Name: Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Poznaj dynamikę pierścienia Z w bakteriach Bacillus subtilis przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D. Ta metoda pozwala obserwować zmiany białka FtsZ podczas podziału komórkowego z superrozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują P. Levinowi, S. Moriya, S. Fosterowi i M. Pinho za dar szczepów i przeciwciał. Dziękują również L. Ferrandowi, P. Goodwinowi, J. Cooperowi i B. Dougherty'emu za fachową pomoc techniczną. CBW jest wspierane przez australijską Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych Senior Research Fellowship (571905). LT był wspierany przez stypendium podoktoranckie UTS Chancellors Fellowship. MPS i ATFL były wspierane przez Australian Postgraduate Awards. Prace te były wspierane przez Australijską Radę ds. Badań Naukowych (Australian Research Council Discovery Project Grant) (DP120102010) dla EJH.

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek B. subtilis do obrazowania
	<ol>
		<li>Zaszczepić 10 ml bulionu Penassay (PAB, znanego również jako pożywka antybiotykowa 3) pojedynczą kolonią szczepu B. subtilis SU570 (168 trpC2 ftsZ::ftsZ-gfp-spec)16. Rosnąć przez noc w wytrząsarce o niskiej prędkości (100 obr./min) w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Rozcieńczyć kulturę przez noc do 0,05 A600 (absorbancja mierzona przy 600 nm) w świeżym PAB w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem z dużą prędkością (215 obr./min) i rosnąć do połowy fazy wykładniczej (A600 ~ 0,4).</li>
		<li>Dodaj 2 g agarozy do elektroforezy w 100 ml 1x pożywka wzrostowa (PAB) w szklanej butelce z zakręcaną nakrętką. Rozpuść agarozę w autoklawie. Można go przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy i w kuchence mikrofalowej w celu stopienia agarozy w razie potrzeby. Pozostawić do zastygnięcia w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przymocuj samoprzylepną ramkę (pojemność 65 μl; patrz Tabela materiałów) do standardowego szklanego szkiełka mikroskopowego. Aby to zrobić, usuń cienki arkusz poliestrowy (każda ramka samoprzylepna jest umieszczona między dwoma arkuszami poliestru, jednym cienkim i jednym grubym, i ma usunięty środkowy kwadrat) i nałóż odsłoniętą powierzchnię klejącą ramy na powierzchnię szkiełka mikroskopowego. To skutecznie tworzy kwadratową studnię na szczycie zjeżdżalni. Pozostaw gruby arkusz poliestru przymocowany do ramy, ponieważ zapobiegnie to przyklejaniu się do niej szkiełka nakrywkowego w kolejnych krokach.</li>
		<li>Rozpuść roztwór agarozy w kuchence mikrofalowej do wrzenia i odpipetuj 67 μl do ramki klejącej. Natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu, aby uzyskać płaską powierzchnię i pozostaw w temperaturze pokojowej na 5-10 minut. Usuń szkiełko nakrywkowe na 1-2 minuty podczas pobierania próbki.</li>
		<li>Pobrać 1 ml podwielokrotności próbki i odwirować przy 5 900 x g przez 30 sekund. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl świeżego PAB.</li>
		<li>Pobrać 2,5 μl zagęszczonej próbki i odpipetować na wcześniej przygotowaną podkładkę agarozową. Próbkę rozprowadzić równomiernie wzdłuż płaskiej powierzchni podkładki agarozowej. Zdejmij ramkę samoprzylepną ze szkiełka mikroskopowego za pomocą pęsety, nie dotykając podkładki agarozowej.</li>
		<li>Przenieść wacik agarozowy ze szkiełka mikroskopowego na szalkę Petriego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem nakrywkowym. Odwrócić podkładkę agarozową tak, aby zawiesina komórek i szkiełko nakrywkowe szalki Petriego stykały się ze sobą bezpośrednio. Dolna część szalki Petriego ma współczynnik załamania światła 1,525 dla obrazowania w wysokiej rozdzielczości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie żywych komórek S. aureus do obrazowania
	<ol>
		<li>Zaszczepić 10 ml bulionu L pojedynczą kolonią szczepu S. aureus SA94 (SH1000 zawierającego pLOW-FtsZ-GFP i pGL485; Ermr, Cmr)25. Uprawiać przez noc w wytrząsarce obrotowej o niskiej prędkości (100 obr./min) w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Rozcieńczyć kulturę przez noc do 0,05 A600 (absorbancja mierzona przy 600 nm) w świeżym L-bulionie 0,05 mM IPTG (izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozyd) w celu indukcji produkcji białka fuzyjnego.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z dużą prędkością (215 obr./min) i rosnąć do połowy fazy wykładniczej (A600 ~ 0,4).</li>
		<li>Postępuj zgodnie z krokami 1.1.3 - 1.1.8 zgodnie z opisem dla preparatu żywych komórek B. subtilis. 
		Uwaga: Dodać odpowiednie stężenie induktora do roztworu agarozy w kroku 1.1.3 dla szczepów, które wyrażają fluorescencyjne białko fuzyjne pod kontrolą indukowalną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikroskopu
Ta metoda wykorzystuje system obrazowania 3D-SIM DeltaVision OMX (Optical Microscope, eXperimental) wyposażony w moduł Blaze. Do opisanych eksperymentów używa się tylko jednego lasera i jednej kamery. Natężenie oświetlenia i ścieżka światła są opisane na rysunku 1. Metoda ta zakłada, że mikroskop posiada odpowiednią kalibrację, pliki funkcji transferu optycznego (OTF) oraz wykonaną konserwację kolimacji świetlnej.
<ol>
	<li>W przypadku eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek upewnij się, że stopień grzewczy jest przymocowany do stolika ceramicznego, a kołnierz grzewczy obiektywu jest przymocowany do obiektywu (obiektyw olejowy 60X 1.42 NA).</li>
	<li>Włącz obiektyw i stage grzałki co najmniej 4 godziny przed obrazowaniem i powoli zwiększaj temperaturę do wymaganego ustawienia z maksymalną szybkością 5 °C/h. Zaleca się rozpoczęcie tego procesu wieczorem przed obrazowaniem i zwiększenie temperatury w temperaturze 3 °C/4 godziny. W przypadku eksperymentów z żywymi komórkami z B. subtilis większość doświadczeń przeprowadza się w temperaturze 30 °C. W przypadku S. aureus wszystkie eksperymenty przeprowadza się w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W dniu eksperymentu włącz system co najmniej 1 godzinę przed obrazowaniem, aby umożliwić pełną stabilizację systemu i laserów. Załaduj małe naczynie stage wkładkę na podgrzewany stage, aby podgrzać.
	<ol>
		<li>Włącz stację roboczą kontrolera głównego.</li>
		<li>Włącz stację roboczą przetwarzania obrazu.</li>
		<li>Włącz chłodnicę aparatu znajdującą się na podłodze na zewnątrz obudowy mikroskopu.</li>
		<li>Włącz wszystkie kamery sCMOS (nawet jeśli nie wszystkie będą używane).</li>
		<li>Wewnątrz obudowy lasera i elektroniki włącz:
		<ol>
			<li>Podwozie kontrolera przyrządów.</li>
			<li>Obudowa Nanomotion.</li>
			<li>Kontroler Jena dla Z piezo.</li>
			<li>Wszystkie 4 sterowniki silników galvo.</li>
			<li>Główny moduł sterujący laserem.</li>
			<li>Dodatkowy moduł sterujący laserem.</li>
			<li>Wszystkie stacje robocze z kamerami.</li>
