Name: Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 34 s
Description: Poznaj metodę BiFC-FRET-FLIM do wizualizacji trójstronnych interakcji białkowych w żywych komórkach roślin Nicotiana benthamiana. Technika ta umożliwia ilościowe badanie kompleksów białkowych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NB, GG, SB, KC serdecznie dziękujemy Komisji ds. Grantów Uniwersyteckich (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE oraz Radzie Badań Naukowych i Przemysłowych (CSIR) za ich stypendia badawcze. Dziękujemy Departamentowi Biotechnologii (DBT), Rządowi Indii, Departamentowi Nauki i Technologii (DST-FIST), Rządowi Indii za wsparcie finansowe.

1. Klonowanie genów w wektorach wejściowych i docelowych (Rysunek 2)
<ol>
	<li>Namnożyć sekwencję kodującą (CDS) genów docelowych (w naszym przypadku geny M i C) metodą PCR, a następnie sklonować je do odpowiednich wektorów wejściowych (np. wektora pENTR/D-TOPO; patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z wektorami użytymi w tym eksperymencie).</li>
	<li>Hodować klony na płytkach z antybiotykami. Zweryfikować wyselekcjonowane na antybiotykach klony za pomocą trawienia restrykcyjnego i sekwencjonowania DNA22,23.</li>
	<li>Przenieść zrekonstytuowane CDS z klonów wejściowych do wektorów docelowych (pSPYNE-35S, pSPYCE-35S, pSITE-1CA i pSITE-3CA) i potwierdzić transfer sekwencji z wektorów wejściowych do docelowych poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi. 
	UWAGA: Wszystkie wektory użyte w tym eksperymencie są wymienione w Tabeli 1.</li>
	<li>Na koniec przeprowadzić transformację komórek Agrobacterium GV3101 (pMP90 (GentR)) wektorami docelowymi metodą elektroporacji (Rysunek 3)24.</li>
</ol>
2. Warunki wzrostu roślin Nicotiana benthamiana
UWAGA: Rośliny Nicotiana należy hodować do stadium 4-6 liści w warunkach kontrolnych.
<ol>
	<li>Aby wyhodować rośliny Nicotiana, przygotować mieszankę glebową, łącząc dostępne w handlu podłoża z torfem kokosowym i kompostem w stosunku 2:1:1.</li>
	<li>W plastikowej tacy wysypać warstwę mieszanki glebowej o grubości 1 cala, tworząc podłoże, a następnie nasycić ją wodą dejonizowaną. W podłożu wysiać około 200 nasion.</li>
	<li>Przenieść całość do większej tacy zawierającej 1 cm wody. Przykryć tacę folią plastikową, aby stworzyć komorę wilgotnościową.</li>
	<li>Umieścić taki zestaw w komorze wzrostowej ustawionej na 23 °C, z cyklem 16 h światła i 8 h ciemności oraz natężeniem światła 150-170 µmol/m2s.</li>
	<li>Po dwóch tygodniach przenieść młode siewki do małych doniczek o średnicy 3-4 cali, zawierających nasyconą wodą mieszankę glebową.</li>
	<li>Umieścić doniczki w plastikowych tacach i przenieść je do komory wzrostowej na kolejne cztery tygodnie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie szczepów bakteryjnych do agroinfiltracji
UWAGA: W przypadku agroinfiltracji szczepy bakteryjne muszą być świeżo przepaszczarkowane i zmieszane ze szczepem p19 Agrobacterium w odpowiednich proporcjach.
<ol>
	<li>Przygotować szalki z agarem 2xYT zawierającym rifampicynę (100 µg/mL), gentamicinę (25 µg/mL) i kanamycynę (50 µg/mL) dla Agrobacterium przenoszącego wektory pSPYNE-35S i pSPYCE-35S. Dla szczepu zawierającego wektor pSITE należy użyć rifampicyny (100 µg/mL), gentamiciny (25 µg/mL) i spektynomycyny (50 µg/mL).</li>
	<li>Przeciągnąć szczepy Agrobacterium zawierające plazmidy na te szalki, używając sterylnych pętli szczepiących w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
	<li>Inkubować je w temperaturze 28 °C przez 48 h w ciemności.</li>
	<li>Rozpocząć tę procedurę poprzez szczepienie szczepu Agrobacterium GV3101 przenoszącego konstrukty BiFC i FRET (przygotowane w wektorach pSPYNE-35S, pSPYCE-35S i pSITE) z posianych szalek do 10 mL bulionu 2xYT zawierającego odpowiednie antybiotyki (rifampicynę (100 µg/mL), gentamicinę (25 µg/mL), kanamycynę (50 µg/mL) lub spektynomycynę (50 µg/mL)).</li>
	<li>Dodatkowo zaszczepić kulturę szczepu p19 Agrobacteria w 10 mL bulionu 2xYT zawierającego rifampicynę (100 µg/mL) i kanamycynę (50 µg/mL). 
	UWAGA: Szczep p19 jest dodawany w celu zapobiegania wyciszaniu transgenów.</li>
	<li>Przykryć kolbę folią aluminiową i inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 28 °C i przy 170 rpm przez 16 h w ciemności.</li>
	<li>Po nocnym wzroście przenieść 1 mL tej kultury do jednorazowej kuwety, aby zmierzyć gęstość optyczną (O.D.) kultur przy 600 nm za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Zmieszać kultury odpowiednich szczepów zawierających partnerów BiFC i FRET w taki sposób, aby końcowa gęstość optyczna każdej z kultur wynosiła 0,5, a kultury p19 – 0,3 w całkowitej objętości 2 mL.</li>
	<li>Aby uzyskać te proporcje, należy użyć poniższego wzoru: 
	<img alt="Wzór bilansowania gęstości optycznej dla obliczenia objętości kultury w eksperymencie mikrobiologicznym." src="/files/ftp_upload/62791/62791eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
	ODobtained = gęstość optyczna kultury zmierzona przy 600 nm 
	Vculture = wymagana objętość kultury 
	ODfinal = 0,5 dla konstruktów i 0,3 dla p19 
	Vfinal = końcowa objętość do infiltracji, wynosząca 2 mL 
	UWAGA: Kombinacje konstruktów użyte w niniejszym badaniu wyszczególniono w Tabeli 2.</li>
	<li>Odwirować zmieszane kultury Agrobacterium przy 3 000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej i ostrożnie usunąć nadsącz. Resuspender osad w 2 mL świeżo przygotowanego buforu do infiltracji (10 mM MES, 100 µM acetosyringonu i 10 mM MgCl2). Użyć mieszadła typu vortex, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek.</li>
	<li>Inkubować probówki zawierające resuspendowane komórki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 3 h.</li>
	<li>W międzyczasie opisać każdą doniczkę z rośliną, podając mieszankę konstruktów, którą będzie ona infiltrowana. Użyć dwóch roślin dla każdej mieszanki infiltracyjnej.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę 1 mL bez igły mieszaniną agrobakteryjną. Delikatnie, ale pewnie docisnąć strzykawkę do strony abaksjalnej całkowicie rozwiniętego liścia, podtrzymując liść z drugiej strony. Powoli nacisnąć tłok, aż roztwory wypełnią obszar liścia równy 2-3 krociom długości końcówki strzykawki.</li>
	<li>Infiltrować do czterech miejsc na liściu i 3-4 liście na roślinę, jak pokazano na Rysunku 4. 
	UWAGA: Zmieniać rękawiczki lub przecierać je 70% alkoholem pomiędzy próbkami, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.</li>
	<li>Przenieść wszystkie doniczki na tacę i inkubować w komorze wzrostowej w tych samych warunkach, o których wspomniano w kroku 2.</li>
