Name: Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Poznaj szybką metodę ekspresji białek ssaczych w komórkach 293F z oczyszczaniem do krystalizacji. Monitorowanie gęstości komórek i ich witalności zapewnia wysokie wydajności białek złożonych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH R01-HL119813 (do T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (do T.J.B.), grant CIMED Pilot and Feasibility (dla T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (do Z.Y.) i 15PRE22110004 (do D.L.K.).

1. Produkcja miligramowych ilości plazmidowego DNA do transfekcji przejściowej na dużą skalę
<ol>
	<li>Sklonuj białko będące przedmiotem zainteresowania do wektora ekspresji ssaków o wysokiej liczbie kopii, stosując klonowanie miejsca restrykcji lub inną odpowiednią technikę.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać optymalne wyniki, użyj wektora pHLsec 7, który ma wbudowany C-końcowy znacznik 6His, silną sekwencję Kozaka promotora i zoptymalizowany sygnał wydzielania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć plazmid w kompetentne komórki.
	<ol>
		<li>Dodać 20 μl kompetentnych komórek E. coli do 1 μg plazmidowego DNA i inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Komórki szoku cieplnego w temperaturze 42 °C przez 35 sekund, a następnie inkubować na lodzie przez 2 minuty.</li>
		<li>Dodać 300 μl pożywki do wzrostu drobnoustrojów (SOC) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut, wytrząsając z prędkością 220 obr./min.</li>
		<li>Płytki komórkowe na płytce agarowej z odpowiednim doborem antybiotyków.
		<ol>
			<li>Użyj 100 μg/ml karbenicyliny, jeśli plazmid znajduje się w wektorze pHLsec.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla kolonii w 250 ml bulionu Luria (LB) Podłoże uzupełnione 100 μg/ml antybiotyku (karbenicyliny) O/N w temperaturze 37 °C, wstrząsając przy 220 obr./min.</li>
	<li>Oczyść DNA z hodowli za pomocą zestawu Hi-Speed Plasmid Maxi Kit zgodnie z protokołem producenta.
	<ol>
		<li>Eluować DNA w buforze EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5), zamiast buforu TE.</li>
		<li>Podwielokrotnić oczyszczony plazmid w ilości potrzebnej do transfekcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla na dużą skalę i transfekcja przejściowa komórek 293F
<ol>
	<li>Uzupełnij 1 L 293F pożywki z 10 ml glutaminy i 5 ml Pen/Strep (oba 100x). Przechowywać w temperaturze 4 °C. 5 ml wstrzykiwacza/paciorkowca ma wystarczającą moc w warunkach bez surowicy, a zmniejszone stężenie antybiotyku poprawia żywotność komórek podczas transfekcji, co poprawia wydajność białka.</li>
	<li>Hodowla komórek 293F w 300 ml pożywce w 1 l poliwęglanowym kolbach Erlenmeyera z wentylowanymi nakrętkami w temperaturze 37 °C z 8% CO2 podczas wytrząsania w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki do gęstości 5 x 105/ml na jeden dzień przed transfekcją.</li>
	<li>W dniu transfekcji należy uzupełnić pożywkę hodowlaną, dodając 10% objętości 2% w/v Cell Boost w pożywce 293F.
	<ol>
		<li>Zmierz stężenie glukozy za pomocą glukometru zgodnie z instrukcją producenta i w razie potrzeby stosuj suplementy, aby osiągnąć stężenie glukozy 500 mg/dl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na tym etapie dodać kifunenzynę (1 μg/ml stężenie końcowe) w celu kontrolowania glikozylacji białek.</li>
	<li>Obliczyć objętość DNA wymaganą dla 1 μg plazmidu na 1 x 106 komórek. W sterylnych warunkach rozcieńczyć DNA w 5 ml pożywki bez surowicy.</li>
	<li>Obliczyć objętość odczynnika do transfekcji wymaganą dla 1 μg plazmidu na 2 μl odczynnika do transfekcji. W sterylnych warunkach rozcieńczyć odczynnik do transfekcji (PEI-TMC-25) w 5 ml pożywki wolnej od surowicy.</li>
	<li>Dodawać odczynnik do transfekcji do roztworu DNA w odstępach co 1 ml, delikatnie mieszając. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej do powstania kompleksów odczynnik-DNA. Następnie dodaj roztwór do komórek kroplami.</li>
	<li>Pozwól transfekowanym komórkom na ekspresję białka przez 72-96 godzin. Uzupełnij ~10% objętości Cell Boost Media codziennie lub w razie potrzeby, aby utrzymać odczyt glukozy na poziomie 400-600 mg / dl.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie
<ol>
	<li>Zdekantować kulturę do kolby wirówkowej, wirować przez 20 minut przy 1 300 x g w celu osadzenia komórek, a następnie zebrać supernatant. W razie potrzeby odwirować po raz drugi i/lub użyć filtra 0,22 μm do sklarowania supernatantu.</li>
	<li>Dodaj 10% objętości 10x bufor wiążący Ni-NTA (1,5 M NaCl, 0,5 M K2HPO4, 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM imidazol).</li>
	<li>Przygotować kolumnę grawitacyjną, dodając 2 ml zawiesiny Ni-NTA do kolumny i równoważąc z 10 objętościami kolumny (CV) 1x buforu wiążącego. Jeśli to możliwe, wszystkie stopnie kolumny należy wykonywać w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C. Alternatywnie, schłodź białko i wszystkie na lodzie przed krokiem kolumny i utrzymuj białko i zebrane przepływy na lodzie. 
