Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM

Badanie interakcji białko-białko pozwala zrozumieć regulację wielu procesów biologicznych. Tutaj demonstrujemy procedurę opisaną początkowo przez Y John shoe and co. Pracownicy w 2007 roku, gdzie autorzy zastosowali BiFC w połączeniu z FRET do walidacji trójstronnego oddziaływania między trzema cząsteczkami białka.

Jednak w tej procedurze uwzględniliśmy pomiary czasu życia fluorescencji, aby uzasadnić pomiary FRET. Aby zademonstrować oddziaływanie trójstronne, wybraliśmy białko, o którym wiadomo, że ulega homodimeryzacji. Co więcej, został on również zweryfikowany wewnętrznie pod kątem interakcji z czujnikiem wapnia białka określanego w tym protokole jako białko C.

Białka MNC oddziałują w cytoplazmie. W tej technice dwa białka są znakowane podzielonymi białkami YFP. Ich interakcja powoduje restytucję funkcjonalnych YFP, które działają jako akceptor FRET dla trzeciego partnera oddziałującego, który jest oznaczony jako CFP działający jako dawca FRET.

Zacznij od amplifikacji sekwencji kodujących interesujących nas genów, które są w naszym przypadku genami M i C, za pomocą PCR i sklonuj je w odpowiednich wektorach wejściowych. Walidacja klonów, które są wybrane na płytkach zawierających antybiotyki, poprzez trawienie restrykcyjne i sekwencjonowanie DNA. Zmobilizuj odtworzone CDS-y z klonów wejściowych do wektorów docelowych.

Wszystkie wektory użyte w tym eksperymencie są wymienione w tabeli pierwszej. Na koniec przekształć komórki agrobacterium GV3101 z wektorami docelowymi za pomocą elektroporacji. Tutaj uprawiamy rośliny Nicotiana Benthamiana jeszcze w fazie od czterech do sześciu w kontrolowanych warunkach w komorze uprawowej.

Przygotuj mieszankę gleby, mieszając soilryt, torf kokosowy i kompost w stosunku 2:1:1. Rozłóż warstwę tej mieszanki o grubości jednego cala na plastikowej tacy, aby przygotować podłoże glebowe i nasącz je niewielką ilością wody. Posyp około 200 nasion na wierzchu gleby i przenieś je na większą tacę, która ma około jednego centymetra stojącej wody.

Przykryj tę tacę folią, aby utworzyć komorę wilgotnościową. Przenieś tę tacę do komory do uprawy ustawionej na 23 stopnie Celsjusza z 16-godzinnym cyklem światła i ośmiogodzinnym cyklem ciemności. Po dwóch tygodniach przenieś młode sadzonki do małych trzy- lub czterocalowych doniczek zawierających nasyconą wodą mieszankę gleby.

Umieść te doniczki w plastikowych tacach i przenieś je do komory uprawowej na kolejne cztery tygodnie. Do agroinfiltracji szczepy bakteryjne muszą być świeżo wyhodowane i zmieszane ze szczepem P19 agrobacterium w odpowiednich proporcjach. Rozpocznij tę procedurę od zaszczepienia szczepów GV3101 agrobacterium zawierających konstrukty BiFC i FRET z płytek smugowych w 10 ml.

do bulionu zawierającego odpowiednie antybiotyki. Wraz z nim zainicjuj również kulturę szczepu P19 agrobakterii, który jest dodawany, aby zapobiec wyciszeniu transgenu. Przykryj kolbę folią aluminiową i trzymaj je w wytrząsarce inkubatora, ustaw ją na 28 stopni Celsjusza przy 170 obr./min na 16 godzin.

Po nocnym wzroście przenieś 1 ml tych kultur do jednorazowego łokcia, aby zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nanometrach za pomocą spektrofotometru. Wymieszać kultury odpowiednich szczepów zawierających BiFC i FRET tak, aby końcowy OD wynosił 0,5, a P19 0,3 w całkowitej objętości 2 ml.

Aby osiągnąć te proporcje, postępujemy zgodnie ze wzorem pokazanym na ekranie dla tych obliczeń. Odwirować zmieszane kultury agrobacterium w temperaturze 3000G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie wyrzucić supernatant. Zawiesić granulki w 2 ml.

bufor infiltracji. Być może będziesz musiał użyć mieszalnika wirowego, aby całkowicie zawiesić komórki w jednorodnej zawiesinie komórek. Następnie inkubuj probówki w temperaturze pokojowej w ciemności przez trzy godziny.