	<li>Sprawdzać niewielką część agroinfiltrowanego liścia w różnych punktach czasowych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Gdy w komórkach będzie można wykryć fluorescencję zarówno YFP, jak i CFP, przystąpić do analizy BiFC-FRET FLIM za pomocą mikroskopu konfokalnego. W tym eksperymencie analizę przeprowadzono 3 dni po agroinfiltracji. 
	​UWAGA: Okres inkubacji po agroinfiltracji należy dobrać indywidualnie dla każdej kombinacji promotora i genu, aby uniknąć nadmiernej ekspresji białek chimerycznych użytych w analizie BiFC-FRET FLIM. Nadmierna ekspresja białek partnerów może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich w badaniu oddziaływań.</li>
</ol>
4. Przygotowanie preparatów do wizualizacji fluorescencyjnej
<ol>
	<li>Gdy rośliny będą gotowe do wizualizacji, wyciąć kwadratowe próbki liści w odległości 5-8 mm od miejsca infiltracji i zamocować je w wodzie destylowanej na czystych szkiełkach. 
	UWAGA: Aby zminimalizować autofluorescencję tła, należy przemyć szkiełka 80% etanolem, a następnie wodą destylowaną 3-4 razy, wysuszyć je na powietrzu i przechowywać na arkuszu chłonnym.</li>
	<li>Próbkę liścia przykryć czystym szkiełkiem nakrywkowym i zabezpieczyć za pomocą laku do paznokci.</li>
	<li>Próbki wizualizować przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.</li>
</ol>
5. Analiza FRET-FLIM z użyciem konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego
UWAGA: W tej procedurze podstawą określania i ilościowego pomiaru oddziaływania między dwoma białkami jest skrócenie czasu życia fluorescencji partnera-donora FRET podczas jego oddziaływania z akceptorem, co służy do obliczenia wydajności FRET. Złożoność w przypadku oddziaływania trójdzielnego wzrasta jeszcze bardziej, ponieważ akceptor FRET w tym przypadku nie jest pojedynczą cząsteczką, lecz rozszczepioną parą YFP-BiFC, która musi najpierw ulec rekonstytucji in vivo, aby stać się funkcjonalnym fluorophorem-akceptorem FRET. Aby przeprowadzić FRET-FLIM, należy najpierw określić czas życia fluorescencji cząsteczki donora samodzielnie, a następnie w obecności partnera FRET.
<ol>
	<li>Otwórz aplikację FLIM w konfokalnym skaningowym mikroskopie laserowym, uruchom konsolę i wykorzystaj zliczanie fotonów z rozpoznawaniem wzorców do pomiaru czasu życia fluorescencji. Wybierz standardowy tryb pomiaru „All photon counting”.</li>
	<li>Przeanalizuj próbki z dwóch typów roślin poddanych agroinfiltracji: jednej tylko z donorem (C-CFP) i drugiej z donorem oraz akceptorem jednocześnie (C-CFP wraz z M-YFP). 
	UWAGA: Ponieważ interakcja białka M z białkiem C została już potwierdzona za pomocą BiFC i Y2H, oczekuje się dobrej wydajności FRET dla tej pary oddziałującej.</li>
	<li>Następnie zeskanuj liść po agroinfiltracji C-CFP i ustaw ostrość na komórce wykazującej silną fluorescencję CFP. Uruchom tryb skanowania laserowego i skonfiguruj system do wizualizacji CFP oraz pomiarów FLIM (laser impulsowy λex 440 nm, detektory hybrydowe λem 480-520 nm, prędkość skanowania 512 x 512 pikseli przy 400 Hz).</li>
	<li>Dostosuj ostrość, powiększenie i inteligentne wzmocnienie (smart gain), aby skupić się na obszarze, który ma zostać zarejestrowany.</li>
	<li>Oświetl próbkę laserem o mocy wystarczającej do zarejestrowania około 0,1 fotonu na impuls. W przypadku próbek o zmiennej intensywności fluorescencji zarejestruj 50 klatek, aby zebrać odpowiednią liczbę fotonów wymaganą do pomiaru czasu życia. CFP wykazuje dwa czasy życia fluorescencji ze względu na adaptację konformacyjną; dlatego dopasuj dane, używając modelu rekonwolucji n-wykładniczej, utrzymując wartość n równą 2.</li>
	<li>Przy tych ustawieniach CFP wykazuje dwa czasy życia: 1,0 i 3,2 ns. W dalszych obliczeniach wykorzystywany jest wyższy czas życia wynoszący 3,2 ns25,26.</li>
	<li>Aby obliczyć wydajność FRET za pomocą FLIM, która jest miarą stopnia interakcji między dwoma białkami, pobierz próbkę liścia współinfiltrowanego C-CFP i M-YFP. Znajdź komórkę ekspresującą zarówno C-CFP, jak i M-YFP i potwierdź ich odpowiednie wzorce emisji, wzbudzając je za pomocą lasera impulsowego λex 440 nm (λem 480-520 nm) oraz białego lasera λex 514 nm (λem 526-550 nm). Skanuj sekwencyjnie i zidentyfikuj komórkę wykazującą fluorescencję zarówno CFP, jak i YFP.</li>
	<li>Po potwierdzeniu fluorescencji obu białek przełącz się na konsolę FLIM, aby zmierzyć czas życia CFP, korzystając z tych samych ustawień, których użyto wcześniej do pomiaru czasu życia C-CFP (krok 5.5). 
	UWAGA: Ta komórka ekspresuje również M-YFP, który może potencjalnie oddziaływać z C-CFP i powodować skrócenie czasu życia C-CFP.</li>
	<li>Dopasuj uzyskany wykres za pomocą modelu rekonwolucji n-wykładniczej z n = 2. Zaobserwowano skrócenie czasu życia CFP z 3,2 do 2,6 ns, co wskazuje na rezonansowy transfer energii Förstera między CFP a YFP (Rycina 5A).</li>
	<li>Uruchom teraz konsolę FRET w oprogramowaniu i oblicz wydajność FRET, wprowadzając ręcznie czas życia niegaszonego donora do równania dostarczonego w programie. Obserwowana wydajność FRET wynosi 56%.</li>
	<li>Interakcja trójczłonowa
	<ol>
		<li>Na koniec, aby zwizualizować interakcje między trzema partnerami, pobierz próbkę liścia z rośliny współinfiltrowanej C-CFP, M-YFPn oraz M-YFPc.</li>
		<li>Zeskanuj wycinek liścia w poszukiwaniu komórki wykazującej fluorescencję zarówno CFP, jak i zrekonstytuowanego YFP wynikającą z interakcji BiFC między dwoma białkami M. Użyj tych samych długości fal lasera i emisji, co wcześniej.</li>
		<li>Następnie wyłącz laser 514 nm i przejdź do konsoli FLIM. 
		UWAGA: Jeśli dimer M-YFP oddziałuje z C-CFP, powinno dojść do skrócenia czasu życia C-CFP, analogicznie do interakcji z M-YFP. Jednak jeśli C-CFP nie wejdzie w interakcję z dimerem M-YFP, czas życia jego fluorescencji powinien pozostać na poziomie 3,2 ns.</li>
		<li>Używając ustawień podobnych do opisanych powyżej, zmierz czas życia CFP w obecności zrekonstytuowanego YFP. Dopasuj uzyskany wykres za pomocą modelu rekonwolucji n-wykładniczej z n = 2 i przejdź do konsoli FRET. 
		UWAGA: Odnotowano spadek czasu życia CFP z 3,2 do 2,3 ns. Oblicz wydajność FRET zgodnie z opisem powyżej. Obliczona wydajność FRET wynosi 55%. Skrócenie czasu życia donora i dobra wydajność FRET na poziomie 55% potwierdzają interakcję trójczłonową między dwoma białkami M a białkiem C in vivo (patrz Rycina 5B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Grove, C. A., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+functionality+and+transcription+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biosystem%22%5BJournal%5D)">Transcription factor functionality and transcription regulatory networks.</a> Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).</li>