			<li>Stacja robocza OMXIC.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Na stacji roboczej kontrolera głównego otwórz oprogramowanie OMX, klikając ikonę. Ustaw ścieżkę pliku do zapisania danych w odpowiednim folderze danych.</li>
		<li>Aby zainicjować sprzęt, przejdź do menu Sprzęt, wybierz Sprzęt i kliknij przycisk Uruchom ponownie sprzęt. Zamknij okno.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie softWoRx. Włącz lasery wymagane do eksperymentów (488 nm).</li>
		<li>Włącz przełącznik kluczykowy laserowej blokady bezpieczeństwa.</li>
		<li>Upewnij się, że właściwa szuflada filtra dichroicznego jest włożona poniżej obiektywu. W przypadku GFP jest to standardowa (lub stała) szuflada.</li>
		<li>W OMX SF przejdź do menu Plik, wybierz Ustawienia i wybierz Stała szuflada z menu rozwijanego Szuflada. Zamknij okno.</li>
		<li>Wykonaj następujące czynności na ekranie głównym oprogramowania, w sekcji Parametry światła:
		<ol>
			<li>Aktywuj odpowiednią kamerę dla kamery z laserem wzbudzenia i filtrem emisyjnym (FITC) z wyboru Kanał.</li>
			<li>Sprawdź, czy tryb obrazu jest ustawiony na sekwencyjny.</li>
			<li>Sprawdź, czy ścieżka światła jest ustawiona na SI.</li>
			<li>Sprawdź, czy tryb jest ustawiony na 95 MHz.</li>
			<li>Sprawdź, czy laser 488 jest wybrany w Wzbudzenie.</li>
			<li>Ustaw Rozmiar na 512 x 512 dla rozmiaru okna i Binowanie na 1 x 1.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Na karcie Eksperyment upewnij się, że Typ jest ustawiony na SI z menu rozwijanego.</li>
		<li>Upewnij się, że podział na sekcje jest włączony i że odstęp między sekcjami optycznymi jest ustawiony na 0,125.</li>
		<li>Upewnij się, że punkt ostrości po rozpoczęciu skanowania znajduje się w środku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Nałóż kroplę olejku na górną część obiektywu. Dla temperatury 37 °C zalecany olej wyjściowy ma współczynnik załamania światła 1,518, aby jak najlepiej odpowiadał współczynnikowi załamania światła wkładki żelowej używanej do montażu komórek bakteryjnych w temperaturze 37 °C (patrz krok 1.1.3).</li>
	<li>Umieścić próbkę na płytce Petriego zawierającą przygotowane komórki we wstawce stolika i przykryć okrągłą pokrywką do podgrzewania. Obniżyć stolik do momentu, gdy olej dotknie dna płytki Petriego próbki.</li>
	<li>Pozwól potrawie zrównoważyć temperaturę przez 15 minut na scenie. Korzystając z ustawienia niskiej ekspozycji wynoszącego 5 ms lub mniej (znajdującego się w sekcji Parametry światła), skoncentruj się na próbce za pomocą elementów sterujących stopniem pozycjonowania nano (dZ, znajdującego się w sekcji Pozycjonowanie nano). Ustaw ostrość w górę i w dół przez próbkę, aby określić, czy światło jest równomiernie rozprowadzane powyżej i poniżej płaszczyzny ogniskowej próbki. Jeśli funkcja rozrzutu punktowego nie jest parzysta (aberracja sferyczna), należy oczyścić dno naczynia na próbkę i obiektyw chloroformem. Wymień olej i powtarzaj ten krok, aż zostanie znalezione odpowiednie dopasowanie między olejem a współczynnikiem załamania światła, aby zminimalizować aberrację sferyczną.</li>
	<li>Używając kroku 0,5 μm dZ, zaznacz górną i dolną część stosu obrazów. Wróć do środka próbki. Kliknij przycisk Pobierz grubość na karcie Eksperyment, aby ustawić grubość pobierania próbki. Utrzymuj wysokość stosu do minimum, uważając, aby nie odciąć górnej i dolnej części pierścieni Z. Typowe grubości próbek B. subtilis wynoszą 2-3 μm.</li>
	<li>Określ maksymalną wartość intensywności (Max) przykładowego obrazu przy bieżących ustawieniach Exposure (Ekspozycja) i %T (%T). Ta wartość znajduje się poniżej okna obrazu. W przypadku obrazowania poklatkowego dostosuj Ekspozycja i % T, aby uzyskać maksymalną intensywność 1,100-1,400 powyżej tła obrazu. Do uzyskania rekonstrukcji obrazu potrzebna jest minimalna intensywność 1,000 nad tłem. W przypadku jednorazowego obrazu zwiększ maksymalną intensywność do 4 000-5 000.</li>
	<li>Aktywuj sekcję Time-lapse w zakładce Eksperyment. Ustaw wymaganą liczbę klatek na sekundę i łączny czas. W polu Plik danych wprowadź odpowiednią nazwę pliku. Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć pobieranie obrazu. 
	Uwaga: Akwizycja obrazu jest zakończona, gdy zielony pasek postępu zostanie zakończony i pojawi się plik dziennika dla zestawu danych w odpowiednim folderze danych.</li>
</ol>
4. Sprawdzanie jakości danych
<ol>
	<li>Na początku akwizycji obrazu zanotuj maksymalną wartość intensywności obrazu na początku akwizycji obrazu dla pierwszej klatki szeregów czasowych. Pod koniec akwizycji pierwszej klatki sprawdź, czy nie nastąpił spadek intensywności sygnału przez stos z o więcej niż 10% dla tej pierwszej klatki. Jeśli w pierwszym punkcie czasowym nastąpił więcej niż ten poziom fotowybielania, dane z szeregów czasowych będą niewystarczającej jakości do analizy, a akwizycja szeregów czasowych może zostać zatrzymana.</li>
	<li>Pod koniec akwizycji szeregów czasowych otwórz wynikowy plik obrazu RAW z sufiksem .dv i upewnij się, że maksymalna intensywność sygnału zmniejszyła się od początku szeregu czasowego do końcowego obrazu. Odrzuć wszystkie punkty czasowe, w których nastąpiło więcej niż 30% fotowybielania.</li>
</ol>
5. Rekonstrukcja obrazów 3D-SIM
<ol>
	<li>Z menu Process (Proces) uaktywnij okno SI Reconstruction. Użyj istniejących ustawień dla wszystkich parametrów.</li>
	<li>Aktywuj przycisk Użyj OTF specyficznego dla kanału i ustaw na Standardowy zestaw filtrów. Aktywuj przycisk Użyj kątów KO specyficznych dla kanału i ustaw na Standardowy zestaw filtrów.</li>
	<li>Przeciągnij i upuść plik raw (.dv) do przestrzeni pliku wejściowego. Kliknij przycisk Zrób to. Plik wyjściowy będzie miał taką samą nazwę jak plik wejściowy z _SI dodanym na końcu. 
	Uwaga: Ten proces rekonstrukcji można uruchomić jako zadanie za pomocą funkcji Konstruktor zadań z menu Proces, jeśli ma zostać przetworzonych wiele plików.</li>
</ol>
6. Eksport i analiza danych
<ol>
	<li>Użyj Imaris do wizualizacji obrazów 3D w trybie przewyższania i eksportowania danych obrazu jako plików tiff (300 dpi) lub avi (bez kompresji). Pomiary rozmiaru w Imaris można wykonać za pomocą narzędzia do pomiarów w trybie przewyższania.</li>
	<li>Generowanie wykresów intensywności 3D pierścienia Z na podstawie danych obrazu 3D-SIM:
	<ol>
		<li>Zbadaj rozkład FtsZ wokół pierścienia Z i utwórz wykresy intensywności 3D
		<ol>
			<li>Otwórz plik obrazu 3D, aby wyświetlić poszczególne plasterki Z. Użyj narzędzia przeglądarki woluminów znajdującego się na karcie menu widoku, aby przyciąć interesujący Cię obszar.</li>
			<li>Wprowadź numer okna dla tego obrazu 3D w oknie wejściowym i wprowadź nowy i nieużywany numer okna w oknie wyjściowym. Przycisk wyboru regionu stanie się dostępny, aby przyciąć pojedynczy pierścień zainteresowania Z z oryginalnego pola widzenia 40 × 40 μm.</li>
