Name: Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj metody ekspresji i oczyszczania ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych. Techniki te umożliwiają odkrywanie nowych celów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wykonana w ramach projektu RESOLUTE. Projekt RESOLUTE otrzymał dofinansowanie ze środków Wspólnego Przedsięwzięcia na rzecz Inicjatywy w zakresie Leków Innowacyjnych 2 na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 777372. Wspólne przedsięwzięcie otrzymuje wsparcie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji "Horyzont 2020" oraz EFPIA. Niniejszy artykuł odzwierciedla jedynie poglądy autorów i ani IMI, ani Unia Europejska, ani EFPIA nie ponoszą odpowiedzialności za jakiekolwiek wykorzystanie zawartych w nim informacji. Plazmid pHTBV został udostępniony dzięki uprzejmości prof. Fredericka Boyce'a (Harvard).

Strategies for Expressing and Purifying Solute Carrier Transporters

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Rozwój terapii ukierunkowanych na SLC pozostaje zahamowany ze względu na brak systematycznej charakterystyki funkcji transportera. Doprowadziło to do nieproporcjonalnie mniejszej liczby leków ukierunkowanych na tę klasę białek w porównaniu z GPCR i kanałami jonowymi63, pomimo ich licznych ról w procesach normalnych i patofizjologicznych. RESOLUTE to międzynarodowe konsorcjum, którego celem jest opracowanie najnowocześniejszych technik i narzędzi badawczych w celu przyspieszenia i usprawnienia obec...

Białka błonowe od dawna są celem zarówno dla badaczy, jak i przemysłu farmaceutycznego. Spośród nich nośniki substancji rozpuszczonych (SLC) są rodziną ponad 400 wtórnych genów transportowych zakodowanych w ludzkim genomie1. Transportery te biorą udział w imporcie i eksporcie wielu cząsteczek, w tym jonów2, neuroprzekaźników3, lipids4,5,6,7, aminokwasy8, składniki odżywcze9,10,11, oraz farmaceutyki<klasa SUP="odnośnik">12. Przy tak szerokim zakresie substratów, białka te są również zaangażowane w szereg patofizjologii poprzez transport toksyn13, transport i hamowanie przez narkotyki nadużywane14,15, lub szkodliwe mutacje16. Homologi bakteryjne posłużyły jako prototypy podstawowego mechanizmu transportu kilku rodzin SLC17,18,19,20,21,22,23,24,25. W przeciwieństwie do białek ludzkich, ortologi prokariotyczne są często lepiej wyrażane w dobrze poznanym systemie ekspresji Escherichia coli26,27 i są bardziej stabilne w mniejszych detergentach, które dają dobrze uporządkowane kryształy do krystalografii rentgenowskiej28. Jednak różnice w sekwencji i funkcjonalności komplikują wykorzystanie tych daleko spokrewnionych białek do odkrywania leków29,30. W związku z tym często potrzebne jest bezpośrednie badanie ludzkiego białka, aby rozszyfrować mechanizm działania leków ukierunkowanych na SLCs31,32,33,34,35. Podczas gdy ostatnie postępy w mikroskopii krioelektronowej (Cryo-EM) umożliwiły strukturalną charakterystykę SLC w warunkach bardziej natywnych36,37, trudności w ekspresji i oczyszczaniu tych białek pozostają wyzwaniem dla opracowania ukierunkowanych terapii i diagnostyki.
Aby złagodzić ten problem, konsorcjum RESOLUTE (re-solute.eu) opracowało zasoby i protokoły do ekspresji i oczyszczania na dużą skalę ludzkich białek z rodziny SLC38. Zaczynając od genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów, opracowaliśmy metody wysokoprzepustowego klonowania i badań przesiewowych konstruktów SLC. Metody te były systematycznie stosowane do całej rodziny SLC, geny sklonowano do systemu ekspresji wirusa BacMam i przetestowano ekspresję białka w ludzkich liniach komórkowych39 w oparciu o wcześniej opisane metody wysokoprzepustowego klonowania i testowania ekspresji40. Podsumowując, gen SLC jest klonowany z plazmidu pDONR221 do wektora pHTBV1.1. Konstrukt ten jest następnie wykorzystywany do transpozycji interesującego genu do wektora bakcydowego do transfekcji komórek owadów, który zawiera promotor wirusa cytomegalii i elementy wzmacniające ekspresję w komórkach ssaków. Powstały w ten sposób bakulowirus może być wykorzystany do transdukcji komórek ssaków w celu ekspresji docelowego białka SLC.
Dalej rozwijaliśmy ustandaryzowane metody ekspresji na dużą skalę i stabilnego oczyszczania wybranych SLC (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ten protokół zawiera wiele punktów kontrolnych, aby ułatwić skuteczne rozwiązywanie problemów i zminimalizować zmienność między eksperymentami. Warto zauważyć, że rutynowe monitorowanie ekspresji i lokalizacji białek, a także optymalizacja warunków oczyszczania na małą skalę dla poszczególnych celów, były wspomagane przez znaczniki Strep i Green Fluorescent Protein (GFP)41,42.
Ostatecznie, te chemicznie czyste i strukturalnie jednorodne próbki białek mogą być używane do określania strukturalnego za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub mikroskopii krioelektronowej (Cryo-EM), biochemicznych testów zaangażowania w cele, immunizacji w celu wytworzenia spoiwa i bezkomórkowych badań funkcjonalnych poprzez rekonstytucję do chemicznie zdefiniowanych liposomów.