	Uwaga: Gnojowica Ni-NTA składa się w 50% z żywicy objętościowo, a podana przez producenta zdolność wiązania wynosi 50 mg / ml. Koraliki Ni-NTA mogą być ładowane do wielu zastosowań</li>
	<li>Przelej supernatant na żywicę i zbierz przepływ. Powtórz ten krok.</li>
	<li>Przemyć 10 CV buforu do przemywania (300 mM NaCl, 50 mM K2HPO4, 20 mM imidazol pH 8).</li>
	<li>Eluować białko w 5 CV buforu elucyjnego (300 mM NaCl, 50 mM K2HPO4, 250 mM imidazol pH 8).</li>
	<li>Jeśli wymagana jest deglikozylacja:
	<ol>
		<li>Aby uzyskać końcową objętość 0,5 ml, zagęścić eluację do 0,43 ml za pomocą koncentratora wirówkowego. Jeśli dojdzie do powstania osadów, wszelkie zanieczyszczenia należy rozdrobnić przez odwirowanie w temperaturze 16 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać 50 μl 500 mM na-cytrynianu o pH 5,5.</li>
		<li>Dodać 20 μl EndoHf (1 x 106 j./ml). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godz. 
		Uwaga: Enzym działa optymalnie w temperaturze 37 °C, co może powodować agregację skoncentrowanego białka. Przedłużyć inkubację RT, jeśli deglikozylacja, oceniana za pomocą SDS-PAGE lub immunoblottingu, jest niekompletna. Enzym nie wykazuje aktywności w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Aby usunąć EndoHf: Przemyj żywicę amylozową 3x w buforze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub końcowym buforze do przechowywania. Inkubować białko z żywicą przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Wirować przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g, aby zebrać granulki i zebrać supernatant.</li>
		<li>Zagęścić białko za pomocą odpowiedniego filtra wirującego odcinającego masę cząsteczkową i wymiany buforu do buforu magazynowego (150 mM NaCl i 20 mM HEPES pH 7,5).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-host+expression+system+for+recombinant+production+of+challenging+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins.</a> PLoS One. 8, e68674(2013).</li>
<li>Chang, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+structural+genomics%3A+solving+the+glycosylation+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li>
<li>Rich, J. R., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+methods+for+the+production+of+homogeneous+human+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins.</a> Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).</li>
<li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-2+promotes+macrophage+survival+and+lung+disease+after+respiratory+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection.</a> J Exp Med. 212, 681-697 (2015).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigated+cytotoxicity+and+tremendously+enhanced+gene+transfection+efficiency+of+PEI+through+facile+one-step+carbamate+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification.</a> Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).</li>
<li>Elbein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosidase+inhibitors%3A+inhibitors+of+N-linked+oligosaccharide+processing%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing.</a> FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+mouse+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells+1+%28TREM-1%29+at+1.76+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A.</a> J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).</li>
<li>Kober, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+crystallization%2C+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+wild-type+and+mutant+human+TREM-2+ectodomains+linked+to+neurodegenerative+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases.</a> Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).</li>
<li>Yurtsever, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-cleavage+of+human+CLCA1+protein+by+a+novel+internal+metalloprotease+domain+controls+calcium-activated+chloride+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation.</a> J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).</li>
<li>Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+CLCA1+modulates+TMEM16A+to+activate+Ca-dependent+chloride+currents+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Komórki HEK 293F oferują solidną produkcję białek wymagających modyfikacji potranslacyjnych. System ten umożliwia szybką i skalowalną ekspresję natywnie pofałdowanych białek zawierających dwusiarczki, glikozylację i fosforylację, które w przeciwnym razie byłyby nieobecne przy użyciu bardziej rutynowych narzędzi do ekspresji. Ponadto system ten może być używany do ekspresji i oczyszczania kompleksów wielobiałkowych po prostu poprzez kotransfekcję wielu plazmidów. Oprócz TREM2, system ten był szeroko stosowany do badań fun...