			<li>Dostosuj żądaną oś i stopień obrotu w zakładce obrotu. Kliknij przycisk Zrób to. Przewiń wolumin, aby uzyskać żądaną perspektywę pierścienia Z.</li>
			<li>Użyj narzędzia Inspektor danych i dostosuj wymiary kolumn/wierszy, aby utworzyć nowy obszar zainteresowania wokół pojedynczego pierścienia Z. Kliknij środek obrazu, aby ustawić ten nowy obszar zainteresowania. Dane obrazu tekstowego są automatycznie generowaną tabelą, która wyświetla intensywność fluorescencji każdego piksela w obszarze zainteresowania.</li>
			<li>Kliknij przycisk Wykres 3D, aby początkowo wyświetlić wykres intensywności.</li>
			<li>Alternatywnie dane obrazu tekstowego można wyeksportować, klikając przycisk Zapisz dane tabeli w menu pliku.</li>
			<li>Skopiuj dane obrazu z zapisanego pliku tekstowego do nowego arkusza kalkulacyjnego. Zaznacz wszystkie komórki w arkuszu kalkulacyjnym i utwórz nowy wykres powierzchni 3D. Sformatuj wykres intensywności 3D do publikacji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku danych poklatkowych powtórz kroki 6.2.1.1 - 6.2.1.7 dla każdego z różnych punktów czasowych z pliku obrazu 3D.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Śledzenie średniej intensywności fluorescencji w czasie
	<ol>
		<li>Użyj danych obrazu tekstowego, aby śledzić intensywność fluorescencji w czasie w obszarze zainteresowania.</li>
		<li>Zaznacz komórki, które odpowiadają interesującemu Cię regionowi.</li>
		<li>Oblicz średnią intensywność fluorescencji w każdym punkcie czasowym dla tego obszaru zainteresowania.</li>
		<li>Użyj średnich wartości intensywności fluorescencji, aby wygenerować osobny wykres liniowy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Harry, E., Monahan, L., Thompson, L., Kwang, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Cell+Division+The+Mechanism+and+Its+Precison%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Cell Division The Mechanism and Its Precison.</a> Int Rev Cytol. 253, 27-94 (2006).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett. 19, 780-782 (1994).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+j%22%5BJournal%5D)">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys j. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3, 793-796 (2006).</li>
<li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+%28English%29%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Ed (English). 47, 6172-6176 (2008).</li>
<li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+Diffraction+Barrier+in+Fluorescence+Microscopy+by+Optical+Shelving%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the Diffraction Barrier in Fluorescence Microscopy by Optical Shelving.</a> Phys Rev Lett. 98, 218103(2007).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophys J. 94, 4957-4970 (2008).</li>
<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320, 1332-1336 (2008).</li>
<li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+modulated+excitation+microscopy%3A+Improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+SPIE+3568%22%5BJournal%5D)">Lateral modulated excitation microscopy: Improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> Proc SPIE 3568. , 185-195 (1999).</li>
<li>Gould, T. J., Burke, D., Bewersdorf, J., Booth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+enables+3D+STED+microscopy+in+aberrating+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics enables 3D STED microscopy in aberrating specimens.</a> Opt Express. 20, 20998-21009 (2012).</li>
<li>Urban, N. icolai T., Willig, K. atrin, Hell, S. tefan W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys J. 101, 1277-1284 (2011).</li>
<li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 1607-1611 (2011).</li>
<li>Strauss, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-SIM+Super+Resolution+Microscopy+Reveals+a+Bead-Like+Arrangement+for+FtsZ+and+the+Division+Machinery+Implications+for+Triggering+Cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biol%22%5BJournal%5D)">3D-SIM Super Resolution Microscopy Reveals a Bead-Like Arrangement for FtsZ and the Division Machinery Implications for Triggering Cytokinesis.</a> PLoS biol. 10, e1001389(2012).</li>
<li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+division+assembly%2C+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell division assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Rev Microbiol. 7, 642-653 (2009).</li>
<li>Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+E+coli+cell+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding E coli cell fission.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 730-737 (2010).</li>
<li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+physics+of+FtsZ+assembly+and+force+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Modeling the physics of FtsZ assembly and force generation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 9238-9243 (2009).</li>
<li>Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+in+Bacterial+Cytokinesis+Cytoskeleton+and+Force+Generator+All+in+One%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">FtsZ in Bacterial Cytokinesis Cytoskeleton and Force Generator All in One.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74, 504-528 (2010).</li>
<li>Lan, G., Wolgemuth, C. W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z-ring+force+and+cell+shape+during+division+in+rod-like+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Z-ring force and cell shape during division in rod-like bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16110-16115 (2007).</li>
<li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+Contractile+FtsZ+Rings+in+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of Contractile FtsZ Rings in Liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li>
<li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 11000-11004 (2013).</li>
<li>Murphy, G. E., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography.</a> BioTechniques. 43, 413-415 (2007).</li>
<li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+plasmid-based+system+that+allows+rapid+generation+of+tightly+controlled+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">A simple plasmid-based system that allows rapid generation of tightly controlled gene expression in Staphylococcus aureus.</a> Microbiology. 157, 666-676 (2011).</li>
<li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-Resolution+Dissection+of+Coordinated+Events+during+Malaria+Parasite+Invasion+of+the+Human+Erythrocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Hos.%2C+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Super-Resolution Dissection of Coordinated Events during Malaria Parasite Invasion of the Human Erythrocyte.</a> Cell Hos., & Microbe. 9, 9-20 (2011).</li>
<li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> EMBO J. 26, 4694-4708 (2007).</li>
</ol>

