Inżynieria tkankowa mikrośrodowiska zrębu guza z zastosowaniem do inwazji komórek rakowych

Ogólnym celem poniższej procedury jest wygenerowanie natywnej macierzy z fibroblastów w celu oceny inwazji komórek nowotworowych. Osiąga się to najpierw poprzez hodowlę fibroblastów na plastiku w pożywce wzbogaconej w kwas sorbowy w celu wytworzenia natywnej matrycy. W drugim kroku natywna matryca jest odłączana i uwalniana od plastikowej powierzchni do uprawy, a następnie ta matryca jest zasiewana komórkami nowotworowymi i po określonym czasie podnoszona do granicy faz powietrze-ciecz

Te kultury 3D są zbierane w celu analizy histologicznej inwazji komórek nowotworowych. Ostatecznie wpływ natywnej macierzy fibroblastów na inwazję komórek nowotworowych można ocenić za pomocą analizy immunohistologicznej. Tak więc zaletą tej techniki generowania typowych kultur 3D jest to, że możemy ocenić natywną matrycę wytwarzaną przez same fibroblasty przy braku syntetycznych lub obcych substratów, takich jak międzygatunkowy kolagen typu pierwszego Zacznij od wysiewu 200 000 fibroblastów na dołek w sześciodołkowych płytkach w pożywce fiberblast, uzupełnionej świeżo przygotowanym kwasem IC.

Dwa fosforany refrenują komórki co dwa do trzech dni za pomocą dwóch do pięciu mililitrów świeżej pożywki. Gruba warstwa komórek osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej widoczna gołym okiem utworzy się pod koniec sześciu tygodni. W zależności od użytych komórek, widoczna matryca może prędzej czy później się uformować i może zacząć odklejać się od naczynia, jak pokazano tutaj.

Aby uwolnić tę warstwę z płytki do hodowli tkankowej, delikatnie zeskrob obwód matrycy za pomocą jednomililitrowej końcówki mikropipety, a następnie popchnij krawędzie matrycy w kierunku środka dołka. Komórki i macierzy natywna powinny łatwo odłączyć się od powierzchni płytki i teraz unosić się w podłożu. Rozłóż natywną matrycę na nośniku, aby uniknąć jej zwijania się w siebie.

Pozwól natywnej matrycy unosić się i przebudowywać przez pięć dni, kontynuując wymianę nośnika co dwa do trzech dni ze względu na wytrzymałość na rozciąganie i wewnętrzną przebudowę. Macierz drastycznie się skurczy i zostanie zredukowana do mniejszej, ale grubszej macierzy natywnej, w którym to czasie będzie gotowa do użycia. Do testu inwazji.

Do testu inwazji. Najpierw użyj kleszczy, aby delikatnie przenieść natywną matrycę do nylonowej siatki. Po znalezieniu się w sieci użyj jednomililitrowej końcówki do mikropipet i kleszczyków, aby delikatnie rozprowadzić matrycę, aby leżała tak płasko, jak to możliwe.

Następnie rozsmaruj niewielką ilość wazeliny na jednym końcu jednego sterylnego cylindra klonalnego na matrycę. Następnie umieść cylindry na natywnych matrycach wazelinową stroną do dołu, aby zapewnić szczelne uszczelnienie między natywną matrycą a pierścieniami klonalnymi. Teraz dodaj 250 000 komórek raka płaskonabłonkowego skóry lub komórek SCC w karatowych pożywkach wzrostowych do cylindrów.

Po tym, jak skórne komórki SCC osiądą na natywnej matrycy, wyjmij cylindry, a następnie podnieś natywną matrycę z siatki nylonowej i skórne komórki SEC do interfejsu ciecz powietrznej i na wygiętą siatkę drucianą ze stali nierdzewnej. Na koniec dodaj pożywkę wzrostową keratynocytów, uzupełnioną jako kwas sorbinowy, aż poziom pożywki dotknie dna macierzy natywnej, zmieniając pożywkę co dwa do trzech dni i zbierając po siedmiu i 14 dniach od wysiewu skórnych komórek SCC. Technika ta otwiera możliwość badania i porównywania inwazyjnego zachowania komórek nowotworowych w różnych środowiskach zrębu 3D.

Jak widać na tych obrazach, inwazja skórnych keratynocytów SCC RDEB była znacznie opóźniona w C seven nad ekspresją natywnych matryc w prawych panelach w porównaniu z kontrolami C seven z niedoborem RDEB w lewych panelach. Opracowanie tej techniki umożliwiło naukowcom bezpośrednią ocenę wpływu macierzy natywnej wytwarzanej przez fibroblasty na procesy zachodzące w komórkach nowotworowych, takie jak inwazja.