<table><tbody><tr><td>Proteaza 3C</td><td>Produkowane we własnym zakresie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>koncentratory odśrodkowe o sile 50 lub 100 kDa</td><td>Sartorius</td><td>VS0242</td><td></td></tr><tr><td>5-cykloheksylo-1-pentylo-&beta;-D-maltozyd</td><td>Anatrace</td><td>C325</td><td>CYMAL-5</td></tr><tr><td>96-dołkowy zestaw do oczyszczania bakimów</td><td>Millipore</td><td>LSKP09604</td><td>Montage Plasmid Miniprep</td></tr><tr><td>96-dołkowy blok (2 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780271</td><td></td></tr><tr><td>Samoprzylepne uszczelki plastikowe</td><td>Qiagen</td><td>19570</td><td>Podkładki taśmowe</td></tr><tr><td>Kolumna chromatograficzna wykluczająca wielkość agarozy</td><td>Cytiva</td><td>29091596</td><td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td></tr><tr><td>DNAzy benzonazy</td><td>Produkowane we własnym zakresie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BisTris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Hemibursztynian cholesrylu Sól Tris</td><td>Anatrace</td><td>CH210</td><td>CHS</td></tr><tr><td>Żywica kobaltowa o powinowactwie do metalu</td><td>Takara Bio</td><td>635653</td><td>TALON Żywica powinowactwa do metalu</td></tr><tr><td>D(+)-biotyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>851209</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna chromatograficzna wykluczająca wielkość dekstranu-agarozy</td><td>Cytiva</td><td>28990944</td><td>Superdex 200 Zwiększ 10/300 GL</td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Apollo Scientific</td><td>BID3301</td><td></td></tr><tr><td>Odbij tkankę młynek (40 ml)</td><td>DWK Nauki Przyrodnicze</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4693132001</td><td>cOmpete, wolny od EDTA Koktajl inhibitorów proteazy</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fos-Choline-12</td><td>Anatrace</td><td>F308S</td><td>FS-12</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Gliko-diosgenina</td><td>Anatrace</td><td>GDN101</td><td>GDN</td></tr><tr><td>Grawitacyjne kolumny przepływowe</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-06479-25</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 średni</td><td>Thermo Fisher</td><td>12338018</td><td>FreeStyle 293 średni</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Apollo Scientific</td><td>BI8181</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofilowa, obojętna krzemionka UHPLC kolumna</td><td>Sepax</td><td>231300-4615</td><td>Unix-C SEC-300 4,6 x 150</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji owadów</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71259</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Lauryl Maltose Neopentyl Glycol</td><td>Anatrace</td><td>NG310</td><td>LMNG</td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do mikroekspresji</td><td>Glas-Col</td><td>107A DPMINC24CE</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>n-Decyl-&beta;-D-Maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D322</td><td>DM</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td>DDM</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-N,N-dimetyloamino-N-tlenek</td><td>Anatrace</td><td>D360</td><td>LDAO</td></tr><tr><td>n-Nonyl-&beta;-D-Glucopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>N324S</td><td>NG</td></tr><tr><td>n-Octyl-d17-&beta;- D-glukopiranozyd</td><td>Anatrace</td><td>O311D</td><td>OGNG</td></tr><tr><td>Glikol oktaetylenowy Monododecyl Anatrace</td><td></td><td>O330</td><td>C12E8</td></tr><tr><td>Oktylowa glukoza Glikol neopentylowy</td><td>Anatrace</td><td>NG311</td><td>OGNG</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Eter polioksyetylenowy(10)dodecylowy</td><td>Anatrace</td><td>AP1210</td><td>C12E10</td></tr><tr><td>Eter polioksyetylenowy(9)dodecylowy</td><td>Anatrace</td><td>APO129</td><td>C12E9</td></tr><tr><td>Porowate uszczelnienie do płytek do kultur tkankowych</td><td>VWR</td><td>60941-084</td><td>Folie ze sztucznego jedwabiu do kultur biologicznych</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka enzymów rekombinacyjnych</td><td>Thermo Fisher</td><td>11791020</td><td>Gateway LR Clonase II</td></tr><tr><td>Pożywka dla owadów bez surowicy</td><td>Gibco</td><td>10902088</td><td>Sf-900 II Pożywka bez surowicy</td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator 24-głowicowa sonda</td><td>Sonics</td><td>630-0579</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka zasilająca Sonicator</td><td>Sonics</td><td>VCX 750</td><td></td></tr><tr><td>Żywica Strep-Tactin</td><td>IBA Life Sciences</td><td>2-5030-025</td><td>Strep-TactinXT 4Flow żywica o dużej pojemności</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Monododekanian sacharozy</td><td>Anatrace</td><td>S350</td><td>DDS</td></tr><tr><td>Komórki HEK293 dostosowane do zawieszenia</td><td>Odczynnik</td> do transfekcji Thermo Fisher <td>A14527</td><td>Expi293F</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70967</td><td>GeneJuice</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Nośniki substancji rozpuszczonych (SLC) to transportery błonowe, które importują i eksportują szereg endogennych i egzogennych substratów, w tym jony, składniki odżywcze, metabolity, neuroprzekaźniki i farmaceutyki. Pomimo tego, że stały się atrakcyjnymi celami terapeutycznymi i markerami choroby, ta grupa białek jest nadal stosunkowo słabo leczona przez obecne farmaceutyki. Projekty odkrywania leków dla tych transporterów są utrudnione przez ograniczoną wiedzę strukturalną, funkcjonalną i fizjologiczną, ostatecznie ze względu na trudności w ekspresji i oczyszczaniu tej klasy białek osadzonych w błonie. W tym miejscu demonstrujemy metody uzyskiwania miligramowych ilości ludzkich białek transportowych SLC o wysokiej czystości przy użyciu sekwencji genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów. W połączeniu z systematyczną eksploracją konstrukcji konstruktów i ekspresji o wysokiej przepustowości, protokoły te zapewniają zachowanie integralności strukturalnej i aktywności biochemicznej docelowych białek. Podkreślamy również krytyczne etapy ekspresji komórek eukariotycznych, oczyszczania powinowactwa i chromatografii wykluczającej wielkość tych białek. Ostatecznie ten przepływ pracy pozwala uzyskać czyste, funkcjonalnie aktywne i stabilne preparaty białkowe odpowiednie do określania struktury w wysokiej rozdzielczości, badań transportu, testów zaangażowania małych cząsteczek i wysokoprzepustowych badań przesiewowych in vitro.