Niniejsza publikacja jest sponsorowana przez GE Healthcare.

Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek jest potężnym narzędziem, które umożliwia obserwację dynamicznych zmian w komórkach w czasie. Obrazowanie biologii komórek bakteryjnych na żywo było wyzwaniem ze względu na mały rozmiar komórek i zmniejszoną zdolność komórek bakteryjnych do wytrzymywania powtarzającej się ekspozycji na światło wzbudzające. f3D-SIM rozszerzył dostępne narzędzia do badania całej biologii komórki, ale konieczne jest staranne wykonanie tej techniki, ponieważ artefakty mogą zostać wprowadzone, jeśli zostaną źle zaimplementowane. Istnieje kilka ważnych czynników wpływających na pomyślne zastosowanie tej techniki. Ponieważ jest to metoda obrazowania fluorescencyjnego o szerokim polu, która opiera się na wykorzystaniu funkcji punktowego rozproszenia emitowanego światła, należy unikać niedopasowania współczynnika załamania światła i aberracji sferycznej emitowanego światła, aby umożliwić dokładną rekonstrukcję obrazu. Zdecydowanie zaleca się stosowanie szkiełek nakrywkowych o grubości 0,17 mm wysokiej jakości, aby uniknąć zmian intensywności sygnału spowodowanych zmiennością grubości szkła w szkiełku nakrywkowym. Niezwykle ważne jest, aby dokładnie ocenić aberrację sferyczną emitowanego światła podczas początkowych etapów wszystkich eksperymentów i w razie potrzeby dostosować współczynnik załamania światła olejku immersyjnego. Może się to różnić z dnia na dzień, ponieważ zależy zarówno od temperatury, jak i nośnika montażowego/podłoża próbki. Użycie niewłaściwego oleju spowoduje gorszą rekonstrukcję obrazów z artefaktami, takimi jak aureole i sygnały echa.
Pod koniec procesu rekonstrukcji obrazu, dla każdej fazy, można uzyskać miarę jakości rekonstrukcji za pomocą "najlepszego dopasowania dla kąta kO" dla każdej fazy/kąta oświetlenia. Jeśli wartość ta jest mniejsza niż 1 dla każdego kąta, to jakość rekonstrukcji najprawdopodobniej będzie wysoka. Jeśli ta wartość jest wyższa niż 6, najprawdopodobniej zrekonstruowany obraz będzie zawierał artefakty. Typowe artefakty obejmują i) pojawienie się pasków na obrazie, które odpowiadają jednemu z kątów siatki. Może to wynikać z niższego sygnału z tego kąta siatki; ii) Aureola wokół konstrukcji. Może to wynikać z bardzo nierównych poziomów sygnału z jasnych struktur w porównaniu z otaczającymi strukturami, niedopasowania współczynnika załamania światła oleju i próbki lub może wynikać z tego, że struktury na obrazie są zbyt amorficzne i nie zawierają wystarczającej ilości "struktury", aby mogły zostać rozpoznane przez algorytm; (iii) "plaster miodu", który wynika z niskiego stosunku sygnału do szumu na obrazie, zwykle z powodu wysokiego sygnału tła; iv) struktury, które są rozciągnięte/wydłużone w XY, co może być spowodowane niedopasowaniem współczynnika załamania światła oleju i próbki. Ten artefakt jest trudny do rozpoznania dla niedoświadczonego użytkownika. Zaleca się, aby nowi użytkownicy skonsultowali się z doświadczonym badaczem SIM w celu uzyskania porady na temat interpretacji i analizy obrazu przed rozpoczęciem korzystania z tej techniki.
Podobnie jak w przypadku wszystkich eksperymentów z obrazowaniem fluorescencyjnym żywych komórek, ważne jest, aby starannie zrównoważyć wejściową energię wzbudzenia, aby zminimalizować stopień fotowybielania i fototoksyczności komórek z wystarczającym sygnałem emisyjnym potrzebnym do rekonstrukcji obrazów przy minimalnym artefaktach. Nadmierne fotowybielanie (większe niż 30% w pojedynczej akwizycji z-stack) doprowadzi do powstania pasków na zrekonstruowanym obrazie. Dzięki zastosowaniu kamer sCMOS można z powodzeniem zrekonstruować obrazy o wysokiej rozdzielczości z obrazów surowych z sygnałem emisyjnym już od 1000 zliczeń nad tłem. Może to pozwolić na bardzo krótkie czasy naświetlania, zmniejszając w ten sposób fotowybielanie i umożliwiając szybkie uchwycenie każdej klatki. Zwiększa również ilość czasu między klatkami, w którym komórki mogą odzyskać siły po wprowadzeniu energii wzbudzenia. Dodatkowo, ze względu na to, że czas przechwytywania każdej pojedynczej klatki może być bardzo krótki, stopień artefaktu wprowadzanego przez "rozmycie ruchu" podczas pojedynczego przechwytywania jest zmniejszony przy użyciu tej metody.
Ta odmiana 3D-SIM oferuje szereg innych zalet w porównaniu z innymi dostępnymi technologiami obrazowania w super- i wysokiej rozdzielczości do obrazowania na żywo przez biologów komórek bakteryjnych. 2-krotny wzrost rozdzielczości we wszystkich 3 wymiarach oraz możliwość obrazowania do 30 μm w próbce umożliwia obrazowanie całych komórek bakteryjnych (i ssaków) podczas eksperymentu. Techniki takie jak lokalizacja pojedynczych cząsteczek, które są powszechnie wykonywane w fali ulotnej, nie mogą osiągnąć głębokości penetracji próbki i nie dostarczają informacji o całych komórkach. Najnowsze osiągnięcia, które pozwalają na większe głębokości próbkowania dla tej techniki, mogą skutkować lepszą rozdzielczością osiową całych komórek. Ponadto techniki lokalizacji pojedynczych cząsteczek, które wymagają uzyskania tysięcy surowych obrazów, są również ograniczone pod względem liczby klatek na sekundę, które można przechwycić, i mogą wymagać kompromisu między liczbą klatek na sekundę przechwytywania a ostateczną osiągniętą rozdzielczością przestrzenną, ponieważ rozdzielczość przestrzenna zależy od liczby zdarzeń zarejestrowanych w zdefiniowanej przestrzeni. Zmniejszenie liczby przechwyconych klatek spowoduje niższą rozdzielczość przestrzenną, ale może być wystarczające do osiągnięcia rozdzielczości czasowej wymaganej dla procesu biologicznego będącego przedmiotem zainteresowania. Wydłużenie czasu odzyskiwania między klatkami może być również konieczne w celu zminimalizowania fototoksyczności w żywych komórkach, ograniczając w ten sposób czas trwania i częstotliwość, z jaką można uzyskać szeregi czasowe. Techniki wysokiej rozdzielczości, takie jak mikroskopia elektronowa (EM) lub kriotomografia elektronowa (ECT), oferują zwiększoną rozdzielczość w porównaniu z 3D-SIM (i innymi technikami mikroskopii optycznej o wysokiej rozdzielczości), ale muszą być wykonywane na utrwalonych próbkach. Utrwalanie i przetwarzanie może wprowadzać artefakty, a brak oznakowania może utrudniać interpretację. Elektrowstrząsy bezznacznikowe mają słaby kontrast i mogą osiągnąć głębokość penetracji próbki około 500-200 nm24, więc nawet jeśli można zidentyfikować białko będące przedmiotem zainteresowania, nie można zaobserwować struktury białka w całej komórce bakteryjnej. Nawet jeśli znakowanie może być stosowane w EM, na przykład za pomocą immunogold, obrazowanie jest wykonywane tylko w 2D. 3D jest możliwe do osiągnięcia tylko przy cienkich przekrojach i komputerowej rekonstrukcji skrawków. Cienkie cięcie wymaga doświadczonego technika, ale może być problematyczne i prowadzić do artefaktów. W przypadku komórek aktywnych lub stacjonarnych karta 3D-SIM nie musi być osadzona w określony sposób, a komórki mogą być szybko przygotowane do obrazowania w stanie zbliżonym do natywnego.
Metoda ta jest stosunkowo łatwa do wdrożenia przez badaczy z minimalnym doświadczeniem w mikroskopii fluorescencyjnej. Eksperymenty można przeprowadzać w pożywkach, które wspierają zdrowe funkcjonowanie komórek, o ile nie fluoryzują ani nie generują nadmiernego sygnału tła. W przypadku komórek bakteryjnych może to pozwolić na stosowanie wielu rodzajów złożonych i minimalnych pożywek lub stosowanie pożywek stałych lub półstałych do kontrolowania ruchliwości komórek bakteryjnych. Wielu biologów, którzy już zaprojektowali fuzje białek fluorescencyjnych (FP) i przetestowali funkcjonalność tych fuzji, może szybko wdrożyć tę technologię bez dalszej inżynierii i walidacji dzięki nowym fotoaktywowalnym fuzjom FP. Stwierdziliśmy, jako ogólną obserwację, że S. aureus był bardziej podatny na fotowybielanie podczas obrazowania z fuzjami FP niż B. subtilis. Korzystając z naszych oryginalnych metod 3D-SIM, w których wzór siatki był generowany przez fizyczną siatkę, nie byliśmy w stanie przeprowadzić obrazowania żywych komórek z wieloma fuzjami FP S. aureus . Jednak dzięki tej zaawansowanej metodzie f3D-SIM byliśmy w stanie zobrazować te fuzje FP i wykonać krótkie szeregi czasowe, aby uchwycić dynamikę tych znakowanych białek. Jest to najprawdopodobniej spowodowane skróconym czasem naświetlania potrzebnym do obrazowania i wydłużonym czasem między klatkami w celu odzyskania komórek.
OMX Blaze 3D-SIM to dostępna na rynku technologia, którą można stosunkowo łatwo wdrożyć w jednym laboratorium lub głównym zakładzie obrazowania. Należy zachować ostrożność podczas wykonywania tej techniki, aby uniknąć artefaktów spowodowanych złym przygotowaniem próbki lub słabym uchwyceniem obrazu. Po opanowaniu tej techniki można przeprowadzić badania struktury i dynamiki białek w małych organizmach, takich jak bakterie, w fluorescencji jedno- lub wielokolorowej.

