Name: Badanie pętli DNA za pomocą pojedynczej cząsteczki FRET (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Poznaj dynamikę pętlowania DNA za pomocą pojedynczej cząsteczki FRET bez białek wiążących. Ta metoda pozwala mierzyć prawdopodobieństwo pętlowania DNA w zależności od jego krzywizny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jamesowi Watersowi, Gable'owi Wadsworthowi i Bo Broadwaterowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Dziękujemy również czterem anonimowym recenzentom za przydatne komentarze. Dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony Georgia Institute of Technology, nagrodę Burroughs Wellcome Fund Career Award w Scientific Interface oraz grant studenckiej sieci badawczej od NSF Physics of Living Systems.

1. Przygotowanie próbki dsDNA
<ol>
	<li>Projektuj globalnie zakrzywione DNA, powtarzając sekwencję 10-merową. Na przykład 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCCX)7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3' jest zakrzywionym DNA o długości 186 pz, gdzie X jest losową dodatkową zasadą, a sekwencja flankująca powtarzającą się sekwencję 10-merową to sekwencje adapterowe. 
	UWAGA: W tym przykładzie dwa 10-mery o przeciwnych preferencjach do tworzenia nukleosomów na podstawie wielkoskalowego badania zajętości nukleosomów przeprowadzonego przez Kaplana i wsp.Wybrano 15 osób. Ponieważ powtórzenie spiralne dsDNA jest bliskie 10 pz, każde odchylenie netto osi spiralnej 10-mera będzie się kumulować, tworząc kształt przypominający łuk kołowy (ryc. 3A). Ponieważ okres spiralny jest bliższy 10,5 pz, po każdych dwóch powtórzeniach wstawiana jest dodatkowa podstawa, aby zakrzywiona struktura była jak najbardziej płaska. Te sekwencje krótsze niż 200 pz można zamówić w firmach oferujących usługę syntezy genów. Wygodnie jest oskrzydlić te sekwencje wspólnymi sekwencjami adaptera dla kolejnych kroków. Procedura jest schematyzowana na rysunku 3B.</li>
	<li>Przeprowadzić PCR ze starterem 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) i starterem 2 (/5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). UWAGA: Podkład 2 jest oznaczony donorem FRET Cy3 na końcu 5'. Typowy przepis PCR i protokół cykliczny przedstawiono w tabelach 1 i 2.</li>
	<li>Wykonaj PCR z Primerem 3 (/5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) i Primerem 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). UWAGA: Podkład 3 jest oznaczony akceptorem FRET Cy5 przez szkielet i łącznik biotyny na końcu 5'. Przepis PCR i protokół rowerowy są jak powyżej.</li>
	<li>Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR.</li>
	<li>Wymieszać produkt znakowany Cy3 i produkt znakowany Cy5 w buforze do wymiany nici (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA) w końcowych stężeniach odpowiednio 0,4 μM i 0,1 μM. UWAGA: Nadmiar Cy3-DNA zwiększa stężenie dupleksu przenoszącego zarówno Cy3, jak i Cy5 w wyniku wymiany nici.</li>
	<li>Wymieniać pasma przez inkubację w temperaturze 98,5 °C przez 2 minuty, stopniowe schładzanie do 5 °C z szybkością narastania 0,1 °C/s i inkubację w temperaturze 5 °C przez 2 godziny.</li>
</ol>
2. Elektroforeza żelowa do wykrywania krzywizny dsDNA
<ol>
	<li>Wlać żel poliakryloamidowy16,17, mieszając roztwory akrylamidu i bis-akrylamidu w stosunku 29,2:0,8, 5% (w/v) w 1X bufor Tris/Boran/EDTA (TBE) o pH 8,0. Uwaga: 10 ml roztworu żelu zawiera: 1,217 ml 40% akrylamidu, 0,667 ml 2% bis-akrylamidu, 1 ml TBE 10X, 100 L nadsiarczanu amonu (APS) 10%, 10 L TEMED, a reszta todH2O. Pełne zestalenie żelu trwa około 30 min.</li>
	<li>Załaduj żel poliakryloamidowy próbkami DNA i drabinką DNA do buforu 1X ładującego (5% glicerolu, 0,03% (w/v) błękitu bromofenolowego) i uruchom żel przy 5-8 V/cm w 4 °C przez 45 minut lub do momentu, gdy czoło barwnika zbliży się do końca żelu.</li>
	<li>Wybarwić żel za pomocą 1X buforu TBE, który zawiera 0,5 g/ml bromku etydyny przez 30 minut. Zidentyfikuj prążki DNA pod wpływem światła UV. Porównaj pozycje prążków ze znacznikiem wielkości (drabinka DNA 100 pz), aby obliczyć pozorne rozmiary cząsteczek DNA. UWAGA: Zakrzywione DNA na ogół poruszają się wolniej niż proste DNA.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komory przepływowej
<ol>
	<li>Wywierć 6-7 par otworów wzdłuż dwóch przeciwległych krawędzi szkiełka (3'' x 1'') za pomocą wiertarki i wierteł diamentowych. Po wierceniu przetrzyj szkiełko w płynącej wodzie, aby usunąć widoczny proszek szklany. UWAGA: Otwory służą jako wloty i wyloty perfuzji. Podczas wiercenia ważne jest chłodzenie szkiełka wodą, aby zapobiec pękaniu.</li>
	<li>Umieść szkiełka pionowo w szklanym słoiku i napełnij go wodą. Sonikuj przez 15 minut i przenieś je do innego szklanego słoika przeznaczonego do czyszczenia acetonem. Napełnij go acetonem i sonikuj przez 15 minut. Przepłukać szkiełka alkoholem etylowym za pomocą butelki z rozpylaczem, a następnie wodą. Umieść je w słoiku z polipropylenu, napełnij go 5 M wodorotlenkiem potasu i sonikuj przez 15 minut. Na koniec poddaj szkiełka działaniu sonikacji w wodzie przez 15 minut. Szkiełka nakrywkowe (nr 1, 24 x 40 mm) należy oczyścić zgodnie z tym samym protokołem. UWAGA: Oczyszczone szkiełka podstawowe i nakrywkowe można przechowywać w dH2O do długotrwałego użytkowania.</li>
	<li>Zmieszać 1 mg biotyny-PEG-silanu (MW 3400) z 80 mg mPEG-silanu (MW 2000) w 340 l 0,1 M roztworu wodorowęglanu sodu. Dobrze wymieszaj i krótko odwiruj mieszaninę, aby pozbyć się pęcherzyków. UWAGA: Funkcjonalizacja powierzchni za pomocą glikolu polietylenowego (PEG) pomaga zmniejszyć niespecyficzne wiązanie DNA z powierzchnią.</li>
	<li>Umieść 80 l roztworu PEG na każdym szkiełku podstawowym i delikatnie opuść na nie szkiełko nakrywkowe. Odczekaj 45 min. Oddzielić szkiełko nakrywkowe od szkiełka pęsetą, spłukać je dużą ilościądH2Oi pozostawić do wyschnięcia na świeżym powietrzu.</li>
	<li>Umieść cienkie paski podwójnej taśmy klejącej w poprzek szkiełka, aby utworzyć kanały. Ułóż na nim szkiełko nakrywkowe i mocno dociśnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka, aby utworzyć płynoszczelne kanały. Użyj 5-minutowej żywicy epoksydowej, aby uszczelnić krawędzie kanałów.</li>
</ol>
4. Przygotowanie roztworu Trolox
<ol>
	<li>Umieścić ~30 mg Trolox i 10 ml dH2O w kolbie i za pomocą mieszadła magnetycznego mieszać roztwór na wolnym powietrzu przez 18 godzin.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm i dostosować pH do 7, dodając ~6 μl 1 M zasady Tris (pH 11). Uwaga: Trolox jest odczynnikiem zapobiegającym mruganiu, który jest powszechnie stosowany w badaniach nad pojedynczymi cząsteczkami18. Działanie przeciwblaknące leku Trolox wynika z jego utlenionej pochodnej, która jest obecna w częściowo zdegradowanym roztworze leku Trolox19. Należy unikać szybkiego rozpuszczania leku Trolox w metanolu lub roztworze Tris o wysokim pH ze względu na nieefektywne utlenianie.</li>
