Name: Metody in vitro Metoda obserwacji interakcji za pośrednictwem selektyny E między krążącymi komórkami nowotworowymi prostaty pochodzącymi od pacjentów a ludzkimi komórkami śródbłonka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Poznaj metodę obserwacji interakcji komórek nowotworowych prostaty z komórkami śródbłonka w warunkach przepływu. Technika mikroprzepływowa umożliwia badanie mechanizmów metastazy w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez fundusze z Departamentu Obrony-Program Badań nad Rakiem Prostaty (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 z National Cancer Institute, oraz Robert McCooey Genitourinary Oncology Research Fund. Chcielibyśmy podziękować dr Annaricie Lorenzo (Oddział Patologii) za dostarczenie przeciwciał przeciwko VE-Kadherynie oraz dr Marco Seandel (Oddział Chirurgii) za dostarczenie HUVEC.

1. Hodowla HUVEC na mikroszkiełkach do obserwacji interakcji CTC-śródbłonek
<ol>
	<li>Pod kapturem do hodowli tkankowej najpierw przepłukać mikroszkiełko o szerokości kanału 1 mm za pomocą PBS. Delikatnie pokryć mikroszkiełko 200 μl 50 μg/ml fibronektyny (rozpuszczonej w PBS) za pomocą 1 ml strzykawki Luer-lock.</li>
	<li>Przykryj mikroszkiełko pokrywką i trzymaj je w kapturze do hodowli tkankowych przez 30 minut. Powolne dozowanie płynu do mikroszkiełka zapobiega tworzeniu się pęcherzyków w kanale.</li>
	<li>Przeprowadzić 200 μl ciepłej (37 °C) pożywki wzrostowej HUVEC (pożywka M199, 1M HEPES, 20% FBS, 5 mg/ml heparyny, 100 μg/ml czynnika wzrostu komórek śródbłonka i L-glutamina) na mikroszkiełku i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Podczas perfuzji należy przygotować zawiesinę komórek HUVEC.</li>
	<li>Przepłukać HUVEC PBS i dodawać 0,05% trypsyny-EDTA przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej. Odwirować HUVEC w 2 ml pożywki wzrostowej przy 180 x g przez 5 min.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie komórek za pomocą hemocytometru neubauerowskiego i przygotować 107 komórek HUVEC/100 μl pożywki wzrostowej. Następnie ostrożnie wyjmij pożywkę z wlotu mikroszkiełka za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.</li>
	<li>Doprowadzić mikroszkiełko do poziomu oczu i za pomocą 1 ml strzykawki Luer-lock delikatnie przelać 200 μl przygotowanego stężenia HUVEC do kanału. Na tym etapie należy zachować ostrożność, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Jeśli pojawią się bąbelki, kontynuuj perfuzję przez nieco dłuższy czas, aż bąbelki dostaną się do kanału wylotowego.</li>
	<li>Umieść równą objętość (~80 μl) pożywki HUVEC zarówno na wlocie, jak i wylocie mikroszkiełka. Zapobiega to przepływowi komórek w dowolnym kierunku.</li>
	<li>Przykryć szkiełko i przechowywać je w inkubatorze (37 °C) przez 1,5 godziny.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zespołu komory przepływowej do nocnej hodowli HUVEC na mikroszkiełku
<ol>
	<li>Umieść sterylną strzykawkę o pojemności 20 ml, żeńskie i męskie złącza Luer, rurkę i pompę strzykawkową w inkubatorze na 15 minut.</li>
	<li>Aby uzyskać minimalną objętość martwą, użyj rurki o średnicy wewnętrznej 0.04 cala. Mniejsza średnica rurki zapobiega tworzeniu się pęcherzyków.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę o pojemności 20 ml ciepłym (37 °C) podłożem HUVEC (12 ml). Przymocować rurkę ze złączami do strzykawki. Usuń bąbelki. Podłącz ten zespół do mikroszkiełka.</li>
	<li>Całkowicie napełnij wlot mikroszkiełka mediami HUVEC. Przynieść napełnioną strzykawkę o pojemności 20 ml dołączoną do łącznika obok mikroszkiełka. Delikatnie przymocuj łącznik do mikroszkiełka.</li>
	<li>Przenieś zestaw do inkubatora i podłącz go do pompy strzykawkowej ustawionej na szybkość ścinania 10 μl/min. Pozostawić komórki O/N w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Następnego dnia zdemontuj zestaw, wyjmując złącze dołączone do wlotu mikroszkiełka.</li>
	<li>Aby zwiększyć ekspresję selektyny E na ECs, przygotuj świeżą pożywkę wzrostową zawierającą IL-1β w stężeniu 10 ng/ml w 4 ml pożywki. Odessać podłoże do strzykawki o pojemności 10 ml. Wyjąć pożywkę z wlotu mikroszkiełka i podłączyć strzykawkę do szkiełka.</li>
	<li>Ustawić pompę strzykawkową na szybkość ścinania 10 μl/min na 4 godziny w inkubatorze.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek raka prostaty znakowanych anty-PSMA (J591-488)
<ol>
	<li>Podczas inkubacji IL-1β HUVEC należy przygotować komórki PCa znakowane anty-PSMA J591-alexa488. Dodaj 0,05% trypsyny-EDTA do komórek MDA na 1 minutę. Nie wystawiaj komórek na działanie trypsyny przez dłuższy czas, ponieważ może to wpływać na glikopeptydy obecne na powierzchni komórki. Zamiast trypsyny można również użyć odczynnika do dysocjacji komórek bez enzymów. Wirować przy 200 x g przez 5 min.</li>
	<li>Zawiesić osad komórek MDA w 1 ml buforu H/H (zrównoważony roztwór soli Hanksa/0,1% HSA/10 mM HEPES/1 mM CaCl2). Dodaj przeciwciało anty-PSMA J591-alexa488 w stężeniu 20 μg/ml przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnym miejscu. Ponownie zawiesić komórki podczas inkubacji.</li>
