze dozujące, aby upewnić się, że są suche i nie są zablokowane. Zagruntować kanały, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Rozłóż płytki testowe i dozuj 2 μl roboczego rozcieńczenia substratu do każdej studzienki. Sprawdź, czy substrat jest dozowany bezpośrednio do każdej studzienki. Ułóż płytki w stos i umieść jedną pustą płytkę testową na pierwszej płytce i jedną pustą płytkę pod dolną płytką w stosie, aby zapobiec parowaniu podczas odczytu i ponownego układania w czytniku płytek.</li>
</ol>
11. Pomiary fluorescencji
<ol>
	<li>Natychmiast załaduj stos płytek testowych do czytnika płytek fluorescencyjnych.</li>
	<li>Rozpocznij pomiar fluorescencji z ustawieniami określonymi wcześniej w kroku 5.7. Szybkość oznaczania dla każdego związku jest obliczana na podstawie wykresu względnej jednostki fluorescencji (RFU) w czasie. Należy pamiętać, że ważne jest, aby uwzględnić kontrolę ujemną (DMSO) w celu uzyskania niezahamowanej szybkości; Do każdej płytki można również dodać kontrolę pozytywną ze znanym inhibitorem. Reprezentatywne dane wyjściowe z pojedynczego punktu czasowego pokazano na rysunku 2.</li>
</ol>
12. Sprzątanie
<ol>
	<li>Uszczelnić każdą złożoną płytę zawartościową uszczelką foliową za pomocą wałka i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Po odczytaniu każdej płytki testowej należy wyrzucić płytki, wszelkie pozostałe rozcieńczenia LC/A lub substratu w odpadach stanowiących zagrożenie biologiczne.</li>
</ol>

