Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja dynamicznych zmian w białku FTSZ podczas podziału komórkowego u bakterii. Osiąga się to poprzez zastosowanie subtelnych komórek Bacillus wyrażających fuzję FTS wspomnianej GFP na powierzchni małego podkładki aros. Podkładka jest następnie odwracana i przenoszona na szalkę Petriego ze szklanym dnem pokrytym.

Drugim krokiem jest uzyskanie poklatkowych obrazów bakterii podczas podziału komórki za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D lub systemu obrazowania 3D SIM. Następnie oceniana jest jakość surowych danych, a obrazy o ponad 30% spadku intensywności z powodu fotowybielania są odrzucane. Ostatnim krokiem jest ilościowa analiza zmian w lokalizacji białka podczas podziału komórki poprzez pomiar rozkładu intensywności fluorescencji białka F-T-S-Z-G-F-P w czasie.

Ostatecznie szybka karta SIM 3D służy do pokazania, jak dynamiczne są białka dionu podczas podziału komórek u bakterii. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi technikami, takimi jak mikroskopia konfokalna, jest to, że otrzymujemy trójwymiarowe informacje o zmianach, które zachodzą w podziale komórek w żywych komórkach. Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w cytokinezę bakteryjną, można ją również zastosować do innych systemów, w których chcemy przyjrzeć się dynamicznym zmianom białek, takim jak komórki ssaków M.

Po raz pierwszy wpadliśmy na ten pomysł, gdy zobaczyliśmy, że tradycyjne obrazy symulacyjne 3D utrwalonych komórek bakteryjnych wykazały, że białko FDZ nie było jednorodnie rozmieszczone wokół pierścienia zed. Chcieliśmy dokładniej zbadać, czy ten rozkład jest związany ze zmianami, które zaszły podczas zwężenia pierścienia Zeda. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej technice, będą miały trudności z powodu niedopasowania współczynnika załamania światła oleju do próbki, a to doprowadzi do niskiej jakości obrazów.

Aby przygotować najsubtelniejsze komórki Bacillus do obrazowania, hoduj komórki do połowy fazy wykładniczej, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie przymocuj samoprzylepną ramkę do standardowego szklanego szkiełka mikroskopowego, najpierw usuwając cienki arkusz poliestru. Następnie nałóż odsłoniętą powierzchnię klejącą ramy na powierzchnię szkiełka mikroskopowego, aby skutecznie utworzyć kwadratową studzienkę na wierzchu szkiełka, pozostaw gruby arkusz poliestru przymocowany do ramy, aby zapobiec przywieraniu szkiełka nakrywkowego w kolejnych krokach.

Następnie rozpuść roztwór aro w kuchence mikrofalowej, aż do wrzenia, odpipetuj 67 mikrolitrów stopionego aros do ramki klejącej. Natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu aros, aby uzyskać płaską powierzchnię i pozostaw w temperaturze pokojowej na pięć do 10 minut. Zdjąć szkiełko nakrywkowe na jedną do dwóch minut podczas pobierania próbki.

Zebrać jedną mililitrową porcję próbki po odwirowaniu przy 8 000 obr./min przez sekundy, dekantować supernatant, ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach świeżej pożywki. Pobrać 2,5 mikrolitra zagęszczonej próbki i odpipetować na wcześniej przygotowaną podkładkę aros. Rozprowadzić próbkę równomiernie wzdłuż płaskiej powierzchni podkładki aros.

Następnie zdejmij ramkę samoprzylepną ze szkiełka mikroskopowego za pomocą pęsety, nie dotykając podkładki aros. Przenieś podkładkę aros z mikroskopu. Przesuń na szalkę Petriego o średnicy 35 milimetrów ze szklanym dnem pokryciowym.

Do obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Odwrócić podkładkę Aros tak, aby zawiesina komórek stykała się ze szkiełkiem nakrywkowym płytki Petriego. W dniu eksperymentu włącz system obrazowania OMX 3D SIM co najmniej godzinę przed obrazowaniem, aby umożliwić pełną stabilizację systemu i laserów.

