Wykrywanie ekspresji docelowych enzymów w genetycznie modyfikowanych komórkach bakteryjnych

Zacznij od rurek zawierających genetycznie modyfikowane komórki bakteryjne. Każda bakteria zawiera fosmidy o wysokiej jakości kopiowania, które kodują różne enzymy.

Inkubuj rurki poprzez potrząsanie w celu ułatwienia ekspresji różnych enzymów wewnątrzkomórkowych.

Dodaj do probówki substrat specyficzny dla docelowego enzymu i dodaj równą objętość buforu do probówki kontrolnej.

Inkubuj z drżeniem. Substrat wchodzi do komórek, gdzie enzymy docelowe go rozszczepiają i wytwarzają produkt fluorescencyjny.

Załaduj rurkę sterującą do cytometru przepływowego z prekaliserią.

Gdy każda komórka przechodzi przez wiązkę lasera, rozprasza ona światło. Wygeneruj wykres rozproszenia, aby zidentyfikować pojedyncze komórki, które rozpraszają mniej światła niż skupiska.

Wyklucz skupiska komórek i wykreśl sygnał fluorescencji pojedynczych komórek, aby ustalić fluorescencję bazową.

Umieść rurkę impregnowaną podłożem w cytometrze przepływowym, aby zmierzyć sygnał fluorescencji.

Zwiększony sygnał fluorescencji w komórkach poddanych substratom w porównaniu z komórkami kontrolnymi potwierdza ekspresję docelowego enzymu.

Aby przesiewać interesujące się enzymy metagenomowe, inkubuj posortowane komórki w temperaturze 3