Sortowanie osadów komórkowych Streptomyces za pomocą złożonego obiektowego analizatora parametrycznego i sortera

Ogólnym celem niniejszej procedury jest sortowanie granulek grzybni tworzonych przez nitkowate streptomyces według wielkości, z wykorzystaniem cytometru przepływowego COPA do dużych cząstek. Jest to realizowane najpierw poprzez hodowlę i następujące po niej pobieranie próbek pożądanego szczepu bakteryjnego. W drugim kroku próbka szczepu jest mierzona za pomocą urządzenia coppa.

Następnie dane są analizowane in silico, a pellety grzybni są sortowane zgodnie z parametrami zdefiniowanymi przez użytkownika. Ostatecznie analizy te mogą zostać wykorzystane do dalszej charakterystyki heterogeniczności rozmiarów pelletów. Chociaż metoda ta może być stosowana w przypadku streptomyces, można ją również zastosować do innych organizmów, takich jak grzyby strzępkowe; procedurę tę zaprezentuje MaRous Petrus, doktorant z naszego laboratorium.

Najpierw należy wyhodować kultury, dodając 100 milliliters ekstraktu drożdżowego i ekstraktu słodowego oraz 0.2 milliliters 2.5 molar chlorku magnezu do jednej sterylnej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 milliliter, wyposażonej w metalowe sprężyny dla każdej próbki bakteryjnej. Następnie każdą kolbę należy zaszczepić dawką 1 × 10⁸ zarodników streptomyces, aby uzyskać stężenie 1 × 10⁶ zarodników per milliliter, a następnie inkubować bakterie w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 180 RPM. Po dwóch dniach, używając sterylnej pipety o pojemności 5 milliliter, należy pobrać próbkę 5 milliliter z każdej kultury, delikatnie potrząsając kolbą w celu równomiernego rozłożenia komórek.

Następnie rozdziel każdą próbkę do oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Aby ocenić próbki za pomocą analizy copus, upewnij się, że komputer pompy copus plus oraz laser argonowy o długości fali 488 nm są włączone, a następnie otwórz oprogramowanie bio source. Sprawdź, czy butelka z płynem osłonowym jest pełna i czy butelka na odpady jest pusta, a następnie kliknij start i uruchom.

Aby przełączyć laser argonowy 488 nanometrów z trybu czuwania na tryb włączony, należy odczekać około 60 sekund, aż laser będzie gotowy. Kliknij „Gotowe”, a następnie sprawdź manometry. Zaznacz pole wyboru obok napisu „Ciśnienie”.

Dobrze, a następnie, gdy system przeprowadzi przygotowanie cewki przepływowej, należy potwierdzić, że ustawienie opóźnienia (delay) wynosi 11, a szerokość (width) wynosi siedem. Ustaw progi na 50 dla sygnału (signal) oraz 40 dla minimalnego czasu przelotu (time of flight minimum). Następnie usuń pozostałą wodę z kubka na próbkę.

Dodaj około 50 mililitrów PBS, a następnie dodaj 0,1 mililitra jednej z próbek strep demy do kubka. Upewnij się, że kubek jest prawidłowo zamknięty, a następnie kliknij acquire, aby rozpocząć zbieranie danych. Dostosuj prędkość przepływu tak, aby uzyskać od 30 do 50 zdarzeń na sekundę po zebraniu co najmniej 2 500 zdarzeń.

Kliknij stop, a następnie zapisz dane do późniejszej analizy statystycznej w celu sortowania osadów bakteryjnych dla każdej próbki. Najpierw ustaw granice sortowania i wprowadź szczegółowe wartości minimalnego oraz maksymalnego czasu przelotu. Alternatywnie, zaznacz obszary, a następnie zdefiniuj obszar bramkowania (gate region), aby utworzyć strefę wyboru osadów o pożądanych wymiarach i właściwościach.

Umieść probówkę o pojemności 50 ml w celu zebrania pelletów spełniających parametry sortowania. Następnie ustaw liczbę pelletów do posortowania i kliknij sort manually, aby rozpocząć sortowanie zgodnie z wybranymi parametrami. Po zakończeniu sortowania usuń pozostałą próbkę i dwukrotnie przepłucz kubek na próbkę wodą.

Przed wyłączeniem urządzenia należy oczyścić naczynie na próbkę 70% etanolem. Następnie uruchomić system dwukrotnie: raz z wodą chlorowaną, a raz z wodą destylowaną, a następnie opróżnić pojemnik na przelew. Po czyszczeniu kliknąć przycisk stop, aby zwolnić ciśnienie z systemu.

Po zatrzymaniu silnika zamknij program i kliknij wyłącz bez płukania. Następnie wyłącz komputer, dygestorium, laser oraz pompę. Streptomyces tworzy granulki grzybni i kultury ciekłe o szerokim zakresie rozmiarów.

Aby przeanalizować rozkład wielkości pelletów, dwudniową hodowlę Streptomyces cila color prowadzoną w cieczy poddano cytometrii przepływowej dużych cząstek przy użyciu profilometru Copus Plus wyposażonego w dyszę o średnicy jednego milimetra. Poniżej przedstawiono typowy wykres rozrzutu uzyskany z urządzenia Copus. Oś X reprezentuje czas przelotu.

Im większa jest granulka, tym dłużej trwa jej przejście przez wiązkę lasera. Oś Y wskazuje ekstynkcję, która reprezentuje gęstość optyczną obiektu; każdy punkt odpowiada pojedynczej granulce przechodzącej przez wiązkę lasera. Przedstawienie punktów danych na histogramie wykazało, że rozmiary w tej reprezentatywnej próbce nie miały rozkładu normalnego.

Rozkład wydawał się prawostronnie skośny. Transformacja zestawu danych również nie doprowadziła do uzyskania rozkładu normalnego. Aby ocenić, czy rozkład wielkości można wyjaśnić, zakładając mieszaninę dwóch rozkładów normalnych, dane poddano modelowaniu matematycznemu. Modelowanie rzeczywiście wykazało obecność populacji małych granulek, stanowiących 92% wszystkich granulek o średniej wielkości 248 micrometers, oraz populacji dużych granulek, obejmujących 8% wszystkich granulek o średniej wielkości 319 micrometers.

Tutaj przedstawiono reprezentatywną analizę mikrokolon wyselekcjonowanych z populacji dużych i małych pelletów. Średnie rozmiary pelletów obu populacji zostały wykorzystane do zdefiniowania granic sortowania, aby ograniczyć selekcję pelletów z nakładającej się części obu rozkładów wielkości; pellety mniejsze niż 248 micrometers uznano za należące do populacji małych pelletów, natomiast pellety większe niż 319 micrometers uznano za należące do populacji dużych pelletów. Analiza mikroskopowa wyselekcjonowanych pelletów potwierdziła ich odmienne rozmiary po zastosowaniu tej procedury.

W celu wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw tej heterogeniczności można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji lub proteomika.