<ol><li>Schantz, E. J., Johnson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+use+of+botulinum+toxin+and+other+microbial+neurotoxins+in+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine.</a> Microbiol. Rev. 56, 80-99 (1992).</li>
<li>Sloop, R. R., Cole, B. A., Escutin, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+response+to+botulinum+toxin+injection%3A+type+B+compared+with+type+A%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Human response to botulinum toxin injection: type B compared with type A.</a> Neurology. 49, 189-194 (1997).</li>
<li>Willis, B., Eubanks, L. M., Dickerson, T. J., Janda, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strange+case+of+the+botulinum+neurotoxin%3A+using+chemistry+and+biology+to+modulate+the+most+deadly+poison%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">The strange case of the botulinum neurotoxin: using chemistry and biology to modulate the most deadly poison.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47, 8360-8379 (2008).</li>
<li>Tacket, C. O., Shandera, W. X., Mann, J. M., Hargrett, N. T., Blake, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+antitoxin+use+and+other+factors+that+predict+outcome+in+type+A+foodborne+botulism%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Equine antitoxin use and other factors that predict outcome in type A foodborne botulism.</a> Am. J. Med. 76, 794-798 (1984).</li>
<li>Capek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+Pharmacokinetic+Properties+of+Botulinum+Neurotoxin+Serotype+A+Protease+Inhibitors+Through+Rational+Design%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhancing the Pharmacokinetic Properties of Botulinum Neurotoxin Serotype A Protease Inhibitors Through Rational Design.</a> ACS Chem. Neurosci. 2, 288-293 (2011).</li>
<li>Schmidt, J. J., Bostian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+of+synthetic+peptides+by+type+A+botulinum+neurotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteolysis of synthetic peptides by type A botulinum neurotoxin.</a> J. Protein Chem. 14, 703-708 (1995).</li>
<li>Schmidt, J. J., Bostian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoproteinase+activity+of+type+A+botulinum+neurotoxin%3A+substrate+requirements+and+activation+by+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">Endoproteinase activity of type A botulinum neurotoxin: substrate requirements and activation by serum albumin.</a> J. Protein Chem. 16, 19-26 (1997).</li>
<li>Schmidt, J. J., Stafford, R. G., Bostian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+A+botulinum+neurotoxin+proteolytic+activity%3A+development+of+competitive+inhibitors+and+implications+for+substrate+specificity+at+the+S1%27+binding+subsite%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Type A botulinum neurotoxin proteolytic activity: development of competitive inhibitors and implications for substrate specificity at the S1' binding subsite.</a> FEBS Lett. 435, 61-64 (1998).</li>
<li>Schmidt, J. J., Stafford, R. G., Millard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assays+for+botulinum+neurotoxin+proteolytic+activity%3A+serotypes+A%2C+B%2C+D%2C+and+F%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem.%22%5BJournal%5D)">High-throughput assays for botulinum neurotoxin proteolytic activity: serotypes A, B, D, and F.</a> Anal. Biochem.. 296, 130-137 (2001).</li>
<li>Schmidt, J. J., Stafford, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorigenic+substrates+for+the+protease+activities+of+botulinum+neurotoxins+serotypes+A%2C+B%2C+and+F.%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fluorigenic substrates for the protease activities of botulinum neurotoxins serotypes A, B, and F.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 297-303 (2003).</li>
<li>Pellett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+cell+based+assays+for+botulinum+neurotoxin+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Progress in cell based assays for botulinum neurotoxin detection.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 257-285 (2013).</li>
<li>Boldt, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization+and+development+of+a+high-throughput+methodology+for+the+discovery+of+botulinum+neurotoxin+a+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization and development of a high-throughput methodology for the discovery of botulinum neurotoxin a inhibitors.</a> J. Comb. Chem. 8, 513-521 (2006).</li>
<li>Henkel, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+properties+of+botulinum+neurotoxin+subtypes+A3+and+A4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Catalytic properties of botulinum neurotoxin subtypes A3 and A4.</a> Biochemistry. 48, 2522-2528 (2009).</li>
<li>Joshi, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+biologically+active+botulinum+neurotoxin--A+in+serum+using+high-throughput+FRET-assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of biologically active botulinum neurotoxin--A in serum using high-throughput FRET-assay.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 65, 8-12 (2012).</li>
<li>Smith, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reexamining+hydroxamate+inhibitors+of+botulinum+neurotoxin+serotype+A%3A+extending+towards+the+beta-exosite%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Reexamining hydroxamate inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A: extending towards the beta-exosite.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 3754-3757 (2012).</li>
<li>Eubanks, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+and+in+vivo+disconnect+uncovered+through+high-throughput+identification+of+botulinum+neurotoxin+A+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2602-2607 (2007).</li>
<li>Baldwin, M. R., Bradshaw, M., Johnson, E. A., Barbieri, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminus+of+botulinum+neurotoxin+type+A+light+chain+contributes+to+solubility%2C+catalysis%2C+and+stability.%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">The C-terminus of botulinum neurotoxin type A light chain contributes to solubility, catalysis, and stability.</a> Protein Expr. Purif. 37, 187-195 (2004).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Capkova, K., Hixon, M. S., McAllister, L. A., Janda, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+discovery+of+potent+inhibitors+of+botulinum+neurotoxin+A%3A+development+of+a+robust+LC+MS+based+assay+operational+from+low+to+subnanomolar+enzyme+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Toward the discovery of potent inhibitors of botulinum neurotoxin A: development of a robust LC MS based assay operational from low to subnanomolar enzyme concentrations.</a> Chem. Commun. , 3525-3527 (2008).</li>
<li>Pires-Alves, M., Ho, M., Aberle, K. K., Janda, K. D., Wilson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescent+proteins+as+enhanced+FRET-based+substrates+for+botulinum+neurotoxin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescent proteins as enhanced FRET-based substrates for botulinum neurotoxin activity.</a> Toxicon. 53, 392-399 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj test LC BONT/A oparty na FRET stanowi atrakcyjną metodę identyfikacji i charakterystyki małych cząsteczek, które modulują aktywność BoNT/A LC. Oparty na roztworze charakter testu sprawia, że protokół ten jest podatny na wysokoprzepustowe badania przesiewowe opisane w sekcji Zautomatyzowana operacja w tekście protokołu. Współczynnik Z jest często używany do określenia przydatności testu w kampaniach HTS18. Określony jako Z = 1 – 3 (σp + σn)/(μp - μn), ws...

