Metody in vitro Metoda obserwacji interakcji za pośrednictwem selektyny E między krążącymi komórkami nowotworowymi prostaty pochodzącymi od pacjentów a ludzkimi komórkami śródbłonka

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie oddziaływań pomiędzy rzadkimi komórkami raka prostaty a komórkami śródbłonka wykazującymi ekspresję selektyny E przy użyciu zestawu do przepływu na mikroprzesuwie. Osiąga się to poprzez wstępne pokrycie mikroprzesuwu fibronektyną. W drugim kroku hoduje się ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (VE) w dynamicznym systemie przepływowym na mikroprzesuwie o małej szerokości kanału.

Następnie komórki raka prostaty znakuje się humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko swoistemu antygenowi błonowemu prostaty (PSMA), które ulega internalizacji. Ostatnim krokiem jest perfuzja znakowanych przeciwciałem anty-PSMA komórek raka prostaty przez naczynie endowtelialne (VE) wykazujące ekspresję selektyny E. Ostatecznie, w celu ukazania interakcji między komórkami raka prostaty a komórkami śródbłonka, wykorzystuje się mikroskopię wideo.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak komora przepływowa z równoległymi płytkami i inne układy dynamiczne, jest możliwość badania interakcji między rzadkimi komórkami raka prostaty, takimi jak krążące komórki nowotworowe, a hodowanymi komórkami śródbłonka w dynamicznym systemie przepływowym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie przerzutowania, takie jak: w jaki sposób komórki nowotworowe prostaty przerzutowują poprzez układ naczyniowy? Czy wykorzystują one ten sam mechanizm, który jest stosowany przez leukocyty podczas ich migracji?

Zazwyczaj osoby początkujące w tej technice napotykają trudności, ponieważ wiąże się ona z hodowlą monowarstwy komórek śródbłonka w wąskim kanale pod wpływem perfuzji pod dygestorium do hodowli tkanek. Najpierw należy wypłukać mikroslajd solą fosforanową w roztworze buforowanym (PBS). Następnie należy delikatnie pokryć mikroslajd 200 µL fibronektyny o stężeniu 50 µg/mL, używając strzykawki o pojemności 1 mL z końcówką Luer-Lock.

Przykryć preparat mikroslajd pokrywką i pozostawić go w komorze do hodowli tkanek na 30 minut. Następnie przeprowadzić perfuzję 200 µL ciepłej pożywki wzrostowej qve przez mikroslajd i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Powolne dozowanie cieczy do mikroslajdu zapobiega powstawaniu pęcherzyków powietrza w kanale.

Podczas perfuzji przygotować zawiesinę vex, płucząc vex w PBS i dodając 0,1% kolagenazy oraz 0,05% EDTA w PBS na jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej. Wirować hve w dwóch mililitrach pożywki wzrostowej z prędkością 180 ×g przez pięć minut. Następnie zmierzyć stężenie komórek przy użyciu cytometru hematologicznego i przygotować 10 milionów komórek na 100 µL pożywki wzrostowej.

Następnie ostrożnie usuń medium z wlotu mikroslajdu. Używając końcówki do pipety o pojemności 200 µL, podnieś mikroslajd na wysokość wzroku i za pomocą strzykawki z systemem Luer Lock o pojemności 1 mL delikatnie wprowadź 200 µL przygotowanego stężenia vex do kanału. Na tym etapie należy zachować ostrożność, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza; jeśli pęcherzyki się pojawią, kontynuuj perfuzję przez nieco dłuższy czas, aż pęcherzyki przedostaną się do kanału wylotowego.

Następnie pipetuj równą objętość, około 80 µL pożywki VE, zarówno do wlotu, jak i wylotu mikroslajdu. Zapobiega to przepływowi komórek w obu kierunkach. Przykryj slajd i pozostaw go w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1,5 godziny.

Aby rozpocząć montaż komory przepływowej, umieść sterylną strzykawkę o pojemności 20 milliliter, złącza luer żeńskie i męskie, pompę strzykawkową oraz przewody w inkubatorze na 15 minut, aby zminimalizować objętość martwą. Należy użyć przewodów o średnicy wewnętrznej 0,04 inches. Mniejsza średnica przewodów zapobiega powstawaniu pęcherzyków powietrza.

Następnie należy napełnić strzykawkę o pojemności 20 ml 12 ml ciepłego medium VE. Całkowicie usunąć pęcherzyk powietrza ze strzykawki. Napełnić wlot mikropreparatu medium VE.

Podłącz ten zestaw do mikroprzesuwnika. Ostrożnie przymocuj złącze wylotowe do mikroprzesuwnika. Przenieś układ do inkubatora i podłącz go do pompy strzykawkowej.

Następnie ustaw pompę na szybkość ścinania 10 µL/min przed pozostawieniem komórek na noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Następnego dnia rozmontuj układ, zdejmując łącznik przymocowany do wlotu mikroprzesuwnika. Następnie zdejmij łącznik wylotowy, aby zwiększyć ekspresję E-selektyny w komórkach śródbłonka.

Przygotuj świeżą pożywkę wzrostową zawierającą interleukinę 1β. Odessij pożywkę do strzykawki o pojemności 10 ml. Usuń pozostałą pożywkę z wlotu preparatu, a następnie dodaj świeżą pożywkę, całkowicie wypełniając wlot.