Zrozumienie struktury białek na poziomie atomowym jest kluczem do odkrycia molekularnych podstaw biologicznych szlaków i chorób. Rentgenowska krystalografia białek jest najpowszechniej stosowaną/aplikacyjną metodą określania struktur makromolekularnych. Głównym wyzwaniem tej metody jest uzyskanie odpowiedniej ilości odpowiednio sfałdowanego, czystego białka. Staje się to problemem szczególnie podczas pracy z wydzielanymi białkami ssaków, które podlegają specyficznym modyfikacjom potranslacyjnym.
Białka o ekspresji bakteryjnej są głównym źródłem skrystalizowanych białek zdeponowanych w Banku Danych Białkowych1. Bakteryjne systemy ekspresji są w dużej mierze preferowane, ponieważ są szybkie, niedrogie i zazwyczaj dają wysokie plony białka. Jednak zewnątrzkomórkowe domeny białek ssaków ulegające ekspresji u bakterii często nie są prawidłowo pofałdowane, w którym to przypadku do uzyskania jednorodnie pofałdowanego białka wymagane jest ponowne fałdowanie i rozległe etapy oczyszczania. Ponadto wiele białek ssaków wymaga glikozylacji potranslacyjnej, aby osiągnąć prawidłowe fałdowanie2. Chociaż ekspresja i glikozylacja w komórkach drożdży lub owadów mogą przezwyciężyć problem fałdowania, modyfikacje potranslacyjne, w tym glikozylacja, różnią się znacznie od tych w komórkach ssaków3, dając białka o nieprawidłowych lub niejednorodnych modyfikacjach.
Komórki ssaków wyrażają wszystkie wymagane molekularne mechanizmy, aby zapewnić prawidłowe modyfikacje potranslacyjne i fałdowanie; jednak te systemy ekspresji nie są zazwyczaj preferowane przez większość laboratoriów, ze względu na ograniczoną wydajność i wysokie koszty odczynników i materiałów eksploatacyjnych. Polietylenoimina, standardowy odczynnik do transfekcji, jest stosunkowo tania, ale narzuca znaczną cytotoksyczność i niską skuteczność transfekcji, co skutkuje zwiększonymi kosztami pożywek komórkowych, DNA i sprzętu do hodowli. Wiele alternatyw dla PEI jest zbyt drogich. Rozwiązujemy te problemy, opisując połączenie ulepszonych narzędzi do hodowli komórkowej i chemicznie zmodyfikowanego PEI w celu uzyskania szybkiej i stosunkowo niedrogiej metody ekspresji wydzielanych białek ssaków, po której następuje jednoetapowe oczyszczanie. Ta solidna metoda daje wystarczającą wydajność do badań funkcjonalnych i biochemicznych4, a w niektórych przypadkach daje białko podatne na krystalizację bez dalszego oczyszczania.
Ten protokół opisuje kilka technik maksymalizacji ekspresji i wydajności wydzielanych białek ssaków w ludzkich embrionalnych komórkach nerki (HEK) 293F hodowanych w zawiesinie. Wydajność (i koszt) transfekcji, produkcja i oczyszczanie białek są znacznie zwiększone dzięki przestrzeganiu tego protokołu. PEI modyfikowany przez dodanie karbaminianów w jednoetapowej reakcji otwarcia pierścienia (PEI-TMC-25, synteza i właściwości opisane szczegółowo w ref 5) znacznie poprawia wydajność transfekcji, zmniejsza cytotoksyczność wynikającą z rozerwania błony kationowej i odpowiednio zmniejsza koszty eksperymentu. Co więcej, żywotność komórek i ekspresja białek ulegają znacznej poprawie dzięki dodaniu suplementów hodowlanych w celu dostarczenia glukozy i witamin. Co ważne dla produkcji białek glikozylowanych, leczenie kifunensyną, nietoksycznym inhibitorem chemicznym mannozydazy I, wytwarza białka z określonymi, niedojrzałymi glikanami, które mogą być usunięte przez endoglikozydazę EndoHf w celu uzyskania białek z pojedynczą N-acetyloglukozaminą zamiast pełnej długości glikanu związanego z N6. Wreszcie, wydzielanie białek do niezawierającej surowicy, chemicznie zdefiniowanej pożywki umożliwia szybkie i łatwe oczyszczanie do badań strukturalnych i biochemicznych. Jednoetapowe oczyszczanie żywicy kwasem niklowo-azotryoctowym (Ni-NTA) usuwa większość zanieczyszczeń w supernatancie, a w niektórych przypadkach może dać białko o czystości wystarczającej do krystalizacji.