Geny SLC można klonować z plazmidów RESOLUTE pDONR do wektorów BacMam w celu ekspresji w komórkach ssaków 
Opisane protokoły klonowania, ekspresji i oczyszczania okazały się skuteczne w przypadku wielu transporterów SLC o różnych strukturach białkowych. Niemniej jednak procedury obejmują kilka punktów kontrolnych do monitorowania postępów, co umożliwia optymalizację w celu uwzględnienia różnic w ekspresji, fałdowaniu białek, stabilności zależnej od lipidów i detergentów oraz wrażliwości na warunki buf...

Badania strukturalne i biochemiczne ludzkich transporterów błonowych wymagają miligramowych ilości stabilnego, nienaruszonego i jednorodnego białka. W tym miejscu opisujemy skalowalne metody badań przesiewowych, ekspresji i oczyszczania ludzkich transporterów nośników substancji rozpuszczonych przy użyciu genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów.

Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Nośniki substancji rozpuszczonych lub SLC są odpowiedzialne za pobieranie składników odżywczych i biorą udział w chorobach ludzi. Jednak istnieje niewiele leków ukierunkowanych na SLC, ponieważ są one słabo przebadane. Opracowaliśmy skuteczne metody klonowania, ekspresji i oczyszczania SLC.Nasz przepływ pracy pozwala na uzyskanie czystych białek, co pozwala na badania biochemiczne i strukturalne, a ostatecznie dostarcza informacji na potrzeby kampanii odkrywania leków. Ze względu na liczne role w procesach biologicznych, chorobach i dostarczaniu leków, SLC cieszą się coraz większym zainteresowaniem i stają się atrakcyjnymi celami terapeutycznymi. Prywatno-publiczne projekty reolute IMI wygenerowały otwarte zasoby i dane Nexus, które umożliwiły nowatorskie odkrycia w zakresie funkcji SLC, fizjologii, patologii i ukierunkowania terapeutycznego.Tradycyjnie, SLC były trudne do zbadania, ponieważ są integralnymi białkami błonowymi o różnych substratach i różnych mechanizmach transportu. Ostatnio cryo-EM, system ekspresji Bacmid i nowe odczynniki certyfikacyjne doprowadziły do skokowej zmiany w cewnikowaniu warstw. Do badań biochemicznych i strukturalnych potrzebne są czyste próbki białek.Jednak ludzcy nosiciele substancji rozpuszczonej często mają słabą wydajność, gdy są nadmiernie eksprymowane i niestabilne po oczyszczeniu. W związku z tym w przeszłości każdy cel wymagał lat na opracowanie indywidualnych struktur w celu wytworzenia próbki białka do dalszych zastosowań. Nasza metoda jest zoptymalizowana pod kątem równoległego i opłacalnego badania wielu celów lub konstrukcji jednego celu.W związku z tym starannie równoważy elastyczność eksperymentów, koszty, czas i zasoby laboratoryjne. Ponadto oferujemy otwarty dostęp do wszystkich naszych protokołów i zasobów w tym artykule oraz w portalu internetowym resolute. Na początek dodaj 150 nanogramów nośnika substancji rozpuszczonej lub klonu SLC i 100 nanogramów wektora w 96-dołkowej płytce, zwiększ objętość reakcji do ośmiu mikrolitrów przy 10-milimolowym roztworze Tris o pH osiem.Następnie dodaj dwa mikrolitry rekombinowanej mieszanki enzymów i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji dodaj jeden mikrolitr proteinazy K i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj cztery mikrolitry mieszaniny reakcyjnej