Neurotoksyna botulinowa A (BoNT/A), najsilniejsza obecnie znana toksyna (LD50 ~1 ng/kg)1, jest silną neurotoksyną wytwarzaną przez bakterię Clostridium botulinum. W obrębie dotkniętego gospodarza BoNT / A zakłóca neurotransmisję w połączeniu nerwowo-mięśniowym poprzez wiązanie neuronów ruchowych, internalizację do cytozolu i ostatecznie rozszczepianie białek neuronalnych, które są niezbędne do egzocytozy acetylocholiny. Po wejściu do neuronu BoNT/A może utrzymywać się nawet przez kilka miesięcy2. Długotrwałe hamowanie uwalniania acetylocholiny utrudnia normalny skurcz mięśni i powoduje porażenie wiotkie, które w ciężkich przypadkach może prowadzić do niewydolności serca i/lub oddechowej. Ze względu na jego ekstremalną moc, łatwość produkcji i długoterminowe skutki w organizmie gospodarza, CDC oznaczyło wszystkie serotypy BoNT jako czynniki bioterrorystyczne wysokiego ryzyka.
Mechanizm działania toksyny obejmuje liczne etapy, w tym wiązanie się z receptorami na powierzchni neuronów, pobieranie komórek przez endocytozę za pośrednictwem receptorów i translokację do cytozolu neuronu. BoNT/A składa się z dwóch łańcuchów, ciężkiego i lekkiego, a oba łańcuchy są wymagane do toksyczności. Łańcuch ciężki (HC) zawiera domeny wiążące i translokacyjne, podczas gdy łańcuch lekki (LC) jest metaloproteazą zależną od, która przemieszcza się z endosomu do cytoplazmy. Po wejściu do cytozolu metaloprotaza LC / A lokalizuje się w wewnętrznej błonie cytoplazmatycznej i rozszczepia białko gospodarza związane z błoną SNAP-25. SNAP-25 należy do rodziny białek SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Protein Receptor), które odgrywają kluczową rolę w egzocytozie acetylocholiny (przegląd w piśmiennictwie3). Rozszczepienie LC/A SNAP-25 upośledza funkcję kompleksu SNARE, co hamuje uwalnianie neuroprzekaźnika acetycholiny i upośledza skurcz mięśni.
Obecnie leczenie zatrucia jadem kiełbasianym jest ograniczone i często obejmuje podawanie przeciwciała neutralizującego u koni4; jednakże, ponieważ toksyna jest szybko internalizowana do neuronów, przeciwciało ma wąskie okno czasowe podania. W związku z tym wielu badaczy uważa, że BoNT/A LC może być lepszym celem terapeutycznym. Ponieważ LC jest metaloproteazą zależną od, jednym ze sposobów hamowania aktywności LC/A było opracowanie związków, które chelatują jon w miejscu aktywnym. Na przykład związki hydroksamianowe chelatują w miejscu aktywnym i mają doskonałą siłę działania in vitro (Ki najlepszego z najlepszych do tej pory małocząsteczkowych inhibitorów BoNT/A LC wynosi 77 nM)5. Jednak wiele małych cząsteczek nie rozwija się jako terapia z powodu różnych problemów ex vivo lub in vivo, w tym słabej rozpuszczalności w wodzie, szybkiego metabolizmu i/lub wysokiej cytotoksyczności. W związku z tym potrzebne są nowe związki o ulepszonych właściwościach farmakologicznych i farmakokinetycznych . Identyfikacja związków małocząsteczkowych często obejmuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS) w celu zidentyfikowania nowych rusztowań. Początkowe metody badania przesiewowego aktywności