<table><tbody><tr><td>Kolby hodowlane</td><td>GeneMate</td><td>F-5909B</td><td></td></tr><tr><td>293 Freestyle Media</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>Stosować zamiast</td></tr><tr><td>odczynnika do transfekcji</td> glutaminy Hype 5 <td>Oz Biosciences</td><td>HY01500</td><td></td></tr><tr><td>293odczynnik do transfekcji fektyn</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>12347019</tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji PEI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Endo Hf</td><td>NEB</td><td>P0703L</td><td></td></tr><tr><td>Żywica amyloza</td><td>NEB</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Cell Boost R05.2</td><td>HyClone</td><td>SH30584.02</td><td>Suplement do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>GlucCell</td><td>CESCO Bioengineering</td><td>DG2032</td><td>System monitorowania glukozy</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>519850.91</td><td>Pożywka wolna od surowicy do transfekcji DNA</td></tr><tr><td>Bulion Luria (LB Media)</td><td>Life Technologies</td><td>10855-001</td><td></td></tr><tr><td>GC10 Kompetentne komórki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2919</td><td></td></tr></tbody></table>

wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Produkcja wydzielanych białek ssaków do badań strukturalnych i biofizycznych może być wyzwaniem, czasochłonnym i kosztownym. Opisano tutaj efektywny czasowo i kosztowo protokół ekspresji wydzielanych białek w komórkach ssaków i jednoetapowego oczyszczania za pomocą chromatografii powinowactwa do niklu. System opiera się na transfekcji przejściowej na dużą skalę komórek ssaków w zawiesinie, co znacznie skraca czas produkcji białka, ponieważ eliminuje etapy, takie jak rozwój wirusów ekspresyjnych lub generowanie stabilnych linii komórkowych o ekspresji. Protokół ten wykorzystuje tanie środki do transfekcji, które można łatwo wytworzyć za pomocą prostej modyfikacji chemicznej, lub środki do transfekcji o umiarkowanej cenie, które zwiększają wydajność poprzez zwiększenie wydajności transfekcji i zmniejszenie cytotoksyczności. Staranne monitorowanie i utrzymywanie poziomu glukozy w pożywce zwiększa wydajność białka. Kontrolowanie dojrzewania natywnych glikanów na etapie ekspresji zwiększa końcową wydajność prawidłowo pofałdowanych i funkcjonalnych białek ssaków, które są idealnymi właściwościami do prowadzenia krystalografii rentgenowskiej. W niektórych przypadkach jednoetapowe oczyszczanie wytwarza białko o czystości wystarczającej do krystalizacji, co pokazano tutaj jako przykład.

Poniżej przedstawiono wyniki zastosowania tego systemu ekspresyjnego w odniesieniu do wydzielanej domeny immunoglobuliny (Ig) o masie 13 kDa pochodzącej z ludzkiego białka TREM2 (triggering receptor expressed on myeloid cells 2, reszty 19-132). TREM2 jest białkiem transbłonowym typu I, zawierającym jedną domenę Ig zlokalizowaną w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, która posiada dwa mostki dwusiarczkowe i dwa miejsca glikozylacji typu N. W przeciwieństwie do wielu innych białek z domeną Ig8, TREM2 nie nadawał się ...