do 50 mikrolitrów chemicznie kompetentnych komórek MAC E-coli i przekształć komórki metodą szoku cieplnego.Po przemianie umieść zawiesinę bakteryjną na płytce agarowej o wadze funtów. Zidentyfikuj kolonie, w których znajduje się wektor PHTBV 1.1 z wstawieniem genu SLC, używając odpowiednich starterów i standardowych protokołów dla Colony PCR. Rozpocznij od rozmrożenia zamrożonych nośników substancji rozpuszczonej lub granulek komórek SLC w łaźni wodnej w temperaturze pokojowej.Przygotować bufor do solubilizacji, łącząc 135 mililitrów buforu zasadowego i trzy tabletki koktajlowe inhibitorów proteazy. Po rozpuszczeniu tabletek należy ponownie zawiesić osad w buforze do solubilizacji. Następnie dodaj DNA i przenieś zawiesinę do lodowatego homogenizatora.Homogenizować roztwór, przesuwając tłok w górę i w dół około 20 razy, utrzymując homogenizator na lodzie. Następnie dodaj roztwór podstawowy detergentu do 1% stężenia końcowego. Przenieś mieszaninę solubilizacyjną do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i powoli obracaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po godzinie odwirować mieszaninę i zebrać supernatant. Zrównoważyć od czterech do sześciu mililitrów objętości złoża żywicy paciorkowcowej taktyny z buforem podstawowym. Następnie dodaj zrównoważoną żywicę do rozpuszczonego supernatantu i obracaj przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wlej roztwór na kolumnę przepływu grawitacyjnego i pozwól roztworowi przepłynąć. Przemyć żywicę 30-krotnością objętości złoża buforu do płukania paciorkowca w trzech równych krokach. Następnie dodaj trzy do pięciu mililitrów buforu iluzji i inkubuj przez 15 minut, zanim zbierzesz elucję.Zmierz stężenie białka za pomocą spektroskopii absorpcyjnej UV. Połącz pożądane frakcje iluzji i dodaj trzy proteazy C. Obracaj rurkę powoli przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia zrównoważ od dwóch do czterech mililitrów objętości złoża żywicy powinowactwa do metalu kobaltowego z buforem SEC. Dodaj wyrównaną żywicę powinowactwa do metalu kobaltowego do mieszaniny reakcyjnej trzech C przez noc i obracaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po godzinie wlej roztwór do kolumny grawitacyjnej i zbierz przepływ.Skoncentrować przepływ w filtrze odśrodkowym o mocy 100 kilodaltonów, wirując z prędkością 3000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zrównoważ opartą kolumnę SEC z buforem SEC. Wstrzyknąć próbkę do pętli próbki i uruchomić program SEC z natężeniem przepływu takim, aby ciśnienie w kolumnie było poniżej specyfikacji producenta kolumny.Za pomocą kolektora frakcji zbierz 300 frakcji mikrolitrów w całym cyklu SEC. Po zebraniu frakcji pikowych zmierz absorbancję przy 280 nanometrach. Następnie zagęścić próbki do wymaganej objętości w filtrze odcinającym o mocy 100 kilodaltonów.Początkową ekspresję białka SLC na małą skalę analizowano za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. Mikroskopia fluorescencyjna SLC oznaczonego GFP potwierdziła lokalizację białka specyficzną dla błony plazmatycznej ze znaczną akumulacją wewnątrzkomórkową. Chemicznie i strukturalnie jednorodne białko dało pojedynczy monodyspersyjny pik A2 80 podczas chromatografii wykluczającej wielkość.