BoNT/A LC opierały się na wykrywaniu metodą HPLC rozszczepienia krótkiego substratu peptydowego, co jest czasochłonne i niepodatne na zastosowania HTS6-8. Następnie Schmidt iwspółpracownicy opracowali wysokoprzepustowy test aktywności BoNT/A LC, który wykorzystuje znakowany fluoresceiną substrat peptydowy kowalencyjnie przymocowany do płytki mikromiareczkowej. BoNT/A LC rozszczepia podłoże i uwalnia fluoresceinę, którą można określić ilościowo za pomocą fluorometru. Format płytki tego testu pozwala na jednoczesne badanie przesiewowe wielu związków; Jednak test wymaga znakowania syntetycznych peptydów fluoresceiną i powlekania płytek testowych derywatyzowanymi cząsteczkami substratu, co jest kłopotliwą techniką. Znacznie prostsza metoda wykrywania aktywności BoNT/A LC przy niskich stężeniach została później opisana przez Schmidta i wsp., gdzie wykorzystano szereg substratów fluorogennych do monitorowania aktywności BoNT LC w czasie rzeczywistym10. Dodatkowe techniki opisane w literaturze obejmują depolaryzację po rezonansowym teście opartym na transferze energii w celu wykrycia i ilościowego określenia aktywności BoNT w ekstraktach surowych; metoda ta może być stosowana w zastosowaniach o wysokiej przepustowości10,11, chociaż wymaga zaawansowanego sprzętu do pomiaru transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) i sygnałów polaryzacji. Wreszcie, opisano kilka modeli komórkowych zatrucia BoNT (omówionych w odnośniku11), które umożliwią naukowcom zbadanie często ograniczających właściwości wcześniej wymienionych związków, w tym cytotoksyczności, przepuszczalności komórek i stabilności. Jednak większość istniejących testów opartych na komórkach nie jest podatna na HTS i jest pracochłonna i czasochłonna.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół dla metody HTS, która wykorzystuje dostępny na rynku substrat BoNT/A LC oparty na FRET. Substrat oparty jest na sekwencji cięcia SNAP-25 i jest syntetycznym 13-merowym peptydem, który zawiera końcowy fluorofor i wygaszacz. Rozszczepienie BoNT/A oddziela fluorofor i wygaszacz, znosząc FRET i zwiększając mierzoną fluorescencję, która może być stale mierzona w czytniku płytek fluorometrycznych. Test jest rutynowo stosowany w naszym, jak również w innych laboratoriach, do identyfikacji nowych klas inhibitorów BoNT/A LC lub do określenia względnej siły działania wcześniej zidentyfikowanych związków5,12-15. Test ten jest odpowiedni dla HTS ze względu na jego prostotę, potencjał automatyzacji, niski koszt materiałów i zdolność do badania przesiewowego wielu związków jednocześnie (patrz odniesienie16; Caglič i wsp., przedłożone; Bompiani i wsp., w przygotowaniu). Oprócz HTS, test ten może być stosowany do porównywania względnej siły działania związków poprzez określenie wartości IC50 (stężenie wymagane do zahamowania 50% aktywności BoNT/A LC) związku. Test może być wykonany ręcznie w formacie 96-dołkowym (sekcja Manual Screening w tekście protokołu) lub może być zautomatyzowany w formacie 384-dołkowym dla HTS (sekcja Automated Operation w tekście protokołu).

