Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji
23 grudnia 2015
To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.
Ogólnym celem tej techniki ekspresji białek ssaków jest wyprodukowanie miligramowych ilości natywnie pofałdowanych białek odpowiednich do badań strukturalnych, biofizycznych i funkcjonalnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to szybki i prosty protokół uzyskiwania wydzielanych białek ssaków oraz stężenia w czystości wymaganego do badań strukturalnych. Ogólnie rzecz biorąc, stwierdzamy, że większość problemów z wydajnością białka wynika ze zdrowia i żywotności komórek.
Ścisłe monitorowanie żywotności komórek, a także monitorowanie poziomu cukru w pożywce, znacznie poprawia zarówno wydajność białka, jak i przedłuża przydatność komórek. Bardzo ważne jest również monitorowanie gęstości komórek. Stwierdzamy, że jeśli w dowolnym momencie przed transfekcją komórki przekroczą 2 miliony komórek na mililitr, to wydajność białka jest znacznie zmniejszona Aby przeprowadzić hodowlę na dużą skalę 2 93 komórek F, uzupełnij jeden litr pożywki 2 93 F 10 mililitrami 100 x glutaminy i pięcioma mililitrami 100 x paciorkowca pióra.
Antybiotyk ma wystarczającą moc w warunkach wolnych od surowicy, a zmniejszone stężenie antybiotyku poprawia żywotność komórek podczas transfekcji, co poprawia wydajność hodowli białka. 2 93 komórki F w 300 mililitrach pożywki w jednym litrze, poliwęglanowe przegrody kolby Erlenmeyera z wentylowanymi nakrętkami w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 8% dwutlenkiem węgla podczas wytrząsania w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych na dzień przed transfekcją rozcieńczają komórki do 0,5 miliona komórek na mililitr gęstości w dniu transfekcji. Uzupełnij pożywkę hodowlaną, dodając 10% objętości lub 2% wzrostu masy na objętość komórki w pożywce 2 93 F.
Dodaj kafu widoczne na tym etapie, aby kontrolować glikozylację białek. Przygotować roztwory odczynników DNA i transfekcji w pożywce wolnej od surowicy, inkubować przez pięć minut. Następnie dodaj odczynnik do transfekcji do roztworu DNA w przyrostach co jeden mililitr, mieszając.
Delikatnie inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby powstały kompleksy DNA odczynników. Następnie dodaj roztwór do komórek Kroplami pozwól transfekowanym komórkom na ekspresję białka przez 72 do 96 godzin w celu oczyszczenia glikoproteiny. Najpierw zdekantować kulturę do wirówki w kolbie wirówkowej na 20 minut w temperaturze 1300 Gs.To osadzać komórki, zbierać supernat i, jeśli to konieczne, wirować po raz drugi i/lub użyć filtra 0,22 mikrona do sklarowania supernatantu.
Następnie dodaj 10% objętości 10 x ładunek nitro niklu, kwas trioctowy lub bufor wiążący nikiel NTA. Następnie przygotuj kolumnę grawitacyjną o temperaturze czterech stopni Celsjusza, dodając dwa mililitry zawiesiny niklu NTA do kolumny i równoważąc z 10 objętościami kolumny po jednym buforze wiążącym x pracującym w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przelej supernatant na żywicę i zebrać przepływ.
Po przelaniu sklarowanego osadu przepływającego przez kolumnę przemyć 10 objętościami buforu płuczącego w kolumnie. Następnie eluować białko w pięciu objętościach kolumnowych buforu elucyjnego. Jeśli deglikozylacja jest wymagana dla końcowej objętości 0,5 mililitra, zagęścić EIT do 0,43 mililitra za pomocą koncentratora wirówkowego osad wszelkie zanieczyszczenia przez odwirowanie w temperaturze 16 000 GS i czterech stopniach Celsjusza.
Następnie dodaj 50 mikrolitrów 500-milimolowego cytrynianu sodu, pH 5,5 i 20 mikrolitrów endo hf. Inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, aby usunąć endo HF, najpierw trzykrotnie przepłucz żywicę amylozową w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Inkubuj białko z przemytą żywicą przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po inkubacji wirować przez pięć minut w temperaturze 1000 Gs, aby osadzać żywicę i zbierać supernatant. Zagęścić białko za pomocą odpowiedniego odcięcia masy cząsteczkowej, filtra wirującego i wymiany buforu w pokazanym buforze do przechowywania. Oto reprezentatywne wyniki strony SDS dla wydzielanego białka ulegającego ekspresji w komórkach traktowanych kiną po chromatografii powinowactwa niklu.
Pierwszy pas to białko przed deglikozylacją, a drugi pas to białko po deglikozylacji przez endo hf. Glikozylowane białko biegnie o około 10 kilodaltonów wyżej, a następnie zapada się do pojedynczego pasma zgodnego z przewidywaną masą cząsteczkową po deglikozylacji, po pojedynczym etapie oczyszczania. Ekrany kryształowe zostały ustawione metodą wiszącego kropli.