<li>Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choose+your+partners%3A+dimerization+in+eukaryotic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).</li>
<li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MADS-box+gene+family+in+rice%3A+genome-wide+identification%2C+organization+and+expression+profiling+during+reproductive+development+and+stress%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress.</a> BMC Genomics. 8 (242), (2007).</li>
<li>Theißen, G., Gramzow, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+evolution+of+plant+MADS+domain+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Transcription+Factors%3A+Evolutionary%2C+Structural+and+Functional+Aspects%22%5BJournal%5D)">Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors.</a> Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).</li>
<li>Schweiger, R., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+visualized+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+tobacco+protoplasts+and+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).</li>
<li>Bracha-Drori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein-protein+interactions+in+plants+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).</li>
<li>Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+bimolecular+fluorescence+complementation+and+f%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+reveals+ternary+SNARE+complex+formation+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Combined bimolecular fluorescence complementation and förster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells.</a> Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).</li>
<li>Margineanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+protein-protein+interactions+using+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+%28FLIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM).</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%3A+fundamentals+and+advances+in+instrumentation%2C+analysis%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications.</a> Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1(2020).</li>
<li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+FRET-FLIM+labeling+conditions+to+detect+nuclear+protein+interactions+at+native+expression+levels+in+living+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).</li>
<li>Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+highly+efficient+method+for+transient+gene+expression+in+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants.</a> Frontiers in Plant Science. , 11(2020).</li>
<li>Kudla, J., Bock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lighting+the+way+to+protein-protein+interactions%3A+Recommendations+on+best+practices+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses.</a> Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).</li>
<li>Shyu, Y. J., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+complementation%3A+an+emerging+tool+for+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research.</a> Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).</li>
<li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+bimolecular+fluorescence+complementation+assay+with+a+high+signal-to-noise+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio.</a> BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).</li>
<li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29%3A+A+5-year+update+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives.</a> BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).</li>
<li>Chakrabarty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pSITE+vectors+for+stable+integration+or+transient+expression+of+autofluorescent+protein+fusions+in+plants%3A+Probing+Nicotiana+benthamiana-+Virus+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).</li>
<li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).</li>
<li>Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+Agrobacterium+binary+Ti+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.</a> Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).</li>
<li>Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+migration+in+gel+filtration+of+the+Cf-4+and+Cf-9+resistance+proteins+is+an+intrinsic+property+of+Cf+proteins+and+not+because+of+their+association+with+high-molecular-weight+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins.</a> Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).</li>
<li>Xie, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+SARS-CoV-2+using+a+reverse+genetic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system.</a> Nature Protocols. 16, (2021).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+plasmid+construction+strategy+for+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimized plasmid construction strategy for Cas9.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).</li>
<li>Mattanovich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transformation+of+Agrobacterium+spp.+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747(1989).</li>
<li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li>
<li>Tramier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picosecond-hetero-FRET+microscopy+to+probe+protein-protein+interactions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).</li>
<li>Alvarez, L. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SP8+FALCON%3A+a+novel+concept+in+fluorescence+lifetime+imaging+enabling+video-rate+confocal+FLIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM.</a> Nature Methods. 20, 2-4 (2019).</li>
<li>Postma, M., Goedhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plotsofdata-a+web+app+for+visualizing+data+together+with+their+summaries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries.</a> PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).</li>
<li>Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-chromophore+fret+microscopy+to+analyze+multiprotein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).</li>
<li>Waadt, R., Kudla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+plant+visualization+of+protein+interactions+using+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Niniejszy protokół demonstruje zastosowanie testu FRET-FLIM opartego na BiFC w celu ustalenia tworzenia trójskładnikowego kompleksu między dwoma monomerami białka MADS-box i białkiem czujnika wapnia. Protokół jest adaptacją raportu Y. John Shyu i wsp., w którym opracowali oni metodę FRET opartą na BiFC do wizualizacji trójskładnikowego kompleksu utworzonego między heterodimerami Fos-Jun a NFAT lub p65 przy użyciu metody emisji uczulonej7. Wcześniej, w roku 2004-29, Galperin i jego współpracownicy ...