</ol>
5. Obrazowanie pojedynczych cząsteczek
<ol>
	<li>Wstrzyknąć 15 μl roztworu NeutrAwidyny (0,5 mg/ml) do kanału i odczekać 2 minuty przed przepłukaniem 100 μl buforu T50 (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,0).</li>
	<li>Wstrzyknąć 50 μl próbki DNA (50-100 pM) do kanału. Odczekaj 5 minut i spłucz niezwiązane DNA 100 l buforu T50. UWAGA: Cząsteczki DNA będą specyficznie wiązać się z powierzchnią poprzez interakcję NeutrAvidin-biotyna.</li>
	<li>Napełnij kanał buforem obrazowania, który zawiera system oczyszczania tlenu20 (100 mM PCD, 5 mM PCA, 1 mM Trolox i 500 mM NaCl).</li>
	<li>Ustaw EMCCD w trybie przesyłania klatek, aby przesyłać strumieniowo 2 x 2 obrazy z kosza (256 x 256) do komputera z prędkością 25 klatek na sekundę.</li>
	<li>Nałóż olejek immersyjny na obiektyw mikroskopu i zamocuj komórkę przepływową na stoliku mikroskopu za pomocą klipsów do próbek. Zgrubnie dostosuj ostrość, patrząc na wzór odbicia lasera na ścianie. Precyzyjnie wyreguluj ostrość, korzystając z podglądu na żywo obrazów fluorescencyjnych na monitorze.</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję danych przy włączonym laserze 532 nm. Sprawdź podgląd na żywo i w razie potrzeby wyreguluj ostrość. Zatrzymaj zbieranie danych, gdy większość cząsteczek uległa fotowybielaniu. 
	UWAGA: W tym obiekcie używany jest napisany w laboratorium program C do sterowania mikroskopem i wyświetlania obrazów na żywo na monitorze podczas ich zapisywania na dysku twardym.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie obrazów i analiza danych
UWAGA: Seria czasowa obrazów o wymiarach 256 x 256 jest przetwarzana przez kod MATLAB w celu wygenerowania śladów czasowych pojedynczej cząsteczki o intensywności Cy3 i Cy5. Aby sparować piksele między kanałem donorowym a kanałem akceptorowym obrazu w widoku podzielonym, ręcznie wybiera się 6-7 par plamek Cy3 i Cy5, z których każda pochodzi z tej samej cząsteczki równomiernie rozproszonej w polu widzenia, a transformacja afiniczna jest obliczana przy użyciu współrzędnych tych punktów jako punktów kontrolnych.
<ol>
	<li>Korzystając ze skryptu MATLAB, przejrzyj wszystkie ślady czasowe pojedynczej cząsteczki, które pokazują wiele przejść między niskimi i wysokimi sygnałami FRET. Zidentyfikuj stany zapętlone i niezapętlone. 
	UWAGA: Sygnał FRET definiuje się jako intensywność Cy5 (Ia) podzieloną przez sumę intensywności Cy3 i Cy5 ( Ia + Id ). Stan zapętlony ma wysoką wartość FRET, podczas gdy stan niezapętlony ma niską wartość FRET. Histogram sygnałów FRET z pojedynczej cząsteczki jest rozłożony bimodalnie ze względu na odwracalne pętlowanie i rozpętlanie.</li>
	<li>Znajdź próg oddzielający te dwa rozkłady, określając przecięcie między dwiema dopasowanymi krzywymi Gaussa.</li>
	<li>Oblicz wydajność FRET jako <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq7.jpg"> i przypisz stany zapętlone z wysokimi wartościami FRET i stany niezapętlone z niskimi wartościami FRET.</li>
	<li>Korzystając ze skryptu MATLAB, przeanalizuj skumulowaną liczbę cząsteczek ( N(t)) ), które zapętliły się (lub osiągnęły wysoki stan FRET) w różnych odstępach czasu od rozpoczęcia pozyskiwania danych. UWAGA: Ponieważ cząsteczka dsDNA może rozpocząć się w dowolnej konformacji stanu niezapętlonego na początku pozyskiwania danych, szybkość wzrostu w zapętlonej populacji odzwierciedla średnią szybkość pętli uśrednioną dla początkowych konformacji. Wyodrębnij pętlę k szybkości pętli, dopasowując N(t) do funkcji wykładniczej: <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq1.jpg"> Jeśli rośnie dwufazowo, można go wyposażyć w podwójną funkcję wykładniczą: <img fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51667/eq2.jpg"> W tym przypadku pętlę k uzyskuje się z: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51667/eq3.jpg"> UWAGA: Teoretycznie prawdopodobieństwo przeżycia, że polimer nie zapętlił się w czasie t, nie jest pojedynczą lub podwójną funkcją wykładniczą12. Dopasowanie wykładnicze jest używane jako praktyczny sposób na wyodrębnienie średniego czasu zapętlenia.</li>
</ol>
7. Wyznaczanie współczynnika J
UWAGA: Czynnik J pokazuje, jak skoncentrowany jest jeden koniec dsDNA wokół drugiego. Można to określić poprzez interpolację stężenia jednego końcowego segmentu DNA, który spowodowałby taką samą szybkość reakcji z drugim segmentem końcowym, jak zmierzona szybkość pętli. Eksperymentalnie jeden segment końcowy jest unieruchomiony na powierzchni, a drugi segment końcowy jest wprowadzany w określonym stężeniu c. Jeśli zmierzona szybkość wyżarzania między dwoma końcami wynosi wyżarzanie k, to współczynnik J21 jest określony przez <img fo:content-width="0,6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq4.jpg">. Stała szybkości wyżarzania ( kwyżarzanie = kwyżarzanie / C ) jest niezależna od stężenia sondy.
<ol>
	<li>Przelać 20 μl oligo biotyny-Cy5 o stężeniu 30-50 pM (Primer 3) do kanału pokrytego NeutrAwidyną. Przepłukać kanał 100 μl T50, aby zmyć niezwiązane oligonukleotydy.</li>
	<li>Przygotować bufor do obrazowania zgodnie z opisem w części 5 z dodatkiem oligo Cy3 (starter 2) o końcowym stężeniu 50 nM. Przelej ten bufor obrazowania do kanału.</li>
	<li>Trzymając włączony laser 532 nm, na krótko włącz laser 640 nm, aby zidentyfikować lokalizacje oligonukleotydów Cy5 związanych z powierzchnią. Wyłącz laser 640 nm i rozpocznij monitorowanie sygnału FRET. 
	UWAGA: Po hybrydyzacji oligo Cy3 z oligotypukleoligukryptą Cy5 związaną powierzchniowo, fluorescencja Cy5 powstanie z FRET.</li>
	<li>Korzystając ze skryptu MATLAB, przeanalizuj liczbę cząsteczek, które zaczynają się w stanie niezwiązanym (niska intensywność Cy5), ale później przechodzą w stan wyżarzony (wysoka intensywność Cy5) w funkcji czasu od śladów intensywności Cy5.</li>
	<li>Wykreśl tę liczbę wyżarzonych cząsteczek w funkcji czasu. Dopasuj tę krzywą do pojedynczej funkcji wykładniczej (<img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq5.jpg">), aby uzyskać szybkość wyżarzania ( k wyżarzania ).</li>
	<li>Powtórz ten eksperyment przy różnych stężeniach oligonugolakotymetrycznych Cy3 (60, 100 i 180 nM), aby potwierdzić liniowość między szybkością wyżarzania a stężeniem reagenta. Wyodrębnić stałą szybkości wyżarzania drugiego rzędu ( kwyżarzania ) ze zbocza.</li>
	<li>Oblicz współczynnik J z <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq6.jpg">, gdzie k pętla to szybkość zapętlania mierzona w tym samym stanie bufora.</li>
</ol>

