Name: Inżynieria tkankowa mikrośrodowiska zrębu guza z zastosowaniem do inwazji komórek rakowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Poznaj metodę generowania macierzy fibroblastowej do badania inwazji komórek nowotworowych w kulturach 3D. Technika ta pozwala ocenić wpływ mikrośrodowiska guza na biologię komórek rakowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.P.S jest wspierany przez DebRA International i British Skin Foundation. Y.Z.N jest wspierany przez A*STAR - University of Dundee Partnership PhD Programme.

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Zasad Helsińskich i zostało zatwierdzone przez odpowiednie Komisje Etyki.
1. Przygotowanie pożywek i odczynników
<ol>
	<li>Przygotowanie 200x bulionu z 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego
	<ol>
		<li>Rozpuścić 29 mg 2-fosforanu L-askorbinowego w 5 ml roztworu zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco i przefiltrować przez filtr membranowy 0,22 μm. Przechowywać w postaci 0,25 ml sterylnych podwielokrotności w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Dodać 0,25 ml podwielokrotności 200x 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego do każdych 50 ml pożywki fibroblastów (DMEM z 1% L-glutaminą i 10% płodową surowicą bydlęcą) w wymaganym dniu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1 mM 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie pożywek wzrostowych keratynocytów
	<ol>
		<li>Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów SCC została opisana wcześniej21. Opisano w nim również przygotowanie pożywek wzrostowych keratynocytów.</li>
		<li>Pokrótce przygotuj podłoże w następujący sposób: 
		300 ml DMEM i 100 ml Ham's F-12 uzupełnione 10% FBS 
		0,4 mg/ml hydrokortyzonu 
		5 mg/ml insuliny 
		10 ng/ml EGF 
		5 mg/ml transferyny 
		8,4 ng/ml toksyny 
		13 ng/ml liotyroniny 
		1x roztwór penicyliny-streptomycyny</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Budowa in vitro natywnej matrycy pochodzącej z fibroblastów w pożywce z dodatkiem 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego
<ol>
	<li>Wysiewaj 200 000 fibroblastów na studzienkę na płytkach 6-dołkowych (20 000 komórek/cm2) w pożywce fibroblastów uzupełnionej 2-fosforanem kwasu L-askorbinowego. Podawaj co 2-3 dni 2-5 ml pożywki. (Uwaga: Częstotliwość i objętość ponownego karmienia można dostosować do indywidualnych potrzeb różnych komórek. Zobacz "Dyskusje").</li>
	<li>Pod koniec 6 tygodni utworzy się gruba warstwa komórek osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej, widoczna gołym okiem (ryc. 1). Aby uwolnić tę warstwę z płytki do hodowli tkankowej, delikatnie zeskrob obwód matrycy końcówką mikropipety o pojemności 1 ml, a następnie popchnij krawędzie matrycy w kierunku środka dołka. Ta warstwa komórek i matrycy (matryca natywna) powinna być łatwa do oderwania od powierzchni płytki, a teraz unosić się w podłożu. Rozłóż natywną matrycę na nośniku, aby uniknąć jej składania się na siebie.</li>
	<li>Pozwól natywnej matrycy unosić się i przemodelować przez 5 dni, zmieniając nośnik co 2-3 dni. Ze względu na wytrzymałość na rozciąganie i wewnętrzną przebudowę w matrycy, matryca drastycznie się skurczy i zostanie zredukowana do mniejszej, ale grubszej macierzy natywnej i jest gotowa do wykorzystania w teście inwazji.</li>
</ol>
3. Test inwazji z keratynocytami SCC guza
<ol>
	<li>Delikatnie podnieś natywną matrycę kleszczami i przenieś do siatki nylonowej. Po umieszczeniu na nylonowej siatce delikatnie rozprowadź matrycę, aby leżała jak najbardziej płasko, używając końcówki do mikropipet o pojemności 1 ml i kleszczyków.</li>
	<li>Przygotuj sterylne cylindry klonalne, smarując niewielką ilość sterylnej wazeliny na jednym końcu.</li>
	<li>Umieść cylindry klonalne na macierzy natywnej, stroną z wazeliną do dołu. Ma to na celu zapewnienie szczelnego uszczelnienia między macierzyą natywną a pierścieniami klonalnymi.</li>
	<li>Dodaj komórki cSCC do cylindrów klonalnych (250 000 komórek w 100 μl pożywki wzrostowej keratynocytów).</li>
	<li>Wyjmij cylindry klonalne po 6 godzinach, gdy komórki cSCC osiądą na macierzy natywnej.</li>
	<li>Podnieś siatkę nylonową z natywną matrycą i komórkami cSCC do interfejsu powietrze-ciecz na wygiętym wsporniku z siatki drucianej ze stali nierdzewnej.</li>
	<li>Dodaj pożywkę wzrostową keratynocytów uzupełnioną kwasem askorbinowym, aż poziom pożywki dotknie dna macierzy natywnej.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni i zbieraj po 7 i 14 dniach od wysiewu komórek cSCC.</li>
</ol>
4. Pobieranie kultur 3D i przygotowanie do histologii
<ol>
	<li>Utrwal 4% paraformaldehydu przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przeciąć próbki na pół i zatopić w wosku w przypadku utrwalonych w formalinie bloków parafinowych, z powierzchnią cięcia skierowaną na zewnątrz.</li>
	<li>Alternatywnie, należy osadzić przecięte na pół próbki w OCT i natychmiast zamrozić w ciekłym azocie w celu uzyskania świeżo zamrożonych bloków tkanek.</li>
	<li>Wyciąć 4 μm odcinki na mikrotomie i odwoskować (jeśli to konieczne). Barwienie przy użyciu standardowej hematoksyliny i eozyny. Aby uwidocznić komórki cSCC, mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko keratynie 14 (LL001, we własnym zakresie) można zastosować w barwieniu immunohistologicznym.</li>
</ol>