high-throughput-expression-purification-human-solute-carriers-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Opisujemy metodę oczyszczania białek rekombinowanych z użyciem znaczników powinowactwa przy wykorzystaniu robotyki do obsługi cieczy. Metoda ta znajduje ogólne zastosowanie w małoscale’owym oczyszczaniu rozpuszczalnych białek z znacznikiem His w formacie wysokoprzepustowym.

Wysokoprzepustowe oczyszczanie rekombinowanych białek z markerami powinowactwa

Protokół ilościowego, wysokoprzepustowego badania ekspresji i analitycznego oczyszczania białek fuzyjnych z małych kultur Escherichia coli jest opisany i zastosowany do ekspresji bogatych w dwusiarczki białek jadu zwierzęcego.

Wysokoprzepustowe ilościowe badania przesiewowe i oczyszczanie stosowane do rekombinowanych, bogatych w dwusiarczki białek jadowych wytwarzanych w E. coli

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem mutacji termostabilizujących, oczyścić ludzki transporter serotoniny, wygenerować przeciwciała o wysokim powinowactwie i skrystalizować kompleks transporter-przeciwciało serotoniny związany z lekiem przeciwdepresyjnym S-citalopram. Protokół ten można dostosować do badania innych trudnych transporterów błonowych, receptorów i kanałów.

Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem

Opisano prosty protokół nadekspresji i oczyszczania zoptymalizowanej pod kątem kodonów, ludzkiej cis-prenylotransferazy, w warunkach niedenaturujących, z Escherichia coli, wraz z testem aktywności enzymatycznej. Protokół ten można uogólnić na produkcję innych białek cis-prenylotransferazy w ilości i jakości odpowiednich do badań mechanistycznych.

Nadekspresja i oczyszczanie ludzkiej cis-prenylotransferazy w Escherichia coli

Oczyszczanie kanałów jonowych jest często wyzwaniem, ale gdy już zostanie osiągnięte, może potencjalnie umożliwić badania in vitro funkcji i struktur kanałów. W tym miejscu opisujemy etapowe procedury ekspresji i oczyszczania białek bestrofiny ssaków, rodziny kanałów Cl- aktywowanych przezCa2+.

Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Tutaj prezentujemy protokół do ekspresji, solubilizacji i oczyszczania kilku eukariotycznych transporterów boranu o homologii do rodziny transporterów SLC4 za pomocą drożdży. Opisujemy również chemiczny test sieciowania w celu oceny oczyszczonych białek homomerycznych pod kątem składania multimerycznego. Protokoły te można dostosować do innych trudnych białek błonowych.

Ekspresja, solubilizacja i oczyszczanie eukariotycznych transporterów boranu

Poznaj metody ekspresji i oczyszczania ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych. Techniki te umożliwiają odkrywanie nowych celów terapeutycznych.

Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

Przeglądaj więcej filmów