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Teknova</td><td>H1021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (klasa HPLC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol (klasa HPLC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka testowa</td><td>Costar</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowa płytka testowa o małej objętości</td><td>Greiner</td><td>788076</td><td></td></tr><tr><td>Lista substratów SNAPtide FITC/Dabcyl</td><td>Laboratoria biologiczne</td><td>521</td><td>Podłoże BoNT/A LC na bazie FRET</td></tr><tr><td>Roztwór do czyszczenia szpilek</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 110</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła niestrzępiąca V</td><td>& P Scientific</td><td>VP 540DB</td><td></td></tr><tr><td>Biomek Uszczelka i próbka Pokrywki z folii aluminiowej</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td></td></tr></tbody></table>

kompatybilna z wysoką przepustowością platforma oparta na fret do identyfikacji i charakterystyki modulatorów łańcucha lekkiego neurotoksyny botulinowej

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Neurotoksyna botulinowa (BoNT) to silna i potencjalnie śmiertelna toksyna bakteryjna, która wiąże się z neuronami ruchowymi gospodarza, jest internalizowana w komórce i rozszczepia wewnątrzkomórkowe białka, które są niezbędne do uwalniania neuroprzekaźników. BoNT składa się z łańcucha ciężkiego (HC), który pośredniczy w wiązaniu i internalizacji komórek gospodarza, oraz łańcucha lekkiego (LC), który rozszczepia wewnątrzkomórkowe białka gospodarza niezbędne do uwalniania acetylocholiny. Podczas gdy terapie, które hamują wiązanie/internalizację toksyn, mają krótkie okno czasowe podawania, związki, które celują w wewnątrzkomórkową aktywność LC, mają znacznie dłuższe okno czasowe podawania, co jest szczególnie istotne, biorąc pod uwagę wyjątkowo długi okres półtrwania toksyny. W ostatnich latach małe cząsteczki były intensywnie analizowane jako potencjalne inhibitory LC w oparciu o ich zwiększoną przepuszczalność komórkową w porównaniu z większymi terapiami (peptydy, aptamery itp.). Identyfikacja odprowadzeń często obejmuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS), w których duże biblioteki małych cząsteczek są badane na podstawie ich zdolności do modulowania docelowej funkcji terapeutycznej. W tym miejscu opisujemy test oparty na FRET z komercyjnym substratem BoNT/A LC i rekombinowanym LC, który można zautomatyzować pod kątem HTS potencjalnych inhibitorów BoNT. Ponadto opisujemy technikę manualną, która może być wykorzystana do dalszych wtórnych badań przesiewowych lub do porównania siły działania kilku kandydujących związków.

Test BoNT/A LC oparty na metodzie FRET można przeprowadzić ręcznie w trybie niskoprzepustowym w celu charakterystyki znanych inhibitorów lub przesiewania małych bibliotek; alternatywnie protokół można zredukować i zautomatyzować do przesiewania wysokoprzepustowego (HTS) z dużymi bibliotekami w celu zidentyfikowania nowych inhibitorów BoNT/A LC. Niezależnie od zastosowanego podejścia, podczas inkubacji BoNT/A LC z substratem powinien być obserwowany wzrost fluorescencji w czasie (Rysunek 1A przedstawia re...

Łańcuch lekki neurotoksyny botulinowej typu A (BoNT/A LC) to metaloproteaza, która dostaje się do neuronów ruchowych, rozszczepia ich substrat SNAP-25 i zakłóca neurotransmisję, powodując tym samym porażenie wiotkie. Wykorzystując wysokoprzepustowy test oparty na FRET, duże biblioteki małych cząsteczek mogą być badane pod kątem ich wpływu na aktywność enzymatyczną BoNT/A LC.

Kompatybilna z wysoką przepustowością platforma oparta na FRET do identyfikacji i charakterystyki modulatorów łańcucha lekkiego neurotoksyny botulinowej

