Inżynieria tkankowa mikrośrodowiska zrębu guza z zastosowaniem do inwazji komórek rakowych
18 marca 2014
Natywna matryca pochodząca z fibroblastów pochodząca z inżynierii tkankowej jest nowym narzędziem do generowania substratu zrębu, który wspiera proliferację i różnicowanie komórek nabłonkowych. W artykule przedstawiono protokół stosujący tę metodologię do oceny wpływu różnych typów komórek zrębu na biologię komórek nowotworowych.
Ogólnym celem poniższej procedury jest wytworzenie natywnej macierzy z fibroblastów w celu oceny inwazji komórek nowotworowych. Osiąga się to najpierw poprzez hodowlę fibroblastów na plastiku w pożywce wzbogaconej kwasem sorbowym, aby wygenerować natywną macierz. W drugim kroku natywna macierz zostaje oddzielona i zwolniona z plastikowej powierzchni hodowlanej, a następnie na macierz tę wysiewa się komórki nowotworowe i po ustalonym czasie przenosi ją na granicę faz powietrze-ciecz.
Te hodowle 3D są zbierane do analizy histologicznej inwazji komórek nowotworowych. Ostatecznie wpływ macierzy fibroblastycznej na inwazję komórek nowotworowych można ocenić za pomocą analizy immunohistologicznej. Zaletą tej techniki generowania typowych hodowli 3D jest możliwość oceny macierzy natywnej produkowanej przez same fibroblasty, bez obecności substratów syntetycznych lub obcych, takich jak kolagen typu I pochodzący z innego gatunku. Pracę rozpoczyna się od wysiania 200 000 fibroblastów na studzienkę w płytkach 6-studzienkowych w pożywce dla fibroblastów, uzupełnionej o świeżo przygotowany kwas askorbinowy.
Wymień pożywkę fosforanową w komórkach co dwa do trzech dni, dodając od dwóch do pięciu mililitrów świeżej pożywki. Po sześciu tygodniach powstanie widoczna gołym okiem gruba warstwa komórek zatopionych w macierzy zewnątrzkomórkowej. W zależności od rodzaju użytych komórek, widoczna macierz może uformować się wcześniej lub później i może zacząć odrywać się od naczynia, co pokazano tutaj.
Aby oddzielić tę warstwę od płytki do hodowli tkanek, delikatnie przesuń końcówką mikropipety o objętości 1 ml wzdłuż obwodu macierzy, a następnie skieruj krawędzie macierzy ku środkowi dołka. Komórki i macierz natywna powinny łatwo oddzielić się od powierzchni płytki i unosić w pożywce. Rozprostuj macierz natywną w pożywce, aby zapobiec jej zwijaniu się.
Pozostawić natywną macierz do pływania i przebudowy przez pięć dni, kontynuując wymianę pożywki co dwa do trzech dni ze względu na wytrzymałość na rozciąganie i wewnętrzną przebudowę. Macierz ulegnie drastycznemu skurczeniu i zmniejszy się do mniejszej, ale grubszej macierzy natywnej, po czym będzie gotowa do wykorzystania w teście inwazji.
W celu przeprowadzenia testu inwazji. Najpierw należy użyć pęsety tępowej, aby delikatnie przenieść natywną macierz na siatkę nylonową. Po umieszczeniu na siatce, za pomocą końcówki mikro-pipety o pojemności 1 ml oraz pęsety tępowej, należy delikatnie rozprowadzić macierz, aby była jak najbardziej płaska.
Następnie nanieś niewielką ilość wazeliny na jeden koniec jednego sterylnego cylindra klonalnego na macierz. Następnie umieść cylindry na macierzach natywnych stroną z wazeliną do dołu, aby zapewnić szczelne połączenie między macierzą natywną a pierścieniami klonalnymi. Teraz dodaj do cylindrów 250 000 komórek raka kolistokomórkowego skóry lub komórek SCC w pożywce do wzrostu carat site.
Po osadzeniu się komórek SCC skóry na macierzy natywnej, wyjmij cylindry, a następnie przenieś natywną macierz z siatki nylonowej oraz komórki SEC skóry na granicę powietrze-ciecz, umieszczając je na wsporniku z giętej stalowej siatki drucianej. Na koniec dodaj pożywkę do wzrostu keratynocytów, uzupełnioną o kwas sorbowy, aż poziom pożywki dotknie spodu macierzy natywnej; wymieniaj pożywkę co dwa lub trzy dni i zbieraj próbki w siódmym oraz czternastym dniu po wysianiu komórek SCC skóry. Technika ta umożliwia badanie i porównywanie zachowania inwazyjnego komórek nowotworowych w różnych trójwymiarowych środowiskach zrębu.
Jak widać na tych obrazach, inwazja keratynocytów RDEB SCC skóry była znacznie zahamowana w komórkach C seven nadprodukujących macierze natywne (panele po prawej stronie) w porównaniu do kontrolnych komórek RDEB z niedoborem C seven (panele po lewej stronie). Opracowanie tej techniki umożliwiło badaczom bezpośrednią ocenę wpływu macierzy natywnej produkowanej przez fibroblasty na procesy komórek nowotworowych, takie jak inwazja.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół wytwarzania natywnej macierzy z fibroblastów w celu badania inwazji komórek nowotworowych. Metodologia ta umożliwia ocenę wpływu różnych typów komórek zrębowych na biologię komórek nowotworowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Biologia komórki
- Onkologia
Wprowadzenie
- Macierze pochodzenia fibroblastycznego zapewniają naturalne środowisko do wzrostu komórek.
