Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Ogólnym celem tej techniki ekspresji białek ssaków jest wyprodukowanie miligramowych ilości natywnie pofałdowanych białek odpowiednich do badań strukturalnych, biofizycznych i funkcjonalnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to szybki i prosty protokół uzyskiwania wydzielanych białek ssaków oraz stężenia w czystości wymaganego do badań strukturalnych. Ogólnie rzecz biorąc, stwierdzamy, że większość problemów z wydajnością białka wynika ze zdrowia i żywotności komórek.

Ścisłe monitorowanie żywotności komórek, a także monitorowanie poziomu cukru w pożywce, znacznie poprawia zarówno wydajność białka, jak i przedłuża przydatność komórek. Bardzo ważne jest również monitorowanie gęstości komórek. Stwierdzamy, że jeśli w dowolnym momencie przed transfekcją komórki przekroczą 2 miliony komórek na mililitr, to wydajność białka jest znacznie zmniejszona Aby przeprowadzić hodowlę na dużą skalę 2 93 komórek F, uzupełnij jeden litr pożywki 2 93 F 10 mililitrami 100 x glutaminy i pięcioma mililitrami 100 x paciorkowca pióra.

Antybiotyk ma wystarczającą moc w warunkach wolnych od surowicy, a zmniejszone stężenie antybiotyku poprawia żywotność komórek podczas transfekcji, co poprawia wydajność hodowli białka. 2 93 komórki F w 300 mililitrach pożywki w jednym litrze, poliwęglanowe przegrody kolby Erlenmeyera z wentylowanymi nakrętkami w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 8% dwutlenkiem węgla podczas wytrząsania w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych na dzień przed transfekcją rozcieńczają komórki do 0,5 miliona komórek na mililitr gęstości w dniu transfekcji. Uzupełnij pożywkę hodowlaną, dodając 10% objętości lub 2% wzrostu masy na objętość komórki w pożywce 2 93 F.

Dodaj kafu widoczne na tym etapie, aby kontrolować glikozylację białek. Przygotować roztwory odczynników DNA i transfekcji w pożywce wolnej od surowicy, inkubować przez pięć minut. Następnie dodaj odczynnik do transfekcji do roztworu DNA w przyrostach co jeden mililitr, mieszając.

Delikatnie inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby powstały kompleksy DNA odczynników. Następnie dodaj roztwór do komórek Kroplami pozwól transfekowanym komórkom na ekspresję białka przez 72 do 96 godzin w celu oczyszczenia glikoproteiny. Najpierw zdekantować kulturę do wirówki w kolbie wirówkowej na 20 minut w temperaturze 1300 Gs.To osadzać komórki, zbierać supernat i, jeśli to konieczne, wirować po raz drugi i/lub użyć filtra 0,22 mikrona do sklarowania supernatantu.

Następnie dodaj 10% objętości 10 x ładunek nitro niklu, kwas trioctowy lub bufor wiążący nikiel NTA. Następnie przygotuj kolumnę grawitacyjną o temperaturze czterech stopni Celsjusza, dodając dwa mililitry zawiesiny niklu NTA do kolumny i równoważąc z 10 objętościami kolumny po jednym buforze wiążącym x pracującym w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przelej supernatant na żywicę i zebrać przepływ.

Po przelaniu sklarowanego osadu przepływającego przez kolumnę przemyć 10 objętościami buforu płuczącego w kolumnie. Następnie eluować białko w pięciu objętościach kolumnowych buforu elucyjnego. Jeśli deglikozylacja jest wymagana dla końcowej objętości 0,5 mililitra, zagęścić EIT do 0,43 mililitra za pomocą koncentratora wirówkowego osad wszelkie zanieczyszczenia przez odwirowanie w temperaturze 16 000 GS i czterech stopniach Celsjusza.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów 500-milimolowego cytrynianu sodu, pH 5,5 i 20 mikrolitrów endo hf. Inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, aby usunąć endo HF, najpierw trzykrotnie przepłucz żywicę amylozową w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Inkubuj białko z przemytą żywicą przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po inkubacji wirować przez pięć minut w temperaturze 1000 Gs, aby osadzać żywicę i zbierać supernatant. Zagęścić białko za pomocą odpowiedniego odcięcia masy cząsteczkowej, filtra wirującego i wymiany buforu w pokazanym buforze do przechowywania. Oto reprezentatywne wyniki strony SDS dla wydzielanego białka ulegającego ekspresji w komórkach traktowanych kiną po chromatografii powinowactwa niklu.

Pierwszy pas to białko przed deglikozylacją, a drugi pas to białko po deglikozylacji przez endo hf. Glikozylowane białko biegnie o około 10 kilodaltonów wyżej, a następnie zapada się do pojedynczego pasma zgodnego z przewidywaną masą cząsteczkową po deglikozylacji, po pojedynczym etapie oczyszczania. Ekrany kryształowe zostały ustawione metodą wiszącego kropli.

Górny obraz pokazuje początkowe uderzenie kryształu, a dolny obraz pokazuje zoptymalizowane warunki krystalizacji. Pokazuje to, że biochemiczna jednorodność białka będącego przedmiotem zainteresowania może być czynnikiem decydującym o powodzeniu krystalizacji, a zoptymalizowany system ekspresji ssaków wytwarza białka podatne na tę krystalizację. Dalsze oczyszczanie białka oczyszczonego niklem można łatwo przeprowadzić za pomocą chromatografii wykluczania wielkości.

Jest to również przydatny krok w kierunku oceny produkcji białek i optymalizacji warunków w celu uzyskania prawidłowo pofałdowanych białek. Białko będące przedmiotem zainteresowania powinno być głównym gatunkiem w elucji chromatograficznej, a objętość elucji powinna odpowiadać masie cząsteczkowej białka. Wcześniej. Czasy EEU mogą sugerować agregację lub nieprawidłowe fałdowanie białka po opanowaniu.

Tę technikę można wykonać w ciągu czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować sterylne warunki hodowli komórkowej Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak wielkość, chromatografia wykluczająca, wielokątowe rozpraszanie światła i skanowanie różnicowe, fluorometria mogą być wykonywane w celu oceny stanu oli izacji i stabilności termicznej białka.