Podłącz strzykawkę do szkiełka. Ustaw pompę strzykawkową na szybkość ścinania 10 µL/min przez cztery godziny w inkubatorze podczas inkubacji vex z interleukiną 1β, przygotowując komórki raka prostaty znakowane przeciwciałem anty-PSMA Alexa 488. Najpierw dodaj 0,05% trypsyny EDTA do komórek raka prostaty MDA na jedną minutę.

Nie należy wystawiać komórek na działanie trypsyny przez zbyt długi czas, ponieważ może to wpłynąć na glikopeptydy obecne na powierzchni komórek. Wirować komórki przy 200 ×g przez pięć minut. Następnie zawiesinę komórek MDA resuspendować w 1 mL buforu Hank'a, dodać przeciwciało anty-PSMA i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnym miejscu, resuspendując komórki podczas inkubacji.

Po 30 minutach odwiruj zawiesinę komórkową z prędkością 800 ×g przez pięć minut. Odessaj nadsącz i resuspenduj osad w jednym mililitrze buforu Hanksa. Policz znakowane komórki MDA i doprowadź końcowe stężenie do 1 miliona komórek na mililitr.

Napełnij strzykawkę o objętości pięciu mililitrów oznakowanymi komórkami MDA i usuń pęcherzyki powietrza. Włącz mikroskop odwrócony i ustaw oświetlenie przy użyciu obiektywu 10x. Umieść pompę strzykawkową na tym samym poziomie co stolik mikroskopu i ustaw naprężenie ścinające na poziomie jednego centa na centymetr kwadratowy.

Następnie otwórz oprogramowanie Zeiss Axio vision. Wybierz odpowiedni obiektyw na ekranie komputera. W opcjach narzędzi oprogramowania utwórz nowy folder.

Otwórz opcję smart experiments w programie Axio vision i dostosuj ustawienia, aby rejestrować krótkie 32-sekundowe filmy przez 30 minut. W przypadku obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym skonfiguruj opcje obrazu. Parametry te pomagają w uzyskaniu filmów o częstotliwości klatek zbliżonej do prędkości wideo przy użyciu kamery Zeiss MRM. Aby zwizualizować pełną szerokość kanału przepływowego przy użyciu obiektywu 10x na ekranie komputera, użyj adaptera mocowania CM. Włącz lampę rtęciową przed umieszczeniem strzykawki i złącza zawierającego komórki na pompie strzykawkowej. Następnie podłącz złącze do wypełnionego kanału wlotowego mikropreparatu zawierającego stymulowane interleukiną 1β komórki Ax.

Połącz kanał wylotowy za pomocą złączki przymocowanej do drenu. Umieść dren w naczyniu lub 15 ml probówce stożkowej, aby zebrać płyn przepływowy. Rozpocznij infuzję przez mikroprzesuwnik z prędkością 10 µL/min.

Obserwuj oddziaływania między komórkami śródbłonka a znakowanymi komórkami MDA lub znakowanymi CTC pochodzącymi od pacjentów przy użyciu filtra 488 nanometrów w mikroskopie epifluorescencyjnym. Rozpocznij rejestrację eksperymentu w formie 32 krótkich filmów.

Podczas analizy nagrania należy zmierzyć prędkość toczenia. Prędkość toczenia mierzy się, dzieląc dystans pokonany przez komórki przez czas. Przedstawiono tutaj nocną kulturę monowarstwy komórek śródbłonka.

Na szkiełku mikroskopowym. Skale pokazują, że przy użyciu obiektywu 5x widoczne jest 100% powierzchni szkiełka, natomiast przy obiektywie 10x widoczne jest 70% powierzchni; w przypadku wybranych interakcji pośredniczących pomija się komórki toczące się przy krawędziach, co sprawia, że ponad 70% powierzchni szkiełka jest dostępnych do rejestracji wideo i analizy odtwarzania. Wykres pudełkowy przedstawia rozkład prędkości toczenia się nieoznaczonych oraz oznakowanych przeciwciałem anty-PSMA komórek MDA na komórkach śródbłonka stymulowanych interleukiną 1β w różnych warunkach naprężenia ścinającego.

Nie zaobserwowano istotnych różnic w prędkościach toczenia przy wartościach 1 i 5 dyn/cm² przy wyższym naprężeniu ścinającym wynoszącym 10 dyn/cm². Odnotowano statystycznie istotną różnicę między prędkościami toczenia nieoznaczonych a oznakowanych anty-PSMA komórek MDA. Film zmontowany z odstępami czasowych, zarejestrowany przy użyciu krwi pacjenta z rakiem prostaty, pokazuje trzy rodzaje interakcji między oznakowanymi CTC prostaty a wykazującymi ekspresję lektyny komórkami śródbłonka: tethering, w którym CTC przywierają i ponownie przywierają; stabilną adhezję, w której CTC nie odłączyły się nawet po 30 sekundach; oraz brak interakcji, gdy nieinteragujące CTC wchodzą w pole widzenia. Preparaty na szkiełkach mikroskopowych można łatwo poddać barwieniu immunologicznemu i obrazowaniu fluorescencyjnemu, co potwierdziło trwałą adhezję oznakowanych anty-PSMA komórek MDA.

Tutaj można zobaczyć komórki śródbłonka po stymulacji interleukiną jeden beta. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak zgodnie z tą procedurą badać oddziaływania między rzadkimi komórkami, takimi jak krążące komórki nowotworowe prostaty, a komórkami śródbłonka wykazującymi ekspresję S-selektyny. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące obecności ligandów S-selektyny, można zastosować również inne metody, takie jak immunofluorescencja.

Techniki takie jak te mogą pomóc badaczom w zrozumieniu różnych etapów zaangażowanych w przerzutowanie.