Górny obraz pokazuje początkowe uderzenie kryształu, a dolny obraz pokazuje zoptymalizowane warunki krystalizacji. Pokazuje to, że biochemiczna jednorodność białka będącego przedmiotem zainteresowania może być czynnikiem decydującym o powodzeniu krystalizacji, a zoptymalizowany system ekspresji ssaków wytwarza białka podatne na tę krystalizację. Dalsze oczyszczanie białka oczyszczonego niklem można łatwo przeprowadzić za pomocą chromatografii wykluczania wielkości.
Jest to również przydatny krok w kierunku oceny produkcji białek i optymalizacji warunków w celu uzyskania prawidłowo pofałdowanych białek. Białko będące przedmiotem zainteresowania powinno być głównym gatunkiem w elucji chromatograficznej, a objętość elucji powinna odpowiadać masie cząsteczkowej białka. Wcześniej. Czasy EEU mogą sugerować agregację lub nieprawidłowe fałdowanie białka po opanowaniu.
Tę technikę można wykonać w ciągu czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować sterylne warunki hodowli komórkowej Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak wielkość, chromatografia wykluczająca, wielokątowe rozpraszanie światła i skanowanie różnicowe, fluorometria mogą być wykonywane w celu oceny stanu oli izacji i stabilności termicznej białka.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje szybki i opłacalny sposób produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków. Podkreśla znaczenie zdrowia komórek i monitorowania warunków w celu osiągnięcia wysokich wydajności odpowiednich do badań strukturalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Ekspresja białek
- Badania biofizyczne
- Kristalografia rentgenowska
Tło
- Skupienie się na produkcji białek o rodzimej strukturze.
- Znaczenie żywotności komórek i warunków pożywki.
- Monitorowanie gęstości komórek jest kluczowe dla wydajności.
- Wykorzystanie komórek 293F do hodowli na dużą skalę.
Cel badania
- Rozwój szybkiego protokołu uzyskania białek ssaków.
- Upewnienie się, że białka są odpowiednie do badań strukturalnych.
- Poprawa wydajności białek poprzez staranne monitorowanie.
Zastosowane metody
- Transfekcja komórek 293F.
- Uzupełnienie pożywki hodowlanej glutaminą i penicyliną-streptomycyną.
- Monitorowanie zdrowia komórek i poziomów cukru w pożywce.
- Techniki hodowli na dużą skalę.
Główne wyniki
- Uzyskano miligramowe ilości wydzielanych białek.
- Zidentyfikowano optymalne warunki dla wzrostu komórek i wydajności białek.
- Wykazano skuteczność monitorowania gęstości komórek.
- Zapobiedzono niezawodną metodę oczyszczania białek.
Wnioski
- Ten protokół jest efektywny w produkcji wysokiej jakości białek ssaków.
- Zdrowie komórek i monitorowanie są kluczowe dla udanej ekspresji białek.
- Pasuje do różnych zastosowań strukturalnych i biofizycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid, scalable production of natively folded mammalian glycoproteins is a critical bottleneck for structural biology and biophysical characterization in early drug discovery. This protocol enables efficient generation and single-step purification of secreted proteins, directly supporting structure-based drug design and mechanistic de-risking. Streamlined workflows reduce time and cost barriers, accelerating progression from target validation to lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables production of milligram quantities of functional glycoproteins for structural interrogation.
- Supports mechanistic de-risking by providing natively folded proteins for biophysical assays.
- Facilitates rapid hypothesis testing and target confidence through high-quality protein reagents.
Screening & Assay Development
- Delivers purified proteins suitable for downstream assay development and screening platforms.
- Improves assay reproducibility and standardization by ensuring protein homogeneity and quality.
- Reduces workflow complexity with single-step purification, supporting scalable screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Provides structurally validated proteins for translational biomarker studies when relevant.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation by supporting advanced biophysical analyses.
- Reduces risk of late-stage failures by ensuring protein quality for functional and structural studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing high-quality protein reagents for structural, biophysical, and functional workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven target validation and pathway elucidation with native glycoproteins.
- Screening: Delivers reproducible, homogeneous proteins for robust assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative assessment of protein folding, purity, and glycosylation state for comparative analyses.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant protein forms for downstream studies when applicable.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for rapid protein production across multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines production timelines with standardized, scalable protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling early structural insights.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally tractable targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture and protein purification techniques.
- Needs access to suspension-adapted cell lines, tissue culture infrastructure, and chromatography systems.
- Demands rigorous monitoring of cell viability, density, and media composition for optimal yields.
- Adaptable to various glycoprotein targets but may require optimization for specific constructs.
- Protein quality assessment (e.g., SDS-PAGE, size exclusion chromatography) is essential for downstream success.