	<li>Po 30 minutach odwirować roztwór komórek o stężeniu 800 x g przez 5 minut. Odessać i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu H/H. Policz znakowane komórki MDA i doprowadź końcowe stężenie do 1x106 komórek/ml. Napełnij strzykawkę o pojemności 5 ml komórkami MDA oznaczonymi J591-488 i usuń pęcherzyki.</li>
</ol>
4. Przygotowanie CTC znakowanych anty-PSMA (J591-488) wzbogaconych od pacjentów z PCa
<ol>
	<li>Pobrać 7,5 ml krwi od pacjentów z rakiem prostaty do niebieskiej probówki (zawierającej cytrynian sodu). Delikatnie rozcieńczyć krew w stosunku 1:1 w 0,1% BSA/1 mM EDTA/PBS.</li>
	<li>Dodać 5,3 ml Ficoll-paque plus do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Warstwę rozcieńczonej krwi na wierzchu ficoll-paque. Wirować przy 400 x g przez 30 min.</li>
	<li>Wstępnie pokryj wszystkie rurki lub końcówki stykające się z CTC 2% FBS/RPMI-1640/ 1 mM CaCl2/ 4 mM MgCl2 (bufor R/S), aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu CTC z powierzchniami. Utrzymuj temperaturę 4 °C pożywek i mających kontakt z CTC.</li>
	<li>Zebrać frakcję komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) zawierającą CTC z granicy faz w innej stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml buforu R/S. Wirować przy 400 x g przez 8 min.</li>
	<li>Zawiesić osad i ponownie przemyć w buforze R/S o stężeniu 400 x g przez 8 min. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w buforze H/H. Dodać przeciwciało anty-PSMA J591-488 w stężeniu 20 μg/ml przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnym miejscu.</li>
	<li>Po 30 minutach odwirować PBMC zawierające CTC znakowane J591-488 w temperaturze 800 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić w buforze H/H. Napełnić próbkę strzykawką o pojemności 1 ml (wstępnie pokrytą buforem R/S).</li>
</ol>
5. Przygotowanie zestawu mikroskopu, pompy strzykawkowej i komory przepływowej
<ol>
	<li>Włącz mikroskop odwrócony i ustaw oświetlenie Kohlera na obiektyw 10X. Ustawić pompę strzykawkową na tym samym poziomie, co stolik na próbki w mikroskopie i ustawić ją na naprężenie ścinające 1 dyn/cm2 (~ 10 μl/min).</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie Zeiss Axiovision. Wybierz cel na ekranie komputera. Utwórz nowy folder w opcji narzędzi w oprogramowaniu.</li>
	<li>Otwórz opcję inteligentnych eksperymentów w Axiovision i dostosuj ustawienia, aby nagrywać krótkie 30-sekundowe filmy przez 30 minut.</li>
	<li>W przypadku fluorescencyjnego wideo na żywo ustaw opcje obrazu - Ekspozycja 12 ms, 2 x 2 bin, 5 Wzmocnienie. Parametry te pomagają w uzyskiwaniu filmów zbliżonych do liczby klatek na sekundę wideo (~ 23 klatki na sekundę) za pomocą aparatu Zeiss mRm.</li>
	<li>Aby wyświetlić na ekranie komputera pełną szerokość kanału przepływowego przy obiektywie 10 X, należy użyć adaptera C-mount (interfejs 0,63 x f/60 mm).</li>
	<li>Włącz lampę rtęciową.</li>
	<li>Umieścić strzykawkę i łącznik zawierający komórki na pompie strzykawkowej.</li>
	<li>Przynieś z inkubatora HUVEC stymulowane przez IL-1β. Przymocuj złącze do wypełnionego kanału wlotowego mikroszkiełka zawierającego HUVEC.</li>
	<li>Podłącz kanał wylotowy do złącza dołączonego do rurki. Umieść rurkę w naczyniu lub stożkowej rurce o pojemności 15 ml, aby zebrać przepływ.</li>
	<li>Rozpocząć infuzję przez mikroszkiełko z prędkością 10 μl/min. Obserwuj interakcje między komórkami śródbłonka a znakowanymi komórkami MDA lub znakowanymi CTC pochodzącymi od pacjentów pod filtrem 488 nm pod mikroskopem epifluorescencyjnym.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie eksperymentu w formie 30-sekundowych krótkich filmów. Podczas analizy odtwarzania zmierz prędkość toczenia. Prędkość toczenia mierzy się, dzieląc odległość przebytą przez komórki w czasie.</li>
</ol>
6. Barwienie immunologiczne mikroszkiełka
<ol>
	<li>Usuń pożywkę z wlotu i wylotu mikroszkiełka po perfuzji komórek MDA na HUVEC stymulowanych IL-1β przez 10 minut.</li>
	<li>Za pomocą końcówki o pojemności 200 μl umieść ciepły (37 °C) PBS zawierający wapń i magnez we wlocie mikroszkiełka na 5 minut. Przechyl mikroszkiełko, używając jego pokrywki jako podpory na stole. Utrzymuj mikroszkiełko w pozycji pochylonej przez wszystkie inkubacje podczas barwienia immunologicznego.</li>
	<li>Napraw HUVEC poprzez perfuzję ciepłego 2% formaldehydu do wlotu</li>
	<li>Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Płukać dwukrotnie PBS przez 5 minut każdy.</li>
	<li>Dodaj triton-X 100 (0,1%) w 5% BSA w PBS przez 10 minut w RT.</li>
	<li>Płukać dwukrotnie PBS przez 5 minut każdy. Blok z 5% BSA w PBS przez 30 min.</li>
	<li>Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem kozim anty-VE-kadheryną (1:100) w 2,5% BSA O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia myj dwukrotnie PBS przez 5 minut każdy. Dodaj wtórne przeciwciało anty-kozie 647 osła na 45 min. Umyć dwukrotnie PBS przez 5 minut każdy.</li>
	<li>Inkubować w RT z humanizowanym sprzężonym przeciwciałem J591-alexa488 przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umyć dwukrotnie PBS przez 5 minut każdy. Dodaj DAPI na 5 minut. Myć wodą destylowaną przez 5 min.</li>
	<li>Dodaj PBS (lub mowiol do długotrwałego przechowywania). Wizualizuj mikroszkiełko pod mikroskopem konfokalnym.</li>
</ol>