<ol><li>Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+tissue+formed+in+vitro+and+accepted+as+skin-equivalent+tissue+of+full+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness.</a> Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).</li>
<li>Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+morphogenesis+and+induction+of+the+67+kD+keratin+polypeptide+by+culture+of+human+keratinocytes+at+the+liquid-air+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface.</a> Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).</li>
<li>Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Cultivation+of+Keratinocytes+with+an+Air-Liquid+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface.</a> J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).</li>
<li>Prunieras, M., Régnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+procedure+for+culturing+human+epidermal+cells+on+allogenic+or+xenogenic+skin%3A+preparation+of+recombined+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Chir.+Plast%22%5BJournal%5D)">New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts.</a> Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).</li>
<li>Gaggioli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-led+collective+invasion+of+carcinoma+cells+with+differing+roles+for+RhoGTPases+in+leading+and+following+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells.</a> Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).</li>
<li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).</li>
<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-%CE%BAB-Dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Manner.+Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent.</a> Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).</li>
<li>Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolism+of+collagen+and+other+proteins+of+the+skin+of+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits.</a> Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).</li>
<li>Ehrmann, R. L., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+of+cells+on+a+transparent+gel+of+reconstituted+rat-tail+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen.</a> J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).</li>
<li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+complexes+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane complexes with biological activity.</a> Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).</li>
<li>Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+active+growth+factors+in+basement+membrane+Matrigel+suggests+caution+in+interpretation+of+cellular+activity+related+to+extracellular+matrix+components%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components.</a> Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BD+Biosciences+-+Discover+Labware%5BTitle%5D)+AND+%22SPC-356230+Rev+5.0+at+Rev+5.0%22%5BJournal%5D)">BD Biosciences - Discover Labware.</a> SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://SPC-356230 Rev 5.0">http://SPC-356230 Rev 5.0</a> Forthcoming.</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Predisposition+to+Cutaneous+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+human+type+VII+collagen.+Complete+primary+sequence+of+the+alpha+1%28VII%29+chain+and+identification+of+intragenic+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms.</a> J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).</li>
<li>Hovnanian, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+linkage+of+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa+to+the+type+VII+collagen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene.</a> J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).</li>
<li>Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+linkage+of+type+VII+collagen+%28COL7A1%29+to+dominant+dystrophic+epidermolysis+bullosa+in+families+with+abnormal+anchoring+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils.</a> J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).</li>
<li>Ng, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-derived+dermal+matrix+drives+development+of+aggressive+cutaneous+squamous+cell+carcinoma+in+patients+with+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa.</a> Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).</li>
<li>Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+15%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 15.</a> Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).</li>
<li>Pouliot, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructed+human+skin+produced+in+vitro+and+grafted+on+athymic+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice).</a> Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).</li>
<li>Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+squamous+cell+carcinoma+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines.</a> Methods Biol. 731, 151-159 (2011).</li>
<li>Pinnell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+collagen+biosynthesis+by+ascorbic+acid%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Yale+J.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review.</a> Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).</li>
<li>Hata, R., Senoo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-ascorbic+acid+2-phosphate+stimulates+collagen+accumulation%2C+cell+proliferation%2C+and+formation+of+a+three-dimensional+tissuelike+substance+by+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts.</a> J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ze względu na charakter tego eksperymentu, całkowity czas potrzebny na jego ukończenie może wynosić do dwóch miesięcy. Przez cały ten czas należy zachować najwyższą ostrożność i stosować praktyki sterylnych hodowli tkankowych, aby zapobiec skażeniu mikrobiologicznemu.