<ol><li>Garcia, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+consequences+of+tightly+bent+DNA%3A+The+other+life+of+a+macromolecular+celebrity%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2007).</li>
<li>Wiggins, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+flexibility+of+DNA+on+short+length+scales+probed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy.</a> Nature Nanotechnology. 1, (2006).</li>
<li>Lionberger, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+kinking+at+distant+sites+in+mechanically+stressed+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA.</a> Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).</li>
<li>Shore, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+flexibility+studied+by+covalent+closure+of+short+fragments+into+circles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).</li>
<li>Geggier, S., Vologodskii, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+dependence+of+DNA+bending+rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Sequence dependence of DNA bending rigidity.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).</li>
<li>Smith, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li>
<li>Peters, J. P., Maher, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curvature+and+flexibility+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).</li>
<li>Cloutier, T. E., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+sharp+bending+of+double-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA.</a> Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).</li>
<li>Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclization+of+short+DNA+fragments+and+bending+fluctuations+of+the+double+helix%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).</li>
<li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T4+DNA+ligase+is+more+than+an+effective+trap+of+cyclized+dsDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA.</a> Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).</li>
<li>Manzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+nonspecific+binding+of+lambda+repressor+on+DNA+looping+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics.</a> Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).</li>
<li>Le, T. T., Kim, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+shape-dependent+looping+probability+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring shape-dependent looping probability of DNA.</a> Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).</li>
<li>Vafabakhsh, R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+bendability+of+DNA+less+than+100+base+pairs+long+revealed+by+single-molecule+cyclization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization.</a> Science. 337, 1097-1101 (2012).</li>
<li>Friedman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viewing+dynamic+assembly+of+molecular+complexes+by+multi-wavelength+single-molecule+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence.</a> Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).</li>
<li>Kaplan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li>
<li>Koo, H. S., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+DNA+curvature+and+a+unified+description+of+sequence-directed+bending%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).</li>
<li>Prosseda, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temperature-induced+narrow+DNA+curvature+range+sustains+the+maximum+activity+of+a+bacterial+promoter+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro.</a> Biochemistry. 49, 2778-2785 (2010).</li>
<li>Rasnik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3, 891-893 (2006).</li>
<li>Cordes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+Trolox+as+antiblinking+and+antibleaching+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).</li>
<li>Aitken, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).</li>
<li>Taylor, W. H., Hagerman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+method+of+phage+T4+DNA+ligase-catalyzed+ring-closure+to+the+study+of+DNA+structure%3A+II.+NaCl-dependence+of+DNA+flexibility+and+helical+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat.</a> Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).</li>
<li>Bolshoy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curved+DNA+without+A-A%3A+experimental+estimation+of+all+16+DNA+wedge+angles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+DNA+fragments+in+yeast+by+one-step+assembly+of+overlapping+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides.</a> Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).</li>
<li>Vologodskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+of+short+DNA+helices%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+DNA+PNA+XNA%22%5BJournal%5D)">Bending of short DNA helices.</a> Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).</li>
<li>Hoover, D. M., Lubkowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAWorks%3A+an+automated+method+for+designing+oligonucleotides+for+PCR-based+gene+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis.</a> Nucl. Acids Res. 30, (2002).</li>
<li>Waters, J. T., Kim, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+Statistics+of+a+Surface-Pinned+Semiflexible+Polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer.</a> Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).</li>
<li>Mills, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+evidence+that+single-stranded+regions+of+1+or+more+nucleotides+dramatically+increase+the+flexibility+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA.</a> Biochemistry. 33, 1797-1803 (1994).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Prosty test jednocząsteczkowy oparty na FRET wykorzystano do zbadania kinetyki pętli DNA o różnych wewnętrznych kształtach. Zakrzywione DNA można wytworzyć, powtarzając sekwencję 10-merową w fazie z okresem spiralnym 10,5 pz, a ich krzywizny można oszacować za pomocą PAGE. Te dsDNA są zaprojektowane z lepkimi końcami, aby umożliwić stabilizację pętli przejściowej. Uzyskaliśmy szybkość zapętlania na podstawie wykładniczego wzrostu liczby zapętlonych cząsteczek w czasie. Stała szybkości wyżarzania między rozłączonymi lepki...