Interakcje białko-białko (PPI) stanowią podstawę prawidłowego funkcjonowania komórek eukariotycznych poprzez regulację różnych procesów metabolicznych i rozwojowych. Niektóre IPP są stabilne, podczas gdy inne mają charakter przejściowy. Interakcje można kategoryzować na podstawie liczby i typu elementów w interakcji, takich jak dimeryczne, trymeryczne, tetrameryczne homomeryczne i heteromeryczne1. Identyfikacja i charakterystyka interakcji białkowych może prowadzić do lepszego zrozumienia funkcji białek i sieci regulacyjnych.
Czynniki transkrypcyjne to białka, które biorą udział w funkcjach regulacyjnych. Regulują szybkość transkrypcji swoich genów poprzez wiązanie się z DNA. Czasami oligomeryzacja lub tworzenie kompleksów wyższego rzędu przez białka jest warunkiem wstępnym do realizacji ich funkcji2. Czynniki transkrypcyjne MADS-box roślin to geny homeotyczne, które regulują różne procesy, takie jak przejście kwiatowe, rozwój organów kwiatowych, zapłodnienie, rozwój nasion, starzenie się i rozwój wegetatywny. Wiadomo, że tworzą kompleksy wyższego rzędu, które wiążą się z klasą DNA3,4. Badanie sieci PPI między czynnikami transkrypcyjnymi i ich interaktorami dostarcza informacji na temat złożoności leżącej u podstaw regulacji transkrypcji.
Przejściowa ekspresja białka u Nicotiana benthamiana była popularnym podejściem do badania lokalizacji białek lub interakcji białko-białko in vivo5. BiFC i FRET to metody badania interakcji białko-białko in vivo przy użyciu fluorescencyjnych systemów reporterowych6. Wykazano, że połączenie tych dwóch technik ujawnia interakcję między trzema białkami7. FRET mierzy się za pomocą fotowybielania akceptorowego, emisji uczulożonej i techniki obrazowania fluorescencji (FLIM). Test FRET oparty na FLIM pojawił się jako narzędzie, które zapewnia dokładną kwantyfikację i czasoprzestrzenną specyficzność dla pomiarów transferu energii między dwiema cząsteczkami na podstawie ich czasu życia fluorescencji8. FLIM mierzy czas, w którym fluorofor pozostaje w stanie wzbudzonym przed wyemitowaniem fotonu i jest lepszy niż techniki wykorzystujące same pomiary intensywności9,10. Oprócz systemów heterologicznych, takich jak Nicotiana benthamiana i skórki naskórka cebuli, nowsze doniesienia wykazały wykorzystanie korzeni Arabidopsis i młodych sadzonek ryżu itp., do analizy in vivo interakcji białko-białko w warunkach natywnych11,12.
Oprócz odpowiedniego systemu ekspresji, wybór partnerów do testów BiFC i FRET jest również kluczowy dla powodzenia tego eksperymentu. PPI wśród partnerów używanych w konfiguracji BiFC powinien zostać zweryfikowany przy użyciu odpowiednich kontroli przed ich użyciem jako sprzężonego partnera w eksperymencie FRET13. BiFC wykorzystuje strukturalną komplementację N- i C-końcowych części białka fluorescencyjnego. Wspólnym ograniczeniem w większości, jeśli nie we wszystkich białkach fluorescencyjnych stosowanych w testach BiFC jest samoorganizacja między dwoma pochodnymi fragmentów niefluorescencyjnych, przyczyniająca się do fałszywie dodatniej fluorescencji i zmniejszająca stosunek sygnału do szumu (S/N)14. Ostatnie osiągnięcia, w tym mutacje punktowe lub pozycja rozszczepienia białka fluorescencyjnego, doprowadziły do powstania par BiFC o zwiększonej intensywności, wyższej specyficzności, wysokim stosunku sygnału do szumu15,16. Te białka fluorescencyjne mogą być również wykorzystane do przeprowadzenia BiFC w zależności od przydatności eksperymentu.
Tradycyjnie, CFP i YFP były używane jako para dawców i akceptorów w eksperymentach FRET17. Stwierdzono jednak, że YFP lub m-cytryn są lepszymi dawcami FRET (gdy są używane z RFP jako akceptorem) ze względu na wysoką wydajność kwantową (QY) podczas natywnej ekspresji białek docelowych w systemie korzeniowym Arabidopsis. Dobór promotorów (konstytutywny kontra natywny/endogenny) i fluoroforu również odgrywa kluczową rolę w projektowaniu udanego eksperymentu BiFC-FRET-FLIM. Należy zauważyć, że skuteczność donorów FRET i przydatność par FRET mają tendencję do zmiany wraz ze zmianą promotora i systemu biologicznego używanego do ekspresji. Jakość fluoroforu, która odnosi się do jego jasności, zależy od pH, temperatury i używanego systemu biologicznego. Sugerujemy, aby kryteria te zostały dokładnie rozważone przed wyborem pary fluoroforów do eksperymentu FRET. System biologiczny, promotory i białka użyte w tym protokole dobrze współpracowały z fluoroforami CFP-YFP w eksperymencie BiFC FRET-FLIM.
W obecnym badaniu wykorzystujemy funkcję FLIM do wizualizacji interakcji między trzema cząsteczkami białka za pomocą FRET opartego na BiFC. W tej technice dwa białka są znakowane rozszczepionym białkiem YFP, a trzecie białko CFP. Ponieważ byliśmy zainteresowani badaniem interakcji homodimeru białka MADS-box (M) z białkiem czujnika wapnia (C), białka te zostały oznaczone białkami fluorescencyjnymi w wektorach pSITE-1CA i pSITE-3CA18. Dwóch z oddziałujących partnerów w tym teście zostało oznaczonych N- i C-końcowymi częściami YFP w wektorach pSPYNE-35S i pSPYCE-35S19, a ich interakcja skutkuje odtworzeniem funkcjonalnego YFP, który działa jako akceptor FRET do trzeciego partnera oddziałującego, który jest oznaczony CFP (działającym jako dawca FRET) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W tym konkretnym przypadku PPI między dwoma monomerami M oraz między M i C został zwalidowany poprzez wykonanie BiFC w trzech różnych systemach wraz z układem drożdża-dwa hybrydy. Wektory te zostały zmobilizowane do szczepu Agrobacterium tumifaciens GV3101 za pomocą elektroporacji. Szczep GV3101 ma rozbrojony plazmid Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) z odpornością na gentamycynę20. Szczep p19 Agrobacterium został dodany wraz ze wszystkimi naciekami, aby zapobiec wyciszaniu transgenu21. Zalecamy, aby te trzy białka były również używane w przeciwstawnych konformacjach w celu walidacji oddziaływań trójstronnych.
W tej technice zastosowaliśmy FLIM, gdzie najpierw mierzy się czas życia fluorescencji dawcy (niewygaszony czas życia dawcy) w przypadku braku akceptora. Następnie mierzy się jego żywotność w obecności akceptora (wygaszony czas życia dawcy). Ta różnica w czasach życia fluorescencji donorowej jest wykorzystywana do obliczania wydajności FRET, która zależy od liczby fotonów wykazujących skrócenie czasu życia fluorescencji. Poniżej wymieniono szczegółowy protokół określający tworzenie się trójskładnikowego kompleksu między dowolnymi trzema białkami poprzez przejściową ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie w Nicotiana benthamiana i oznaczanie ich interakcji za pomocą BiFC-FRET-FLIM.

