Sortowanie osadów komórkowych Streptomyces za pomocą złożonego obiektowego analizatora parametrycznego i sortera

Ogólnym celem tej procedury jest sortowanie granulek grzybni utworzonych przez nitkowate paciorkowce według wielkości, przy użyciu cytometru przepływowego COPA o dużych cząstkach. Osiąga się to najpierw poprzez wzrost, a następnie pobranie próbki pożądanego szczepu bakterii. W drugim etapie odkształcenie próbki jest mierzone za pomocą coppa.

Dane są następnie analizowane in silico, a granulki grzybni są sortowane według parametrów zdefiniowanych przez użytkownika. Ostatecznie analizy te mogą być wykorzystane do dalszego scharakteryzowania niejednorodności wielkości granulek. Chociaż metoda ta może być stosowana w przypadku paciorkowców, może być również stosowana do innych organizmów, takich jak grzyby strzępkowe, co zademonstruje ta procedura MaRous Petrus, doktorant z naszego laboratorium.

Najpierw hoduj kultury, dodając 100 mililitrów ekstraktu drożdżowego, pożywki z ekstraktu słodowego i 0,2 mililitra 2,5 molowego chlorku magnezu do jednej sterylnej 250-mililitrowej kolby Erlenmeyera, wyposażonej w metalowe sprężyny zwijane dla każdej próbki bakteryjnej. Następnie zaszczepić każdą kolbę jednym razy 10 do ośmiu zarodników Streptomyces, aby uzyskać stężenie zarodników od jednego razy 10 do sześciu zarodników na mililitr i hodować bakterie w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 180 obr./min. Po dwóch dniach użyj sterylnej pięciomililitrowej pipety, aby pobrać pięciomililitrową próbkę z każdej kultury, delikatnie potrząsając kolbą, aby równomiernie rozprowadzić komórki.

Następnie dozuj każdą próbkę do pojedynczych stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów. Aby ocenić próbki za pomocą analizy Copus, upewnij się, że komputer copus plus pompa i laser argonowy 488 nanometrów są włączone, a następnie otwórz oprogramowanie źródła biologicznego. Upewnij się, że butelka z płynem w osłonie jest pełna i że butelka na odpady jest pusta, a następnie kliknij start i uruchom.

Aby przełączyć laser argonnowy 488 nm z trybu czuwania na włączony po około 60 sekundach, laser będzie gotowy. Kliknij i gotowe, a następnie sprawdź manometry. Kliknij pole wyboru obok opcji nacisk.

W porządku, a następnie po tym, jak system zaleje komórkę przepływową, upewnij się, że ustawienie opóźnienia wynosi 11, a szerokość jest równa siedem. Ustaw progi na 50 dla sygnału i 40 dla minimalnego czasu lotu. Następnie usuń resztki wody z kubka na próbkę.

Dodaj około 50 mililitrów PBS, a następnie dodaj 0,1 mililitra jednej z próbek paciorkowca do kubka. Upewnij się, że kubek jest prawidłowo zamknięty, a następnie kliknij przycisk pobierz, aby rozpocząć zbieranie danych. Zarządzaj szybkością przepływu, aby uzyskać od 30 do 50 zdarzeń na sekundę, gdy zebrano co najmniej 2 500 zdarzeń.

Kliknij, zatrzymaj, a następnie zapisz, aby zapisać dane do późniejszej analizy statystycznej w celu sortowania granulek bakteryjnych dla każdej próbki. Najpierw ustaw limity sortowania i wprowadź szczegółowe informacje o minimalnym i maksymalnym czasie lotu. Alternatywnie wybierz regiony, a następnie zdefiniuj region bramki, aby utworzyć obszar do wyboru granulek o żądanych wymiarach i właściwościach.

Umieść 50-mililitrową tubę, aby zebrać granulki spełniające parametry sortowania. Następnie ustaw liczbę granulek do sortowania i kliknij przycisk sortuj ręcznie, aby posortować według wybranych parametrów. Po sortowaniu usunąć pozostałą próbkę i dwukrotnie przepłukać kubek na próbkę wodą.

Przed wyłączeniem kopusa wyczyść kubek na próbkę 70% etanolem. Teraz uruchom system dwukrotnie. Raz chlorowaną wodą, a raz zwykłą wodą, a następnie opróżnij pojemnik przelewowy Po czyszczeniu kliknij przycisk Stop, aby zwolnić ciśnienie z systemu.

Gdy silnik się zatrzyma, zamknij program i kliknij przycisk Zamknij bez czyszczenia. Następnie wyłącz komputer, copa, laser i pompę tworzą się paciorkowce. Granulki grzybni i płynne kultury o szerokim zakresie rozmiarów.

Aby przeanalizować rozkład wielkości osadów, dwudniową kulturę barwną Streptomyces cila hodowaną w płynie poddano cytometrii przepływowej dużych cząstek przy użyciu profilera copus plus wyposażonego w dyszę o średnicy jednego milimetra. W tym miejscu pokazany jest typowy wykres rozrzutu danych wyjściowych copus. Oś x reprezentuje czas lotu.

Im większy apel, tym dłużej trwa przejście wiązki laserowej. Oś Y wskazuje ekstynkcję, która reprezentuje gęstość optyczną obiektu, każdy punkt w polu odpowiada pojedynczej kulce przechodzącej przez wiązkę laserową. Wykreślenie punktów danych na histogramie wykazało, że rozmiary z tej reprezentatywnej próbki nie miały rozkładu normalnego.

Dystrybucja wydawała się być przekrzywiona do prawego dziennika. Przekształcenie zbioru danych również nie doprowadziło do powstania rozkładu normalnego, aby ocenić, czy rozkład wielkości można wyjaśnić, zakładając mieszaninę dwóch rozkładów normalnych, dane zostały zamodelowane matematycznie. Modelowanie rzeczywiście wykazało populację małych granulek składającą się z 92% wszystkich granulek o średniej wielkości 248 mikrometrów oraz populację dużych granulek składającą się z 8% wszystkich granulek o średniej wielkości 319 mikrometrów.

Przedstawiono reprezentatywną analizę mikrokolonii posortowanych z dużych i małych populacji granulek. Średnie rozmiary granulek z obu populacji wykorzystano do określenia granic sortowania, tak aby ograniczyć sortowanie granulek z nakładającej się części dwóch rozkładów wielkości: granulki mniejsze niż 248 mikrometrów uznano za pochodzące z populacji małych granulek, podczas gdy granulki większe niż 319 mikrometrów uznano za pochodzące z dużej populacji granulek. Analiza mikroskopowa posortowanych granulek potwierdziła ich wyraźne rozmiary Po tej procedurze.

Inne metody, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji lub proteomika, mogą być wykonane w celu rozwikłania mechanizmów leżących u podstaw tej heterogeniczności.