Zrozumienie właściwości mechanicznych dsDNA ma fundamentalne znaczenie w naukach podstawowych i zastosowaniach inżynieryjnych. Struktura dsDNA jest bardziej skomplikowana niż prosta spiralna drabina, ponieważ kąty przetaczania, pochylania i skręcania między kolejnymi parami zasad mogą się różnić w zależności od sekwencji. Fluktuacje termiczne mogą powodować, że dsDNA ulega różnym trybom fluktuacji konformacyjnych, takich jak zginanie, skręcanie i rozciąganie. Przejścia, takie jak topnienie i załamanie, mogą również wystąpić w ekstremalnych warunkach.
Wśród tych ruchów, zginanie dsDNA ma najbardziej zauważalny wpływ biologiczny1. Wyginanie dsDNA jest związane z represją lub aktywacją genów poprzez zbliżenie do siebie dwóch odległych miejsc. Odgrywa również ważną rolę w pakowaniu DNA wewnątrz jądra komórkowego lub kapsydu wirusa. Deformacja zginania dsDNA może być wizualizowana eksperymentalnie za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości (AFM2 i TEM3), a termodynamikę i kinetykę można badać za pomocą testów pętlowych, które chemicznie łączą zestawione miejsca dsDNA.
Jednym z takich testów jest cyklizacja zależna od ligazy4. W tym teście cząsteczki dsDNA z "lepkimi" (spoistymi) końcami są cyrkularyzowane lub dimeryzowane przez ligazę DNA. Porównując tempo powstawania okręgów i dimerów, można uzyskać efektywne stężenie molowe jednego końca DNA w pobliżu drugiego końca, które jest znane jako czynnik J. Ten czynnik J jest wymiarowo równoważny gęstości prawdopodobieństwa znalezienia jednego końca DNA w niewielkiej odległości od drugiego końca, a zatem odzwierciedla elastyczność DNA. Pomiar czynnika J w funkcji długości DNA ujawnia wiele cech mechaniki DNA, w tym długość trwałości4,5.
Model łańcucha podobnego do robaka (WLC) jest powszechnie uważany za kanoniczny model polimerowy dla mechaniki dsDNA, na podstawie jego sukcesu w wyjaśnianiu krzywych siły-wydłużenia uzyskanych w eksperymentach z ciągnięciem DNA6 i poprawnego przewidywania czynników J dla dsDNA dłuższych niż 200 pz7. Jednak korzystając z testu cyklizacji na cząsteczkach dsDNA o wielkości zaledwie 100 pz, Cloutier i Widom zmierzyli, że czynniki J są o kilka rzędów wielkości wyższe niż przewidywania modelu WLC8. Rok później Du i wsp. wyprodukowano czynniki J zgodne z modelem WLC przy użyciu testu cyklizacji z niższymi stężeniami ligazy i przypisano anomalny wynik z grupy Widoma zastosowanym wysokim stężeniom ligazy9. Ta kontrowersja ilustruje nieunikniony wpływ ligazy DNA na kinetykę cyklizacji przy użyciu konwencjonalnego testu9. Co więcej, ligaza DNA może również wpływać na strukturę i sztywność DNA poprzez niespecyficzne wiązanie10,11.
Aby wyeliminować problemy techniczne związane z testami pętli zależnych od białek, niedawno zademonstrowaliśmy test pętli bez białka oparty na transferze energii rezonansu fluorescencji (FRET)12. W tej metodzie zapętlone konformacje są wykrywane przez FRET między donorem a akceptorem przyczepionym w pobliżu lepkich końców cząsteczki DNA. Obiektywny mikroskop fluorescencyjny z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) służy do rejestrowania trajektorii odwracalnych zdarzeń pętli i odpętlania z unieruchomionych powierzchniowo pojedynczych cząsteczek DNA przez dłuższy czas. Metoda ta polega na składaniu cząsteczek DNA w oparciu o PCR w celu wygenerowania cząsteczek DNA wolnych od niezgodności, co jest kluczowym ulepszeniem w porównaniu z podobną metodą Vafabakhsh i Ha13. Aspekt pojedynczej cząsteczki tego protokołu umożliwia pomiar rozkładów oprócz średnich zespołowych, podczas gdy aspekt FRET pozwala na wielokrotny pomiar dynamiki pętli DNA z tej samej cząsteczki, nawet w warunkach, które mogą upośledzać aktywność ligazy.
Ustawienia TIRFM są pokazane na rysunku 1. Specjalnie zaprojektowany stolik na próbki jest umieszczony nad korpusem mikroskopu Olympus IX61. Lasery o długości fali 532 nm i 640 nm są wprowadzane z boku i są odbijane przez maleńkie eliptyczne zwierciadła14 do wysokiego obiektywu NA, aby osiągnąć krytyczny kąt padania na granicy faz szkiełko nakrywkowe. Zwracamy uwagę, że w tym zastosowaniu FRET można również zastosować bardziej rozpowszechniony TIR przez obiektyw przy użyciu zwierciadeł dichroicznych lub konfiguracji TIR opartych na pryzmacie. Obraz fluorescencyjny utworzony przez mikroskop jest dzielony na obrazy donorowe i akceptorowe przez lustro dichroiczne. Następnie są one ponownie obrazowane na dwóch połówkach EMCCD. Dodatkowe długoprzepustowe filtry emisyjne służą do redukcji sygnału tła.
Kontrola temperatury jest niezbędna do pozyskiwania powtarzalnych danych kinetycznych. W celu kontroli temperatury obiektyw jest oddzielony od końcówki korpusu mikroskopu, aby zminimalizować przenoszenie ciepła, a woda z agregatu chłodniczego / grzałki o kontrolowanej temperaturze krąży przez mosiężny kołnierz, który ściśle przylega do wewnętrznego metalu pod osłoną obiektywu. Taki układ jest w stanie zapewnić solidną kontrolę temperatury na powierzchni szkiełka nakrywkowego w zakresie od 15 do 50 °C (ilustracja 2). W tej pracy temperaturę próbki utrzymywano na poziomie 24 °C.
Poniższy protokół przedstawia krok po kroku procedurę budowy DNA, szacowania kształtu DNA, eksperymentu z pojedynczą cząsteczką i wyznaczania czynnika J.