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Ogólnym celem tej procedury jest badanie małych cząsteczek pod kątem neurotoksyny botulinowej, hamowania łańcucha lekkiego. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie serii rozcieńczeń związków z dużą dokładnością i precyzją. Drugim krokiem jest przeniesienie rozcieńczeń złożonych na czarną płytkę 96-dołkową.Następnie rozcieńczony enzym łańcucha lekkiego dodaje się do płytki i enzym inkubuje się ze związkiem przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ostatnim krokiem jest dodanie substratu progu łańcucha lekkiego w celu zainicjowania reakcji, która jest monitorowana za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ostatecznie należy zastosować wtórne badania przesiewowe, które wykorzystują niefluorescencyjny substrat peptydowy, w celu potwierdzenia aktywności związku i wyznaczenia bardziej rygorystycznych stałych kinetycznych, takich jak stała dysocjacji inhibitora lub ki.Główną zaletą tego testu w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metody oparte na HPLC lub metody komórkowe, jest to, że jest prosty do wykonania, łatwo zautomatyzowany i może być używany do porównywania względnej siły działania wielu związków. Osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć trudności z przygotowaniem serii rozcieńczeń związków i prawidłowym mieszaniem płytki po dodaniu wszystkich składników. Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania i odczynników zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Skonfiguruj czytnik płytek tak, aby potrząsał płytką ze średnią prędkością przez 10 sekund, a następnie monitorował fluorescencję przy długości fali wzbudzenia 490 nanometrów i długości fali emisji 523 nanometrów co pięć minut w trybie kinetycznym przez godzinę 30 minut w temperaturze pokojowej. Po określeniu zakresu stężeń związku oznacz probówki z odpowiednią nazwą związku i stężeniem, Eloqua, 100% tlenkiem dimetylosulfa lub DMSO do wszystkich probówek, aby przygotować je do rozcieńczenia zbóż złożonych. Następnie należy przygotować seryjne rozcieńczanie związków dla standardowej serii rozcieńczeń od jednego do trzech.Dodać dwa mikrolitry nierozcieńczonego związku do czterech mikrolitrów DMSO w pierwszej probówce z serii rozcieńczeń i dobrze wymieszać z nową końcówką pipety. Usunąć dwa mikrolitry pierwszego rozcieńczenia i dodać do czterech mikrolitrów DMSO w drugiej mieszance probówkowej. Dobrze powtórzyć dla pozostałych rozcieńczeń.Upewnij się, że dobrze wymieszałeś rozcieńczenia związków, aby upewnić się, że stężenia związków są dokładne. Przykryj probówki złożone i odłóż je na bok W temperaturze pokojowej uzyskać płaską denną, nieprzezroczystą czarną płytkę 96-dołkową. Korzystając z zalecanej konfiguracji tablicy, którą można znaleźć w protokole tekstowym.Ręcznie dozować jeden mikrolitr odpowiedniego rozcieńczenia związku bezpośrednio na dno każdej odpowiedniej studzienki dla studzienek od pierwszej do dziewiątej, dozować jeden mikrolitr najwyższego stężenia związku, który ma być badany, do dołka.11. Służy jako związek wewnętrznej kontroli fluorescencji. Ta kontrola ma na celu określenie, czy same związki są fluorescencyjne i/lub wpływają na hydrolizę substratu.Ręcznie dozuj jeden mikrolitr znanego silnego inhibitora do studni, 12 jako kontrolę pozytywną i jeden mikrolitr 100% DMSO do studni. 10 jako kontrola ujemna z automatycznym dozowaniem pipetowym. 79 mikrolitrów buforu do oznaczania na bok studzienek, jeden przez 10 i 12 oraz 89 mikrolitrów na bok studzienki, 11. Upewnij się, że nie dotykasz końcówki do dna studni, w której znajduje się związek, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego studzienek. Vortex, rozcieńczony enzym łańcucha lekkiego, i użyj automatycznego pipetera, aby dodać 10 mikrolitrów enzymu z boku każdej studzienki, z wyjątkiem studzienki 11. Delikatnie postukaj w płytkę, aby upewnić się, że całkowita objętość dodanego enzymu trafia na dno studzienki, delikatnie wymieszaj, przykryj i inkubuj płytkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Ta inkubacja zapewnia etap równowagi wstępnej, w którym związki mogą związać się z łańcuchem lekkim. Przed dodaniem substratu delikatnie wymieszaj neurotoksynę botulinową z substratem o łańcuchu lekkim. Następnie za pomocą automatycznej pipety dodaj 10 mikrolitrów substratu z boku każdej z nich.Cóż, pamiętaj, aby dodać substrat po stronie studni przeciwnej do miejsca, w którym enzym został dodany wcześniej. Delikatnie postukaj w płytkę, aby natychmiast wymieszać odczynniki. Umieścić