<ol><li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li>
<li>Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+selectins+and+selectin+ligands+in+inflammation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Ther.+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).</li>
<li>Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+in+transit%3A+the+vascular+interactions+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).</li>
<li>Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li>
<li>Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+prostate-specific+membrane+antigen+%28PSMA%29+expression+in+prostate+carcinoma+with+distant+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Oncol.+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis.</a> Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).</li>
<li>Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+study+of+lutetium-177+labeled+anti-prostate-specific+membrane+antigen+%28PSMA%29+monoclonal+antibody+J591+for+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Cancer Res. , (2013).</li>
<li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+their+use+in+the+study+of+neutrophil+transmigration+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions.</a> J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).</li>
<li>Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+metastatic+potential+in+the+adhesion+of+human+breast+cancer+cells+to+endothelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers.</a> Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).</li>
<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li>
<li>Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectin+binding+is+essential+for+peritoneal+carcinomatosis+in+a+xenograft+model+of+human+pancreatic+adenocarcinoma+in+pfp--%2Frag2--+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp--/rag2-- mice.</a> Gut. 62 (5), 741-750 (2013).</li>
<li>Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+and+adhesion+of+human+tumor+cells+on+vascular+endothelium+under+physiological+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions.</a> J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).</li>
<li>Remuzzi, A., Giavazzi, R. Adhesion of tumor cells under flow. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRemuzzi%2C+A+%22Adhesion+Protein+Protocols%22">Adhesion Protein Protocols</a>. Dejana, E., Corada, M. 96, Humana Press. 153-157 (1999).</li>
<li>Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+the+extracellular+domain+of+prostate-specific+membrane+antigen+also+react+with+tumor+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium.</a> Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).</li>
<li>Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-regulated+endothelial+S1P+receptor-1+signaling+sustains+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development.</a> Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).</li>
<li>Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+fucosyltransferase+III+disrupts+the+adhesion+of+circulating+cancer+cells+to+E-selectin+without+affecting+hematopoietic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion.</a> Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).</li>
<li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).</li>
</ol>