Na przestrzeni lat do badania bakterii używano wielu różnych technologii obrazowania, w tym różnych technik mikroskopii elektronowej i optycznej. Podczas gdy mikroskopia elektronowa oferuje niezwykle wysoką rozdzielczość, aż do nanometrów, potrzeba próżni i stosowania środków kontrastowych ograniczyła tę technikę do utrwalonych i osadzonych próbek. Artefakty mogą być również wprowadzane ze względu na długotrwałe przygotowanie próbki, a do przygotowania próbek oraz analizy i interpretacji powstałych obrazów potrzebny jest wykwalifikowany praktyk. Mikroskopia optyczna oferuje korzyści w postaci prostszego przygotowania próbki i aplikacji wielu etykiet ze względną łatwością w porównaniu z mikroskopią elektronową. Za pomocą białek fluorescencyjnych i koniugatów barwnikowych możliwa jest również możliwość badania żywych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Dzięki poprawie stabilności fluoroforu i wielkości/struktury białek fluorescencyjnych, co prowadzi do zmniejszenia toksyczności komórek, a także postępom w technologii wykrywania kamer, mikroskopia fluorescencyjna z wykorzystaniem szerokokątnych i konfokalnych systemów obrazowania znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat dynamiki przestrzennej komórek. Korzystając z tych technik, nasza wiedza na temat komórki bakteryjnej w ciągu ostatnich 20 lat znacznie się rozwinęła, osiągając znacznie bardziej szczegółowy obraz, który ujawnia wysoki poziom organizacji strukturalnej i białkowej w komórce bakteryjnej1.
Jednak konwencjonalne metody mikroskopii optycznej są ograniczone dyfrakcją, co oznacza, że rozdzielczość wewnętrzna wynosi około połowy długości fali użytego światła wzbudzenia. W rezultacie, nawet przy najbardziej optymalnym konwencjonalnym systemie mikroskopii optycznej, najlepsza rozdzielczość boczna wynosi około 220-250 nm, a rozdzielczość osiowa wynosi około 500 nm (przegląd patrz Schermelleh i wsp.2). W szczególności dla biologów komórek bakteryjnych nadal poważnie ogranicza to nasze zrozumienie organizacji przestrzennej tych maleńkich komórek; o średnicy zaledwie 1-2 μm i długości 1-10 μm. Istnieje również zapotrzebowanie na techniki o wyższej rozdzielczości, które można przeprowadzić na żywych komórkach, w których można analizować dynamiczne zachowanie przestrzenne białka w celu uzupełnienia danych in vitro.
W ciągu ostatniej dekady opracowano kilka technik obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości. Mikroskopia superrozdzielcza opisuje techniki obrazowania, które co najmniej podwajają rozdzielczość boczną możliwą do uzyskania za pomocą konwencjonalnej mikroskopii świetlnej, pokonując w ten sposób barierę dyfrakcyjną. Techniki te manipulują oświetleniem i/lub analizą emitowanego światła w celu uzyskania rzeczywistego wzrostu pozornej rozdzielczości. Obecnie istnieją trzy główne rodzaje technik super-rozdzielczości – i) mikroskopia wymuszonej deprymcji emisji3 (STED); ii) mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek, w tym techniki takie jak mikroskopia lokalizacji fotoaktywacji4,5 (PALM), stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej6 (STORM), bezpośrednia STORM7 (dSTORM) oraz zubożenie stanu podstawowego ze zwrotem pojedynczej cząsteczki8 (GDSIM); oraz iii) mikroskopia oświetlenia strukturalnego9-12 (SIM). Techniki lokalizacji pojedynczych cząsteczek oferują największy wzrost rozdzielczości bocznej, do 10-40 nm w próbkach biologicznych. W wielu implementacjach mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek głębokość próbkowania jest ograniczona do fali ulotnej, a początkowe implementacje STED były również ograniczone pod względem głębokości próbkowania. Jednak ostatnie postępy, takie jak zastosowanie optyki adaptatywnej, wykorzystanie astygmatyzmu w funkcji punktowego rozproszenia w różnych punktach ogniskowych, detekcja wielopłaszczyznowa i wykorzystanie dwóch obiektywów do wnioskowania o osiowym położeniu emitowanego światła, przyniosły poprawę zarówno rozdzielczości osiowej, jak i głębokości próbkowania zarówno w lokalizacji STED, jak i pojedynczej cząsteczki13,14. Szybkość pozyskiwania danych dla technik lokalizacji STED i pojedynczych cząsteczek jest również stosunkowo niska ze względu na dużą liczbę obrazów, które należy uzyskać w celu uzyskania maksymalnej rozdzielczości (do 50 000 w przypadku technik lokalizacyjnych). To powolne pozyskiwanie danych nie nadaje się do obrazowania żywych próbek bez niestandardowych modyfikacji, które często są dość drogie. Te dwie techniki są obecnie optymalnie dostosowane do próbek stałych (przegląd zob. 2,15), jednak wiele pracy jest wykonywane, aby rozwiązać ten problem.
Trójwymiarowa mikroskopia oświetlenia strukturalnego (3D-SIM) to technika szerokokątna, która poprawia rozdzielczość zarówno poprzeczną, jak i osiową, uzyskując rozdzielczości odpowiednio około 110 i 280 nm. Głębokość pobierania próbek wynosi do 30 μm od szkiełka nakrywkowego, co pozwala na obrazowanie całych komórek. Wariant 3D-SIM opracowany przez Sedata, Agarda i Gustaffssona na platformie Optical Microscope eXperimental (OMX) polega na oświetlaniu próbki znanym wzorem siatki, który jest przesuwany do 15 różnych pozycji w każdej płaszczyźnie z9-11. Mierzone są prążki w powstałych wzorach mory, które powstają w przestrzeni częstotliwości poza obserwowalnym obszarem. Informacje z przestrzeni częstotliwości są rekonstruowane obliczeniowo w celu wygenerowania widzialnego obrazu o wysokiej rozdzielczości10,11. Względna szybkość, z jaką można uzyskać surowe obrazy za pomocą tej techniki, umożliwia obrazowanie żywych komórek. Należy jednak zauważyć, że w przypadku procesów biologicznych zachodzących w skali sekund szybkość akwizycji surowych obrazów jest nadal zbyt niska, aby uchwycić dynamiczne zmiany. W przypadku szeregów czasowych z szybkością przechwytywania wynoszącą sekundy powtarzająca się akwizycja bez wystarczającego czasu odzyskiwania może prowadzić do fototoksyczności i fotowybielania, szczególnie podczas obrazowania na żywo małych komórek bakteryjnych.
Aby przezwyciężyć te problemy, opracowano najnowsze rozwiązania dla szybkiej karty 3D-SIM (f3D-SIM). Tutaj opisujemy jeden znany jako OMX Blaze16, który został wprowadzony pod koniec 2011 roku. Technologia ta tworzy wzorzyste oświetlenie bez użycia fizycznej siatki, jak to było stosowane we wcześniejszych systemach. Zastosowanie interferencyjnych wiązek światła i nowej technologii przesłon pozwala na bardzo szybkie wytworzenie wzorzystego światła na próbce. Szybkość akwizycji obrazu została dodatkowo zwiększona dzięki wprowadzeniu naukowych kamer z komplementarnym półprzewodnikiem tlenku metalu (sCMOS), zwłaszcza w porównaniu z istniejącymi kamerami EMCCD. Zmiany te spowodowały możliwą szybkość akwizycji obrazu wynoszącą jedną klatkę na sekundę dla głębokości próbkowania 1 μm (512 x 512 pikseli, 9 plasterków Z), co pozwoliło na monitorowanie dynamicznych zmian w komórkach, które zachodzą w ciągu kilku sekund16. Skrócenie czasu pozornej ekspozycji (wzbudzenia) na żywe komórki przy użyciu tej metody pozwala na uchwycenie rozszerzonych szeregów czasowych lub zwiększenie szybkości wychwytywania.
Tutaj opisujemy zastosowanie mikroskopii f3D-SIM do zbadania struktury i dynamicznego ruchu cytokinetycznego pierścienia Z w komórkach dwóch gatunków bakterii: modelowego organizmu w kształcie pręcika Bacillus subtilis i kokoidalnego ludzkiego patogenu Staphylococcus aureus. FtsZ jest białkiem cytoszkieletu podobnym do tubuliny, które odgrywa kluczową rolę w podziale komórek u bakterii17,18. Lokalizuje się w miejscu podziału, aby zrekrutować co najmniej 20 innych białek podziałowych, tworząc aparat podziału17,18 i uważa się, że zapewnia siłę do zwężenia komórki19-23. Metoda ta ujawnia, że FtsZ jest niejednorodnie rozmieszczony wokół pierścienia Z w obu organizmach w układzie podobnym do koralików; rozwiązując długo utrzymywany problem, czy pierścień Z jest ciągłym, jednolitym pasem wokół komórki, jak to uwidoczniono za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej o szerokim polu, czy też nieciągłą strukturą, jak sugeruje kriotomografia elektronowa (ECT)24. Pokazujemy, w jaki sposób możliwości 3D-SIM mogą znacznie poprawić badanie przestrzenne maleńkich (o średnicy 1 μm) okrągłych komórek, takich jak S. aureus, które dzielą się w trzech kolejnych prostopadłych płaszczyznach (x,y,z). Badania poklatkowe wykorzystujące te techniki pokazują, że struktura pierścienia Z jest dynamiczna, z dużymi zmianami organizacyjnymi w pierścieniu, a nie cząsteczkami FtsZ poruszającymi się do i z nieruchomego rusztowania24.