płytkę w czytniku płytek do mikromiareczkowania fluorescencyjnego i rozpocząć wcześniej skonfigurowany program.Po zakończeniu programu oblicz prędkości enzymu, rysując na wykresie względną jednostkę fluorescencji w funkcji czasu i obliczając nachylenie linii w okresie liniowym reakcji. Przygotuj się do zautomatyzowanej operacji dla badań przesiewowych o wysokiej przepustowości, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, Demonstrując część protokołu badań przesiewowych o wysokiej przepustowości, będziesz młodym doktorem w moim laboratorium. Pokaże, w jaki sposób związki są przenoszone na płytki w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu laboratoryjnego sprzętu do automatyzacji Po dozowaniu rozcieńczonej neurotoksyny botulinowej, enzymu łańcucha lekkiego do płytki testowej.Przypisz obszary na platformie obsługi cieczy dla płytek złożonych, płytek testowych i pojemników z roztworami czyszczącymi. Zaprogramować osobę zajmującą się cieczami tak, aby umieszczała płytki złożone i płytki testowe w wyznaczonych pozycjach i zdejmowała pokrywki płytek przed tłoczeniem. Skalibruj oprogramowanie programu do stemplowania i upewnij się, że kołki do stemplowania są zanurzone, ale nie rysują dolnej części płytki testowej.Wytłocz 50 nanolitrów związku bezpośrednio na płytce testowej zawierającej osiem mikrolitrów neurotoksyny botulinowej. Lekki łańcuch. Wyczyść szpilki po każdej płytce, zanurzając je w DMSO, a następnie susząc na bibułce i powtarzając ten proces z izopropanolem i metanolem.Na koniec wysuszyć kołki nad wentylatorem po wytłoczeniu związków na płytkach testowych enzymem. Oddzielnie ułóż podstawowe płytki złożone, a płytki testowe przykryj górną płytkę testową w stosie, aby zapobiec parowaniu, i odłóż na bok. Upewnij się, że inkubujesz łańcuch lekki ze związkami przez co najmniej pięć minut w temperaturze pokojowej.Dłuższe czasy inkubacji można zastosować przy tłoczeniu dużej liczby płytek. Na koniec dozować substrat do płytek testowych i zmierzyć fluorescencję zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Niezależnie od tego, czy wykonujesz test neurotoksyny botulinowej na bazie progów jako łańcuch lekki w sposób niskoprzepustowy, czy wysokoprzepustowy, wzrost fluorescencji powinien być obserwowany w czasie, gdy neurotoksyna botulinowa, łańcuch lekki jest inkubowany z substratem.Jeśli badane są seryjne rozcieńczenia związku, często uzyskuje się serię linii o różnym nachyleniu. Tu. Końcowe stężenie związku na bazie hydroksy podaje się w jednostkach mikromolowych. Otóż 10 w opisanym tutaj układzie tablic rejestracyjnych służy jako kontrola ujemna, gdzie dodawany jest tylko pojazd.Szybkość tej reakcji definiuje się jako 100% aktywność enzymu, a szybkość w obecności związku można znormalizować do tej szybkości, aby uzyskać względną szybkość lub procentowe hamowanie. Gdy test jest wykonywany z seryjnymi rozcieńczeniami związku, wykres szybkości reakcji w stosunku do stężenia inhibitora można wykorzystać do określenia połowy maksymalnego stężenia hamującego lub IC 50. Zakres rozcieńczenia powinien być tak dobrany, aby wykres wyglądał na esiowaty w celu optymalnego dopasowania krzywej.Wartość IC 50 jest względną miarą siły działania, którą najlepiej opisać jako pozorną wartość KI, ponieważ zależy ona od stężenia enzymu obecnego w teście. Wartość ta może być następnie wykorzystana do porównania i uszeregowania siły działania kilku związków, jeśli zostaną przetestowane. Równolegle, odpowiednie wymieszanie płytki po dodaniu każdego składnika jest kluczowe dla uzyskania płynnego liniowego wzrostu fluorescencji w czasie, co jest niezbędne do dokładnego wyznaczenia prędkości początkowych.Ten wykres przedstawia reprezentatywny eksperyment, w którym nie było wystarczającego mieszania, a tempo tworzenia się produktu nie jest liniowe w czasie. Myląca analiza danych Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż dwie godziny dla maksymalnie ośmiu związków. Po tym eksperymencie można przeprowadzić inne testy z niefluorescencyjnymi substratami peptydowymi, aby potwierdzić, że związki hamują neurotoksynę botulinową, łańcuch lekki i aktywność somatyczną.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić względną siłę działania inhibitorów łańcucha lekkiego neurotoksyny botulinowej. Protokół został zrealizowany w trzech krokach. Po pierwsze, przygotowanie serii rozcieńczeń związków.Po drugie, dodanie rekombinowanego enzymu łańcucha lekkiego, a po trzecie, dodanie substratu fluorescencyjnego i późniejszy pomiar na czytniku płytek fluorescencyjnych.