Następnie włącz różne komponenty wymienione w protokole tekstowym na stacji roboczej kontrolera głównego. Otwórz oprogramowanie OMX, klikając ikonę. Ustaw ścieżkę pliku do zapisania danych w odpowiednim folderze danych.

Następnie uruchom oprogramowanie do pracy miękkiej. Włącz lasery wymagane do eksperymentów na ekranie głównym w sekcji parametrów światła. Aktywuj kamerę FITC od wyboru kanału i przejdź do sprawdzania parametrów zgodnie z protokołem tekstowym.

Nałóż kroplę olejku na górną część obiektywu. Umieścić próbkę na płytce Petriego zawierającą przygotowane komórki we wstawce stolika i przykryć okrągłą pokrywką do podgrzewania. Obniżyć stolik do momentu, gdy olej dotknie dna płytki Petriego próbki.

Pozwól naczyniu się nagrzać, zrównoważyć przez 15 minut Na stoliku przy ustawieniu niskiej ekspozycji skup się na próbce, korzystając z elementów sterujących nano position. Ustaw ostrość w górę i w dół przez próbkę, aby określić, czy światło jest równomiernie rozprowadzane powyżej i poniżej płaszczyzny ogniskowej próbki. Następnie użyj rozmiarów kroku 0,5 mikrona i zaznacz górną i dolną część stosu obrazów przed powrotem do środka próbki w zakładce eksperymentu, kliknij przycisk Pobierz grubość, aby ustawić grubość pobieranej próbki.

Określ maksymalną wartość intensywności przykładowego obrazu przy użyciu bieżących ustawień ekspozycji i procentu przepuszczalnego światła. Ta wartość znajduje się poniżej okna obrazu. W przypadku obrazowania poklatkowego dostosuj ekspozycję i procent przepuszczanego światła, aby uzyskać maksymalną intensywność od 1100 do 1400.

Nad tłem. W przypadku obrazu aktywuj sekcję poklatkową na karcie eksperymentu. Ustaw wymaganą liczbę klatek na sekundę i łączny czas w pliku danych.

Wprowadź odpowiednią nazwę pliku. Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć pobieranie obrazu na początku pobierania obrazu. Zwróć uwagę na maksymalną wartość intensywności obrazu na początku akwizycji obrazu dla pierwszej klatki szeregu czasowego.

Pod koniec akwizycji pierwszej ramki sprawdź, czy nie nastąpił większy niż 10% spadek intensywności sygnału przez Zack dla tej pierwszej ramki. Pod koniec akwizycji szeregów czasowych otwórz wynikowy plik obrazu RAW z sufiksem DV i upewnij się, że od początku szeregu czasowego do końcowego obrazu zmniejszyła się maksymalna intensywność sygnału. Odrzuć wszystkie punkty czasowe, w których nastąpiło więcej niż 30% wybielania zdjęć z menu procesu, aktywuj okno rekonstrukcji SI.

Użyj istniejących ustawień dla wszystkich parametrów. Aktywuj przycisk OTF specyficzny dla używanego kanału i ustaw na standardowy zestaw filtrów. Aktywuj przycisk kątów KO specyficznych dla używanego kanału i ustaw na standardowy zestaw filtrów.

Przeciągnij i upuść plik RAW do przestrzeni plików wejściowych. Kliknij przycisk Zrób to. Zbadaj rozkład FTSZ wokół pierścienia Z, aby utworzyć wykresy intensywności 3D.

Następnie otwórz plik obrazu 3D. Wyświetlanie poszczególnych plasterków z. Użyj narzędzia przeglądarki woluminów znajdującego się na karcie menu widoku.

Aby przyciąć obszar zainteresowania, wprowadź numer okna dla tego obrazu 3D w oknie wejściowym i wprowadź nowy i nieużywany numer okna w oknie wyjściowym. Przycisk wyboru regionu stanie się dostępny, aby przyciąć pojedynczy pierścień Z z oryginalnego pola widzenia 40 na 40 mikronów. Dostosuj żądaną oś i stopień obrotu w zakładce obrót.