Oprócz roli kofaktora w syntezie hydroksyproliny i hydroksylizyny kolagenów, kwas askorbinowy stymuluje ekspresję mRNA specyficznego dla kolagenu w fibroblastach22. Kwas askorbinowy z wybor...

Użycie biomateriału w hodowli tkanek 3D umożliwiło naukowcom badanie zachowania komórek w laboratorium w warunkach fizjologicznych bardziej zbliżonych do środowiska in vivo niż do środowiska rekapitulowanego z adhezją 2D i plastikowym podłożem. W szczególności poczyniono ogromne postępy w modelowaniu nabłonka warstwowego dzięki zastosowaniu metod hodowli 3D na granicy faz powietrze-ciecz1-4. Takie techniki wiernie naśladują różnicowanie keratynocytów i inwazję komórek nowotworowych, umożliwiając badaczom badającym te procesy większą elastyczność i wierność. Wybór substratu biomateriałowego do naśladowania środowiska zrębu obejmował przede wszystkim użycie kolagenu typu I, macierzy mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm i odskórnej skóry właściwej. Na przykład wykazano, że fibroblasty związane z rakiem przyczyniają się do inwazji raka5, inicjacji i progresji poprzez interakcje zrębowo-nabłonkowe6,7, gdy są hodowane w takich podłożach.

Złotym standardem naśladowania środowiska zrębu w skórze, największego i najczęściej badanego nabłonka warstwowego przy użyciu takich technik, jest de-epidermized human dermis (DED). Przygotowanie DED polega na usunięciu naskórka poprzez trypsynizację lub fizyczną dysocjację od skóry zwłok człowieka3,4. Jednak dostęp do takiej skóry może być bardzo trudny dla laboratoriów niezwiązanych z instytucjami klinicznymi, a chora skóra właściwa jest prawie niemożliwa do uzyskania. Jako alternatywę, laboratoria często używają kombinacji kolagenu typu I (wyizolowanego z ogonów szczura) i/lub macierzy mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm.