Dr Bander jest wynalazcą patentów, które są przypisane do Cornell Research Foundation ("CRF") dla przeciwciała J591 użytego w tym artykule. Dr Bander jest konsultantem i właścicielem udziałów w BZL Biologics, firmie, której CRF udzieliło licencji na patenty na dalsze badania i rozwój.

Ze względu na niską liczbę CTC w komórkach krwi, trudno jest wyizolować CTC jako czystą populację komórek. W celu zbadania interakcji CTC/EC, rzadka i nieczysta populacja CTC stawia dwa główne wyzwania: a) Identyfikacja CTC w komórkach krwi; b) Obserwacja interakcji CTC/EC.

Aby przezwyciężyć pierwsze ograniczenie związane z identyfikacją CTC prostaty wśród komórek krwi, wykorzystaliśmy fakt, że praktycznie wszystkie komórki nowotworowe prostaty wyrażają PSMA6<...

Przerzuty to złożony, wieloetapowy proces, który pozostaje słabo poznany. Wykazano, że oś ligandu E-selektyna/selektoryna odgrywa ważną rolę w przerzutach nowotworowych poprzez promowanie pierwotnych interakcji adhezyjnych między śródbłonkiem naczyniowym a komórkami nowotworowymi1,2. Selektyna śródbłonkowa (E) jest białkiem transbłonowym wyrażanym przez aktywowane komórki śródbłonka, podczas gdy różne ligandy E-selektyny są wyrażane przez komórki nowotworowe3. Liczne podejścia in vitro zostały z powodzeniem zastosowane do modelowania interakcji liganda E-selektyny/selektoryny między komórkami nowotworowymi a komórkami śródbłonka (EC)1. Aby zbadać te interakcje, stosuje się różne systemy komór przepływowych do symulacji układu krwionośnego. Wśród zespołów komór przepływowych, komora przepływowa z równoległą płytką (PPFC) w połączeniu z EC jest rutynowo stosowana jako model in vitro symulujący in vivo warunki naprężenia ścinającego. W tej metodzie EC są hodowane na szalce o średnicy 35 mm, a po uzyskaniu monowarstwy EC są dołączane do PPFC i przeprowadzane są eksperymenty oparte na naprężeniach ścinających. 

