Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

Badania strukturalne i biochemiczne ludzkich transporterów błonowych wymagają miligramowych ilości stabilnego, nienaruszonego i jednorodnego białka. W tym miejscu opisujemy skalowalne metody badań przesiewowych, ekspresji i oczyszczania ludzkich transporterów nośników substancji rozpuszczonych przy użyciu genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów.

Nośniki substancji rozpuszczonych lub SLC są odpowiedzialne za pobieranie składników odżywczych i biorą udział w chorobach ludzi. Jednak istnieje niewiele leków ukierunkowanych na SLC, ponieważ są one słabo przebadane. Opracowaliśmy skuteczne metody klonowania, ekspresji i oczyszczania SLC.

Nasz przepływ pracy pozwala na uzyskanie czystych białek, co pozwala na badania biochemiczne i strukturalne, a ostatecznie dostarcza informacji na potrzeby kampanii odkrywania leków. Ze względu na liczne role w procesach biologicznych, chorobach i dostarczaniu leków, SLC cieszą się coraz większym zainteresowaniem i stają się atrakcyjnymi celami terapeutycznymi. Prywatno-publiczne projekty reolute IMI wygenerowały otwarte zasoby i dane Nexus, które umożliwiły nowatorskie odkrycia w zakresie funkcji SLC, fizjologii, patologii i ukierunkowania terapeutycznego.

Tradycyjnie, SLC były trudne do zbadania, ponieważ są integralnymi białkami błonowymi o różnych substratach i różnych mechanizmach transportu. Ostatnio cryo-EM, system ekspresji Bacmid i nowe odczynniki certyfikacyjne doprowadziły do skokowej zmiany w cewnikowaniu warstw. Do badań biochemicznych i strukturalnych potrzebne są czyste próbki białek.

Jednak ludzcy nosiciele substancji rozpuszczonej często mają słabą wydajność, gdy są nadmiernie eksprymowane i niestabilne po oczyszczeniu. W związku z tym w przeszłości każdy cel wymagał lat na opracowanie indywidualnych struktur w celu wytworzenia próbki białka do dalszych zastosowań. Nasza metoda jest zoptymalizowana pod kątem równoległego i opłacalnego badania wielu celów lub konstrukcji jednego celu.

W związku z tym starannie równoważy elastyczność eksperymentów, koszty, czas i zasoby laboratoryjne. Ponadto oferujemy otwarty dostęp do wszystkich naszych protokołów i zasobów w tym artykule oraz w portalu internetowym resolute. Na początek dodaj 150 nanogramów nośnika substancji rozpuszczonej lub klonu SLC i 100 nanogramów wektora w 96-dołkowej płytce, zwiększ objętość reakcji do ośmiu mikrolitrów przy 10-milimolowym roztworze Tris o pH osiem.

Następnie dodaj dwa mikrolitry rekombinowanej mieszanki enzymów i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji dodaj jeden mikrolitr proteinazy K i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj cztery mikrolitry mieszaniny reakcyjnej do 50 mikrolitrów chemicznie kompetentnych komórek MAC E-coli i przekształć komórki metodą szoku cieplnego.

Po przemianie umieść zawiesinę bakteryjną na płytce agarowej o wadze funtów. Zidentyfikuj kolonie, w których znajduje się wektor PHTBV 1.1 z wstawieniem genu SLC, używając odpowiednich starterów i standardowych protokołów dla Colony PCR. Rozpocznij od rozmrożenia zamrożonych nośników substancji rozpuszczonej lub granulek komórek SLC w łaźni wodnej w temperaturze pokojowej.

Przygotować bufor do solubilizacji, łącząc 135 mililitrów buforu zasadowego i trzy tabletki koktajlowe inhibitorów proteazy. Po rozpuszczeniu tabletek należy ponownie zawiesić osad w buforze do solubilizacji. Następnie dodaj DNA i przenieś zawiesinę do lodowatego homogenizatora.

Homogenizować roztwór, przesuwając tłok w górę i w dół około 20 razy, utrzymując homogenizator na lodzie. Następnie dodaj roztwór podstawowy detergentu do 1% stężenia końcowego. Przenieś mieszaninę solubilizacyjną do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i powoli obracaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po godzinie odwirować mieszaninę i zebrać supernatant. Zrównoważyć od czterech do sześciu mililitrów objętości złoża żywicy paciorkowcowej taktyny z buforem podstawowym. Następnie dodaj zrównoważoną żywicę do rozpuszczonego supernatantu i obracaj przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wlej roztwór na kolumnę przepływu grawitacyjnego i pozwól roztworowi przepłynąć. Przemyć żywicę 30-krotnością objętości złoża buforu do płukania paciorkowca w trzech równych krokach. Następnie dodaj trzy do pięciu mililitrów buforu iluzji i inkubuj przez 15 minut, zanim zbierzesz elucję.

Zmierz stężenie białka za pomocą spektroskopii absorpcyjnej UV. Połącz pożądane frakcje iluzji i dodaj trzy proteazy C. Obracaj rurkę powoli przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia zrównoważ od dwóch do czterech mililitrów objętości złoża żywicy powinowactwa do metalu kobaltowego z buforem SEC. Dodaj wyrównaną żywicę powinowactwa do metalu kobaltowego do mieszaniny reakcyjnej trzech C przez noc i obracaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po godzinie wlej roztwór do kolumny grawitacyjnej i zbierz przepływ.

Skoncentrować przepływ w filtrze odśrodkowym o mocy 100 kilodaltonów, wirując z prędkością 3000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zrównoważ opartą kolumnę SEC z buforem SEC. Wstrzyknąć próbkę do pętli próbki i uruchomić program SEC z natężeniem przepływu takim, aby ciśnienie w kolumnie było poniżej specyfikacji producenta kolumny.

Za pomocą kolektora frakcji zbierz 300 frakcji mikrolitrów w całym cyklu SEC. Po zebraniu frakcji pikowych zmierz absorbancję przy 280 nanometrach. Następnie zagęścić próbki do wymaganej objętości w filtrze odcinającym o mocy 100 kilodaltonów.

Początkową ekspresję białka SLC na małą skalę analizowano za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. Mikroskopia fluorescencyjna SLC oznaczonego GFP potwierdziła lokalizację białka specyficzną dla błony plazmatycznej ze znaczną akumulacją wewnątrzkomórkową. Chemicznie i strukturalnie jednorodne białko dało pojedynczy monodyspersyjny pik A2 80 podczas chromatografii wykluczającej wielkość.