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Ogólnym celem tej techniki ekspresji białek ssaków jest otrzymanie miligramowych ilości natywnie sfałdowanych białek, odpowiednich do badań strukturalnych, biofizycznych i funkcjonalnych. Główną zaletą tej metody jest to, że stanowi ona szybki i prosty protokół pozyskiwania wydzielanych białek ssaków w stężeniu i czystości wymaganej do badań strukturalnych. Zazwyczaj stwierdzamy, że większość problemów z wydajnością białka wynika ze stanu zdrowia i żywotności komórek.Poprzez ścisłe monitorowanie żywotności komórek oraz poziomu cukru w pożywce, można znacznie zwiększyć wydajność białka i przedłużyć czas użyteczności komórek. Bardzo ważne jest również monitorowanie gęstości komórek. Stwierdzono, że jeśli w dowolnym momencie przed transfekcją liczba komórek przekroczy 2 miliony komórek na mililitr, wydajność białka ulega znacznemu obniżeniu. Aby przeprowadzić hodowlę komórek 2 93 F na dużą skalę, należy uzupełnić jeden litr pożywki 2 93 F za pomocą 10 mililitrów 100 x glutaminy oraz pięciu mililitrów 100 x pen strep.Antybiotyk wykazuje wystarczającą aktywność w warunkach bezsurowiczych, a zmniejszona koncentracja antybiotyku poprawia żywotność komórek podczas transfekcji, co zwiększa wydajność produkcji białka w kulturze. Komórki 2 93 F hoduje się w 300 ml pożywki w jednolitrowych, poliwęglanowych kolbach Erlenmeyera z przegrodami i wentylowanymi zakrętkami w temperaturze 37 °C przy 8% CO₂ w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych, wstrząsając kolbami. Na jeden dzień przed transfekcją należy rozcieńczyć komórki do gęstości 0,5 mln komórek/ml w dniu transfekcji. Pożywkę hodowlaną należy uzupełnić, dodając 10% objętości 2% m/v Cell Boost w pożywce dla komórek 2 93 F.W tym kroku dodaj kafu w celu kontroli glikozylacji białek. Przygotuj roztwory DNA i odczynnika do transfekcji w pożywce bezzerowej i inkubuj przez pięć minut. Następnie dodawaj odczynnik do transfekcji do roztworu DNA w przyrostach jednego mililitra, mieszając.Inkubować delikatnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby utworzyły się kompleksy DNA z odczynnikami. Następnie dodać roztwór do komórek kroplami. Pozostawić przetransformowane komórki na 72 do 96 godzin w celu ekspresji białka i oczyszczenia glikoproteiny. Najpierw przelać kulturę do kolby wirówkowej i wirować przez 20 minut przy 1300 Gs. Abyt stworzyć pellet komórkowy, zebrać nadsącz, a w razie potrzeby odwirować go drugi raz lub użyć filtra 0,22 μm w celu sklarowania nadsączu.Następnie należy dodać 10% objętości 10 x nickel nitro load, kwasu trioctowego lub buforu wiążącego nikiel NTA. Następnie przygotowuje się kolumnę grawitacyjną w temperaturze czterech stopni Celsjusza, dodając dwa mililitry zawiesiny nikielu NTA do kolumny i równoważąc ją 10 objętościami kolumny jednokrotnego buforu wiążącego w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przepuszcza się supernatant przez żywicę i zbiera frakcję przepływową.Po przelaniu nadsączu, przemyj kolumnę 10 objętościami buforu do płukania. Następnie eluuj białko, używając pięciu objętości buforu do elucji. Jeśli wymagana jest deglikozylacja, aby uzyskać objętość końcową 0,5 milliliters, zagęść EIT do 0,43 milliliters za pomocą koncentratora do wirowania, a następnie odwirowuj wszelkie zanieczyszczenia przy 16 000 GS i temperaturze four degrees Celsius.Następnie dodaj 50 µL 500 mM cytrynianu sodu, pH 5,5 oraz 20 µL endo HF. Inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, aby usunąć endo HF. Najpierw przemyj żywicę amylozową trzy razy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Inkubuj białko z przemytą żywicą przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C.Po inkubacji wirować przez pięć minut przy 1000 Gs w celu osadzenia żywicy i zebrać nadsącz. Skoncentrować białko, stosując odpowiedni filtr do odwirowywania z określoną granicą odcięcia masy cząsteczkowej, a następnie przeprowadzić wymianę buforu na wskazany bufor do przechowywania. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki elektroforezy SDS-PAGE dla białka wydzielanego, ekspresowanego w komórkach traktowanych cine po chromatografii powinowactwa do niklu.Pierwsza ścieżka przedstawia białko przed deglikozylacją, a druga ścieżka białko po deglikozylacji za pomocą endo hf. Glikozylowane białko wędruje o około 10 kilodaltonów wyżej, a następnie, po pojedynczym etapie oczyszczania, zapada się do pojedynczego prążka zgodnego z przewidywaną masą cząsteczkową po deglikozylacji. Przesiewy krystalizacyjne przygotowano metodą wiszącej kropli.Górny obraz przedstawia początkowy kryształ, a dolny obraz pokazuje zoptymalizowane warunki krystalizacji. Świadczy to o tym, że homogeniczność biochemiczna badanego białka może być czynnikiem decydującym o sukcesie krystalizacji, a zoptymalizowany system ekspresji ssaczej pozwala na otrzymanie białek podatnych na ten proces. Dalsze oczyszczanie białka oczyszczonego za pomocą niklu jest łatwo realizowane poprzez chromatografię wykluczania cząsteczkowego.Jest to również przydatny etap w ocenie produkcji białka i optymalizacji warunków w celu uzyskania prawidłowo sfałdowanych białek. Białko docelowe powinno być głównym składnikiem elucji chromatograficznej, a objętość elucji powinna odpowiadać masie cząsteczkowej białka. Wcześniejsze czasy elucji mogą sugerować agregację lub błędne sfałdowanie białka po opanowaniu tej metody.Technikę tę można przeprowadzić w ciągu czterech dni, jeśli zostanie ona wykonana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury ważne jest zachowanie warunków sterylnych dla hodowli komórkowej. W celu oceny stanu oligomeryzacji oraz stabilności termicznej białka można zastosować inne metody, takie jak chromatografia wykluczania, wielokątowe rozpraszanie światła oraz różnicowa fluorometria skanująca.