Po odkryciu w 1927 roku przez Nageotte8, że kolagen można łatwo wyizolować za pomocą kwasu octowego i wytrącania soli, jego zastosowanie do hodowli tkankowej zostało następnie zapoczątkowane przez Huzellę i współpracowników9. Powłoka kolagenowa okazała się lepsza od szkła w hodowli komórkowej 29 szczepów i eksplantatów tkankowych, jak przebadali Ehrmann i Gey9. Obecnie główny rodzaj kolagenu stosowany w hodowli tkankowej jest izolowany ze ścięgien ogona szczura i jest zwykle kupowany ze źródeł komercyjnych. Jednak wadą wiernej rekapitulacji substratu jest to, że kolagen z ogona szczura nie jest identyczny z kolagenem ludzkim lub ludzką skórą właściwą, gdzie kolageny typu I i III są obecne jako główne składniki, a izolowany kolagen z ogona szczura jest niezmiennie rozdrobniony.

Macierz mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm to galaretowata mieszanina białek wydzielana przez hodowane komórki mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm10. Głównymi składnikami są laminina, kolagen typu IV, siarczan heparyny, proteoglikan, entaktyna i nidogen, a dokładne proporcje tych białek będą się różnić w zależności od partii. Oprócz białek strukturalnych, matryca ta zawiera również znaczne poziomy czynników wzrostu, takich jak transformujący czynnik wzrostu β, naskórkowy czynnik wzrostu, insulinopodobny czynnik wzrostu 1, czynnik wzrostu fibroblastów bydlęcych i płytkowy czynnik wzrostu, który zmieniłby zachowanie komórkowe11,12. Wskazując na samą złożoność macierzy mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm, w niedawnym badaniu proteomicznym zidentyfikowano łącznie1851 białek. Ze względu na bogatą i złożoną naturę tej matrycy zaleca się ostrożność przy interpretacji i porównywaniu różnych eksperymentów z jej użyciem11.

Nasze laboratoria żywo interesują się genetycznymi chorobami skóry, szczególnie tymi z predyspozycjami do rozwoju raka płaskonabłonkowego skóry (cSCC)14. W przypadku recesywnego dystroficznego pęcherzowego oddzielania się naskórka (RDEB), ciężkiej choroby pęcherzowej z mutacjami linii zarodkowej w genie15-17 COL7A1, ustaliliśmy, że mikrośrodowisko skórne u tych pacjentów sprzyja nowotworowi18. W trakcie tego badania nie byliśmy w stanie ocenić właściwości fibroblastów skóry osadzonych w macierzy mięsaka myszy kolagenu I / Engelbreth-Holm-Swarm i badaliśmy sposoby oceny własnej, natywnej macierzy komórek. Aby to osiągnąć, zmodyfikowaliśmy poprzednią technikę z laboratorium Lucie Germain, pracując na odpowiednikach ludzkiej skóry19,20. Technika Germaina była w stanie zrekonstruować ludzką skórę z dobrze zorganizowaną błoną podstawną przy użyciu pierwotnych kultur ludzkich keratynocytów i fibroblastów przy braku syntetycznego lub trupiego rusztowania.

W tym artykule opisano kroki użyte do podsumowania mikrośrodowiska zrębu guza skórnego (macierzy natywnej) pochodzącego bezpośrednio z pierwotnych fibroblastów zrębu in vitro 18. Natywne matryce wytworzone w wyniku długotrwałej hodowli fibroblastów zastosowano jako skórny odpowiednik testu na inwazję komórek cSCC. Przedstawiamy dane przy użyciu natywnej macierzy pochodzącej albo z macierzy zewnątrzkomórkowej wydzielanej przez fibroblasty RDEB (z niedoborem kolagenu typu VII (C7)) lub z fibroblastów RDEB transdukowanych retrowirusowo konstruktem eksprymującym kolagen typu VII i wykazujemy głęboki wpływ pojedynczego kolagenu na inwazję komórek nowotworowych.