<table><tbody><tr><td>Strzykawki 1 ml bez igieł</td><td>Dispovan</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&nbsp; LR Clonase II Mieszanka enzymów</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11791020</td><td>Wektory użyte w badaniu to</td></tr><tr><td>siarczan gentamycyny</td> na bazie bramy, <td>Himedia</td><td>CMS461</td><td></td></tr>, <tr><td>siarczan kanamycyny,</td><td>Himedia</td><td>MB105</td><td></td></tr>, <tr><td>hydrat MES</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO Zestaw do klonowania</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>K240020</td><td>Wektory użyte w badaniu to Oparta na bramce</td></tr><tr><td>Phusion polimeraza DNA Taq o wysokiej wierności</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>F530-S</td><td>Dowolna polimeraza o wysokiej wierności może działać</td></tr><tr><td>Ryfampicyna</td><td>Himedia</td><td>CMS1889</td><td></td></tr><tr><td>SP8 FALCON Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Leica</td><td>SP8 FALCON</td><td>Można do tego użyć dowolnego CLSM z możliwościami FLIM analiza</td></tr><tr><td>Spektynomycyna dichlorowodorek pentahydrat</td><td>Himedia</td><td>TC034</td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego mads-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu bifc-fret-flim

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Interakcje białko-białko są integralną częścią wszystkich procesów biologicznych w komórkach, ponieważ odgrywają kluczową rolę w regulacji, utrzymaniu i zmianie funkcji komórkowych. Interakcje te biorą udział w szerokim zakresie zjawisk, takich jak transdukcja sygnału, odpowiedź patogenu, interakcje komórka-komórka, procesy metaboliczne i rozwojowe. W przypadku czynników transkrypcyjnych interakcje te mogą prowadzić do oligomeryzacji podjednostek, sekwestracji w określonych kontekstach subkomórkowych, takich jak jądro, cytoplazma itp., co z kolei może mieć głębszy wpływ na ekspresję genów znajdujących się w dalszej części łańcucha. W tym miejscu demonstrujemy metodologię wizualizacji trójstronnej interakcji in vivo za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) opartej na transferze energii rezonansu Förster (FRET) z obrazowaniem czasu życia fluorescencji (FLIM). Dwa z białek wybranych do tej demonstracji oddziałują jako partnerzy BiFC, a ich odtworzona aktywność fluorescencyjna jest wykorzystywana do oznaczania FRET-FLIM z trzecim partnerem. Cztero- do pięciotygodniowe rośliny Nicotiana benthamiana hodowane w komorze wzrostu zostały wykorzystane jako modelowy system roślinny w tej demonstracji.