<table><tbody><tr><td>Zestaw ekstraktu z małego DNA FRAG-100PR</td><td>VWR</td><td>97060-558</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid 40% roztwór 500 ml</td><td>VWR</td><td>97064-522</td><td></td></tr><tr><td>Bis-akryloamid 2% (w/v) roztwór 500 ml</td><td>VWR</td><td>97063-948</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Drabinka DNA, 100-1,000 pz</td><td>Fermentas</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Mini pionowy system PAGE</td><td>VWR</td><td>89032-300</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,2 &mu; m CS50</td><td>VWR</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813-1G</td><td>wygaszacz stanu trypletowego</td></tr><tr><td>Kwas protokatechowy (PCA)</td><td>System oczyszczania tlenu</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>08992-50MG</td></tr><tr><td>Protokatechuat 3,4-dioksygenaza (PCD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td>system oczyszczania tlenu</td></tr><tr><td>mPEG-silan, MW 2,000 1 g</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SIL-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-PEG-Silan, MW 3,400</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotyna-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>Avidin, NeutrAvidin Białko wiążące biotynę</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England Biolabs</td><td>F-540L</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji fragmentów DNA w żelu/PCR</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47020</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe ze szkła zwykłego premium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikro szkło nakrywkowe VWR, prostokątne, nr 1</td><td>VWR</td><td>48404-456</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp 1006S Recyrkulacyjny agregat chłodniczy/nagrzewnica</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> Kontrola <td>temperatury</td></tr><tr><td>Obiektywny kołnierz</td><td>chłodzący Bioptechs</td><td>150303</td><td>regulacja temperatury</td></tr><tr><td>KMI53 Biologiczny Mikrometryczny stolik pomiarowy</td><td>Semprex</td><td>KMI53</td><td></td></tr><tr><td>Wysokowydajny laser DPSS 532 nm 50 mW</td><td>Edmund optyka</td><td>NT66-968</td><td>Cy3 wzbudzenie</td></tr><tr><td>CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, światłowód, FC / APC Złącze</td><td>koherentne</td><td>1139604</td><td>wzbudzenie Cy5</td></tr><tr><td>650 nm BrightLine Dichroiczny rozdzielacz wiązki</td><td>Semrock</td><td>FF650-Di01-25x36</td><td>rozdzielacz dichroiczny</td></tr><tr><td>Łącznik wiązki LaserMUX, odbija 514,5, 532 i Lasery 543,5 nm, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>LM01-552-25</td><td>łączący dichroiczny</td></tr><tr><td>filtr fluorescencyjny Brightline 593/40</td><td>Filtr emisji Semrock</td><td>FF01-593/40-25</td><td>Cy3</td></tr><tr><td>Filtr długoprzepustowy EdgeBasic LWP 635 nm, 25 mm</td><td>Filtr emisyjny Semrock</td><td>BLP01-635R-25</td><td>Cy5</td></tr><tr><td>EMCCD iXon+</td><td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>IX51 odwrócona ramka mikroskopu</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective UApo N 100X/1.49 Olej TIRF</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny typ-F do mikroskopii fluorescencyjnej</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>2 mm Średnica 45&deg; Soczewka pręta pokryta aluminium&nbsp;</td><td>Edmund optics</td><td>54-092</td><td>miniaturowe lustro</td></tr><tr><td>1/4" podróżne jednoosiowe stadium translacyjne</td><td>Thorlabs</td><td>MS-1</td><td>tłumaczenie miniaturowego lustra</td></tr><tr><td>&Oslash; 1" Achromatyczny dublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A soczewka</td><td>skupiająca</td></tr><tr><td>Regulowana szczelina mechaniczna</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td></td></tr><tr><td>Lustro dielektryczne</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash; 1" Achromatyczny dublet, f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A soczewka przekaźnikowa</td><td></td></tr><tr><td>Mocowanie obiektywu do &Oslash; 1" Optyka</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td></td></tr><tr><td>Mocowanie filtra dichroicznego</td><td>Thorlabs</td><td>FFM1</td><td></td></tr><tr><td>Stała platforma klatkowa</td><td>Platforma Thorlabs</td><td>B3C</td><td></td></tr><tr><td>Kinematyka Montaż do &Oslash; 1" Optyka</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Wypukła soczewka & Oslash; 1", f = 40 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-A soczewka</td><td>kolimacyjna</td></tr><tr><td>N-BK7 Soczewka płasko-wypukła, &Oslash; 6,0 mm, f = 15 mm</td><td>Soczewka teleskopu Thorlabs</td><td>LA1222-A</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka plano-wypukła N-BK7 & Oslash; 6,0 mm, f = 150 mm</td><td>obiektyw teleskopu</td> <td>Thorlabs</td><td>LA1433-A</td></tr></tbody></table>