Jednak PPFC i inne obecne systemy mają wiele ograniczeń w badaniu interakcji adhezyjnych między krążącymi komórkami nowotworowymi (CTC) pochodzącymi od pacjentów a EC, przede wszystkim dlatego, że CTC to rzadka populacja komórek, wydalanych z pierwotnego nowotworu, krążących wśród milionów komórek krwi (1 CTC na 109 komórek krwi)4. W związku z tym, w przeciwieństwie do nieograniczonej podaży hodowanych linii komórkowych, niska liczba CTC prowadzi do bardzo niewielu i rzadkich interakcji CTC/EC, co wymaga odpowiedniej szerokości kanału przepływu do rejestrowania interakcji do analizy odtwarzania. Dodatkowo, ponieważ CTC pochodzące od pacjentów są populacją zanieczyszczoną, dlatego wymagany jest marker identyfikacyjny do śledzenia CTC w szczególności. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy nową metodę identyfikacji CTC raka prostaty (PCa), wykorzystując fakt, że praktycznie wszystkie te CTC wyrażają antygen błonowy specyficzny dla prostaty (PSMA) na powierzchni komórki5,6. W tym raporcie wykorzystaliśmy linię komórkową raka prostaty, MDA PCa2b (MDA), aby zademonstrować potencjalną użyteczność naszego nowego systemu do badania interakcji CTC prostaty z EC, w końcu, aby zrozumieć mechanizm przerzutów.

Nasza metodologia może być stosowana do różnych eksperymentów opartych na ścinaniu, symulujących układ naczyniowy in vivo 7-9. Oprócz badania interakcji PCa CTC/EC, obecny system komór przepływowych może być łatwo przystosowany do analizy komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub interakcji komórek nowotworowych z EC. Łatwość demontażu i ponownego montażu komory przepływowej, mikroszkiełko III (0,1) (zwane dalej mikroszkiełkiem), umożliwia hodowlę EC pod wpływem perfuzji i stymulowanie EC różnymi cytokinami w celu indukowania ekspresji białka. Poza tym hodowane EC, rekombinowane białka, takie jak selektyna E i P, mogą być pokryte mikroszkiełkiem, a interakcje z komórkami nowotworowymi można obserwować w warunkach przepływu laminarnego10.

<table><tbody><tr><td>Microslide</td><td>Ibidi</td><td>80331</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Rurka plastikowa</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-96115-08</td><td></td></tr><tr><td>Męska adapter Luer</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Żeńska adapter Luer</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Chemyx Inc</td><td>Fusion 100</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Luer-lock</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>M199 medium</td><td>Sigma</td><td>M7653</td><td></td></tr><tr><td>Śródbłonek Mitogen</td><td>Technologie biomedyczne</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Anty-PSMA J591-488</td><td>Weill Cornell Medical College-Laboratorium Onkologii</td><td></td><td></td>Urologicznej</tr><tr><td>Interleukina-1 beta</td><td>Peprotech</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Millipore</td><td>SM-2002-C</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H-3149</td><td></td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Weill Cornell Medical College-Wydział Chirurgii</td><td></td><td>dostarczony przez Marco Seandel</td></tr><tr><td>VE-Cadherin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5648</td><td></td></tr><tr><td>10x obiektyw</td><td>Zeiss Plan Neofluar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bezenzymatyczny odczynnik do dysocjacji komórek</td><td>Millipore</td><td>S-004-C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Lonza</td><td>12-702-F</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-paque plus</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr></tbody></table>

metody in vitro metoda obserwacji interakcji za pośrednictwem selektyny e między krążącymi komórkami nowotworowymi prostaty pochodzącymi od pacjentów a ludzkimi komórkami śródbłonka

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Przerzuty to proces, w którym komórki nowotworowe zrzucają się z pierwotnego wewnątrznaczyniowego układu krwionośnego i limfatycznego guza, uzyskując w ten sposób dostęp do wynaczynienia i tworząc niszę wtórną. Wynaczynienie komórek nowotworowych z układu krwionośnego można badać za pomocą komórek śródbłonka (EC) i komórek nowotworowych uzyskanych z różnych linii komórkowych. Początkowe badania przeprowadzono w warunkach statycznych, ale zostało dobrze udokumentowane, że EC zachowują się inaczej. w fizjologicznych warunkach przepływu. Dlatego różne zespoły komór przepływowych są obecnie używane do badania interakcji komórek nowotworowych z EC. Obecne zespoły komór przepływowych oferują powtarzalne wyniki przy użyciu różnych linii komórkowych lub płynu w różnych warunkach naprężeń ścinających. Jednakże, aby obserwować i badać interakcje z rzadkimi komórkami, takimi jak krążące komórki nowotworowe (CTC), Konieczne jest wprowadzenie pewnych zmian w konwencjonalnym zespole komory przepływowej. CTC to rzadka populacja komórek spośród milionów komórek krwi. W związku z tym trudno jest uzyskać czystą populację CTC. Zanieczyszczenie CTC różnymi typami komórek normalnie występujących w krążeniu jest nieuniknione przy użyciu obecnych technik wzbogacania lub zubożania. W niniejszym raporcie opisujemy unikalną metodę fluorescencyjnego znakowania krążących komórek raka prostaty i badania ich interakcji z EC w samoorganizującym się systemie komór przepływowych. Technika ta może być dalej stosowana do obserwacji interakcji między prostatą CTC i wszelkie białka będące przedmiotem zainteresowania.