Niniejszy protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę badania in vivo trójdzielnych oddziaływań białko-białko w roślinach. Podstawową zasadą protokołu jest połączenie dwóch technik badania oddziaływań białek z użyciem znaczników fluorescencyjnych, tj. BiFC i FRET, w celu stworzenia testu pozwalającego mierzyć tworzenie kompleksów trójskładnikowych pomiędzy trzema białkami. W tej pracy zastosowano FLIM do pomiaru czasu życia fluorescencji donora FRET w obecności i pod nieobecność akceptora FRET. Oczekiwano skróce...

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji tworzenia się kompleksu trójskładnikowego między trzema partnerami białkowymi za pomocą białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą testu FRET-FLIM opartego na BiFC. Metoda ta jest cenna w badaniu kompleksów interakcji białko-białko in vivo.

Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

Badanie interakcji białko-białko pozwala zrozumieć regulację wielu procesów biologicznych. Tutaj demonstrujemy procedurę opisaną początkowo przez Y John shoe and co. Pracownicy w 2007 roku, gdzie autorzy zastosowali BiFC w połączeniu z FRET do walidacji trójstronnego oddziaływania między trzema cząsteczkami białka.Jednak w tej procedurze uwzględniliśmy pomiary czasu życia fluorescencji, aby uzasadnić pomiary FRET. Aby zademonstrować oddziaływanie trójstronne, wybraliśmy białko, o którym wiadomo, że ulega homodimeryzacji. Co więcej, został on również zweryfikowany wewnętrznie pod kątem interakcji z czujnikiem wapnia białka określanego w tym protokole jako białko C.Białka MNC oddziałują w cytoplazmie. W tej technice dwa białka są znakowane podzielonymi białkami YFP. Ich interakcja powoduje restytucję funkcjonalnych YFP, które działają jako akceptor FRET dla trzeciego partnera oddziałującego, który jest oznaczony jako CFP działający jako dawca FRET.Zacznij od amplifikacji sekwencji kodujących interesujących nas genów, które są w naszym przypadku genami M i C, za pomocą PCR i sklonuj je w odpowiednich wektorach wejściowych. Walidacja klonów, które są wybrane na płytkach zawierających antybiotyki, poprzez trawienie restrykcyjne i sekwencjonowanie DNA. Zmobilizuj odtworzone CDS-y z klonów wejściowych do wektorów docelowych.Wszystkie wektory użyte w tym eksperymencie są wymienione w tabeli pierwszej. Na koniec przekształć komórki agrobacterium GV3101 z wektorami docelowymi za pomocą elektroporacji. Tutaj uprawiamy rośliny Nicotiana Benthamiana jeszcze w fazie od czterech do sześciu w kontrolowanych warunkach w komorze uprawowej.Przygotuj mieszankę gleby, mieszając soilryt, torf kokosowy i kompost w stosunku 2:1:1. Rozłóż warstwę tej mieszanki o grubości jednego cala na plastikowej tacy, aby przygotować podłoże glebowe i nasącz je niewielką ilością wody. Posyp około 200 nasion na wierzchu gleby i przenieś je na większą tacę, która ma około jednego centymetra stojącej wody.Przykryj tę tacę folią, aby utworzyć komorę wilgotnościową. Przenieś tę tacę do komory do uprawy ustawionej na 23 stopnie Celsjusza z 16-godzinnym cyklem światła i ośmiogodzinnym cyklem ciemności. Po dwóch tygodniach przenieś młode sadzonki do małych trzy- lub czterocalowych doniczek zawierających nasyconą wodą mieszankę gleby.Umieść te doniczki w plastikowych tacach i przenieś je do komory uprawowej na kolejne cztery tygodnie. Do agroinfiltracji szczepy bakteryjne muszą być świeżo wyhodowane i zmieszane ze szczepem P19 agrobacterium w odpowiednich proporcjach. Rozpocznij tę procedurę od zaszczepienia szczepów GV3101 agrobacterium zawierających konstrukty BiFC i FRET z płytek smugowych w 10 ml.do bulionu zawierającego odpowiednie antybiotyki. Wraz z nim zainicjuj również kulturę szczepu P19 agrobakterii, który jest dodawany, aby zapobiec wyciszeniu transgenu. Przykryj kolbę folią aluminiową i trzymaj je w wytrząsarce inkubatora, ustaw ją na 28 stopni Celsjusza przy 170 obr./min na 16 godzin.Po nocnym wzroście przenieś 1 ml tych kultur do jednorazowego łokcia, aby zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nanometrach za pomocą spektrofotometru. Wymieszać kultury odpowiednich szczepów zawierających BiFC i FRET tak, aby końcowy OD wynosił 0,5, a P19 0,3 w całkowitej objętości 2 ml.Aby osiągnąć te proporcje, postępujemy zgodnie ze wzorem pokazanym na ekranie dla tych obliczeń. Odwirować zmieszane kultury agrobacterium w temperaturze 3000G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie wyrzucić supernatant. Zawiesić granulki w 2 ml.bufor infiltracji. Być może będziesz musiał użyć mieszalnika wirowego, aby całkowicie zawiesić komórki w jednorodnej zawiesinie komórek. Następnie inkubuj probówki w temperaturze pokojowej w ciemności przez trzy godziny.W międzyczasie oznacz każdą doniczkę pod kątem mieszanki konstruktu, którą będzie infiltrowana. Napełnij strzykawkę bezigłową o pojemności 1 ml mieszanką agrobakteryjną.Delikatnie, ale stanowczo dociśnij końcówkę strzykawki do strony aosiowej w pełni rozwiniętego liścia, jednocześnie podtrzymując liść z drugiej strony. Delikatnie naciskać tłok, aż roztwór wypełni się w obszarze liścia w ilości odpowiadającej dwa do trzech razy w stosunku do końcówki strzykawki. Naciekaj mieszankę bakteryjną w maksymalnie czterech miejscach na jednym liściu i powtórz tę procedurę dla trzech do czterech liści, aby uzyskać jeden rodzaj naciekania.Dołącz również co najmniej dwie rośliny na konstrukcję do infiltracji. Pamiętaj, aby przetrzeć ręce 70% alkoholem lub zmienić rękawiczki, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Przenieś wszystkie doniczki na tacę i inkubuj w komorze wzrostu w tych samych warunkach wzrostu.Sprawdź niewielką część liścia przesączanego za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Gdy fluorescencja zarówno z YFP, jak i CFP jest wykrywalna w komórkach, przejdź do mikroskopu konfokalnego w celu przeprowadzenia testu BiFC FRET-FLIM. W naszym przypadku analiza