<table><tbody><tr><td>2-fosforan kwasu L-askorbinowego</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM z L-glutaminą, 4 500 mg/L D-glukoza, 110 mg/L pirogronian sodu</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicylina-Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina</td><td>VWR</td><td>PROL28908.290</td><td></td></tr><tr><td>Cylindry klonalne</td><td>Sigma</td><td>Z370789</td><td></td></tr><tr><td>Siatka nylonowa Tarcza filtracyjna hydrofilowa 100 &#956; m 25 &#956; m średnica 100 / pk</td><td>Millipore</td><td>NY1H02500</td><td></td></tr><tr><td>Gięta siatka druciana ze stali nierdzewnej</td><td>Wykonane we własnym zakresie</td><td></td><td>Wymiary zostały wykonane tak, aby siatka pasowała do płyt 6-dołkowych</td></tr></tbody></table>

inżynieria tkankowa mikrośrodowiska zrębu guza z zastosowaniem do inwazji komórek rakowych

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypowe hodowle komórek nabłonkowych na matrycy z komórkami mezenchymalnymi są szeroko stosowane do badania różnicowania i inwazji komórek nabłonkowych. Kolagen i/lub matryca ogona szczura typu I pochodzące z komórek mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm były tradycyjnie wykorzystywane jako substraty do modelowania mikrośrodowiska macierzy lub zrębu, w którym znajdują się komórki mezenchymalne (zwykle fibroblasty). Chociaż eksperymenty z użyciem takich matryc są bardzo pouczające, można argumentować, że ze względu na nadrzędną obecność pojedynczego białka (takiego jak kolagen typu I) lub wysoką zawartość składników błony podstawnej i czynników wzrostu (takich jak w macierzy pochodzącej z komórek mięsaka myszy), substraty te nie odzwierciedlają najlepiej wkładu samych komórek zrębu w skład macierzy. Aby zbadać natywne matryce wytwarzane przez pierwotne fibroblasty skóry wyizolowane od pacjentów ze skłonnym do nowotworów, genetycznym zaburzeniem pęcherzowym (recesywne dystroficzne pęcherzowe oddzielanie się naskórka), dostosowaliśmy istniejący natywny protokół matrycowy do badania inwazji komórek nowotworowych. Fibroblasty są indukowane do wytwarzania własnej macierzy przez dłuższy czas w hodowli. Ta natywna matryca jest następnie odłączana od naczynia hodowlanego, a komórki nabłonkowe są na niej umieszczane, zanim cała kokultura zostanie podniesiona do granicy faz powietrze-ciecz. Różnicowanie i/lub inwazję komórkową można następnie ocenić w czasie. Technika ta zapewnia możliwość oceny interakcji komórek nabłonkowo-mezenchymalnych w warunkach 3D bez konieczności stosowania syntetycznej lub obcej matrycy, a jedyną wadą jest wydłużony okres czasu wymagany do wytworzenia macierzy natywnej. Tutaj opisujemy zastosowanie tej techniki do oceny zdolności pojedynczej cząsteczki wyrażanej przez fibroblasty, kolagen typu VII, do hamowania inwazji komórek nowotworowych.

Technika ta otwiera możliwość badania i porównywania zachowań inwazyjnych komórek nowotworowych (w tym przypadku cSCC) w różnych trójwymiarowych środowiskach zrębowych. Dzięki tej metodzie można generować nie tylko natywne macierze z niedoborem C7, które odtwarzają środowisko skóry właściwej w RDEB, ale także dodatkowe macierze zmodyfikowane genetycznie w celu nadekspresji C718. Jak pokazano na Rysunku 2, inwazja keratynocytów cSCC w RDEB była znacznie zahamowana w natywnych macierzach z nadek...

Natywna matryca pochodząca z fibroblastów pochodząca z inżynierii tkankowej jest nowym narzędziem do generowania substratu zrębu, który wspiera proliferację i różnicowanie komórek nabłonkowych. W artykule przedstawiono protokół stosujący tę metodologię do oceny wpływu różnych typów komórek zrębu na biologię komórek nowotworowych.