Rysunek 1 przedstawia kulturę jednowarstwy ECs na mikroslajdzie po inkubacji przez noc (O/N). Skale na Rysunku 1A pokazują, że przy użyciu obiektywu 5X widoczne jest 100% powierzchni mikroslajdu, podczas gdy przy użyciu obiektywu 10X widoczne jest 70% (Rysunek 1B). W przypadku oddziaływań pośredniczonych przez E-selektynę nie bierze się pod uwagę komórek toczących się przy krawędziach, co sprawia, że ponad 70% powierzchni mikroslajdu jest dostępnych do rejestracji wideo ...

Nasz raport opisuje unikalną metodę wizualizacji i analizy interakcji CTC/EC w raku prostaty w warunkach fizjologicznego przepływu.

Metody in vitro Metoda obserwacji interakcji za pośrednictwem selektyny E między krążącymi komórkami nowotworowymi prostaty pochodzącymi od pacjentów a ludzkimi komórkami śródbłonka

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie oddziaływań pomiędzy rzadkimi komórkami raka prostaty a komórkami śródbłonka wykazującymi ekspresję selektyny E przy użyciu zestawu do przepływu na mikroprzesuwie. Osiąga się to poprzez wstępne pokrycie mikroprzesuwu fibronektyną. W drugim kroku hoduje się ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (VE) w dynamicznym systemie przepływowym na mikroprzesuwie o małej szerokości kanału.Następnie komórki raka prostaty znakuje się humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko swoistemu antygenowi błonowemu prostaty (PSMA), które ulega internalizacji. Ostatnim krokiem jest perfuzja znakowanych przeciwciałem anty-PSMA komórek raka prostaty przez naczynie endowtelialne (VE) wykazujące ekspresję selektyny E. Ostatecznie, w celu ukazania interakcji między komórkami raka prostaty a komórkami śródbłonka, wykorzystuje się mikroskopię wideo.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak komora przepływowa z równoległymi płytkami i inne układy dynamiczne, jest możliwość badania interakcji między rzadkimi komórkami raka prostaty, takimi jak krążące komórki nowotworowe, a hodowanymi komórkami śródbłonka w dynamiczny

in-vitro-method-to-observe-e-selectin-mediated-interactions-between

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

In vitro Metoda obserwacji interakcji zależnych od E-selektyny między krążącymi komórkami nowotworowymi prostaty pochodzącymi od pacjentów a ludzkimi komórkami śródbłonka

Krążące komórki nowotworowe są izolowane z krwi pacjentów onkologicznych bez powodowania uszkodzeń komórkowych. Izolacja komórek nowotworowych jest realizowana przy użyciu bimolekularnej powierzchni E-selectiny oraz przeciwciał przeciwko markerom nabłonkowym. Powłoka z nanorurek specyficznie wspomaga adhezję komórek rakowych, co skutkuje wysoką czystością wychwytu.

Szybka izolacja żywych krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pacjentów

Przyleganie neutrofili do aktywowanego śródbłonka w miejscach infekcji jest integralnym składnikiem odpowiedzi zapalnej gospodarza. W niniejszym raporcie opisano test wiązania neutrofili, który pozwala na ilościowe określenie in vitro pierwotnego wiązania ludzkich neutrofili z komórkami śródbłonka aktywowanymi przez mediatory stanu zapalnego w warunkach statycznych.

Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych

Brakuje dostępu do wiarygodnych modeli do badania interakcji naczyniowych krwi u ludzi. Przedstawiamy model in vitro hodowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka w połączeniu z ludzką krwią pełną w celu zbadania interakcji komórkowych zarówno we krwi (ELISA), jak i w przedziale naczyniowym (mikroskopia).