ta została przeprowadzona trzy dni po agroinfiltracji.Teraz, gdy rośliny są gotowe do wizualizacji pod mikroskopem, odetnij próbki o kwadratowych liściach od 5 do 8 mm od nawiniętej końcówki strzykawki i zamontuj je na wodzie destylowanej. Umieść na nim czyste szkiełko nakrywkowe i zamknij.Wizualizuj te próbki w konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym. W tej procedurze podstawą określenia i ilościowego określenia interakcji między dwoma białkami jest skrócenie czasu życia fluorescencji partnera dawcy FRET po jego interakcji z akceptorem, co służy do obliczenia wydajności FRET. Złożoność w przypadku oddziaływania trójstronnego dodatkowo wzrasta, ponieważ akceptor FRET w tym przypadku nie jest pojedynczą cząsteczką, ale podzieloną parą YFP BiFC, która powinna najpierw zostać odtworzona in vivo, aby stać się funkcjonalnym akceptorem FRET fluoroforem.Aby przeprowadzić badanie FRET-FLIM, musimy określić czas życia fluorescencji cząsteczek donorowych, najpierw samodzielnie, a następnie w obecności partnera FRET. Otwórz aplikację FLIM w konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym, uruchom konsolę i użyj funkcji zliczania fotonów do rozpoznawania wzorców, aby zmierzyć czas życia fluorescencji. Wybierz standardowy tryb pomiaru zliczania wszystkich fotonów.Weźmiemy dwa rodzaje roślin agroinfiltrowanych. Jeden, który ma gen CCFP, a drugi, który ma CCFP wraz z MYFP, ponieważ interakcja białka M została już zwalidowana z białkiem C przy użyciu BiFC i Y2H, spodziewamy się dobrej wydajności FRET z tą oddziałującą parą. Teraz najpierw skanujemy liść agroinfiltrowany CCFP i szukamy komórki wykazującej dobrą fluorescencję CFP.Ustawienia mikroskopu są wyświetlane na ekranie. Próbka jest oświetlana z mocą lasera wystarczającą do osiągnięcia około 0,1 fotonu na impuls. W przypadku próbek o zmiennej intensywności fluorescencji przechwycimy 50 klatek, aby zebrać odpowiednie fotony wymagane do pomiaru czasu życia.Ponieważ wiadomo, że CFP wykazuje dwa czasy życia fluorescencji ze względu na jego konfirmacyjną adaptację, podajemy dane za pomocą wykładniczego modelu rekonwolucji, zachowując wartość N równą dwa. Przy tych ustawieniach dwa okresy życia są widoczne w jednej i 3,2 nanosekundzie. We wszystkich kolejnych obliczeniach użyjemy dłuższego okresu istnienia.Jesteśmy teraz gotowi do pomiaru FRET między CCFP a MYFP. W tym celu użyjmy próbki liści z rośliny agroinfiltrowanej z CCFP i MYFP. Szukamy komórki, która wyraża zarówno CCFP, jak i MYFP i potwierdzamy ich odpowiednie wzorce emisji, wzbudzając je za pomocą pełnego lasera impulsowego 40 nanometrów i lasera światła białego 514 nanometrów.Następnie przełączamy się na konsolę FLIM, aby zmierzyć czas życia CFP przy użyciu tych samych ustawień, których użyliśmy wcześniej do pomiaru czasu życia CCFP. Ale tym razem komórka wykazuje również ekspresję MYFP, który może potencjalnie wchodzić w interakcje z CCFP i powodować skrócenie czasu życia CCFP. Jak przeczytaliśmy wykres uzyskany przy użyciu modelu N wykładniczej rekonwolucji z N równym dwa, w rzeczywistości następuje skrócenie czasu życia CFP z 3,2 do 2,6 nanosekundy.Uruchamiamy teraz konsolę FRET w oprogramowaniu i obliczamy wydajność FRET poprzez ręczne wprowadzenie niepodważalnej żywotności w równaniu podanym w oprogramowaniu, a obserwowana wydajność FRET wynosi 56%Przejdźmy teraz do ostatniego kroku, czyli wizualizacji interakcji między trzema partnerami. W tym celu pobieramy próbkę liści z rośliny, która była współinfiltrowana za pomocą CCFP i MYFPN za pomocą MYFPC. Skanujemy roślinę liściową w poszukiwaniu komórki, która wykazuje zarówno CFP, jak i odtworzoną fluorescencję YFP emanującą z interakcji między dwoma białkami M.Używamy tego samego lasera i długości fali emisji, co wcześniej. Następnie wyłączamy laser 514 nanometrów i przechodzimy do konsoli FLIM. Jeśli dimer MYFP wchodzi w interakcję z CCFP.Powinniśmy zaobserwować skrócenie czasu życia CCFP, co zaobserwowano podczas jego interakcji z MYFP. Jeśli jednak CCFP nie wejdzie w interakcję ze ściemniaczem MYFP, jego czas trwania fluorescencji powinien pozostać widoczny na poziomie 3,2 nanosekundy. Korzystając z podobnych ustawień, jak wspomniano powyżej, mierzymy czas życia CFP w obecności odtworzonego YFP.Dopasowujemy wykres za pomocą modelu N wykładniczej rekonwolucji z liczbą równą dwóm i przechodzimy do konsoli FRET. I tak, nastąpił spadek czasu życia CFP z 3,2 do 2,3 nanosekundy. Wydajność FRET obliczamy zgodnie z powyższym opisem.Obliczona wydajność FRET wynosi 55%Tutaj użyliśmy FLIM do pomiaru czasu życia fluorescencji partnera dawcy FRET w obecności i bez akceptora FRET. Spodziewano się skrócenia czasu życia fluorescencji dawcy, jeśli wystąpiła pozytywna interakcja między tymi dwoma białkami. W przypadku kontroli pozytywnej jest to CCFP i MYFP.Obserwujemy skrócenie czasu życia fluorescencji dawcy z 3,3 do 2,5 nanosekundy, a skuteczność FRET wyniosła 56%Podobne ćwiczenie z odtworzonym YFP wynikało z interakcji między dwoma amonomerami i białkami C, również skutkowało dodatnią interakcją FRET, co doprowadziło do skrócenia czasu życia fluorescencji dawcy do 2,6 nanosekundy. Obliczona sprawność FRET wyniosła w tym przypadku około 55%. Skrócenie czasu życia fluorescencji donora FRET dostarcza mocnych dowodów na trójstronną interakcję między tymi białkami.Opisany tutaj protokół jest potężnym narzędziem do określania trójstronnych interakcji białko-białko w żywych komórkach. Procedura ta może również pomóc w określeniu wewnątrzkomórkowej lokalizacji powstałych kompleksów, co jest ważne w rozszyfrowaniu funkcji i fizjologicznego znaczenia każdego kompleksu białkowego. Podsumowując, test FRET-FLIM oparty na BiFC daje możliwość zbadania i scharakteryzowania ważnych aspektów trójstronnych interakcji białkowych, co może być pomocne w badaniach interakcji białko-białko zarówno w systemach zwierzęcych, jak i roślinnych.

