Metody in vitro Metoda obserwacji interakcji za pośrednictwem selektyny E między krążącymi komórkami nowotworowymi prostaty pochodzącymi od pacjentów a ludzkimi komórkami śródbłonka

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie interakcji między rzadkimi komórkami raka prostaty a komórkami śródbłonka eksprymującymi selektynę e przy użyciu zestawu przepływu mikroszkiełkowego. Osiąga się to poprzez uprzednie pokrycie mikroszkiełka fibronektyną. Drugim krokiem jest hodowla ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej lub VE w systemie dynamicznego przepływu na mikroszkiełku o małej szerokości kanału.

Następnie komórki raka prostaty są znakowane antygenem błonowym specyficznym dla prostaty lub humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym PSMA, które ulega internalizacji. Ostatnim krokiem jest perfuzja komórek raka prostaty znakowanych anty PSMA przez selektynę e wyrażającą ve. Ostatecznie mikroskopia wideo służy do pokazania interakcji między komórkami raka prostaty a komórkami śródbłonka.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak równoległa komora przepływowa i inne zespoły dynamiczne, jest to, że za pomocą tej techniki można badać interakcje między rzadkimi komórkami raka prostaty, takimi jak krążące komórki nowotworowe i hodowane komórki śródbłonka w systemie dynamicznego przepływu. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przerzutów, takie jak to, w jaki sposób komórki nowotworowe prostaty dają przerzuty przez układ krwionośny? Czy wykorzystują ten sam mechanizm, który jest używany przez leukocyty podczas ich izacji?

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej technice, będą miały trudności, ponieważ polega ona na hodowli pojedynczej warstwy komórek śródbłonka w wąskim kanale pod perfuzją Pod kapturem hodowli tkankowej. Najpierw przepłucz mikroszkiełko solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS. Następnie delikatnie pokryj mikroszkiełko 200 mikrolitrami po 50 mikrogramów na mililitr fibronektyny za pomocą jednomililitrowej strzykawki z blokadą przynęty.

Przykryj mikroszkiełko pokrywką i trzymaj je w kapturze do hodowli tkankowych przez 30 minut. Następnie przelej 200 mikrolitrów ciepłej pożywki wzrostowej qve na mikroszkiełku i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Powolne dozowanie cieczy w mikroszkiełku zapobiega tworzeniu się pęcherzyków w kanale.

Podczas perfuzji należy przygotować zawiesinę vex, spłukując ją PBS i dodając 0,1% kolagenazy i 0,05% EDTA do PBS przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej. Odwirować have w dwóch mililitrach pożywki wzrostowej o stężeniu 180 razy G przez pięć minut. Następnie zmierz stężenie komórek za pomocą hemocytometru i przygotuj 10 milionów komórek na 100 mikrolitrów pożywki wzrostowej.

Następnie ostrożnie wyjmij medium z wlotu mikroszkiełka. Za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów przyłóż mikroszkiełko do poziomu oczu i za pomocą jednomililitrowej strzykawki z blokadą przynęty delikatnie wprowadź do kanału 200 mikrolitrów przygotowanego stężenia vex. Na tym etapie należy zachować ostrożność, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków, jeśli pojawią się pęcherzyki, kontynuuj perfuzję przez nieco dłuższy czas, aż bąbelki dostaną się do kanału wylotowego.

Następnie odpipetować równą objętość około 80 mikrolitrów pożywki VE zarówno do wlotu, jak i wylotu mikroszkiełka. Zapobiega to przepływowi komórek w dowolnym kierunku. Przykryj szkiełko i trzymaj je w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny.

Aby rozpocząć montaż komory przepływowej, umieść sterylną strzykawkę o pojemności 20 mililitrów, żeńskie i męskie łączniki przynęty, pompę strzykawkową i rurkę w inkubatorze na 15 minut, aby uzyskać minimalną objętość martwą. Używane rurki o średnicy wewnętrznej 0,04 cala. Mniejsza średnica rurki zapobiega tworzeniu się pęcherzyków.

Następnie napełnij 20-mililitrową strzykawkę 12 mililitrami ciepłego podłoża VE. Całkowicie usunąć pęcherzyk ze strzykawki. Napełnij wlot mikroszkiełka medium VE.

Podłącz ten zespół do mikroprowadnicy. Delikatnie przymocuj złącze wylotowe do mikrosuwaka. Umieścić zestaw w inkubatorze i podłączyć go do pompy strzykawkowej.

Następnie ustaw pompę na szybkość ścinania 10 mikrolitrów na minutę przed pozostawieniem komórek na noc w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia należy zdemontować zestaw, wyjmując łącznik dołączony do wlotu mikroprowadnicy. Następnie wyjmij złącze wylotowe dwa, aby zwiększyć ekspresję selektyny e na komórkach śródbłonka.

Przygotuj świeżą pożywkę zawierającą interleukinę jedną beta. Odessać pożywkę w strzykawce o pojemności 10 mililitrów. Usuń resztki podłoża z wlotu szkiełka, a następnie dodaj świeże, całkowicie wypełniające wlot.

Podłączyć strzykawkę do szkiełka. Ustaw pompę strzykawkową na szybkość ścinania 10 mikrolitrów na minutę przez cztery godziny w inkubatorze podczas inkubacji interleukiny beta vex, przygotuj komórki raka prostaty znakowane przeciwciałem anty PSMA Alexa 4. Najpierw dodaj 0,05% trypsyny EDTA do komórek raka prostaty MDA na jedną minutę.

