Badanie pętli DNA za pomocą pojedynczej cząsteczki FRET

To badanie przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną do pomiaru dynamiki pętli dwuniciowego DNA za pomocą jednocząsteczkowego transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET). Protokół opisuje również, w jaki sposób wyodrębnić zapętloną gęstość prawdopodobieństwa zwaną współczynnikiem J.

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie, w jaki sposób na dynamikę pętli dwuniciowego DNA wpływa wewnętrzny kształt DNA bez użycia białek wiążących DNA. Osiąga się to poprzez włączenie cząsteczek barwnika do dwuniciowych fragmentów DNA o różnych krzywiznach, dzięki czemu pętle DNA mogą być monitorowane przez rezonans fluorescencyjny, transfer energii lub progi. Odwracalne zdarzenia pętli i odpętlania pojedynczych cząsteczek DNA można następnie obserwować za pomocą mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia

Szybkość zapętlania DNA można następnie ekstrapolować na podstawie trajektorii czasowych fluorescencji każdej pojedynczej cząsteczki. Ostatecznie można zmierzyć prawdopodobieństwo zapętlenia DNA w stosunku do wewnętrznego kształtu fragmentu. Główną zaletą tego testu pętli DNA jest to, że nie opiera się on na białku wiążącym DNA A, co może wpływać na kinetykę pętli DNA A.

Prosty protokół polega na użyciu techniki zwanej rezonansem fluorescencyjnym, transferem energii i syntezą DNA opartą na PCR. Aby zmierzyć prawdopodobieństwo patrzenia DNA: Zacznij od zaprojektowania globalnie zakrzywionych DNA, powtarzając sekwencję 10 MER. Na przykład ta reprezentatywna sekwencja to zakrzywiony DNA o liczbie 186 par zasad, gdzie X jest losową dodatkową zasadą, a sekwencje flankujące powtarzającą się sekwencję 10 mer są sekwencjami adapterowymi.

Następnie wykonaj PCR ze starterami pierwszym i drugim z donorem progów SI trzy znakowanie startera drugiego na pięciu pierwszych końcach. Następnie wykonaj PCR ze starterami trzecim i czwartym z akceptorem progów SCI pięć znakując przez szkielet i łącznik biotyny na piątym pierwszym końcu startera trzeciego. Po oczyszczeniu produktów PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR, wymieszaj trzy znakowane SCI i pięć znakowanych SCI produkty w buforze do wymiany nici w końcowych stężeniach odpowiednio 0,4 mikromola i 0,1 mikromola.

Następnie inkubuj pasma w temperaturze 98,5 stopni Celsjusza przez dwie minuty, stopniowo schładzając do pięciu stopni Celsjusza z szybkością narastania 0,1 stopnia Celsjusza na sekundę, a następnie inkubując w temperaturze pięciu stopni Celsjusza przez dwie godziny. Aby wymienić pasma w celu przygotowania komory przepływowej, użyj wiertarki i wierteł diamentowych, aby utworzyć od sześciu do siedmiu par otworów wzdłuż dwóch przeciwległych krawędzi szkiełka o wymiarach trzy cale na jeden cal. Po wywierceniu wszystkich otworów przetrzyj szkiełko pod bieżącą wodą, aby usunąć widoczny proszek szklany.

Umieść szkiełka pionowo w szklanym słoiku i napełnij go wodą destylowaną. Sonikuj słoik przez 15 minut, a następnie przenieś szkiełka do szklanego słoika przeznaczonego do czyszczenia acetonem. Napełnij słoik acetonem i poddaj szkiełka sonikacji w acetonie przez kolejne 15 minut.

Następnie spryskaj szkiełka etanolem, a następnie wodą, aby je wypłukać, a następnie przenieś szkiełka do słoika z polipropylenu. Napełnij słoik polipropylenowy pięcioma molowymi wodorotlenkami potasu, a następnie poddaj szkiełka sonifikacji przez kolejne 15 minut po ostatnim myciu, opłucz szkiełka w wodzie destylowanej, a następnie wykonaj kolejne 15 minut. Sonikacja, a następnie po oczyszczeniu szkiełek nakrywkowych.

W ten sam sposób naniej 80 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu PEG na każde szkiełko, a następnie delikatnie opuść szkiełko nakrywkowe na kołek. Po 45 minutach za pomocą pęsety usuń szkiełka nakrywkowe z szkiełek, opłucz szkiełka i szkiełka nakrywkowe dużą ilością wody destylowanej. Następnie wysusz je w suchym miejscu, gdy szkiełka nakrywkowe i szkiełka wyschną, umieść cienkie paski podwójnej taśmy klejącej w poprzek szkiełka, aby utworzyć kanały, linię szkiełka nakrywkowego na paskach i mocno dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby utworzyć płynne kanały.

Następnie użyj pięciominutowej żywicy epoksydowej, aby uszczelnić krawędzie kanałów, aby unieruchomić cząsteczki do mikroskopii. Najpierw wstrzyknij 15 mikrolitrów roztworu neu tradyny do jednego kanału. Po dwóch minutach przepłucz kanał 100 mikrolitrami buforu T 50, a następnie wstrzyknij 50 mikrolitrów próbki DNA do kanału.