determination-tripartite-interaction-between-two-monomers-mads-box

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Subkomórkowa lokalizacja białek jest kluczowa dla określenia czasowo-przestrzennej regulacji sygnalizacji komórkowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy bimolekularną komplementację fluorescencji (BiFC) jako prostą metodę monitorowania przestrzennych oddziaływań białek w komórce.

Bimolekularna komplementacja fluorescencyjna

Niniejszy materiał wideo przedstawia szczegółowy protokół badania profilu farmakologicznego ludzkich kanałów TRPA1 przy użyciu systemu FlexStation 3. Protokół obejmuje szczegóły dotyczące przygotowania komórek, ładowania barwnika oraz obsługi czytnika mikropłytek FlexStation 3.

Komórkowy test wapniowy do przesiewowej analizy funkcji kanałów TRP o średniej i wysokiej przepustowości z wykorzystaniem systemu FlexStation 3

Mikroskopia oparta na transferze energii fluorescencji (FRET) jest potężną techniką monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach z wykorzystaniem różnych biosensorów jako reporterów. W niniejszej pracy opisujemy sposób budowy spersonalizowanego systemu obrazowania FRET w epifluorescencji z komponentów dostępnych w handlu oraz sposób jego wykorzystania w eksperymentach FRET.

Mikroskopia FRET do monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach przy użyciu unimolekularnych biosensorów

Ten film opisuje wysoce wydajną anizotropię fluorescencji, która pomaga monitorować interakcję między czynnikami transkrypcyjnymi a DNA. Test monitoruje interakcje cząsteczki DNA znakowanej fluoroforem z jej specyficznym czynnikiem transkrypcyjnym, mierząc stopień polaryzacji spowodowanej rotacją molekularną lub anizotropią DNA znakowanego fluoroforem.

Anizotropia fluorescencyjna w celu określenia powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego i DNA

Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.

Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Tutaj prezentujemy nowatorską metodę określania powinowactwa wiązania w równowadze i w roztworze z wysoką czułością na dużą skalę. Poprawia to analizę ilościową wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA. Metoda opiera się na zautomatyzowanych pomiarach anizotropii fluorescencji w kontrolowanym systemie dostarczania.

Pomiar wysokiej czułości powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA za pomocą miareczkowania kompetencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Interakcje białko-białko są kluczowe dla systemów biologicznych, a badania kinetyki wiązania dostarczają wglądu w dynamikę i funkcję kompleksów białkowych. Opisujemy metodę, która określa ilościowo parametry kinetyczne kompleksu białkowego za pomocą rezonansu fluorescencyjnego, transferu energii i techniki zatrzymanego przepływu.

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalnej elastyczności i dynamiki biomolekuł za pomocą czasowo-rozdzielczej anizotropii fluorescencji na poziomie pojedynczej cząsteczki w trybie mikroskopii konfokalnej.

Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach

Poznaj metodę BiFC-FRET-FLIM do wizualizacji trójstronnych interakcji białkowych w żywych komórkach roślin Nicotiana benthamiana. Technika ta umożliwia ilościowe badanie kompleksów białkowych in vivo.

Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM (Wideo) | JoVE Journal

Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM

Przeglądaj więcej filmów