Kliknij przycisk Zrób to. Przewiń wolumin, aby uzyskać żądaną perspektywę, pierścień Z. Użyj narzędzia Inspektor danych, aby dostosować wymiary wiersza kolumny w celu utworzenia nowego obszaru zainteresowania wokół pojedynczego pierścienia Z.

Kliknij środek obrazu, aby ustawić ten nowy obszar zainteresowania. Dane obrazu tekstowego są automatycznie generowaną tabelą, która wyświetla intensywność fluorescencji każdego piksela w obszarze zainteresowania. Kliknij przycisk Wykres 3D, aby początkowo wyświetlić wykres intensywności.

Alternatywnie dane obrazu tekstowego można wyeksportować, klikając przycisk Zapisz dane tabeli. W menu Plik skopiuj dane obrazu z zapisanego pliku tekstowego do nowego arkusza kalkulacyjnego. Zaznacz wszystkie komórki w arkuszu kalkulacyjnym i utwórz nowy wykres powierzchni 3D.

Sformatuj wykres intensywności 3D do publikacji dla danych poklatkowych. Powtórz te kroki dla każdego z różnych punktów czasowych z pliku obrazu 3D. Po uwidocznieniu za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej szerokokątnego, pierścień Z pojawia się jako pojedyncze poprzeczne pasmo fluorescencji w subtelnych pałeczkach.

Intensywność fluorescencji w całym tym paśmie jest jednolita. Wzorzec lokalizacji daje niewielki wgląd w organizację strukturalną i rozmieszczenie FTS, wspomnianych polimerów w pierścieniu, tutaj badane są te same komórki. Korzystanie z metody FAST 3D sim.

Obrót obrazu symulatora 3D wokół osi Z umożliwia wizualizację pierścienia Z jako prawdziwej struktury pierścieniowej w przestrzeni trójwymiarowej. Poprawa rozdzielczości pozwala na wizualizację niejednorodnego rozkładu FTSZ w obrębie pierścienia. Dodatkowe przykłady pierścieni Bacillus Z zwizualizowanych za pomocą tej techniki ilustrują, że intensywność fluorescencji wokół pierścienia Z nigdy nie jest taka sama.

Ponadto obserwuje się obszary o bardzo niskiej intensywności fluorescencji lub przerwy. Aby określić ilościowo te obserwacje, stworzono wykresy intensywności 3D pierścienia Z. Wykresy intensywności pokazują, że ilość fluorescencji może zmieniać się nawet czterokrotnie w różnych obszarach najsubtelniejszego pierścienia Z pałeczki.

Wykresy intensywności 3D pokazują, że luki prawie odczytują podstawowe poziomy fluorescencji tła, aby przeanalizować dynamiczne zmiany zachodzące w pierścieniu Z. Z biegiem czasu wykonywany jest symat 3D. Ten film pokazuje, jak FTSZ w subtelnym pierścieniu Z Bacillus stale się zmienia i jest mierzony za pomocą wykresu intensywności, który jest generowany dla każdego obrazu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować i przygotowywać komórki bakteryjne, jak je obrazować za pomocą 3D Sim, jak je analizować w celu uzyskania danych ilościowych i wreszcie, jak zapewnić obrazy o jakości prezentacji. Bardzo ważne jest, aby podczas akwizycji obrazu monitorować stan zdrowia komórek, a także monitorować poziom ekspresji białka fluorescencyjnego podczas akwizycji po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę innym ludziom w dziedzinie biologii komórek bakteryjnych do stosowania innych metod mikroskopii superrozdzielczej i lokalizowania innych białek bakteryjnych w różnych organizmach.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne formy mikroskopii super rozdzielczości, takie jak mikroskopia lokalizacyjna aktywowana zdjęciem, aby przyjrzeć się dynamicznym zmianom w białku FDS w czasie.