Sortowanie osadów komórkowych Streptomyces za pomocą złożonego obiektowego analizatora parametrycznego i sortera
13 lutego 2014
Hodowle Streptomyces hodowane w płynie charakteryzują się niejednorodnymi rozmiarami granulek grzybni. Opisujemy tutaj metodę analizy i sortowania takich granulek w sposób wysokoprzepustowy. Granulki te mogą być wykorzystane do dalszych analiz, które dostarczą wskazówek do zrozumienia i kontrolowania niejednorodności wzrostu.
Ogólnym celem tej procedury jest sortowanie granulek grzybni utworzonych przez nitkowate paciorkowce według wielkości, przy użyciu cytometru przepływowego COPA o dużych cząstkach. Osiąga się to najpierw poprzez wzrost, a następnie pobranie próbki pożądanego szczepu bakterii. W drugim etapie odkształcenie próbki jest mierzone za pomocą coppa.
Dane są następnie analizowane in silico, a granulki grzybni są sortowane według parametrów zdefiniowanych przez użytkownika. Ostatecznie analizy te mogą być wykorzystane do dalszego scharakteryzowania niejednorodności wielkości granulek. Chociaż metoda ta może być stosowana w przypadku paciorkowców, może być również stosowana do innych organizmów, takich jak grzyby strzępkowe, co zademonstruje ta procedura MaRous Petrus, doktorant z naszego laboratorium.
Najpierw hoduj kultury, dodając 100 mililitrów ekstraktu drożdżowego, pożywki z ekstraktu słodowego i 0,2 mililitra 2,5 molowego chlorku magnezu do jednej sterylnej 250-mililitrowej kolby Erlenmeyera, wyposażonej w metalowe sprężyny zwijane dla każdej próbki bakteryjnej. Następnie zaszczepić każdą kolbę jednym razy 10 do ośmiu zarodników Streptomyces, aby uzyskać stężenie zarodników od jednego razy 10 do sześciu zarodników na mililitr i hodować bakterie w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 180 obr./min. Po dwóch dniach użyj sterylnej pięciomililitrowej pipety, aby pobrać pięciomililitrową próbkę z każdej kultury, delikatnie potrząsając kolbą, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
Następnie dozuj każdą próbkę do pojedynczych stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów. Aby ocenić próbki za pomocą analizy Copus, upewnij się, że komputer copus plus pompa i laser argonowy 488 nanometrów są włączone, a następnie otwórz oprogramowanie źródła biologicznego. Upewnij się, że butelka z płynem w osłonie jest pełna i że butelka na odpady jest pusta, a następnie kliknij start i uruchom.
Aby przełączyć laser argonnowy 488 nm z trybu czuwania na włączony po około 60 sekundach, laser będzie gotowy. Kliknij i gotowe, a następnie sprawdź manometry. Kliknij pole wyboru obok opcji nacisk.
W porządku, a następnie po tym, jak system zaleje komórkę przepływową, upewnij się, że ustawienie opóźnienia wynosi 11, a szerokość jest równa siedem. Ustaw progi na 50 dla sygnału i 40 dla minimalnego czasu lotu. Następnie usuń resztki wody z kubka na próbkę.
Dodaj około 50 mililitrów PBS, a następnie dodaj 0,1 mililitra jednej z próbek paciorkowca do kubka. Upewnij się, że kubek jest prawidłowo zamknięty, a następnie kliknij przycisk pobierz, aby rozpocząć zbieranie danych. Zarządzaj szybkością przepływu, aby uzyskać od 30 do 50 zdarzeń na sekundę, gdy zebrano co najmniej 2 500 zdarzeń.
Kliknij, zatrzymaj, a następnie zapisz, aby zapisać dane do późniejszej analizy statystycznej w celu sortowania granulek bakteryjnych dla każdej próbki. Najpierw ustaw limity sortowania i wprowadź szczegółowe informacje o minimalnym i maksymalnym czasie lotu. Alternatywnie wybierz regiony, a następnie zdefiniuj region bramki, aby utworzyć obszar do wyboru granulek o żądanych wymiarach i właściwościach.
Umieść 50-mililitrową tubę, aby zebrać granulki spełniające parametry sortowania. Następnie ustaw liczbę granulek do sortowania i kliknij przycisk sortuj ręcznie, aby posortować według wybranych parametrów. Po sortowaniu usunąć pozostałą próbkę i dwukrotnie przepłukać kubek na próbkę wodą.
Przed wyłączeniem kopusa wyczyść kubek na próbkę 70% etanolem. Teraz uruchom system dwukrotnie. Raz chlorowaną wodą, a raz zwykłą wodą, a następnie opróżnij pojemnik przelewowy Po czyszczeniu kliknij przycisk Stop, aby zwolnić ciśnienie z systemu.
Gdy silnik się zatrzyma, zamknij program i kliknij przycisk Zamknij bez czyszczenia. Następnie wyłącz komputer, copa, laser i pompę tworzą się paciorkowce. Granulki grzybni i płynne kultury o szerokim zakresie rozmiarów.
Aby przeanalizować rozkład wielkości osadów, dwudniową kulturę barwną Streptomyces cila hodowaną w płynie poddano cytometrii przepływowej dużych cząstek przy użyciu profilera copus plus wyposażonego w dyszę o średnicy jednego milimetra. W tym miejscu pokazany jest typowy wykres rozrzutu danych wyjściowych copus. Oś x reprezentuje czas lotu.
Im większy apel, tym dłużej trwa przejście wiązki laserowej. Oś Y wskazuje ekstynkcję, która reprezentuje gęstość optyczną obiektu, każdy punkt w polu odpowiada pojedynczej kulce przechodzącej przez wiązkę laserową. Wykreślenie punktów danych na histogramie wykazało, że rozmiary z tej reprezentatywnej próbki nie miały rozkładu normalnego.