a-high-throughput-compatible-fret-based-platform-for-identification

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Platforma FRET o wysokiej wydajności do identyfikacji i charakteryzacji modulatorów łańcucha lekkiego neurotoksyny botulicznej

Testy wykrywania neurotoksyny botulinowej (BoNT) BoTest Matrix szybko oczyszczają i kwantyfikują BoNT z różnych matryc próbek. Tutaj prezentujemy protokół wykrywania i oznaczania ilościowego BoNT zarówno z matryc stałych, jak i ciekłych oraz demonstrujemy test z BOTOXEM, pomidorami i mlekiem.

Izolacja i kwantyfikacja neurotoksyny botulinowej ze złożonych matryc za pomocą testów matrycowych BoTest

Tutaj demonstrujemy użycie fluorescencyjnego barwnika Alexa sprzężonego z α-bungarotoksyną do pomiaru lokalizacji powierzchni receptora GABA A i endocytozy w neuronach hipokampa. Dzięki zastosowaniu konstruktów z krótkim znacznikiem zewnątrzkomórkowym, który wiąże α-bungarotoksynę, można uzyskać analizę transportu endocytarnego białek błony komórkowej.

Używanie znacznika miejsca wiązania α-bungarotoksyny do badania lokalizacji i transportu błony receptora GABA A

Neurotoksyna botulinowa jest jedną z najsilniejszych toksyn wśród czynników zagrożenia biologicznego kategorii A, jednak terapia poekspozycyjna nie jest dostępna. Metoda obrazowania o wysokiej zawartości jest potężną metodologią identyfikacji nowych inhibitorów, ponieważ umożliwia wieloparametrowe badania przesiewowe z wykorzystaniem biologicznie istotnych neuronów ruchowych, które są głównym celem tej toksyny.

Test obrazowania o wysokiej zawartości do identyfikacji inhibitorów neurotoksyny botulinowej

Opisany jest niestandardowy protokół różnicowania komórek ES myszy w zdefiniowane populacje wysoce czystych neuronów wykazujących działające synapsy i emergentne zachowanie sieci. Analiza elektrofizjologiczna wykazała utratę przekaźnictwa synaptycznego po ekspozycji na serotypy neurotoksyny botulinowej /A-/G i neurotoksynę tężcową.

Ocena funkcjonalna neurotoksyn biologicznych w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości (HCA) wykorzystujący automatyczne obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białek za pomocą odczytów opartych na transferze energii rezonansu Förstera (FRET). Akwizycja danych dla tego urządzenia openFLIM-HCA jest kontrolowana przez oprogramowanie napisane w μManager, a analiza danych odbywa się w FLIMfit.

Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Opisujemy powtarzalny, zautomatyzowany i bezstronny system obrazowania do charakteryzowania funkcji połączeń nerwowo-mięśniowych przy użyciu ludzkiej tkanki mięśniowej i optogenetycznych neuronów ruchowych. System ten pozwala na funkcjonalną kwantyfikację połączeń nerwowo-mięśniowych w czasie i wykrywa zmniejszone funkcje nerwowo-mięśniowe spowodowane przez neurotoksyny i surowicę pacjenta z miastenią.

Inżynieria i charakterystyka modelu optogenetycznego ludzkiego połączenia nerwowo-mięśniowego

Prezentowany tutaj jest protokół wykorzystujący główne promastigoty Leishmania do określenia wiązania, cytotoksyczności i sygnalizacji indukowanej przez toksyny tworzące pory. Dostarczony jest dowód słuszności koncepcji ze streptolizyną O. Inne toksyny mogą być również wykorzystane do wykorzystania mutantów genetycznych dostępnych w L. major do zdefiniowania nowych mechanizmów oporności na toksyny.

Rozszyfrowanie mechanizmu molekularnego i funkcji toksyn tworzących pory za pomocą Leishmania major

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Odkryj metodę FRET do identyfikacji inhibitorów łańcucha lekkiego neurotoksyny botulinowej typu A. To wysokoprzepustowe podejście umożliwia szybkie przesiewanie małych cząsteczek i określanie ich kinetyki hamowania enzymu.

Kompatybilna z wysoką przepustowością platforma oparta na FRET do identyfikacji i charakterystyki modulatorów łańcucha lekkiego neurotoksyny botulinowej (Wideo) | JoVE Journal

Kompatybilna z wysoką przepustowością platforma oparta na FRET do identyfikacji i charakterystyki modulatorów łańcucha lekkiego neurotoksyny botulinowej

Przeglądaj więcej filmów