- Zrozumienie inwazji komórek nowotworowych ma kluczowe znaczenie dla badań nad rakiem.
- Hodowle 3D mogą dokładniej naśladować warunki in vivo niż hodowle 2D.
- Macierze natywne pozwalają uniknąć komplikacji związanych z podłożami syntetycznymi.
Cel badania
- W celu wytworzenia naturalnej macierzy pochodzącej z fibroblastów.
- W celu oceny wpływu tej macierzy na zachowanie komórek nowotworowych.
- W celu lepszego zrozumienia oddziaływań między nowotworem a zrąbem.
Zastosowane metody
- Fibroblasty hoduje się w pożywce wzbogaconej kwasem sorbowym.
- Naturalną macierz oddziela się od plastikowej powierzchni.
- Komórki nowotworowe wysiewa się na macierz.
- Kultury 3D analizuje się histologicznie pod kątem inwazji nowotworowej.
Główne wyniki
- Naturalna macierz wspomaga proliferację komórek nowotworowych.
- Analiza histologiczna pozwala zrozumieć wzorce naciekania nowotworu.
- Różne typy komórek zrębowych wpływają na zachowanie komórek nowotworowych.
- Metoda ta zapewnia model bardziej istotny fizjologicznie do celów badawczych.
Wnioski
- Macierz pochodna od fibroblastów jest cennym narzędziem w badaniach nad rakiem.
- Ułatwia ona zrozumienie mikrośrodowisk nowotworowych.
- Podejście to może doprowadzić do opracowania lepszych strategii terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Technika ta umożliwia bezpośrednią ocenę wpływu macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzenia fibroblastów na inwazję komórek nowotworowych, zapewniając fizjologicznie istotny model oddziaływań między zrębem a guzem. Dzięki wyeliminowaniu syntetycznych podłoży zwiększa ona pewność prognostyczną w przedklinicznej walidacji celów oraz w redukcji ryzyka mechanistycznego terapii modulujących zrąb. Podejście to wspiera wczesne etapy procesów odkrywania leków, skupiające się na udziale zrębu w progresji nowotworu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie składników macierzy pochodzenia zmiennego w testach inwazji nowotworowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia istotny dla ludzi trójwymiarowy system hodowli 3D w celu minimalizacji ryzyka związanego z celami stromalnymi.
- Wartość naukowa: Wspiera funkcjonalną walidację cząsteczek stromalnych, takich jak kolagen typu VII, w modulowaniu zachowania nowotworu.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia generowanie ustandaryzowanych macierzy natywnych do odtwarzalnych pomiarów inwazji komórek nowotworowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ilościową ocenę histologiczną głębokości i wzorca inwazji w czasie.
- Wartość naukowa: Ułatwia porównywanie inwazji w warunkach stroma określonych genetycznie.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje ciągłość między guzem a zrębem u ludzi z wykorzystaniem fibroblastów pochodzących od pacjentów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużną analizę inwazji w 7. i 14. dniu po wysiewaniu.
- Wartość naukowa: Łączy skład macierzy zrębowej z fenotypem inwazyjnym w raku płaskonabłonkowym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od identyfikacji celów w zrębie po walidację funkcjonalną w testach inwazji 3D – co pozwala na wybór wiodących kandydatów spośród czynników modulujących zrąb.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez dotyczących wpływu macierzy zrębu na szlaki inwazji nabłonkowej.
- Screening: Przeprowadzanie testów inwazji z wykorzystaniem ustandaryzowanych macierzy generowanych przez fibroblasty w celu screeningu związków chemicznych lub genetycznego.
- Analityka: Dostarczanie histologicznych punktów końcowych do ilościowego oznaczania inwazji w określonych warunkach zrębu.
- Badania translacyjne: Wykorzystanie fibroblastów pochodzących od pacjentów do modelowania wkładu zrębu istotnego dla przebiegu choroby.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Tworzenie wielokrotnego wykorzystania platformy do badań biologii zrębu w różnych typach nowotworów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez odizolowanie efektów macierzy zrębowej od substratów egzogennych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację produkcji macierzy oraz konfiguracji testów pomiędzy laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ujawnienie zależności zrębowych w inwazji nowotworowej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów ukierunkowanych na zrąb, z uwzględnieniem dostosowania do ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli pierwotnych fibroblastów oraz inżynierii tkankowej 3D.
- Zależy od długoterminowej hodowli (do sześciu tygodni) w celu odłożenia naturalnej macierzy.
- Wymaga zachowania sterylnych warunków podczas odrywania macierzy, wysiewania komórek nowotworowych oraz hodowli na granicy fazy powietrze-ciecz.
- Obejmuje obróbkę histologiczną i obrazowanie w celu analizy inwazji.
- Ograniczony przez wydłużony czas dojrzewania macierzy, co wpływa na przepustowość metody.