Inżynieria tkankowa mikrośrodowiska zrębu guza z zastosowaniem do inwazji komórek rakowych

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Ogólnym celem poniższej procedury jest wytworzenie natywnej macierzy z fibroblastów w celu oceny inwazji komórek nowotworowych. Osiąga się to najpierw poprzez hodowlę fibroblastów na plastiku w pożywce wzbogaconej kwasem sorbowym, aby wygenerować natywną macierz. W drugim kroku natywna macierz zostaje oddzielona i zwolniona z plastikowej powierzchni hodowlanej, a następnie na macierz tę wysiewa się komórki nowotworowe i po ustalonym czasie przenosi ją na granicę faz powietrze-ciecz.Te hodowle 3D są zbierane do analizy histologicznej inwazji komórek nowotworowych. Ostatecznie wpływ macierzy fibroblastycznej na inwazję komórek nowotworowych można ocenić za pomocą analizy immunohistologicznej. Zaletą tej techniki generowania typowych hodowli 3D jest możliwość oceny macierzy natywnej produkowanej przez same fibroblasty, bez obecności substratów syntetycznych lub obcych, takich jak kolagen typu I pochodzący z innego gatunku. Pracę rozpoczyna się od wysiania 200 000 fibroblastów na studzienkę w płytkach 6-studzienkowych w pożywce dla fibroblastów, uzupełnionej o świeżo przygotowany kwas askorbinowy.Wymień pożywkę fosforanową w komórkach co dwa do trzech dni, dodając od dwóch do pięciu mililitrów świeżej pożywki. Po sześciu tygodniach powstanie widoczna gołym okiem gruba warstwa komórek zatopionych w macierzy zewnątrzkomórkowej. W zależności od rodzaju użytych komórek, widoczna macierz może uformować się wcześniej lub później i może zacząć odrywać się od naczynia, co pokazano tutaj.Aby oddzielić tę warstwę od płytki do hodowli tkanek, delikatnie przesuń końcówką mikropipety o objętości 1 ml wzdłuż obwodu macierzy, a następnie skieruj krawędzie macierzy ku środkowi dołka. Komórki i macierz natywna powinny łatwo oddzielić się od powierzchni płytki i unosić w pożywce. Rozprostuj macierz natywną w pożywce, aby zapobiec jej zwijaniu się.Pozostawić natywną macierz do pływania i przebudowy przez pięć dni, kontynuując wymianę pożywki co dwa do trzech dni ze względu na wytrzymałość na rozciąganie i wewnętrzną przebudowę. Macierz ulegnie drastycznemu skurczeniu i zmniejszy się do mniejszej, ale grubszej macierzy natywnej, po czym będzie gotowa do wykorzystania w teście inwazji.W celu przeprowadzenia testu inwazji. Najpierw należy użyć pęsety tępowej, aby delikatnie przenieść natywną macierz na siatkę nylonową. Po umieszczeniu na siatce, za pomocą końcówki mikro-pipety o pojemności 1 ml oraz pęsety tępowej, należy delikatnie rozprowadzić macierz, aby była jak najbardziej płaska.Następnie nanieś niewielką ilość wazeliny na jeden koniec jednego sterylnego cylindra klonalnego na macierz. Następnie umieść cylindry na macierzach natywnych stroną z wazeliną do dołu, aby zapewnić szczelne połączenie między macierzą natywną a pierścieniami klonalnymi. Teraz dodaj do cylindrów 250 000 komórek raka kolistokomórkowego skóry lub komórek SCC w pożywce do wzrostu carat site.Po osadzeniu się komórek SCC skóry na macierzy natywnej, wyjmij cylindry, a następnie przenieś natywną macierz z siatki nylonowej oraz komórki SEC skóry na granicę powietrze-ciecz, umieszczając je na wsporniku z giętej stalowej siatki drucianej. Na koniec dodaj pożywkę do wzrostu keratynocytów, uzupełnioną o kwas sorbowy, aż poziom pożywki dotknie spodu macierzy natywnej; wymieniaj pożywkę co dwa lub trzy dni i zbieraj próbki w siódmym oraz czternastym dniu po wysianiu komórek SCC skóry. Technika ta umożliwia badanie i porównywanie zachowania inwazyjnego komórek nowotworowych w różnych trójwymiarowych środowiskach zrębu.Jak widać na tych obrazach, inwazja keratynocytów RDEB SCC skóry była znacznie zahamowana w komórkach C seven nadprodukujących macierze natywne (panele po prawej stronie) w porównaniu do kontrolnych komórek RDEB z niedoborem C seven (panele po lewej stronie). Opracowanie tej techniki umożliwiło badaczom bezpośrednią ocenę wpływu macierzy natywnej produkowanej przez fibroblasty na procesy komórek nowotworowych, takie jak inwazja.