Dystrybucja wydawała się być przekrzywiona do prawego dziennika. Przekształcenie zbioru danych również nie doprowadziło do powstania rozkładu normalnego, aby ocenić, czy rozkład wielkości można wyjaśnić, zakładając mieszaninę dwóch rozkładów normalnych, dane zostały zamodelowane matematycznie. Modelowanie rzeczywiście wykazało populację małych granulek składającą się z 92% wszystkich granulek o średniej wielkości 248 mikrometrów oraz populację dużych granulek składającą się z 8% wszystkich granulek o średniej wielkości 319 mikrometrów.
Przedstawiono reprezentatywną analizę mikrokolonii posortowanych z dużych i małych populacji granulek. Średnie rozmiary granulek z obu populacji wykorzystano do określenia granic sortowania, tak aby ograniczyć sortowanie granulek z nakładającej się części dwóch rozkładów wielkości: granulki mniejsze niż 248 mikrometrów uznano za pochodzące z populacji małych granulek, podczas gdy granulki większe niż 319 mikrometrów uznano za pochodzące z dużej populacji granulek. Analiza mikroskopowa posortowanych granulek potwierdziła ich wyraźne rozmiary Po tej procedurze.
Inne metody, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji lub proteomika, mogą być wykonane w celu rozwikłania mechanizmów leżących u podstaw tej heterogeniczności.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę sortowania pelletów mycelialnych z hodowli Streptomyces w cieczy w oparciu o wielkość, wykorzystując cytometr przepływowy COPA do dużych cząstek. Podejście to pozwala na wysokowydajną analizę niejednorodności wielkości pelletów, co może prowadzić do wnikliwszego zrozumienia kontroli wzrostu.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Mikrobiologia
- Biologia komórki
- Biotechnologia
Tło
- Streptomyces to nitkowate bakterie znane ze swoich złożonych cykli życiowych.
- Pellet mycelialny powstający w czasie wzrostu wykazuje niejednorodność wielkości.
- Zrozumienie tej niejednorodności jest kluczowe dla zastosowań w biotechnologii.
- Cytometria przepływowa zapewnia metodę analizy wielkości cząstek w sposób wysokowydajny.
Cel badania
- Opracowanie metody sortowania pelletów mycelialnych według wielkości.
- Analiza rozkładu wielkości pelletów Streptomyces.
- Udostępnienie ram dla dalszych badań nad niejednorodnością wzrostu.
Zastosowane metody
- Hodowla kultur Streptomyces w kontrolowanym środowisku.
- Pobranie próbek i przygotowanie kultur do analizy cytometrią przepływową.
- Wykorzystanie cytometru przepływowego COPA do pomiaru i sortowania pelletów według wielkości.
- Analiza statystyczna rozkładu wielkości i modelowanie populacji pelletów.
Główne wyniki
- Identyfikacja dwóch odrębnych populacji pelletów w oparciu o wielkość.
- Małe pellety miały średnio 248 mikrometrów, podczas gdy duże pellety miały średnio 319 mikrometrów.
- Rozkład wielkości nie był normalnie rozłożony, co wskazuje na znaczącą niejednorodność.
- Analiza mikroskopowa potwierdziła odrębne wielkości sortowanych pelletów.
Wnioski
- Opracowany metodą efektywnie sortuje pellety mycelialne według wielkości.
- Dalsze analizy mogą wyjaśnić mechanizmy leżące za niejednorodnością wielkości.
- To podejście może być dostosowane do innych organizmów nitkowatych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Heterogeneity in mycelial pellet size directly impacts productivity in streptomycetes-based antibiotic and enzyme production, creating a bottleneck in cell factory optimization. Sorting pellets by size enables mechanistic de-risking of growth variability and supports predictive confidence in strain performance. This capability informs early discovery decisions by linking phenotypic output to bioprocess scalability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of growth heterogeneity hypotheses by isolating defined pellet subpopulations.
- Operational Value: Provides reproducible fractionation of mycelial pellets for downstream omics or phenotypic screening.
- Strategic Value: Supports target validation by linking pellet size to productivity traits in streptomycetes cell factories.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates size-sorted pellet fractions for standardized assay inputs in enzyme or metabolite screening.
- Operational Value: Delivers quantitative time-of-flight and extinction measurements for pellet classification.
- Strategic Value: Facilitates assay standardization by reducing biological noise from pellet size variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables continuity from discovery to preclinical scale by providing sorted pellets for RNA, protein, or omics analysis.
- Operational Value: Supports scalable sample preparation for mechanistic studies underlying pellet heterogeneity.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement by identifying size-correlated productivity markers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling phenotypic screening of pellet subpopulations prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of growth mechanisms through size-based pellet fractionation.
- Screening: Delivers assay-ready, size-homogeneous pellet samples for compound or condition testing.
- Analytics: Provides time-of-flight and extinction readouts for quantitative pellet classification and sorting.
- Translational Research: Connects sorted pellets to downstream molecular analysis for biomarker or mechanism discovery.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for pellet analysis across streptomycetes strain development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in growth studies by enabling isolation of defined pellet populations.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization in pellet analysis across batches and strains.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking pellet size to productivity outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of streptomycetes strains based on size-sorted productivity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and streptomycetes culture handling.
- Dependent on large particle COPAS instrumentation with appropriate nozzle and laser configuration.
- Necessitates standardization of sample preparation and sheath fluid protocols across users.
- Involves adaptation of sorting gates for different pellet size ranges in various filamentous systems.
- Limited by the need for optimization of flow rates and threshold settings for accurate pellet detection.