efficient-mammalian-cell-expression-single-step-purification

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Domeny palców cynkowych są z natury przepuszczalne dla komórek i zdolne do pośredniczenia w dostarczaniu białek do szerokiego zakresu typów komórek ssaków. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku wdrażania technologii palca cynkowego do wewnątrzkomórkowego dostarczania białka.

Bezpośrednie dostarczanie białek do komórek ssaków za pomocą przepuszczalnych dla komórek domen Cys2-his 2 palców cynkowych

Opisujemy tutaj opłacalny system ekspresji granzymu wykorzystujący komórki HEK293T, który daje wysokie plony czystej, w pełni glikozylowanej i enzymatycznie aktywnej proteazy.

Wysokowydajny i ekonomiczny system ekspresji ludzkich granzymów w komórkach ssaków

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Prezentujemy podejścia do biofizycznej i strukturalnej charakterystyki glikoprotein z fałdowaniem immunoglobulin za pomocą interferometrii biowarstwowej, izotermicznej kalorymetrii miareczkowej i krystalografii rentgenowskiej.

Charakterystyka glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym za pomocą krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych

Oczyszczanie kanałów jonowych jest często wyzwaniem, ale gdy już zostanie osiągnięte, może potencjalnie umożliwić badania in vitro funkcji i struktur kanałów. W tym miejscu opisujemy etapowe procedury ekspresji i oczyszczania białek bestrofiny ssaków, rodziny kanałów Cl- aktywowanych przezCa2+.

Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Ten protokół opisuje konfigurację do krystalizacji transportera steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 jest odtwarzany w postaci wodoroceli w celu krystalizacji w kropli wiszącej. Protokół nie wymaga specjalistycznych materiałów ani podłoży, dzięki czemu jest dostępny i łatwy do adaptacji w każdym laboratorium w celu określenia struktury białka za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja ABCG5/G8 w lipidowym środowisku bicelle do krystalografii rentgenowskiej

Badania strukturalne i biochemiczne ludzkich transporterów błonowych wymagają miligramowych ilości stabilnego, nienaruszonego i jednorodnego białka. W tym miejscu opisujemy skalowalne metody badań przesiewowych, ekspresji i oczyszczania ludzkich transporterów nośników substancji rozpuszczonych przy użyciu genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów.

Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

Poznaj szybką metodę ekspresji białek ssaczych w komórkach 293F z oczyszczaniem do krystalizacji. Monitorowanie gęstości komórek i ich witalności zapewnia wysokie wydajności białek złożonych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Przeglądaj więcej filmów