tissue-engineering-tumor-stromal-microenvironment-with-application-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Inżynieria tkankowa mikrośrodowiska stromy guzowej z zastosowaniem do inwazji komórek nowotworowych

Opisano prostą metodę analizy wpływu fibroblastów tkankowych na powiązane z nimi komórki nabłonkowe. Połączenie tej metody z trójwymiarową hodowlą tkankową może ułatwić analizę komórek po ich izolacji z układu 3D. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku komórek o różnym potencjale złośliwości, co pozwala na systematyczne badanie wpływu ziówna związanego z nowotworem na komórki nowotworowe.

Izolacja komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z trójwymiarowej mieszanej kokultury sferoidów komórkowych

Przepływ płynu śródmiąższowego jest zwiększony w guzach litych i może modulować inwazję komórek nowotworowych. W niniejszej pracy opisujemy technikę nakładania przepływu płynu śródmiąższowego na komórki zatopione w macierzy, a następnie pomiaru jego wpływu na inwazję komórek. Technika ta może być łatwo zaadaptowana do badania innych układów.

Trójwymiarowy model hodowli komórkowej do pomiaru wpływu przepływu płynu śródmiąższowego na inwazję komórek nowotworowych

Ten film opisuje technikę wykorzystania natywnej matrycy do badania inwazji komórek nowotworowych. Technika zastosowana w tym teście zapewnia możliwość oceny interakcji komórek nabłonkowo-mezenchymalnych w warunkach 3D bez konieczności stosowania syntetycznej lub obcej matrycy.

Test inwazji komórek nowotworowych: natywna metoda 3D oparta na macierzy in vitro do oceny interakcji komórek nabłonkowo-mezenchymalnych

Opisano metody tworzenia ludzkich tkanek nowotworowych 3D jako systemów testowych. Technologie te opierają się na bezkomórkowym biologicznym rusztowaniu unaczynionym (BioVaSc), pierwotnych komórkach ludzkich i linii komórek nowotworowych, które mogą być hodowane zarówno w warunkach statycznych, jak i dynamicznych w bioreaktorze przepływowym.

Inżynieria tkankowa ludzkiego systemu badań 3D nowotworów in vitro

Tutaj prezentujemy protokół do ko-hodowli w trzech wymiarach, który jest przydatny do badania interakcji wielokomórkowych i zależnej od macierzy zewnątrzkomórkowej modulacji zachowania komórek rakowych. W tym eksperymentalnym modelu komórki rakowe są hodowane na żelach kolagenowych osadzonych w ludzkich fibroblastach związanych z rakiem.

Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu 3D in vitro do badania różnicowania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) w środowisku podobnym do masy guza, które mogą być adresowane w różnych systemach analizy, takich jak immunofluorescencja, analiza transkrypcyjna i obrazowanie żywych komórek.

Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Poznaj metodę generowania macierzy fibroblastowej do badania inwazji komórek nowotworowych w kulturach 3D. Technika ta pozwala ocenić wpływ mikrośrodowiska guza na biologię komórek rakowych.

Inżynieria tkankowa mikrośrodowiska zrębu guza z zastosowaniem do inwazji komórek rakowych

Przeglądaj więcej filmów