<table><tbody><tr><td>Agaroza I (klasa biotecnologiczna)</td><td>AMRESCO</td><td>0710-500G</td><td>Służy do budowy 2% wafor agarozowych. Użyj kuchenki mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę w pożywkach wzrostowych.</td></tr><tr><td>Dibromek N-(3-trietyloamoniopropylo)-4-(6-(4-(dietyloamino)fenylo)heksatrienylo)pirydyny dibromek (FM 4-64)</td><td>Life Technologies</td><td>T-13320</td><td>Barwnik lipofilowy stosowany do barwienia błon komórkowych.</td></tr><tr><td>Mikroprobówka 1,5 ml, z dyplomem</td><td>Specjalności Przyrodnicze Inc.</td><td>1210-00</td><td>Wykonany z homopolimeru polipropylenu, używany do zbierania komórek bakteryjnych przed umieszczeniem ich na podkładkach agarozowych w celu wizualizacji.</td></tr><tr><td>Baza bulionowa Luria, Miller</td><td>BD</td><td>241420</td><td>Przygotowana zgodnie z instrukcją producenta. Dodaj 2% agarozy po autoklawowaniu.</td></tr><tr><td>BBL Bulion do oznaczania antybiotyków, Pożywka antybiotykowa 3</td><td>BD</td><td>210932</td><td>Przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta.</td></tr><tr><td>Ramka samoprzylepna</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>ABGAB-0577</td><td>Znana jako Gene Frame z tą firmą. Służy do przygotowania płatków agarozowych 2% (Wymiary: 15 x 16 mm).</td></tr><tr><td>Szkło pokrywy mikroskopu</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>111512-9</td><td>22 x 22 Nr 1 Grubość</td></tr><tr><td>Średnica 35 mm Szalka Petriego ze szklanym dnem szkiełka nakrywkowego</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>FD35-100</td><td>Znany jako FluoroDish z tą firmą. Danie: &Oslash; 35 mm, Szkło: &Oslash; 23 mm, Grubość szkła: 0,17 mm, niepirogenny</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-25G</td><td>Przygotuj 10 mg/ml zapasu w 95% etanolu.</td></tr><tr><td>Chlorowodorek linkomycyny</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>L6004-5MU</td><td>Przygotować zapas 25 mg/ml w 50% etanolu.</td></tr><tr><td>Erytromycyna</td><td>Boehringer Mannheim GmbH</td><td>12390120-14</td><td>Przygotuj zapas 10 mg/ml w 95% etanolu.</td></tr><tr><td>Połączona orbitalno-liniowa kąpiel wodna z wytrząsaniem</td><td>Grant scientific Instruments</td><td>OLS-200</td><td>Prędkość wytrząsania stosowana do hodowli: spektrofotometr UV widzialny 215 obr./min</td></tr><tr><td></td><td>Shimadzu</td><td>UV-1601</td> o <td>długości fali 600 nm został użyty do pomiaru gęstości optycznej kultur bakteryjnych.</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>Granulki kultur bakteryjnych uzyskano poprzez odwirowanie średnio rosnących kultur z prędkością 8 000 obr./min przez 30 sekund.</td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td>Przed użyciem przygotować 1 M wywar i przefiltrować sterylizację.</td></tr><tr><td>oprogramowanie softWoRx</td><td>Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td><td>wersja 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych Imaris</td><td>Bitplane Scientific Software, Bitplane AG</td><td>wersja 7.0.0</td><td>Matlab XTensions zawierało</td></tr><tr><td>system obrazowania DeltaVision OMX 3D-SIM wyposażony w moduł Blaze.</td><td>Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td><td></td><td>Moduł Blaze zamontowany w OMX V3</td></tr><tr><td>Pionowy mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss Axioplan 2</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie cytokinetycznego pierścienia z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3d (f3d-sim)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Obrazowanie próbek biologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej znacznie się rozwinęło dzięki nowym technologiom, które pozwalają na pokonanie bariery rozdzielczości dyfrakcji światła, co pozwala na uzyskanie superrozdzielczości żywych próbek. Obecnie istnieją trzy główne rodzaje technik super-rozdzielczości – wymuszone zubożenie emisji (STED), mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek (w tym techniki takie jak PALM, STORM i GDSIM) oraz mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM). Podczas gdy techniki lokalizacji STED i pojedynczych cząsteczek wykazują największy wzrost rozdzielczości, są one wolniejsze, oferując większą szybkość akwizycji obrazu. Trójwymiarowa karta SIM (3D-SIM) to technika mikroskopii fluorescencyjnej o szerokim polu widzenia, która oferuje szereg zalet zarówno w porównaniu z lokalizacją pojedynczych cząsteczek, jak i STED. Rozdzielczość jest poprawiona, z typową rozdzielczością boczną i osiową odpowiednio 110 i 280 nm oraz głębokością próbkowania do 30 μm z szkiełka nakrywkowego, co pozwala na obrazowanie całych komórek. Najnowsze osiągnięcia (szybkie 3D-SIM) w technologii zwiększającej szybkość przechwytywania surowych obrazów pozwalają na szybkie uchwycenie procesów biologicznych zachodzących w ciągu kilku sekund, przy jednoczesnym znacznym ograniczeniu fototoksyczności i fotowybielania. Tutaj opisujemy zastosowanie jednej z takich metod do obrazowania komórek bakteryjnych zawierających znakowane fluorescencyjnie cytokinetyczne białko FtsZ, aby pokazać, w jaki sposób komórki są analizowane i rodzaj unikalnych informacji, które może dostarczyć ta technika.

Czasoprzestrzenne informacje o dynamicznych białkach wewnątrz żywych komórek są kluczowe dla zrozumienia biologii. Rodzaj mikroskopii superrozdzielczej, zwany szybką mikroskopią oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM), ujawnia unikalne informacje na temat cytokinetycznego pierścienia Z u bakterii: zarówno jego wygląd podobny do koralików, jak i szybką dynamikę FtsZ w pierścieniu.

Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja dynamicznych zmian w białku FTSZ podczas podziału komórek bakterii. Osiąga się to poprzez naniesienie komórek Bacillus subtilis wykazujących ekspresję fuzji FTSZ-GFP na powierzchnię małej podkładki agarowej. Następnie podkładkę odwraca się i przenosi do szalki Petriego z dnem z przeszklonego zakrycia.Drugim krokiem jest wykonanie obrazowania time-lapse bakterii podczas podziału komórkowego przy użyciu systemu mikroskopii strukturalnej iluminacji 3D lub systemu obrazowania 3D SIM. Następnie oceniana jest jakość surowych danych, a obrazy z większym niż 30% spadkiem intensywności spowodowanym fotoblaknięciem są odrzucane. Ostatnim krokiem jest ilościowa analiza zmian w lokalizacji białka podczas podziału komórkowego poprzez pomiar rozkładu intensywności fluorescencji białka F-T-S-Z-G-F-P w czasie.W ostateczności szybka mikroskopia SIM 3D jest wykorzystywana do wykazania dynamiki białek dione podczas podziału komórek bakterii. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna, jest uzyskanie trójwymiarowych informacji o zmianach zachodzących podczas podziału komórek w żywych organizmach. Chociaż metoda ta pozwala na wgląd w cytokinezę bakteryjną, może ona zostać zastosowana również w innych układach, w których chcemy badać dynamiczne zmiany białek, takich jak komórki ssaków.Pomysł ten pojawił się u nas po zaobserwowaniu, że tradycyjne obrazy 3D sym utrwalonych komórek bakteryjnych wykazują niejednorodny rozkład białka FDZ wokół pierścienia Zed. Chcieliśmy sprawdzić, czy rozkład ten jest powiązany ze zmianami zachodzącymi podczas zwężania się pierścienia Zed. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką napotykają trudności z powodu niedopasowania współczynnika refrakcji oleju do próbki, co prowadzi do uzyskania obrazów słabej jakości.Aby przygotować komórki bacillus subtilis do obrazowania, należy hodować je do środkowej fazy wykładniczej, zgodnie ze szczegółowym opisem w protokole tekstowym. Następnie należy przymocować ramkę klejącą do standardnego szkiełka przedmiotowego, usuwając najpierw cienką folię poliestrową. Następnie nanosi się odsłoniętą powierzchnię klejącą ramki na powierzchnię szkiełka przedmiotowego, aby utworzyć kwadratową komorkę na górze szkiełka; grubą folię poliestrową należy pozostawić przymocowaną do ramki, aby zapobiec przywieraniu szkiełka nakrywkowego w kolejnych krokach.Następnie rozpuścić roztwór ARO w mikrofalówce aż do wrzenia, a następnie pipetować 67 µL roztopionego ARO do ramki adhezyjnej. Natychmiast nałożyć na ARO szkiełko nakrywkę, aby stworzyć płaską powierzchnię, i pozostawić w temperaturze pokojowej na od 5 do 10 minut. Zdjąć szkiełko nakrywkowe na jedną do dwóch minut w czasie pobierania próbki.Pobierz jedną mililitrową alikwot próbki po wirowaniu przy 8,000 RPM przez określony czas, odlej nadsącz, a osad resuspenduj w 200 µL świeżej pożywki. Pobierz 2.5 µL skoncentrowanej próbki i nanieś pipetą na wcześniej przygotowaną podkładkę aros. Rozprowadź próbkę równomiernie po płaskiej powierzchni podkładki aros.Następnie za pomocą pęsety usuń ramkę z klejem z szkiełka mikroskopowego, nie dotykając podkładki aros. Przenieś podkładkę aros ze szkiełka mikroskopowego do szalki Petriego o średnicy 35 mm z szklanym dnem z pokrywy.W celu obrazowania o wysokiej rozdzielczości należy odwrócić podkładkę aros tak, aby zawiesina komórkowa stykała się z szkiełkiem podstawowym szalki Petriego. W dniu eksperymentu należy włączyć system obrazowania OMX 3D SIM co najmniej na godzinę przed rozpoczęciem pracy, aby system i lasery mogły w pełni się ustabilizować.Następnie włącz poszczególne komponenty zgodnie z listą w protokole tekstowym na stacji roboczej sterownika głównego. Otwórz oprogramowanie OMX, klikając ikonę. Ustaw ścieżkę zapisu plików w odpowiednim folderze danych.Następnie uruchom oprogramowanie SoftWork. Na głównym ekranie, w sekcji parametrów światła, włącz lasery wymagane do przeprowadzenia eksperymentów. Z listy wyboru kanałów aktywuj kamerę FITC, a następnie sprawdź parametry zgodnie z listą zamieszczoną w protokole tekstowym.Nanieś kroplę oleju na górną część obiektywu. Umieść szalkę Petriego z przygotowanymi komórkami w uchwycie stolika i przykryj okrągłą pokrywą grzewczą. Obniżaj stolik, aż olej dotknie dna szalki Petriego z próbką.Pozostaw szalkę na 15 minut w celu wyrównania temperatury. Na etapie wykorzystania niskiej ekspozycji, ustaw ostrość na próbce, korzystając z elementów sterujących nano-pozycjonerem stołu. Przesuwaj płaszczyznę ostrości w górę i w dół przez próbkę, aby sprawdzić, czy światło rozkłada się równomiernie powyżej i poniżej płaszczyzny ogniskowej próbki. Następnie, stosując krok 0,5 micron, zaznacz górną i dolną granicę stosu obrazów, a przed powrotem do środka próbki w zakładce eksperymentu, kliknij przycisk „get thickness”, aby ustawić grubość akwizycji próbki.Wyznacz maksymalną wartość intensywności obrazu próbki przy aktualnych ustawieniach czasu ekspozycji i procentowej transmitancji światła. Wartość ta znajduje się poniżej okna obrazu. W przypadku obrazowania poklatkowego (time-lapse) dostosuj czas ekspozycji oraz procentową transmitancję światła, aby uzyskać maksymalną intensywność w zakresie od 1100 do 1400.Powyżej tła. Aby uzyskać obraz, aktywuj sekcję poklatkową (time lapse) w zakładce eksperymentu. Ustaw wymaganą liczbę klatek na sekundę oraz całkowity czas w pliku danych.Wprowadź odpowiednią nazwę pliku. Kliknij przycisk uruchamiania, aby rozpocząć akwizycję obrazu. Odnotuj maksymalną wartość intensywności obrazu na początku akwizycji dla pierwszej klatki serii czasowej.Po zakończeniu akwizycji pierwszej klatki należy sprawdzić, czy spadek intensywności sygnału w Zack dla tej klatki nie przekroczył 10%. Po zakończeniu akwizycji serii czasowej należy otworzyć wynikowy surowy plik obrazu z rozszerzeniem DV i określić spadek maksymalnej intensywności sygnału od początku serii czasowej do ostatniego obrazu. W menu procesu należy odrzucić wszystkie punkty czasowe, w których fotoblaknięcie przekroczyło 30%, a następnie aktywować okno rekonstrukcji SI.Użyj istniejących ustawień dla wszystkich parametrów. Aktywuj przycisk OTF specyficzny dla używanego kanału i ustaw standardowy zestaw filtrów. Aktywuj przycisk kątów KO specyficzny dla używanego kanału i ustaw standardowy zestaw filtrów.Przeciągnij i upuść surowy plik w obszarze pliku wejściowego. Kliknij przycisk „do it”. Przeanalizuj rozkład FTSZ wokół pierścienia Z, aby utworzyć trójwymiarowe wykresy intensywności.Następnie otwórz plik z obrazem 3D. Aby wyświetlić poszczególne przekroje w osi z, użyj narzędzia do przeglądania wolumetrycznego znajdującego się w zakładce menu widoku.Aby wyciąć obszar zainteresowania, wprowadź numer okna dla tego obrazu 3D w oknie wejściowym, a w oknie wyjściowym wprowadź nowy, niewykorzystany numer okna. Przycisk wyboru obszaru zostanie aktywowany, umożliwiając wycięcie pojedynczej pierścieniowej warstwy Z z oryginalnego pola widzenia o wymiarach 40 na 40 mikronów. W zakładce rotacji dostosuj żądaną oś oraz stopień obrotu.Kliknij przycisk do wykonania czynności. Przewiń przez wolumen, aby uzyskać pożądaną perspektywę pierścienia Z. Użyj narzędzia inspektora danych, aby dostosować wymiary wierszy i kolumn i utworzyć nowy obszar zainteresowania wokół pojedynczego pierścienia Z.Kliknij środek obrazu, aby ustawić ten nowy obszar zainteresowania. Dane obrazowe w formie tekstu to automatycznie generowana tabela, która wyświetla intensywność fluorescencji każdego piksela w obrębie obszaru zainteresowania. Kliknij przycisk wykresu 3D, aby wstępnie wyświetlić wykres intensywności.Alternatywnie dane obrazu w formie tekstowej można wyeksportować, klikając przycisk zapisu danych tabeli. W menu plików skopiuj dane obrazu z zapisanego pliku tekstowego do nowego arkusza kalkulacyjnego. Zaznacz wszystkie komórki w arkuszu i utwórz nowy trójwymiarowy wykres powierzchniowy.Sformatuj wykres 3D intensywności dla danych time-lapse do publikacji. Powtórz te kroki dla każdego z różnych punktów czasowych z pliku obrazu 3D. W przypadku wizualizacji za pomocą konwencjonalnej fluorescencyjnej mikroskopii szerokopolowej, pierścień Z w bacillus subtles pojawia się jako pojedynczy poprzeczny pas fluorescencji.Intensywność fluorescencji w całym tym pasmie jest jednolita. Wzorzec lokalizacji dostarcza niewielkich informacji na temat organizacji strukturalnej i rozkładu polimerów FTS w obrębie pierścienia; tutaj badane są te same komórki. Zastosowano metodę FAST 3D sim.Obrót trójwymiarowego obrazu symulacji wokół osi Z umożliwia wizualizację pierścienia Z jako rzeczywistej struktury pierścieniowatej w przestrzeni trójwymiarowej. Poprawa rozdzielczości pozwala na wizualizację niejednorodnego rozkładu FTSZ w obrębie pierścienia. Dodatkowe przykłady pierścieni Z u Bacillus wizualizowane za pomocą tej techniki ilustrują, że intensywność fluorescencji wokół pierścienia Z nigdy nie jest jednolita.Ponadto obserwuje się obszary o bardzo niskiej intensywności fluorescencji lub przerwy. Aby ilościowo ocenić te spostrzeżenia, utworzono trójwymiarowe wykresy intensywności pierścienia Z. Wykresy intensywności wykazują, że poziom fluorescencji może różnić się nawet czterokrotnie w różnych regionach pierścienia Z Bacillus subtilis.Wykresy intensywności 3D pokazują, że w przerwach poziomy fluorescencji tła są niemal zbliżone do linii bazowej, co pozwala analizować dynamiczne zmiany zachodzące w obrębie pierścienia Z. W czasie przeprowadzono obrazowanie poklatkowe 3D sim. Film ten przedstawia ciągłe zmiany FTSZ w pierścieniu Z bakterii Bacillus subtilis, które są mierzone za pomocą wykresu intensywności generowanego dla każdego obrazu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak hodować i przygotowywać komórki bakteryjne, jak obrazować je przy użyciu 3D Sim, jak analizować je w celu uzyskania danych ilościowych, a na koniec, jak przygotować obrazy o jakości prezentacyjnej. Podczas akwizycji obrazów bardzo ważne jest monitorowanie stanu zdrowia komórek, a także poziomu ekspresji białka fluorescencyjnego w trakcie procesu obrazowania. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę innym badaczom w dziedzinie biologii komórek bakteryjnych do stosowania innych metod mikroskopii superrozdzielczej i lokalizacji innych białek bakteryjnych w różnych organizmach.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne formy mikroskopii superrozdzielczej, takie jak mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanej, aby przeanalizować dynamiczne zmiany białka FDS w czasie.