badanie pętli dna za pomocą pojedynczej cząsteczki fret

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Zaginanie dwuniciowego DNA (dsDNA) jest związane z wieloma ważnymi procesami biologicznymi, takimi jak rozpoznawanie DNA-białka i pakowanie DNA do nukleosomów. Termodynamika zginania dsDNA została zbadana metodą zwaną cyklizacją, która opiera się na ligazie DNA w celu kowalencyjnego łączenia krótkich, lepkich końców dsDNA. Jednak na wydajność ligacji może mieć wpływ wiele czynników, które nie są związane z pętlą dsDNA, takich jak struktura DNA otaczająca połączone lepkie końce, a ligaza może również wpływać na pozorną szybkość pętli poprzez mechanizmy, takie jak niespecyficzne wiązanie. Tutaj pokazujemy, jak zmierzyć kinetykę pętli dsDNA bez ligazy, wykrywając przejściowe tworzenie pętli DNA za pomocą FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Cząsteczki dsDNA są konstruowane przy użyciu prostego protokołu opartego na PCR z parą FRET i łącznikiem biotyny. Gęstość prawdopodobieństwa pętli, znana jako współczynnik J, jest uzyskiwana z szybkości zapętlania i szybkości wyżarzania między dwoma rozłączonymi lepkimi końcami. Testując dwa dsDNA o różnych wewnętrznych krzywiznach, pokazujemy, że czynnik J jest wrażliwy na wewnętrzny kształt dsDNA.

Cząsteczki DNA użyte do badania pętli składają się z dupleksowego obszaru o zmiennej sekwencji i długości oraz jednoniciowych zwisów, które są względem siebie komplementarne. Zwisy, które mają długość 7 podstaw, mogą wyżarzać się względem siebie, aby uchwycić stan pętli. Każdy zwis zawiera Cy3 lub Cy5, który jest połączony w szkielecie DNA poprzez chemię amidytów. Zwis Cy5 jest również połączony z biotyną-TEG (15-atomowy dystans glikolu tetraetylenowego) w celu unieruchomienia powierzchni (patrz rysunek 4A</stron...

To badanie przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną do pomiaru dynamiki pętli dwuniciowego DNA za pomocą jednocząsteczkowego transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET). Protokół opisuje również, w jaki sposób wyodrębnić zapętloną gęstość prawdopodobieństwa zwaną współczynnikiem J.