Nie wystawiaj komórek na działanie trypsyny przez dłuższy czas, ponieważ może to wpływać na glikopeptydy obecne na powierzchni komórki. Odwirować komórki w temperaturze 200 razy G przez pięć minut. Następnie ponownie zawieś podniebienie komórkowe MDA w jednym mililitrze buforu Hanka i dodaj przeciwciało anty PSMA inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnym miejscu, resusując zawiesić komórki podczas inkubacji.

Po 30 minutach odwirować roztwór komórek o stemperaturze 800 razy G przez pięć minut. Odessać i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze bufora Hanka. Policz oznakowane komórki MDA i doprowadź końcowe stężenie do 1 miliona komórek na mililitr.

Napełnij pięciomililitrową strzykawkę oznaczonymi komórkami MDA i usuń bąbelki. Włącz odwrócony mikroskop i ustaw oświetlenie lokówki na 10 x obiektyw. Ustawić pompę strzykawkową na tym samym poziomie, co stolik na próbki w mikroskopie i ustawić ją na naprężenie ścinające o wartości jednej centy na centymetr kwadratowy.

Następnie otwórz oprogramowanie Zeiss Axio vision. Wybierz cel na ekranie komputera. Utwórz nowy folder w opcji narzędzi w oprogramowaniu.

Otwórz opcję inteligentnych eksperymentów w Axio vision i dostosuj ustawienia, aby nagrywać krótkie 32. filmy przez 30 minut W przypadku fluorescencyjnego wideo na żywo ustaw opcje obrazu. Parametry te pomagają w uzyskiwaniu filmów zbliżonych do liczby klatek na sekundę za pomocą kamery Zeiss MRM, aby zobrazować pełną szerokość kanału przepływu przy 10-krotnym obiektywie na ekranie komputera, użyj przełącznika adaptera CM na lampie rtęciowej przed umieszczeniem strzykawki i złącza zawierającego komórki na pompie strzykawkowej. Następnie przymocuj łącznik do wypełnionego kanału wlotowego mikroszkiełka zawierającego interleukinę jedną siekierę stymulowaną beta.

Podłącz kanał wylotowy do złącza dołączonego do rurki. Włóż rurkę do naczynia lub stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów, aby zebrać przepływ. Rozpocznij infuzję przez mikroszkiełko z prędkością 10 mikrolitrów na minutę.

Obserwuj interakcje między komórkami śródbłonka a znakowanymi komórkami MDA lub znakowanymi CTC pochodzącymi od pacjentów o długości poniżej 488 nanometrów. Filtr w mikroskopie fluorescencyjnym epi. Rozpocznij nagrywanie eksperymentu jako 32. krótkie filmy.

Podczas analizy odtwarzania zmierz prędkość toczenia. Prędkość toczenia mierzy się, dzieląc odległość przebytą przez komórki w czasie. Pokazano tutaj nocną hodowlę monowarstwy komórek śródbłonka.

Na mikro zjeżdżalni. Skale pokazują, że 100% mikroszkiełka jest widoczne przy użyciu obiektywu pięciokrotnego, podczas gdy 70% jest widoczne przy użyciu obiektywu 10x dla wybranych interakcji zapośredniczonych, komórki toczące się na krawędziach nie są brane pod uwagę, co sprawia, że ponad 70% mikroszkiełka jest dostępne do nagrywania wideo i analizy odtwarzania. Wykres pudełkowy przedstawia rozkład prędkości toczenia zarówno nieznakowanych, jak i anty PSMA, znakowanych komórek MDA na interleukinie jednej beta stymulowanej komórkami śródbłonka w różnych warunkach naprężenia ścinającego.

Nie zaobserwowano istotnej różnicy w prędkościach toczenia na poziomie 1 i 5 centymetrów kwadratowych przy wyższym naprężeniu wynoszącym 10 centów na centymetr kwadratowy. Zaobserwowano statystycznie istotną różnicę między prędkościami toczenia nieznakowanych i anty PSMA, znakowanych komórek MDA, Zszyty w czasie film wykonany przy użyciu krwi pacjenta z rakiem prostaty pokazuje trzy rodzaje interakcji między znakowanymi CTC prostaty a klektyną eksprymującą komórki śródbłonka, gdzie CTC przyczepiają się i ponownie przyczepiają, stabilną adhezję, gdzie CTC nie odrywały się nawet po 30 sekundach i brak interakcji, gdy nieoddziałujące CTC wchodzą w pole widzenia. Mikropreparaty można łatwo wybarwić immunologicznie i obrazować fluorescencyjnie mocną przyczepność komórek anty PSMA, oznaczonych MDA.

Po obfitości w interleukinie można zobaczyć tutaj jedną komórkę śródbłonka stymulowaną przez beta. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać interakcje między rzadkimi komórkami, takimi jak krążące komórki guza prostaty i komórki śródbłonka wyrażające selektynę S po tej procedurze. Inne metody, takie jak immunofluorescencja, mogą być również wykonane, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak obecność selektyny. Ligandy.

Techniki takie jak te mogą pomóc naukowcom w zrozumieniu różnych etapów związanych z przerzutami.