super-resolution-imaging-cytokinetic-z-ring-live-bacteria-using-fast

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Super-rozdzielcze obrazowanie pierścienia cytokinetycznego Z w żywych bakteriach za pomocą szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

Opisujemy metodę obrazowania w super-rozdzielczości, aby zbadać strukturalną organizację bakteryjnego pierścienia FtsZ, niezbędnego aparatu do podziału komórek.  Metoda ta opiera się na analizach ilościowych obrazów z mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) i może być stosowana do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu.

Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Żywotność komórek zależy od szybkiego i skutecznego radzenia sobie z nieprawidłowym fałdowaniem białek.  W tym miejscu opisujemy metodę wizualizacji różnych potencjalnych losów nieprawidłowo sfałdowanego białka: ponownego fałdowania, degradacji lub sekwestracji w inkluzjach. Demonstrujemy zastosowanie czujnika składania, Ubc9ts, do monitorowania proteostazy i kontroli jakości agregacji w żywych komórkach za pomocą mikroskopii 4D.

Obrazowanie 4D agregacji białek w żywych komórkach

Ten artykuł opisuje działający protokół obrazowania kolców dendrytycznych z neuronów hipokampa in vitro za pomocą Mikroskopii Iluminacji Strukturalnej (SIM). Mikroskopia superrozdzielcza wykorzystująca SIM zapewnia rozdzielczość obrazu znacznie wykraczającą poza granicę dyfrakcji światła we wszystkich trzech wymiarach przestrzennych, umożliwiając obrazowanie pojedynczych kolców dendrytycznych z większą szczegółowością.

Obrazowanie kolców dendrytycznych pierwotnych neuronów hipokampa szczura za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Ten artykuł zawiera szczegółowy przewodnik po montażu i obsłudze mikroskopu z oświetleniem strukturalnym działającym z pełnym wewnętrznym odbiciem fluorescencyjnym (TIRF-SIM) do obrazowania dynamicznych procesów biologicznych z optyczną superrozdzielczością w wielu kolorach.

Przewodnik po oświetleniu strukturalnym Mikroskopia TIRF z dużą prędkością i wieloma kolorami

Ostatnio zmapowaliśmy trójwymiarowe (3D) przestrzenne lokalizacje tras transportowych dla różnych białek przemieszczających się wewnątrz rzęsek pierwotnych w żywych komórkach. W tym artykule szczegółowo opisano konfigurację eksperymentalną, proces pobierania próbek biologicznych i analizy danych dla podejścia do obrazowania fluorescencji 3D o wysokiej rozdzielczości, nowo zastosowanego w żywych rzęskach pierwotnych.

Zastosowanie szybkiej mikroskopii superrozdzielczej SPEED w żywej rzęsce pierwotnej

Tutaj opisujemy metodę fotowybielania w celu zmniejszenia autofluorescencji sinic. Po fotowybielaniu stosuje się stochastyczną mikroskopię rekonstrukcji optycznej w celu uzyskania trójwymiarowych obrazów pierścienia FtsZ cyjanobakterii o wysokiej rozdzielczości.

Fotowybielanie umożliwia obrazowanie pierścienia FtsZ w Cyanobacterium prochlorococcus w superrozdzielczości

Ten protokół opisuje analizę fluorescencyjnie znakowanych przedziałów wewnątrzkomórkowych w pączkujących drożdżach za pomocą wielokolorowej mikroskopii konfokalnej 4D (time-lapse 3D). Parametry obrazowania dobierane są tak, aby wychwycić odpowiednie sygnały przy jednoczesnym ograniczeniu fotouszkodzeń. Niestandardowe wtyczki ImageJ umożliwiają śledzenie oznaczonych struktur i analizę ilościową.

Mikroskopia 4D drożdży

Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakterii do trójwymiarowego obrazowania na żywo oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów.

Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Poznaj dynamikę pierścienia Z w bakteriach Bacillus subtilis przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D. Ta metoda pozwala obserwować zmiany białka FtsZ podczas podziału komórkowego z superrozdzielczością.

Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM) (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

Przeglądaj więcej filmów