Po pięciu minutach wypłucz niezwiązane DNA 100 mikrolitrami buforu T 50, a następnie napełnij kanał buforem obrazowania, który zawiera system usuwania tlenu. Teraz umieść olejek immersyjny na obiektywie mikroskopu, a następnie użyj klipsów do próbek, aby przymocować komórkę przepływową do stolika mikroskopu. Włącz laser o długości fali 532 nm.

Użyj podglądu na żywo obrazów fluorescencyjnych na monitorze, aby uzyskać dokładność. Dostosuj ostrość. Rozpocznij akwizycję danych przy włączonym laserze 532 nm.

Zatrzymaj pobieranie danych, gdy większość cząsteczek zostanie wybielona w celu przetworzenia i analizy obrazów, użyj skryptu MATLAB, aby przejrzeć wszystkie ślady czasowe pojedynczej cząsteczki, które pokazują wiele przejść między sygnałami wysokiego i niskiego progu. Zidentyfikuj stany pętli i rozpętlenia, a następnie znajdź próg oddzielający te dwa rozkłady, określając przecięcie między dwiema dopasowanymi krzywymi Gaussa. Następnie oblicz wydajność frontu F, dzieląc intensywność science fiction przez sumę trzech SCI i intensywności sci-fi.

Przypisywanie stanów pętli z wysokimi wartościami progów i stanów unloop z niskimi wartościami progów. Następnie, za pomocą skryptu MATLAB, przeanalizuj skumulowaną liczbę cząsteczek lub NFT, które zapętliły się, czyli osiągnęły stan wysokiego progu w różnych odstępach czasu. Od początku akwizycji danych, pętla podrzędna K z szybkością pętli może być następnie wyodrębniona, dopasowując NFT do funkcji wykładniczej.

Jeśli NFT zwiększa się bi, w zasadzie można go wyposażyć w podwójną funkcję wykładniczą, jak pokazano w równaniu. W tym przypadku z tego równania uzyskuje się pętlę podrzędną K w celu wyznaczenia przepływu współczynnika J. 20 mikrolitrów od 30 do 50 picaMolar biotyna sci pięć oligo lub starter trzy do jednego z kanałów pokrytych nakrętką, jak właśnie pokazano.

Następnie przepłukać kanał 100 mikrolitrami T 50 w celu zmycia niezwiązanych oligonukleotydów, a następnie wprowadzić do komory świeżo przygotowany bufor obrazujący uzupełniony oligonukleotydem PS trzy. Pozostaw włączony laser 532 n, a następnie na krótko włącz laser 640 n., aby zidentyfikować lokalizacje wszelkich oligonukleotydów science fiction związanych z powierzchnią. Następnie wyłącz laser 640 nm i rozpocznij monitorowanie sygnału progu.

Użyj skryptu MATLAB, aby przeanalizować liczbę cząsteczek, które zaczynają się w stanie niezwiązanym. To znaczy z niską intensywnością sci five, ale później przechodzi w stan IL. Oznacza to, że przy wysokiej intensywności scifi w funkcji czasu ze śladów intensywności science fiction wykreśla tę liczbę cząsteczek ane w funkcji czasu, dopasowując krzywą za pomocą pojedynczej funkcji wykładniczej, aby uzyskać szybkość ealinga.

K sub anil, powtórz eksperyment przy różnych stężeniach oligonukleotydów SI, aby potwierdzić liniowość między szybkością klęczenia a stężeniem reagenta. Wyodrębnij drugi rząd stałej szybkości klękania K prime sub ail ze zbocza. Na koniec oblicz współczynnik J, gdzie podpętla K jest szybkością pętli mierzoną w tych samych warunkach buforowych, aby przetestować wpływ wewnętrznej krzywizny dwuniciowego DNA na pętlę.

W tym eksperymencie jedna prosta i jedna zakrzywiona para zasad 186. Każdy z dwuniciowych DNA został skonstruowany w porównaniu z prostym DNA. Stwierdzono, że zakrzywione DNA powoduje więcej zdarzeń o wysokim progu w tym samym okresie.

Zakrzywione DNA zapętlało się również cztery razy częściej niż proste DNA w tym samym czasie pozyskiwania, co pokazuje, że wewnętrzna krzywizna DNA może znacząco wpływać na dynamikę pętli. W tym końcowym etapie analizy współczynnik J obliczono, dzieląc szybkość pętli przez pierwszy porządek, stałą szybkości klęczenia, i określono na 61 plus minus trzy anomolowe dla prostego DNA i 265 plus minus 48 nanomolowych dla krzywej DNA, zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami. Zgodnie z tą procedurą można badać wpływ czynnika wypadku na ruchliwość pętli, taki jak temperatura, odkształcenie i lepkość.

Protokół ten będzie przydatny nie tylko do badania fizyki polimerów DNA, ale także do zademonstrowania mocy fluorescencji pojedynczej cząsteczki początkującym studentom lub laikom.