W międzyczasie oznacz każdą doniczkę pod kątem mieszanki konstruktu, którą będzie infiltrowana. Napełnij strzykawkę bezigłową o pojemności 1 ml mieszanką agrobakteryjną.

Delikatnie, ale stanowczo dociśnij końcówkę strzykawki do strony aosiowej w pełni rozwiniętego liścia, jednocześnie podtrzymując liść z drugiej strony. Delikatnie naciskać tłok, aż roztwór wypełni się w obszarze liścia w ilości odpowiadającej dwa do trzech razy w stosunku do końcówki strzykawki. Naciekaj mieszankę bakteryjną w maksymalnie czterech miejscach na jednym liściu i powtórz tę procedurę dla trzech do czterech liści, aby uzyskać jeden rodzaj naciekania.

Dołącz również co najmniej dwie rośliny na konstrukcję do infiltracji. Pamiętaj, aby przetrzeć ręce 70% alkoholem lub zmienić rękawiczki, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Przenieś wszystkie doniczki na tacę i inkubuj w komorze wzrostu w tych samych warunkach wzrostu.

Sprawdź niewielką część liścia przesączanego za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Gdy fluorescencja zarówno z YFP, jak i CFP jest wykrywalna w komórkach, przejdź do mikroskopu konfokalnego w celu przeprowadzenia testu BiFC FRET-FLIM. W naszym przypadku analiza ta została przeprowadzona trzy dni po agroinfiltracji.

Teraz, gdy rośliny są gotowe do wizualizacji pod mikroskopem, odetnij próbki o kwadratowych liściach od 5 do 8 mm od nawiniętej końcówki strzykawki i zamontuj je na wodzie destylowanej. Umieść na nim czyste szkiełko nakrywkowe i zamknij.

Wizualizuj te próbki w konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym. W tej procedurze podstawą określenia i ilościowego określenia interakcji między dwoma białkami jest skrócenie czasu życia fluorescencji partnera dawcy FRET po jego interakcji z akceptorem, co służy do obliczenia wydajności FRET. Złożoność w przypadku oddziaływania trójstronnego dodatkowo wzrasta, ponieważ akceptor FRET w tym przypadku nie jest pojedynczą cząsteczką, ale podzieloną parą YFP BiFC, która powinna najpierw zostać odtworzona in vivo, aby stać się funkcjonalnym akceptorem FRET fluoroforem.

Aby przeprowadzić badanie FRET-FLIM, musimy określić czas życia fluorescencji cząsteczek donorowych, najpierw samodzielnie, a następnie w obecności partnera FRET. Otwórz aplikację FLIM w konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym, uruchom konsolę i użyj funkcji zliczania fotonów do rozpoznawania wzorców, aby zmierzyć czas życia fluorescencji. Wybierz standardowy tryb pomiaru zliczania wszystkich fotonów.

Weźmiemy dwa rodzaje roślin agroinfiltrowanych. Jeden, który ma gen CCFP, a drugi, który ma CCFP wraz z MYFP, ponieważ interakcja białka M została już zwalidowana z białkiem C przy użyciu BiFC i Y2H, spodziewamy się dobrej wydajności FRET z tą oddziałującą parą. Teraz najpierw skanujemy liść agroinfiltrowany CCFP i szukamy komórki wykazującej dobrą fluorescencję CFP.

Ustawienia mikroskopu są wyświetlane na ekranie. Próbka jest oświetlana z mocą lasera wystarczającą do osiągnięcia około 0,1 fotonu na impuls. W przypadku próbek o zmiennej intensywności fluorescencji przechwycimy 50 klatek, aby zebrać odpowiednie fotony wymagane do pomiaru czasu życia.

Ponieważ wiadomo, że CFP wykazuje dwa czasy życia fluorescencji ze względu na jego konfirmacyjną adaptację, podajemy dane za pomocą wykładniczego modelu rekonwolucji, zachowując wartość N równą dwa. Przy tych ustawieniach dwa okresy życia są widoczne w jednej i 3,2 nanosekundzie. We wszystkich kolejnych obliczeniach użyjemy dłuższego okresu istnienia.