Badanie pętli DNA za pomocą pojedynczej cząsteczki FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie, w jaki sposób na dynamikę pętli dwuniciowego DNA wpływa wewnętrzny kształt DNA bez użycia białek wiążących DNA. Osiąga się to poprzez włączenie cząsteczek barwnika do dwuniciowych fragmentów DNA o różnych krzywiznach, dzięki czemu pętle DNA mogą być monitorowane przez rezonans fluorescencyjny, transfer energii lub progi. Odwracalne zdarzenia pętli i odpętlania pojedynczych cząsteczek DNA można następnie obserwować za pomocą mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia.Szybkość zapętlania DNA można następnie ekstrapolować na podstawie trajektorii czasowych fluorescencji każdej pojedynczej cząsteczki. Ostatecznie można zmierzyć prawdopodobieństwo zapętlenia DNA w stosunku do wewnętrznego kształtu fragmentu. Główną zaletą tego testu pętli DNA jest to, że nie opiera się on na białku wiążącym DNA A, co może wpływać na kinetykę pętli DNA A.Prosty protokół polega na użyciu techniki zwanej rezonansem fluorescencyjnym, transferem energii i syntezą DNA opartą na PCR. Aby zmierzyć prawdopodobieństwo patrzenia DNA: Zacznij od zaprojektowania globalnie zakrzywionych DNA, powtarzając sekwencję 10 MER. Na przykład ta reprezentatywna sekwencja to zakrzywiony DNA o liczbie 186 par zasad, gdzie X jest losową dodatkową zasadą, a sekwencje flankujące powtarzającą się sekwencję 10 mer są sekwencjami adapterowymi.Następnie wykonaj PCR ze starterami pierwszym i drugim z donorem progów SI trzy znakowanie startera drugiego na pięciu pierwszych końcach. Następnie wykonaj PCR ze starterami trzecim i czwartym z akceptorem progów SCI pięć znakując przez szkielet i łącznik biotyny na piątym pierwszym końcu startera trzeciego. Po oczyszczeniu produktów PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR, wymieszaj trzy znakowane SCI i pięć znakowanych SCI produkty w buforze do wymiany nici w końcowych stężeniach odpowiednio 0,4 mikromola i 0,1 mikromola.Następnie inkubuj pasma w temperaturze 98,5 stopni Celsjusza przez dwie minuty, stopniowo schładzając do pięciu stopni Celsjusza z szybkością narastania 0,1 stopnia Celsjusza na sekundę, a następnie inkubując w temperaturze pięciu stopni Celsjusza przez dwie godziny. Aby wymienić pasma w celu przygotowania komory przepływowej, użyj wiertarki i wierteł diamentowych, aby utworzyć od sześciu do siedmiu par otworów wzdłuż dwóch przeciwległych krawędzi szkiełka o wymiarach trzy cale na jeden cal. Po wywierceniu wszystkich otworów przetrzyj szkiełko pod bieżącą wodą, aby usunąć widoczny proszek szklany.Umieść szkiełka pionowo w szklanym słoiku i napełnij go wodą destylowaną. Sonikuj słoik przez 15 minut, a następnie przenieś szkiełka do szklanego słoika przeznaczonego do czyszczenia acetonem. Napełnij słoik acetonem i poddaj szkiełka sonikacji w acetonie przez kolejne 15 minut.Następnie spryskaj szkiełka etanolem, a następnie wodą, aby je wypłukać, a następnie przenieś szkiełka do słoika z polipropylenu. Napełnij słoik polipropylenowy pięcioma molowymi wodorotlenkami potasu, a następnie poddaj szkiełka sonifikacji przez kolejne 15 minut po ostatnim myciu, opłucz szkiełka w wodzie destylowanej, a następnie wykonaj kolejne 15 minut. Sonikacja, a następnie po oczyszczeniu szkiełek nakrywkowych.W ten sam sposób naniej 80 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu PEG na każde szkiełko, a następnie delikatnie opuść szkiełko nakrywkowe na kołek. Po 45 minutach za pomocą pęsety usuń szkiełka nakrywkowe z szkiełek, opłucz szkiełka i szkiełka nakrywkowe dużą ilością wody destylowanej. Następnie wysusz je w suchym miejscu, gdy szkiełka nakrywkowe i szkiełka wyschną, umieść cienkie paski podwójnej taśmy klejącej w poprzek szkiełka, aby utworzyć kanały, linię szkiełka nakrywkowego na paskach i mocno dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby utworzyć płynne kanały.Następnie użyj pięciominutowej żywicy epoksydowej, aby uszczelnić krawędzie kanałów, aby unieruchomić cząsteczki do mikroskopii. Najpierw wstrzyknij 15 mikrolitrów roztworu neu tradyny do jednego kanału. Po dwóch minutach przepłucz kanał 100 mikrolitrami buforu T 50, a następnie wstrzyknij 50 mikrolitrów próbki DNA do kanału.Po pięciu minutach wypłucz niezwiązane DNA 100 mikrolitrami buforu T 50, a następnie napełnij kanał buforem obrazowania, który zawiera system usuwania tlenu. Teraz umieść olejek immersyjny na obiektywie mikroskopu, a następnie użyj klipsów do próbek, aby przymocować komórkę przepływową do stolika mikroskopu. Włącz laser o długości fali 532 nm.Użyj podglądu na żywo obrazów fluorescencyjnych na monitorze, aby uzyskać dokładność. Dostosuj ostrość. Rozpocznij akwizycję danych przy włączonym laserze 532 nm.Zatrzymaj pobieranie danych, gdy większość cząsteczek zostanie wybielona w celu przetworzenia i analizy obrazów, użyj skryptu MATLAB, aby przejrzeć wszystkie ślady czasowe pojedynczej cząsteczki, które pokazują wiele przejść między sygnałami wysokiego i niskiego progu. Zidentyfikuj stany pętli i rozpętlenia, a następnie znajdź próg oddzielający te dwa rozkłady, określając przecięcie między dwiema dopasowanymi krzywymi Gaussa. Następnie oblicz wydajność frontu F, dzieląc intensywność science fiction przez sumę trzech SCI i intensywności sci-fi.Przypisywanie stanów pętli z wysokimi wartościami progów i stanów unloop z niskimi wartościami progów. Następnie, za pomocą skryptu MATLAB, przeanalizuj skumulowaną liczbę cząsteczek lub NFT, które zapętliły się, czyli osiągnęły stan wysokiego progu w różnych odstępach czasu. Od początku akwizycji danych, pętla podrzędna K z szybkością pętli może być następnie wyodrębniona, dopasowując NFT do funkcji wykładniczej.Jeśli NFT zwiększa się bi, w zasadzie można go wyposażyć w podwójną funkcję wykładniczą, jak pokazano w równaniu. W tym przypadku z tego równania uzyskuje się pętlę podrzędną K w celu wyznaczenia przepływu współczynnika J. 20 mikrolitrów od 30 do 50 picaMolar biotyna sci pięć oligo lub starter trzy do jednego z kanałów pokrytych nakrętką, jak właśnie pokazano.Następnie przepłukać kanał 100 mikrolitrami T 50 w celu zmycia niezwiązanych oligonukleotydów, a następnie wprowadzić do komory świeżo przygotowany bufor obrazujący uzupełniony oligonukleotydem PS trzy. Pozostaw włączony laser 532 n, a następnie na krótko włącz laser 640 n., aby zidentyfikować lokalizacje wszelkich oligonukleotydów science fiction związanych z powierzchnią. Następnie wyłącz laser 640 nm i rozpocznij monitorowanie sygnału progu.Użyj skryptu MATLAB, aby przeanalizować liczbę cząsteczek, które zaczynają się w stanie niezwiązanym. To znaczy z niską intensywnością sci five, ale później przechodzi w stan IL. Oznacza to, że przy wysokiej intensywności scifi w funkcji czasu ze śladów intensywności science fiction wykreśla tę liczbę cząsteczek ane w funkcji czasu, dopasowując krzywą za pomocą pojedynczej funkcji wykładniczej, aby uzyskać szybkość ealinga.K sub anil, powtórz eksperyment przy różnych stężeniach oligonukleotydów SI, aby potwierdzić liniowość między szybkością klęczenia a stężeniem reagenta. Wyodrębnij drugi rząd stałej szybkości klękania K prime sub ail ze zbocza. Na koniec oblicz współczynnik J, gdzie podpętla K jest szybkością pętli mierzoną w tych samych warunkach buforowych, aby przetestować wpływ wewnętrznej krzywizny dwuniciowego DNA na pętlę.W tym eksperymencie jedna prosta i jedna zakrzywiona para zasad 186. Każdy z dwuniciowych DNA został skonstruowany w porównaniu z prostym DNA. Stwierdzono, że zakrzywione DNA powoduje więcej zdarzeń o wysokim progu w tym samym okresie.Zakrzywione DNA zapętlało się również cztery razy częściej niż proste DNA w tym samym czasie pozyskiwania, co pokazuje, że wewnętrzna krzywizna DNA może znacząco wpływać na dynamikę pętli. W tym końcowym etapie analizy współczynnik J obliczono, dzieląc szybkość pętli przez pierwszy porządek, stałą szybkości klęczenia, i określono na 61 plus minus trzy anomolowe dla prostego DNA i 265 plus minus 48 nanomolowych dla krzywej DNA, zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami. Zgodnie z tą procedurą można badać wpływ czynnika wypadku na ruchliwość pętli, taki jak temperatura, odkształcenie i lepkość.Protokół ten będzie przydatny nie tylko do badania fizyki polimerów DNA, ale także do zademonstrowania mocy fluorescencji pojedynczej cząsteczki początkującym studentom lub laikom.