Nowatorski model in vitro do badania interakcji między ludzką krwią pełną a śródbłonkiem

Wykazano, że Wykazano, że krążące komórki nowotworowe (CTC) odgrywają ważną rolę w przerzutach nowotworowych. W tym miejscu opisano metodę izolacji i namnażania CTC z krwi pełnej syngenicznego modelu guza myszy z przerzutami raka wątrobowokomórkowego (HCC).

Izolacja i rozmnażanie krążących komórek nowotworowych z mysiego modelu raka

Zgłaszamy wiarygodną metodę izolowania i hodowli pierwotnych komórek śródbłonka specyficznych dla nowotworu z genetycznie modyfikowanych modeli mysich.

Izolacja i ekspansja hodowli komórek śródbłonka specyficznych dla nowotworu

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje metodę używaną do generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty (PDX) z krążących komórek nowotworowych (CTC). Generowanie modeli PDX z CTC zapewnia alternatywny model eksperymentalny do badania raka prostaty; Najczęściej diagnozowany nowotwór i częsta przyczyna zgonów z powodu raka u mężczyzn.

Generowanie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty z krążących komórek nowotworowych

Przedstawiamy protokół do badania interakcji między ludzkim śródbłonkiem a perycytami u myszy za pomocą wariantu testu angiogenezy z zatyczką żelową macierzy.

In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie domięśniowego wstrzykiwania komórek raka prostaty do środka prostaty, z późniejszą kastracją. Ortotopowe modele przedkliniczne androgenozależnego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego mają kluczowe znaczenie dla badania choroby w kontekście klinicznie istotnego mikrośrodowiska guza i immunokompetentnego gospodarza.

Bioluminescencyjny i fluorescencyjny, ortotopowy, syngeniczny mysi model androgenowego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego

Genetycznie modyfikowane myszy są użytecznymi modelami do badania mechanizmów raka prostaty. W tym miejscu przedstawiamy protokół identyfikacji i preparowania płatów prostaty z układu moczowo-płciowego myszy, różnicowania ich na podstawie histologii oraz izolowania i hodowli pierwotnych komórek prostaty in vitro jako sferoid do dalszych analiz.

Identyfikacja, charakterystyka histologiczna i sekcja płatów prostaty myszy dla modeli hodowli sferoidalnych 3D in vitro

Tutaj prezentujemy zintegrowany przepływ pracy w celu identyfikacji cech fenotypowych i molekularnych, które charakteryzują krążące komórki nowotworowe (CTC). Łączymy barwienie immunologiczne na żywo i mikromanipulację mikromanipulacją pojedynczych i grupowanych CTC z technikami opartymi na pojedynczych komórkach do dalszej analizy i oceny zdolności do wysiewu przerzutów.

Mikromanipulacja krążącymi komórkami nowotworowymi w celu dalszej analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego

Oporność na terapię często rozwija się u pacjentów z zaawansowanym rakiem prostaty, a w niektórych przypadkach rak rozwija się do śmiertelnego podtypu zwanego neuroendokrynnym rakiem prostaty. Ocena niewielkich zmian molekularnych za pośrednictwem niekodującego RNA, które ułatwiają to przejście, pozwoliłaby na lepszą stratyfikację choroby i identyfikację mechanizmów przyczynowych, które prowadzą do rozwoju neuroendokrynnego raka gruczołu krokowego.

Sekwencjonowanie małego niekodującego RNA z tkanek utrwalonych formaliną i egzosomów pochodzących z surowicy od pacjentów z opornym na kastrację rakiem prostaty

Poznaj metodę obserwacji interakcji komórek nowotworowych prostaty z komórkami śródbłonka w warunkach przepływu. Technika mikroprzepływowa umożliwia badanie mechanizmów metastazy w czasie rzeczywistym.

Metody in vitro Metoda obserwacji interakcji za pośrednictwem selektyny E między krążącymi komórkami nowotworowymi prostaty pochodzącymi od pacjentów a ludzkimi komórkami śródbłonka (Wideo) | JoVE Journal

Metody in vitro Metoda obserwacji interakcji za pośrednictwem selektyny E między krążącymi komórkami nowotworowymi prostaty pochodzącymi od pacjentów a ludzkimi komórkami śródbłonka

Przeglądaj więcej filmów