Jesteśmy teraz gotowi do pomiaru FRET między CCFP a MYFP. W tym celu użyjmy próbki liści z rośliny agroinfiltrowanej z CCFP i MYFP. Szukamy komórki, która wyraża zarówno CCFP, jak i MYFP i potwierdzamy ich odpowiednie wzorce emisji, wzbudzając je za pomocą pełnego lasera impulsowego 40 nanometrów i lasera światła białego 514 nanometrów.

Następnie przełączamy się na konsolę FLIM, aby zmierzyć czas życia CFP przy użyciu tych samych ustawień, których użyliśmy wcześniej do pomiaru czasu życia CCFP. Ale tym razem komórka wykazuje również ekspresję MYFP, który może potencjalnie wchodzić w interakcje z CCFP i powodować skrócenie czasu życia CCFP. Jak przeczytaliśmy wykres uzyskany przy użyciu modelu N wykładniczej rekonwolucji z N równym dwa, w rzeczywistości następuje skrócenie czasu życia CFP z 3,2 do 2,6 nanosekundy.

Uruchamiamy teraz konsolę FRET w oprogramowaniu i obliczamy wydajność FRET poprzez ręczne wprowadzenie niepodważalnej żywotności w równaniu podanym w oprogramowaniu, a obserwowana wydajność FRET wynosi 56%Przejdźmy teraz do ostatniego kroku, czyli wizualizacji interakcji między trzema partnerami. W tym celu pobieramy próbkę liści z rośliny, która była współinfiltrowana za pomocą CCFP i MYFPN za pomocą MYFPC. Skanujemy roślinę liściową w poszukiwaniu komórki, która wykazuje zarówno CFP, jak i odtworzoną fluorescencję YFP emanującą z interakcji między dwoma białkami M.

Używamy tego samego lasera i długości fali emisji, co wcześniej. Następnie wyłączamy laser 514 nanometrów i przechodzimy do konsoli FLIM. Jeśli dimer MYFP wchodzi w interakcję z CCFP.

Powinniśmy zaobserwować skrócenie czasu życia CCFP, co zaobserwowano podczas jego interakcji z MYFP. Jeśli jednak CCFP nie wejdzie w interakcję ze ściemniaczem MYFP, jego czas trwania fluorescencji powinien pozostać widoczny na poziomie 3,2 nanosekundy. Korzystając z podobnych ustawień, jak wspomniano powyżej, mierzymy czas życia CFP w obecności odtworzonego YFP.

Dopasowujemy wykres za pomocą modelu N wykładniczej rekonwolucji z liczbą równą dwóm i przechodzimy do konsoli FRET. I tak, nastąpił spadek czasu życia CFP z 3,2 do 2,3 nanosekundy. Wydajność FRET obliczamy zgodnie z powyższym opisem.

Obliczona wydajność FRET wynosi 55%Tutaj użyliśmy FLIM do pomiaru czasu życia fluorescencji partnera dawcy FRET w obecności i bez akceptora FRET. Spodziewano się skrócenia czasu życia fluorescencji dawcy, jeśli wystąpiła pozytywna interakcja między tymi dwoma białkami. W przypadku kontroli pozytywnej jest to CCFP i MYFP.

Obserwujemy skrócenie czasu życia fluorescencji dawcy z 3,3 do 2,5 nanosekundy, a skuteczność FRET wyniosła 56%Podobne ćwiczenie z odtworzonym YFP wynikało z interakcji między dwoma amonomerami i białkami C, również skutkowało dodatnią interakcją FRET, co doprowadziło do skrócenia czasu życia fluorescencji dawcy do 2,6 nanosekundy. Obliczona sprawność FRET wyniosła w tym przypadku około 55%. Skrócenie czasu życia fluorescencji donora FRET dostarcza mocnych dowodów na trójstronną interakcję między tymi białkami.

Opisany tutaj protokół jest potężnym narzędziem do określania trójstronnych interakcji białko-białko w żywych komórkach. Procedura ta może również pomóc w określeniu wewnątrzkomórkowej lokalizacji powstałych kompleksów, co jest ważne w rozszyfrowaniu funkcji i fizjologicznego znaczenia każdego kompleksu białkowego. Podsumowując, test FRET-FLIM oparty na BiFC daje możliwość zbadania i scharakteryzowania ważnych aspektów trójstronnych interakcji białkowych, co może być pomocne w badaniach interakcji białko-białko zarówno w systemach zwierzęcych, jak i roślinnych.