studying-dna-looping-by-single-molecule-fret

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół demonstruje prostą technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek służącą do wizualizacji replikacji DNA przez poszczególne replisomy w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisujemy metodę obserwacji replikacji pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym, pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga.

Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Ten protokół demonstruje prosty, solidny i wysokoprzepustowy test rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania jednowymiarowej (1D) dyfuzji cząsteczek wzdłuż DNA.

Prosta, solidna i wysokowydajna implementacja testu rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania transportu cząsteczek wzdłuż DNA

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzujący cząstki nukleosomów na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą technik obrazowania statycznej i poklatkowej mikroskopii sił atomowych (AFM). Opisana metoda funkcjonalizacji powierzchni pozwala na uchwycenie struktury i dynamiki nukleosomów w wysokiej rozdzielczości w nanoskali.

Badanie struktury i dynamiki nukleosomów za pomocą obrazowania mikroskopowego sił atomowych

Tutaj opisujemy użycie metody obrazowania pojedynczych cząsteczek, Zasłon DNA, do badania biofizycznego mechanizmu gromadzenia się kondensatów EWS-FLI1 na DNA.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek kondensatów EWS-FLI1 składających się na DNA

Ten artykuł przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną odtwarzania nukleosomów DNA dla siły korelacji pojedynczej cząsteczki i mikroskopii fluorescencyjnej. Dalej opisano kilka dalszych eksperymentów, które można przeprowadzić w celu wizualizacji zachowania wiązania białek oddziałujących z chromatyną i analizy zmian właściwości fizycznych nukleosomów.

Składanie nukleosomów in situ do mikroskopii korelacyjnej i fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Ten protokół opisuje test replikacji pojedynczej cząsteczki DNA oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym interakcji między polimerazami DNA a przeszkodami, takimi jak struktury G-quadruplex.

Wizualizacja fluorescencji pojedynczej cząsteczki dynamiki polimerazy DNA w G-kwadrupleksach

Funkcja białek błonowych jest regulowana przez skład lipidowy błony komórkowej. Niniejszy artykuł wideo szczegółowo opisuje sposób tworzenia łatki za pomocą elektrod do łatki dwuwarstwowej, a także wykorzystanie kanałów gramicydyny jako reporterów zmienionych właściwości błony.

Metody pojedynczych cząsteczek do monitorowania zmian właściwości elastycznych dwuwarstwy

Poznaj dynamikę pętlowania DNA za pomocą pojedynczej cząsteczki FRET bez białek wiążących. Ta metoda pozwala mierzyć prawdopodobieństwo pętlowania DNA w zależności od jego krzywizny.

Badanie pętli DNA za pomocą pojedynczej cząsteczki FRET

Przeglądaj więcej filmów